CN109402203A

CN109402203A - 一种表达o型口蹄疫包涵体工程菌的培养基

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Publication number: CN109402203A
Application number: CN201811269546.1A
Authority: CN
Inventors: 秦天达; 扶星星; 黄银君; 温建波; 王科; 牟克斌; 武志宇; 刘斌; 李金杰; 李佳霞; 邢向茹; 陈晓宇; 岑静; 刘瑞; 宫士越; 史效茹
Original assignee: Sichuan Bainuoji Technology Co ltd; Tianjin Weite Biomedical Co ltd
Current assignee: Sichuan Bainuoji Technology Co ltd; Tianjin Weite Biomedical Co ltd
Priority date: 2018-10-29
Filing date: 2018-10-29
Publication date: 2019-03-01

Abstract

本发明公开了属于生物技术领域的一种表达O型口蹄疫包涵体工程菌的培养基。本发明包括基础培养基及补料培养基，不含速效碳源，通过流加60%葡萄糖来缓慢补充碳源，能够降低乙酸的产生，也防止了氨水调节pH导致活菌数下降的发生。本培养基补料培养基通过菌体合成所需氨基酸比例，合理添加不同种类氨基酸，避免了营养过剩的浪费。本培养基能显著提高大肠杆菌工程发酵密度，同时保证高密度下有高的活菌数，不降低每单位菌体蛋白表达量。提高目的蛋白表达总量，提高生产效率，降低生产成本。

Description

一种表达O型口蹄疫包涵体工程菌的培养基

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种表达O型口蹄疫包涵体工程菌的培养基。

背景技术

随着生物制药的发展，利用重组DNA技术克隆大肠杄菌制得的工程菌，生产生物药物数量越来越多，为生物技术获得生物药物产品的主要途径。

一般情况下，生物药物的产率与大肠杆菌发酵密度密切相关，大肠杆菌的收率直接关系到生物药物的产率。所以在菌体表达蛋白效率相当的情况下，大肠杆菌的发酵密度直接影响到生物药物的效率和成本。特别是在同样的纯化技术条件下，不断有学者进行这方面的研究，如根据化学计量模式(stoichiometric mode1)的方法重新对培养基配方进行设计和优化。在发酵策略方面，为了提高细菌发酵密度，发酵工艺普遍采用补料－分批发酵(fed－batch)的方式提高菌体生长密度和目标产物的表达总量。开发出一种适用于工程菌高密度发酵培养的培养基是非常有必要的。

发明内容

为了解决工程菌的高密度发酵培养问题，本发明提出了一种表达O型口蹄疫包涵体工程菌的培养基。

一种表达O型口蹄疫包涵体工程菌的培养基，包括基础培养基及补料培养基；

所述基础培养基每升包含下列配比组分：酵母提取物2～6g/L，胰蛋白胨 1～4g/L，七水硫酸镁0.5～1.5g/L，六水氯化钴0.1～0.3g/L，四水氯化锰0.1～0.2g/L，磷酸二氢钾0.3～0.6g/L，磷酸氢二钾1.2～1.6g/L，泛酸钙0.1～0.4g/L，生物素0.05～0.15g/L，叶酸0.05～0.15g/L；

所述补料培养基每升包含下列配比组分：酵母提取物30～50g/L，胰蛋白胨20～30g/L，磷酸二氢钾4～5g/L，磷酸氢二钾13～16g/L，天冬酰胺4～7g/L，丝氨酸4～7g/L，甘氨酸1.5～2.2g/L,谷氨酸3～4g/L,丙氨酸3～4g/L,精氨酸 1.5～2.1g/L,亮氨酸1.5～2.1g/L,赖氨酸1.1～1.8g/L，L-甲硫氨酸0.5～1.2g/L， L-异亮氨酸0.5～1.2g/L，L-缬氨酸0.5～1.2g/L，组氨酸0.2～0.6g/L。

一种表达O型口蹄疫包涵体的工程菌制的备方法，包括如下步骤：

(1)摇瓶培养：所用培养基为权利要求1所述的基础培养基，用冻存菌种于摇瓶培养基中，在摇床中37℃，180～220rpm条件下培养6～10h至对数生长期；

(2)基础培养阶段：取500ml菌液接种到发酵罐的发酵培养基中，温度控制在37℃；通过流加60％葡萄糖控制pH在7.2；溶氧控制在30％，开始阶段搅拌速度为40～60rpm，通气量为4～6L/min；当溶氧水平低于阈值30％时，搅拌速度和溶氧与溶氧30％偶联，发酵阶段转速设为400～600rpm，通气量设为80～100L/min；

