CN106676058B

CN106676058B - 一种bhk21悬浮细胞高密度流加培养方法及其在口蹄疫病毒增殖中的应用

Info

Publication number: CN106676058B
Application number: CN201611132227.7A
Authority: CN
Inventors: 刘学荣; 武发菊; 安芳兰; 董文教; 葛玉凤; 陶世宇; 杨进才; 张云德
Original assignee: China Agricultural Vet Bio Science And Technology Co ltd
Current assignee: China Agricultural Vet Bio Science And Technology Co ltd
Priority date: 2016-12-09
Filing date: 2016-12-09
Publication date: 2020-06-19
Anticipated expiration: 2036-12-09
Also published as: CN106676058A

Abstract

本发明公开了一种BHK21悬浮细胞高密度流加培养方法及其在口蹄疫病毒增殖中的应用。本发明根据BHK21细胞在ZN‑MEM基础培养基中生长及代谢水平，提出了一种BHK21细胞专用的流加浓缩培养液，包括氨基酸、葡萄糖、维生素和其它添加物成份。同时，在BHK21细胞批式培养基础上，设计了一套个性化流加策略，经规模化培养应用，进一步优化生物反应器关键控制参数，确定了BHK21细胞的流加培养方法。该方法有效消除了底物和产物的抑制和毒害作用，促进了细胞的生长和代谢，提高了细胞的培养效能。采用本发明方法获得的BHK21细胞，对口蹄疫病毒的感染性增加，病毒的有效抗原含量得到显著提升，提高了口蹄疫病毒的生产效率，从而为高品质疫苗的生产奠定了基础，具有显著的经济效益。

Description

一种BHK21悬浮细胞高密度流加培养方法及其在口蹄疫病毒增殖中的应用

技术领域

本发明涉及一种BHK21悬浮细胞的培养方法，特别涉及一种BHK21悬浮细胞高密度流加培养方法、用于该方法的流加培养液以及该方法在口蹄疫病毒增殖中的应用。本发明属于细胞培养技术领域。

背景技术

口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease，FMD)是致偶蹄动物感染的一种急性、高度接触性、发热性传染病，以传播迅速、感染率高而著称，国际兽疫局(OIE)将其列为A类传染病之首。多年来，口蹄疫作为重大动物疫病不仅严重威胁畜牧业的健康发展，而且会引起人们对食品安全担忧等一系列社会问题。目前的防控手段主要是采取扑杀感染动物和免疫接种健康易感动物达到净化的目的。随着生物生产技术的不断发展，对疫苗产品品质提出了更高的要求。因此开发和优化BHK-21细胞的大规模培养技术，研究维持细胞生长和病毒繁殖的最优化环境控制，是口蹄疫疫苗生产的必然趋势。

本发明根据BHK-21细胞基础代谢流水平，在前期研究得到的一种用于BHK-21细胞高密度悬浮培养的低血清培养基(命名为ZN-MEM，申请号为201510980603.7)的基础上，设计了营养物均衡供给的流加培养基，并调整了ZN-MEM中葡萄糖以及谷氨酰胺的含量，采用调整后的ZN-MEM基础培养基和流加培养基进行流加培养，设计不同的流加策略，确定适宜于口蹄疫病毒生产的BHK-21细胞流加培养关键过程控制工艺参数，使得培养细胞在维持高活率的条件下，终密度提高近2倍左右，细胞代谢副产物浓度降低30％，增殖的口蹄疫病毒抗原含量提高达80％左右，提高了口蹄疫病毒的生产效率，为口蹄疫疫苗高效大规模工业化生产奠定了基础。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种成分较为明确、培养效果显著的适用于BHK-21细胞流加培养的个性化浓缩培养液；

本发明的目的之二是提供一种BHK21悬浮细胞高密度流加培养方法；

本发明的目的之三是提供所述流加培养方法在口蹄疫病毒增殖中的应用。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明的一种适用于BHK-21细胞流加培养的浓缩培养液，由以下含量的各原料物质组成：

在本发明所述的浓缩培养液中，优选的，由以下含量的各原料物质组成：

进一步的，本发明还提出了所述的浓缩培养液在BHK-21细胞培养中的应用。

再进一步的，本发明还提出了一种BHK-21悬浮细胞高密度流加培养方法，该方法利用生物反应器进行流加培养，所用培养基为调整后的ZN-MEM基础培养基，在细胞培养过程中，补加本发明所述的浓缩培养液，继续培养，收获细胞；