(3)补料培养阶段：当A600值达到15时，基础培养基营养快消耗完，开始进入补料培养阶段，根据菌量和生长速度，呈指数增加变化流加权利要求 1所述补料培养基，当菌生长到预定的密度时开始加入诱导剂进行诱导，诱导 4～6小时后进行收菌。

有益效果：本发明的培养基成分较为明确，不含速效碳源，通过流加60％葡萄糖来缓慢补充碳源，能够降低乙酸的产生，也防止了氨水调节pH导致活菌数下降的发生。本培养基补料培养基通过菌体合成所需氨基酸比例，合理添加不同种类氨基酸，避免了营养过剩的浪费。本培养基能显著提高大肠杆菌工程发酵密度，同时保证高密度下有高的活菌数，不降低每单位菌体蛋白表达量。提高目的蛋白表达总量，提高生产效率，降低生产成本。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。

下述实施例所用O型口蹄疫包涵体工程菌由中国农业科学院兰州兽医研究所构建表达。菌种形态：在含75μg/ml卡那霉素的LBA琼脂平板上生长的菌落应为圆凸起、光滑、边缘整齐的灰白色菌落。菌体培养物结晶紫染色后，呈红色，在显微镜下观察为无芽孢的直杆菌，两端钝圆。生化特性：可发酵乳糖和山梨醇；吲哚和甲基红试验均为阳性，VP试验和枸橼酸盐利用试验均为阴性。

实施例1

按照本发明配方配制的培养基大规模发酵工艺研究实验

(1)发酵采用fed-batch模式，发酵罐50L(沃力信)，配制20L基础培养基，发酵罐原位灭菌后备用，配制补料培养5L,灭菌备用。

基础培养基按如下配方配制：酵母提取物4g/L,胰蛋白胨2.5g/L,七水硫酸镁1g/L,六水氯化钴0.2g/L,四水氯化锰0.15g/L,磷酸二氢钾0.45g/L,磷酸氢二钾1.45g/L,泛酸钙0.25g/L,生物素0.1g/L,叶酸0.1g/L，培养基用NaOH等碱性溶液调至合适pH值。

补料培养基按如下配方配制：酵母提取物40g/L,胰蛋白胨25g/L,磷酸二氢钾4.5g/L,磷酸氢二钾14.5g/L,天冬酰胺5.4g/L,丝氨酸5.4g/L,甘氨酸1.62g/L, 谷氨酸3.6g/L,丙氨酸3.6g/L,精氨酸1.89g/L,亮氨酸1.89g/L,赖氨酸1.35g/L,L- 甲硫氨酸0.96g/L,L-异亮氨酸0.96g/L,L-缬氨酸0.72g/L,组氨酸0.47g/L。

(2)实验过程：

(1)摇瓶培养：所用培养基为所述的基础培养基，用冻存菌种于摇瓶培养基中，在摇床中37℃200rpm条件下培养8h至对数生长期；

(2)基础培养阶段：取500ml菌液接种到发酵罐的发酵培养基中，温度控制在37℃；通过流加60％葡萄糖控制pH在7.2；溶氧控制在30％，开始阶段搅拌速度为50rpm，通气量为5L/min；当溶氧水平低于阈值30％时，搅拌速度和溶氧与溶氧30％偶联，发酵阶段转速设为500rpm，通气量设为90L/min；

(3)补料培养阶段：当A600值达到15时，基础培养基营养快消耗完，开始进入补料培养阶段，根据菌量和生长速度，呈指数增加变化流加补料培养基，当菌生长到预定的密度时开始加入诱导剂进行诱导，诱导5小时后进行收菌。

(4)在发酵过程中，每隔1h取样，检测菌量。主要采用紫外分光光度计测定600nm波长的A值，同时测量菌的湿重和cfu进行辅助分析。

表达产物的SDS-PAGE电泳图谱表明，所有的重组蛋白均以包涵体的形式存在。且经Western blot分析证实，重组蛋白能够与口蹄疫O型阳性血清发生特异性反应。传代稳定性实验表明传代代次限定在9代以内。