其中，所述的调整后的ZN-MEM基础培养基包括氨基酸部分，平衡盐部分，维生素部分、其他添加物、血清以及蒸馏水，pH值7.0～7.2，其中，血清添加浓度为1％(v/v)，其他各原料物质在培养基中的终浓度为：

①氨基酸部分，包括：

②平衡盐部分，包括：

③维生素部分，包括：

④其它添加物，包括：

优选的，其他各原料物质在培养基中的终浓度为：

①氨基酸部分，包括：

②平衡盐部分，包括：

③维生素部分，包括：

④其它添加物，包括：

在本发明所述的方法中，优选的，以初始接种密度0.4～0.5×10⁶个/ml向调整后的ZN-MEM基础培养基中接种复苏后的BHK-21细胞，培养参数：温度为36.5～37.0℃，pH值为6.8～7.0，DO值为60.0％～80.0％，搅拌转速为100～120r/min；在细胞培养至24-36h，细胞生长密度达到1.5×10⁶个/ml以上时，开始补加本发明所述的浓缩培养液，补加体积为原培养基体积的3％；培养至48h-60h，再补加原培养基体积2％的本发明所述的浓缩培养液；培养至72h，收获细胞；优选的，在细胞培养至24h，细胞生长密度达到1.5×10⁶个/ml以上时，开始补加本发明所述的浓缩培养液，补加体积为原培养基体积的3％；培养至48h，再补加原培养基体积2％的本发明所述的浓缩培养液；培养至72h，收获细胞。

在本发明所述的方法中，优选的，补加培养液后的培养参数为：温度37.0～37.5℃、pH值为6.95～7.20、DO值为50.0％～80.0％、搅拌转速为60～100r/min、渗透压值为260～320mOsm/L，更优选的，培养参数为：温度37.0、pH值为6.95、DO值为80.0％、搅拌转速为100r/min、渗透压值为320mOsm/L。

再进一步的，本发明还提出了按照本发明所述的方法制备得到的BHK-21细胞及所述的BHK-21细胞在口蹄疫病毒增殖中的应用，相对于普通BHK-21细胞，该BHK-21细胞对口蹄疫病毒的感染性增加。

其中，优选的，所述的病毒增殖包括向按照本发明所述的方法制备得到的BHK-21细胞接种病毒，设定控制参数为：温度36.5～37.0℃，pH值7.4～7.6，DO值为50.0％～70.0％，搅拌转速为50～70r/min，进行病毒增殖培养。

更优选的，设定控制参数为：温度37.0℃，pH值7.6、DO为50.0％、搅拌为70r/min，进行病毒增殖培养。

其中，优选的，所述的口蹄疫病毒为FMD/O/MYA98/BY/2010、FMD/Re-A WH/09和FMD/Asia1 JSL/06毒株。

相较于现有技术，本发明的有益效果为：

1、采用本发明建立的流加培养方法培养的BHK-21细胞，细胞活率保持在96％以上，细胞密度可达6.0×10⁶个/ml，较普通批式培养提高近2倍；

2、采用本发明建立的流加培养方法培养BHK-21细胞，通过优化生物反应器设定参数，有效控制了细胞及环境因素的变化，确保了生产过程的一致性和稳定性，确保细胞产品产量和质量在可控范围内，BHK-21细胞在流加培养过程中，乳酸浓度低于9.4mM，氨离子浓度小于4.5mM，有效地消除了底物和产物抑制、毒害作用，促进了细胞的生长和代谢，提高了细胞的培养效能；

3、采用本发明建立的流加培养方法获得的BHK21细胞，对口蹄疫病毒的感染性增加，病毒的有效抗原含量得到显著提升(提高80％左右)，从而实现了BHK21细胞高密度悬浮培养的目标，达到了细胞培养过程的可控性和有效性，提高了口蹄疫病毒的生产效率，为高品质疫苗的生产奠定了基础，具有显著的经济效益。

附图说明

图1为不同葡萄糖浓度对细胞增殖的影响；

图2为不同氨浓度对BHK-21细胞生长的影响；

图3为乳酸浓度对细胞增殖的影响；

图4为BHK21细胞流加培养和批式培养的生长曲线；

图5为应用流加培养基代谢产物的积累；

图6为不同组别病毒滴度分析图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例一BHK21悬浮细胞基础代谢水平的研究以及BHK-21细胞悬浮培养流加培养基的建立

1材料

1.1 BHK-21细胞

悬浮培养BHK-21细胞工作细胞库，批号为BHK-21/W/S-201201。

1.2培养基

ZN-MEM培养基，按照申请号为201510980603.7，发明名称为“一种用于BHK-21细胞高密度悬浮培养的低血清培养基及其在口蹄疫病毒增殖中的应用”的专利申请的配方，调整葡萄糖和谷氨酰胺浓度分别为1.98g/L和0.47g/L，委托宜兴赛尔公司加工。调整后的ZN-MEM培养基包括氨基酸部分，平衡盐部分，维生素部分、其他添加物、血清以及蒸馏水，pH值7.0～7.2，其中，血清添加浓度为1％(v/v)，其他各原料物质在培养基中的终浓度如下所示：

①氨基酸部分，包括：

②平衡盐部分，包括：

③维生素部分，包括：

④其它添加物，包括：

1.3血清

新生牛血清，购自合格供应商，按照中农威特生物科技股份有限公司新生牛血清内控质量标准检验合格后使用。

1.4试剂与设备

主要试剂：Labtech氨基酸色谱柱(5μm，250×4.6mmol)；20种氨基酸标样；乙腈(色谱纯)；醋酸钠(分析纯)；醋酸(分析纯)；三乙胺(TEA)；苯异硫氰酸酯(PITC)；葡萄糖及乳酸测定试剂盒(南京建成)等。

主要仪器：细胞分析仪(德国INNOVATIS公司)；氨离子测定仪(美国Thermo公司)；显微镜(日本Olympus)；LC600高效液相色谱仪(北京Labtech公司)。Uv1700紫外分光光度计(日本岛津)，5L生物反应器(美国NBS)，500L生物反应器(中农威特现有生物反应器)。

2 BHK-21细胞代谢需求水平的确定

通过细胞代谢流的研究，观察BHK21细胞特有的反应性变化，测知细胞与外界环境的关系，了解细胞生存条件，BHK21细胞对基础培养基的代谢情况，检测BHK21细胞培养性能，为流加培养的研究奠定基础。

2.1 BHK21细胞对氨基酸的代谢需求

通过检测BHK-21细胞在调整后的ZN-MEM基础培养基批式培养过程中对谷氨酰胺等各种氨基酸的消耗量，结合细胞生长情况，确定生产单位细胞量的各种氨基酸消耗率。氨基酸采用HPLC进行检测。

2.2 BHK-21细胞对葡萄糖的代谢需求

收集处于对数生长期的细胞，调整密度至0.4×10⁶个/ml，分别接种于6个5L生物反应器中，培养参数：温度37℃、DO值为68％、pH值为7.0、转速120r/min。分别加入2.0mmol/L、4.0mmol/L、6.0mmol/L、8.0mmol/L、12.0mmol/L、24.0mmol/L的葡萄糖浓缩液，培养参数均自动控制，每12h取样，统计活细胞密度与活率，分析葡萄糖的消耗情况。葡萄糖浓度采用葡萄糖氧化酶法试剂盒测定。

2.3代谢副产物氨对BHK-21细胞增殖的影响

收集处于对数生长期的细胞，调整密度至0.4×10⁶个/ml，分别接种至6个5L生物反应器中，培养参数：温度37℃、DO值为68％、pH值为7.0、转速120r/min。分别加入0.0mmol/L、1.8mmol/L、2.5mmol/L、4.0mmol/L、6.5mmol/L、10.5mmol/L的氨浓缩液，培养参数均自动控制，每12h取样，分析氨离子浓度对细胞生长代谢的影响，确定了BHK21细胞对氨离子最大耐受浓度为6.5mmol/L。氨浓度采用氨离子测定仪测定。

2.4代谢副产物乳酸对BHK-21细胞增殖的影响

收集处于对数生长期的细胞，调整密度至0.4×10⁶个/ml，分别接种至6个5L生物反应器中，培养参数：温度37℃、DO值为68％、pH值为7.0、转速120r/min。分别加入2.0mmol/L、5.6mmol/L、9.4mmol/L、25.5mmol/L、45mmol/L和70mmol/L的乳酸浓缩液，培养参数均自动控制，每12h取样一次，分析乳酸浓度对细胞生长代谢的影响,确定了BHK21细胞对乳酸最大耐受浓度为25.5mmol/L。乳酸浓度采用乳酸脱氢酶法测定试剂盒测定。

3结果

3.1 BHK-21细胞营养代谢流分析

3.1.1氨基酸对细胞增殖的影响

结果如下表1和表2所示：

表1 BHK21批式培养过程中各种氨基酸的消耗情况(mM)