实施例2

在变指数流加补料策略培养大肠杆菌工程菌时，采用葡萄糖溶液和氨水两种方式调节pH值实验。

1.发酵参数控制

A罐和B罐都是2L基础培养基+1L补料培养基，流加补料培养基的策略也一样，不同的是，A罐在发酵罐中糖不够时加入一定量的葡萄糖溶液，再通过 25％氨水来调控pH；B罐通过60％葡萄糖溶液来调节pH，具体发酵参数如表 1、表2所示：

表1 A罐发酵控制参数

表2 B罐发酵控制参数

说明：1.A罐和B罐都是2L基础培养基+1L补料培养基。

2.A罐和B罐流加补料培养基的策略完全一样。

3.A罐分多次在当发酵罐中糖不够时加入一定量的葡萄糖溶液，再通过 25％氨水来调控pH；B罐通过60％葡萄糖溶液来调节pH。

2.检测OD600、菌体湿重、活菌数(cfu)、乙酸、血糖，实验数据如表3、表4所示：

表3 A罐实验数据

表4 B罐实验数据

由实验结果可知，采用60％葡萄糖溶液调控pH值的方法能取得较高生物量的同时保证较高的活菌数。

C罐是2L基础培养基+1L补料培养基，流加补料培养基的策略也同B罐一样，所不同的是C罐的补料培养基中还加入扭口藓提取物2g/L；所述扭口藓提取物的提取方法为：将扭口藓晒干，磨成粉末，加3-8被重量份数的水回流提取3次，合并滤液，蒸干制成。检测OD600、菌体湿重、活菌数(cfu)、乙酸、血糖，实验数据如表5所示。

表5 C罐实验数据

由表5可以看出，加入扭口藓提取物后，可以显著提高发酵菌体的湿重，活菌数，降低乙酸含量。

Claims

1.一种表达O型口蹄疫包涵体工程菌的培养基，其特征在于，包括基础培养基及补料培养基；

所述基础培养基每升包含下列配比组分：酵母提取物2～6g/L，胰蛋白胨1～4 g/L，七水硫酸镁0.5～1.5 g/L，六水氯化钴0.1～0.3 g/L，四水氯化锰0.1～0.2 g/L，磷酸二氢钾0.3～0.6 g/L，磷酸氢二钾1.2～1.6 g/L，泛酸钙0.1～0.4 g/L，生物素0.05～0.15 g/L，叶酸0.05～0.15 g/L;

所述补料培养基每升包含下列配比组分：酵母提取物30～50 g/L，胰蛋白胨20～30 g/L，磷酸二氢钾4～5 g/L，磷酸氢二钾13～16 g/L，天冬酰胺4～7g/L，丝氨酸4～7 g/L，甘氨酸1.5～2.2 g/L,谷氨酸3～4 g/L,丙氨酸3～4 g/L,精氨酸1.5～2.1 g/L,亮氨酸1.5～2.1 g/L,赖氨酸1.1～1.8 g/L，L-甲硫氨酸0.5～1.2 g/L，L-异亮氨酸0.5～1.2 g/L，L-缬氨酸0.5～1.2 g/L，组氨酸0.2～0.6g/L。

2.一种表达O型口蹄疫包涵体的工程菌制备的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）摇瓶培养：所用培养基为权利要求1所述的基础培养基，用冻存菌种于摇瓶培养基中，在摇床中37℃，180～220rpm 条件下培养6～10h至对数生长期；

（2）基础培养阶段：取500ml菌液接种到发酵罐的发酵培养基中，温度控制在37℃；通过流加60%葡萄糖控制pH在7.2；溶氧控制在30%，开始阶段搅拌速度为40～60rpm，通气量为4～6L/min；当溶氧水平低于阈值30%时，搅拌速度和溶氧与溶氧30%偶联，发酵阶段转速设为400～600rpm，通气量设为80～100L/min；

（3）补料培养阶段：当A600值达到15时，基础培养基营养快消耗完，开始进入补料培养阶段，根据菌量和生长速度，呈指数增加变化流加权利要求1所述补料培养基，当菌生长到预定的密度时开始加入诱导剂进行诱导，诱导4～6小时后进行收菌。