AA/cell(*10<sup>-6</sup>)	12h	24h	36h	48h	60h
						天冬氨酸	0.062081	0.055296	0.013465	0.018658	0.040111
谷氨酸	0.339478	0.21638	0.101538	0.090346	0.359461
						天冬酰胺	0.046568	0.081441	0.026758	0.014404	0
丝氨酸	0.054443	0.091961	0.008537	0.02002	0.057325
						谷氨酰胺	1.956911	4.288273	1.068816	0.262878	0.061508
甘氨酸	0.259733	0.368004	0.179014	0.075081	0.080595
						组氨酸	0.144159	0.104017	0.027737	0.020611	0.021832
精氨酸	0.320433	0.361877	0.06307	0.044749	0.066662
						苏氨酸	0.602989	0.61154	0.083261	0.07677	0.191953
丙氨酸	0.434843	0.531735	0.348701	0.462618	0.846247
						脯氨酸	0.074496	0.049253	0.012406	0.017851	0.036927
酪氨酸	0.439422	0.166405	0.081784	0.035807	0.069667
						缬氨酸	0.661889	0.446744	0.122538	0.131665	0.209746
蛋氨酸	0.1559	0.1417	0.031503	0.02342	0.026142
						胱氨酸	0.138212	0.237022	0.022644	0.044037	0.181174
异亮氨酸	0.560111	0.512267	0.060215	0.159492	0.448084
						亮氨酸	0.589633	0.658434	0.055294	0.184362	0.29804
苯丙氨酸	0.337144	0.253307	0.03399	0.056445	0.111219
						色氨酸	0.075158	0.063933	0.005696	0.009634	0.015861
赖氨酸	0.515142	0.511663	0.040161	0.068519	0.286571

表2 BHK21细胞对氨基酸的基础代谢水平

3.1.2不同葡萄糖浓度对BHK-21细胞增殖的影响

不同葡萄糖浓度对细胞增殖的影响如图1所示。

由图1可知，葡萄糖浓度低于6mmol/L时，细胞增殖明显变缓，葡萄糖浓度在8mmol/L～12mmol/L时，细胞倍增数目最大且具有明显的稳定期，葡萄糖浓度达24mmol/L时，细胞没有明显的生长周期，表现为持续的延迟期。可见BHK-21细胞在葡萄糖代谢过程中最适范围在8mmol/L～12mmol/L。

3.1.3代谢副产物氨和乳酸对BHK21细胞生长代谢的影响

不同氨浓度对BHK-21细胞生长的影响如图2所示，不同乳酸浓度对细胞增殖的影响如图3所示。

由图2和图3可知，BHK21细胞对代谢副产物乳酸的最大耐受浓度为25.5mM，对氨离子的最大耐受浓度为6.5mM。

4 BHK-21细胞流加浓缩培养液配方的确定

通过上述检测BHK-21细胞对葡萄糖、谷氨酰胺、氨基酸等营养物质的代谢需求量，应用化学计量的方法确定生产单位细胞所需的关键营养物质的比例，按营养物质的消耗速率设计一种适合BHK-21细胞增殖的流加培养基浓缩液配方和流加策略。流加培养基浓缩液配方命名为LP，包括蒸馏水、氨基酸、葡萄糖、维生素和其它添加物成份，各原料物质的浓度为：

优选的，各原料物质的终浓度为：

实施例二BHK21悬浮细胞流加培养工艺的优化与建立

1.材料

1.1 BHK-21细胞

悬浮培养BHK-21细胞工作细胞库，批号为BHK-21/W/S-201201。

1.2培养基

调整后的ZN-MEM基础培养基，同实施例一，委托宜兴赛尔公司加工；流加浓缩培养液按照实施例一所述的优选配方制备。

1.3血清

1.4试剂与设备

主要仪器：细胞分析仪(德国INNOVATIS公司)；氨离子测定仪(美国Thermo公司)；显微镜(日本Olympus)；LC600高效液相色谱仪(北京Labtech公司)。500L生物反应器(美国NBS)，3000L生物反应器(自主设计委托生物反应器厂家生产)，微泡通气，自动控制pH值、DO值、搅拌转速、温度等参数，安装和使用按说明书进行。

2.方法

2.1细胞复苏与培养

从悬浮培养BHK-21细胞工作细胞库复苏细胞一支，静置培养于T100细胞方瓶内，传2～3代，待细胞长满单层后，用胰蛋白酶消化，补加适量细胞培养液转移至1000ml三角瓶中(培养量约200ml)，37℃恒温摇床振荡(120r/min)培养约48h，转入3000ml三角瓶中，待细胞培养体积达到一定数量后，收集细胞，逐级放大，转入5L生物反应器培养。

2.2 BHK-21细胞流加培养工艺策略的优化

2.2.1 5L生物反应器BHK21细胞基础培养

利用5L生物反应器进行批式培养，所用培养基为调整后的ZN-MEM培养基；以初始接种密度0.5×10⁶个/ml接种复苏后的BHK-21细胞，培养参数：温度37℃、DO值为68％、pH值为7.0、转速120r/min。作为试验组1。

2.2.2流加培养策略的设计

在5L生物反应器进行流加培养，在2.2.1所述的基础培养的基础上，根据培养体积，在不同时间流加浓缩营养液，分别作为试验组2-5，流加方式如下表3所示：

表3 BHK21细胞流加培养方案

流加培养过程中，每隔24h无菌在线取样，进行细胞密度、活率和主要营养物质氨基酸、葡萄糖和维生素含量的测定，考察流加培养效果。

2.3 BHK-21细胞流加培养生物反应器关键参数的确定与优化

以调整后的ZN-MEM为基础培养基，按照试验组5的方法进行流加培养，采用L16(45)正交实验设计，选取温度(T)、pH值、溶解氧(DO值)、搅拌速度(Agit)、渗透压(mOsm)作为考察因素，以细胞密度和细胞活率为评价指标，以4.0×10⁵个/ml为细胞接种密度，确定培养过程中关键参数控制对细胞增殖的影响。水平及正交实验方案见表4以及表5。

表4工艺参数优化水平及因素

水平	T(A)	pH(B)	DO(C)	Agit(D)	mOsm(E)
						1	36.0	6.80	50	60	320
2	36.5	6.95	60	80	300
						3	37.0	7.10	70	100	280
4	37.5	7.20	80	120	260

表5L16(4⁵)正交试验设计

注：T1、T2、T3、T4分别为各因素同一水平的均值。

2.4工艺放大试验

取生长良好的细胞种子，以5L生物反应器确定的工艺最佳参数组合为标准，将细胞接种于500L和3000L生物反应器中，对其细胞活率、密度及比生长率等参数进行分析，进行放大效果验证。

3.结果

3.1 BHK-21细胞流加培养工艺策略的优化

为了避免细胞培养过程中的营养物质限制和有毒代谢产物的积累，有效增加细胞密度和提高产物浓度，我们根据BHK-21细胞在基础培养基中各种营养物质的代谢流和代谢产物的产量，结合细胞生长速率、细胞产量等情况，进行了流加策略的研究，流加方式如表3所示，不同流加培养方案对BHK21细胞生长状态的影响如表6所示。

表6不同流加培养方案对BHK21细胞生长状态的影响

由表6可知，不同试验组都表现出典型的细胞生长周期，其中试验组5培养效果最优，细胞经对数生长期，培养至72h，细胞在维持较高活率的条件下细胞密度达到了6.4×10⁶cells/ml，较批式培养最大细胞密度提高近2倍。因此，在BHK21细胞的流加培养过程中，结合基础培养基，我们选择在培养24-36h，细胞密度1.5×10⁶cells/ml以上，补加3％浓缩培养液，继续培养至48h-72h流加2％浓缩培养液，培养72h收获细胞，为流加培养策略，最佳的，选择在细胞培养至24h，细胞生长密度达到1.5×10⁶个/ml以上时，开始补加浓缩培养液，补加体积为原培养基体积的3％；培养至48h，再补加原培养基体积2％的浓缩培养液；培养至72h，收获细胞。

3.2细胞培养过程中生物反应器关键参数控制

以调整后的MEM为基础培养基(其中葡萄糖和谷氨酰胺浓度分别为11mM和1.6mM)，按照试验组5的方法进行流加培养，采用L16(45)正交实验设计，选取温度、pH值、DO值、搅拌转速(Agit)、渗透压(mOsm)作为考察因素，培养过程中，每隔24h无菌在线取样，进行细胞密度、活率和主要营养物质氨基酸、葡萄糖和维生素含量的测定。以细胞密度、活率为评价指标，确定培养过程中关键参数控制对细胞增殖的影响。结果如表7所示。

表7 L16(4⁵)正交试验结果分析

注：T1、T2、T3、T4分别为各因素同一水平的均值。

从表7结果可以看出，10号试验组细胞密度最大，即温度、搅拌转速在3水平、pH值在2水平、DO值在4水平、渗透压在1水平时细胞增殖最快，各因子的最佳水平组合为A3B2C4D3E1，该组合可有效提高细胞的密度。但10、14、16组对细胞增殖能力的影响差异不显著。因此在大规模悬浮培养生产工艺中，宜选择如下工艺控制参数：温度37.0～37.5℃、pH值为6.95～7.20、DO值为50.0％～80.0％、搅拌转速为60～100r/min、渗透压值为260～320mOsm/L，优选的，工艺控制参数：温度37.0、pH值为6.95、DO值为80.0％、搅拌转速为100r/min、渗透压值为320mOsm/L。

3.2 BHK21细胞流加培养和批式培养的比较

应用上述优化的培养条件，在5L生物反应器分别进行流加培养和批式培养的比较。流加培养条件：温度37.0℃、pH值为6.95、DO值为80.0％、搅拌转速为100r/min，渗透压值为320mOsm/L；批式培养条件：接种密度0.45×10⁶个/ml，温度37℃、DO值为68％、pH值为7.0、转速120r/min。

由于流加培养具有更加优化的培养环境，细胞代谢旺盛，在保持高活率的条件下，培养细胞密度可达6.0×10⁶个/ml，较批式培养密度提高近2倍，大大提高了目标产物的产量。

BHK21细胞流加培养和批式培养的生长曲线如图4所示。

3.3工艺放大及验证

应用上述优化的流加培养基及流加培养工艺进行500L和3000L规模培养应用验证。

3.3.1 BHK-21细胞流加培养过程中细胞增殖状态分析

表8 BHK-21细胞生长情况

将优化的流加培养关键参数组合进行500L和3000L不同规模细胞悬浮培养的应用验证，如表8所示，按本发明确定的工艺，细胞主要增殖时间在24～72h之间，培养过程中活率达到95％以上，在培养72h细胞密度达到最大值，倍增比率高达15倍，活率96％以上，可见建立的细胞培养技术平台能够满足规模化病毒生产要求。

3.3.2 BHK-21细胞流加培养过程中乳酸和氨浓度的变化

应用流加培养基代谢产物的积累如图5所示，从图5结果可以看出，乳酸浓度低于9.4mM，氨浓度小于4.5mM时对细胞生长没有影响。由此可见，BHK-21细胞在流加批培养过程中，代谢副产物氨和乳酸的积累并未达到对细胞增长的抑制浓度。

4结论

4.1以前期研究的基础代谢水平实验结果为依据，根据BHK-21细胞的生长和代谢特性，设计了营养物均衡供给的流加培养基，采用流加培养基和基础培养基进行流加培养，设计不同的流加策略，获得了适宜于口蹄疫病毒生产的BHK-21细胞流加培养工艺参数，为口蹄疫疫苗高效大规模工业化生产奠定了基础。

4.2进行规模化流加培养，生物反应器的过程控制参数对流加培养效果有着直接影响。本发明确定了流加工艺参数，即温温度37.0～37.5℃、pH值为6.95～7.20、DO值为50.0％～80.0％、搅拌转速为60～100r/min、渗透压值为260～320mOsm/L，优选的，工艺控制参数：温度37.0、pH值为6.95、DO值为80.0％、搅拌转速为100r/min、渗透压值为320mOsm/L。通过控制细胞及环境因素的变化，可确保生产过程的一致性和稳定性，确保细胞产品产量和质量在可控范围内，从而有效实施流加培养工艺。

4.3应用上述确定的流加培养工艺关键过程控制参数组合，通过3000L生物反应器规模化流加培养的验证，使细胞在培养过程中处于能够满足其生长代谢需要的营养供给环境，提高了BHK-21细胞流加培养的倍增数量，培养细胞终密度能达到6.5×10⁶cells/ml，细胞活率可达94％以上，且避免了代谢副产物的积累。因此，本研究确定的用于口蹄疫病毒生产的BHK-21细胞流加培养工艺参数，能够满足工业化生产的需求。

实施例三FMDV规模化生产过程中生物反应器参数控制对病毒增殖的影响

1材料

1.1 BHK-21细胞

批号为BHK-21/W/S。

1.2培养基

MD611，购自清大天一。

1.3新生牛血清

购自合格供应商，按照中农威特生物科技股份有限公司新生牛血清内控质量标准检验合格后使用。

1.4毒种

O/MYA98/BY/2010、FMD/Asia 1 JSL/06、Re-A/WH/09悬浮细胞毒由中农威特生物科技股份有限公司保存并提供。

1.5主要设备

5L生物反应器，购自美国NBS公司；500L生物反应器(中农威特生物科技股份有限公司提供)，细胞分析仪，购自德国INNOVATIS公司；生物安全柜等。

1.6小鼠及乳鼠

兰州兽医研究所实验动物中心引进繁殖的昆明种小鼠，体重18～22g，乳鼠系2～3日龄小鼠。

2方法

2.1试验设计

试验采用L9(3⁴)正交实验设计，选取温度(T)、pH值、DO值和Agit作为考察因素，分别命名为A、B、C、D 4个因素，以146S含量为评价指标，确定病毒培养过程中参数控制对病毒增殖的影响，从而进行差异显著性分析，对3个最优组病毒液TCID₅₀、LD₅₀进行检测，试验重复3次。水平及正交实验方案见表9和表10。

表9因子水平表

水平	T(A)	pH值(B)	DO(C)	Agit(D)
					1	36.0	7.4	50	50
2	36.5	7.6	60	60
					3	37.0	7.8	70	70

表10 L9(3⁴)正交试验设计

试验号	T(A)	pH值(B)	DO(C)	Agit(D)
					1	1	1	1	1
2	1	2	2	2
					3	1	3	3	3
4	2	1	2	3
					5	2	2	3	1
6	2	3	1	2
					7	3	1	3	2
8	3	2	1	3
					9	3	3	2	1
T1	2.16	2.26	2.52	2.48
					T2	2.59	2.90	2.40	2.65
T3	2.95	2.45	2.60	2.59
					极差R	0.43	0.23	0.18	0.10

注：T1、T2、T3分别为各因素同一水平的均值。

2.2病毒培养

将5L生物反应器中按照实施例二方法培养好的对数生长期的BHK-21细胞4℃～8℃静置，待细胞沉降后弃掉上清，加入病毒维持液，终体积为500mL，按病毒维持液体积的5％加入O/MYA98/BY/2010、FMD/Asia 1JSL/06或Re-A WH/09型种毒，其生物反应器主要控制参数设定见表10，生物反应器均自动控制，测定146S含量，对3个最优组病毒液TCID₅₀、LD₅₀进行检测，试验重复3次。

2.3培养工艺放大效果验证

采用前期在5L生物反应器所获得的生物反应器工艺，对3个毒种的病毒在500L生物反应器进行扩大培养，检测病毒液TCID₅₀、LD₅₀和146S含量，试验重复3次。

2.4检测方法

2.4.1 146S含量检测按《口蹄疫灭活疫苗中间品及成品146S抗原含量检测方法》进行检测。

2.4.2 LD₅₀和TCID₅₀检测按常规方法进行。

3结果

3.1过程参数控制对病毒效价的影响

确定细胞密度及病毒的接种量后，对过程参数控制进行优化，可实现生产工艺的最大优化策略，L9(3⁴)正交试验结果如表11所示。

表11 L9(3⁴)正交试验结果分析

注：T1、T2、T3分别为各因素同一水平的均值.同列中相同字母表示差异不显著，不同字母表示差异显著(p>0.05)。

如表11所示，8号试验组146S含量最高，由此可见当温度、搅拌在3水平、pH值在2水平、DO在1水平时146S含量最高，各因子的最佳水平组合为：A3B2C1D3，即温度37.0℃，pH值7.6、DO为50.0％、搅拌为70r/min时，该组合可有效提高146S含量；极差分析表明：RA>RB>RC>RD，可见温度和pH值对病毒增殖的影响最大。

对最优的三组进行差异显著性分析，结果表明，第5组、第7组和第8组差异不显著，然后对此三组进行病毒效价的检测，分别命名为Ⅰ、Ⅱ、III组，结果如下图6。

3.2不同毒型的病毒工艺放大验证

如表12所示，用该工艺生产O/MYA98/BY/2010株病毒，每0.2ml的病毒液病毒含量为10^7.50LD₅₀～10^8.50LD₅₀，每1.0ml的病毒液病毒含量为10^7.50TCID₅₀～10^8.17TCID₅₀，每1.0ml病毒液146S含量为6.88～7.01μg；Re-A/WH/09株病毒，每0.2ml的病毒液病毒含量为10^7.50LD₅₀～10^8.00LD₅₀，每1.0ml的病毒液病毒含量10^7.50TCID₅₀～10^7.83TCID₅₀，每1.0ml病毒液146S含量为5.75～6.32μg；FMD/Asia 1 JSL/06，每0.2ml的病毒液病毒含量为10^7.00LD₅₀～10^7.67LD₅₀，每1.0ml的病毒液病毒含量10^7.50TCID₅₀～10^7.83TCID₅₀，每1.0ml病毒液146S含量为5.19～5.66μg。

表12不同毒种病毒含量及146S含量结果

4小结

4.1确定了流加培养的BHK-21细胞生产O/MYA98/BY/2010、FMD/Asia 1JSL/06和Re-A/WH/09口蹄疫病毒时生物反应器培养关键控制参数：温度36.5～37.0℃，pH值7.4～7.6，DO值为50.0％～70.0％，搅拌转速为50～70r/min。

4.2用该流加培养工艺生产3种病毒，O/MYA98/BY/2010病毒，每0.2ml的病毒液病毒含量为10^7.50LD₅₀～10^8.50LD₅₀，每1.0ml的病毒液病毒含量为10^7.50TCID₅₀～10^8.17TCID₅₀，每1.0ml病毒液146S含量为6.88～7.01μg；Re-A/WH/09病毒，每0.2ml的病毒液病毒含量为10^7.50LD₅₀～10^8.00LD₅₀，每1.0ml的病毒液病毒含量10^7.50TCID₅₀～10^7.83TCID₅₀、每1.0ml病毒液146S含量为5.75～6.32μg；FMD/Asia1JSL/06，每0.2ml的病毒液病毒含量为10^7.00LD₅₀～10^7.67LD₅₀，每1.0ml的病毒液病毒含量10^7.50TCID₅₀～10^7.83TCID₅₀，每1.0ml病毒液146S含量为5.19～5.66μg。

4.3采用本发明所述的流加培养工艺可进行规模化FMDV生产。

实施例四ZN-MEM培养与流加培养得到的细胞培养病毒的对比结果

为了说明采用ZN-MEM培养(按照申请号为201510980603.7，发明名称为“一种用于BHK-21细胞高密度悬浮培养的低血清培养基及其在口蹄疫病毒增殖中的应用”专利申请所公开的方法制备)与本发明实施例二流加培养得到的BHK-21细胞在病毒培养中的差异，本发明分别采用ZN-MEM培养基与流加培养得到的BHK-21细胞按照实施例三的方法进行病毒增殖实验，结果如下13所示：

表13 ZN-MEM培养与流加培养得到的细胞培养病毒的对比结果

注：A：ZN-MEM培养；B：流加培养。

从该表结果可以看出，用流加培养获得的BHK-21悬浮细胞生产得口蹄疫病毒液，其效价为10^7.50LD50～10^8.00LD50，10^7.50TCID50～10^8.00TCID50，具有较强的感染性，均可达到生物制品规程规定的要求。而应用本发明研究的流加培养策略生产的不同型口蹄疫病毒液，较ZN-MEM培养试验组，其有效抗原146S含量提升达80％，这为口蹄疫疫苗产业化生产产品品质的提升、生产效率的提高奠定了基础。

Claims

1.一种BHK-21悬浮细胞高密度流加培养方法，其特征在于利用生物反应器进行流加培养，所用基础培养基为调整后的ZN-MEM培养基，在细胞培养过程中，补加浓缩培养液，继续培养，收获细胞；

所述的调整后的ZN-MEM培养基包括氨基酸部分，平衡盐部分，维生素部分、其他添加物、血清以及蒸馏水，pH值7.0～7.2，其中，血清添加浓度为1％v/v，其他各原料物质在培养基中的终浓度为：

①氨基酸部分，包括：

②平衡盐部分，包括：

③维生素部分，包括：

④其他添加物，包括：

所述的浓缩培养液由以下含量的各原料物质组成：

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于其他各原料物质在培养基中的终浓度为：

①氨基酸部分，包括：

②平衡盐部分，包括：

③维生素部分，包括：

④其他添加物，包括：

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的浓缩培养液由以下含量的各原料物质组成：

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于以初始接种密度0.4～0.5×10⁶个/ml向调整后的ZN-MEM培养基中接种复苏后的BHK-21细胞，培养参数：温度为36.5～37.0℃，pH值为6.8～7.0，DO值为60.0％～80.0％，搅拌转速为100～120r/min；在细胞培养至24-36h，细胞生长密度达到1.5×10⁶个/ml以上时，开始补加所述的浓缩培养液，补加体积为原培养基体积的3％；培养至48h-60h，再补加原培养基体积2％的所述的浓缩培养液；培养至72h，收获细胞。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于在细胞培养至24h，细胞生长密度达到1.5×10⁶个/ml以上时，开始补加所述的浓缩培养液，补加体积为原培养基体积的3％；培养至48h，再补加原培养基体积2％的所述的浓缩培养液；培养至72h，收获细胞。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于补加浓缩培养液后的培养参数为：温度37.0～37.5℃、pH值为6.95～7.20、DO值为50.0％～80.0％、搅拌转速为60～100r/min、渗透压值为260～320mOsm/L。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于培养参数为：温度37.0℃、pH值为6.95、DO值为80.0％、搅拌转速为100r/min、渗透压值为320mOsm/L。