CN115433705B - 用于培养bhk21细胞的化学限定培养基、添加剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本申请提出了用于培养BHK21细胞的化学限定培养基、添加剂及其应用。根据本申请的实施例，本申请的发明人提出了一种用于BHK21细胞的化学限定培养基添加剂，该培养基添加剂可以添加至DMEM/F12培养基，从而获得化学限定培养基，该化学限定培养基能够用于对BHK21细胞进行悬浮培养，并且意外地实现了培养结团率的降低、增殖倍数的提高。

Description

用于培养BHK21细胞的化学限定培养基、添加剂及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体的，本申请涉及针对特定细胞的培养基添加剂及其用途。
背景技术
BHK-21细胞系（Baby hamster kidney cell line）是从叙利亚幼鼠肾组织中分离培养获得的成纤维型贴壁细胞系，其可连续传代。BHK-21细胞系可以用于多种病毒的增殖和纯化，如口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus，FMDV）、脑心肌炎病毒（Encephalomyocarditis virus，EMCV）、呼肠孤病毒（Reovirus）、水疱性口炎病毒（Vesicularstomatitis virus，VSV）、新城疫病毒（Newcastle Disease Virus）等。目前，BHK-21细胞系已被广泛应用于口蹄疫疫苗的生产。
然而，目前针对BHK21细胞的培养手段，尤其是针对应用于疫苗领域的BHK21细胞的培养手段仍有待改进。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种有用的商业选择。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够有效地用于对BHK21细胞进行培养的化学限定培养基添加剂。
本申请是基于发明人的下列发现而完成的：
BHK21细胞在应用于病毒的培养时，通常采用DMEM/F12添加血清作为培养基。然而，发明人在细胞培养领域的长期研发过程中，发现在采用血清作为添加剂与DMEM/F12培养基配合对BHK21细胞进行悬浮培养时，会存在一些不可克服的缺陷，例如细胞的48小时存活率偏低、细胞结团率偏高，同时在应用于动物时，血清中的成分会不可避免地引发不必要的免疫反应。为此本申请的发明人致力于开发出一款新型的化学限定培养基，即不存在任何蛋白质成分，在应用于疫苗领域时，以避免引发不必要的免疫反应。为此目的，发明人结合之前在细胞培养领域积累的丰富经验，进行了大量的筛选和优化工作，意外地获得了一组配方，可以作为BHK21细胞的化学限定培养基，该培养基能够有效地对BHK21细胞进行悬浮培养，同时能够在多项指标上获得比血清培养更优异的表现。
由此，在本发明的第一方面，本申请提出了一种用于BHK21细胞的化学限定培养基添加剂，该化学限定培养基添加剂用于与DMEM/F12配合，并且化学限定培养基添加剂包括：
成分 重量份（mg/L）
L-盐酸精氨酸 230~240
L-天门冬氨酸 320~330
L-门冬酰胺 495~500
L-半胱氨酸盐酸盐一水 155~165
L-胱氨酸二盐酸盐 14~16
L-谷氨酸 108~112
L-谷氨酰胺 435~440
甘氨酸 138~142
L-盐酸组氨酸一水 28~32
L-羟脯氨酸 270~280
L-异亮氨酸 380~400
L-亮氨酸 320~330
L-盐酸赖氨酸 100~105
L-甲硫氨酸 145~150
L-苯丙氨酸 160~170
L-脯氨酸 365~375
L-丝氨酸 180~185
L-苏氨酸 95~100
L-色氨酸 220~240
L-缬氨酸 190~210
还原型谷胱甘肽 大约0.427
七水硫酸亚铁 大约0.373
七水硫酸锌 大约0.387
维生素C 大约2.533
D-泛酸钙 大约2.133
叶酸 大约2.800
肌醇 大约26.000
烟酰胺 大约2.267
维生素B6 大约2.200
维生素B1 大约2.267
维生素B12 大约5.187
L-酪氨酸二钠盐无水 大约70.667
五水硫酸铜 大约0.002
六水氯化镁 大约46.943
D-生物素 大约0.133
氯化胆碱 大约30.667
次黄嘌呤 大约2.173
亚油酸 大约0.081
硫辛酸 大约0.207
1，4-丁二胺二盐酸盐 大约0.733
维生素B2 大约0.457
胸苷 大约0.380
对氨基苯甲酸 大约0.453
柠檬酸铁 大约15.000
氢化可的松 大约0.050
亚硒酸钠 大约0.003
重组人胰岛素 大约2.000
F68 大约1000
HEPES 大约3000
钼酸铵 大约0.001
二水氯化铜 大约0.001
氯化锂 大约0.002
氯化铝 大约0.020
九水偏硅酸钠 大约0.073
维生素E 醋酸酯 大约0.016
肉豆蔻酸 大约0.002
油酸 大约0.002
棕榈酸 大约0.002
硬脂酸 大约0.002
吐温80 大约0.490
根据本申请的实施例，本申请的发明人提出了一种用于BHK21细胞的化学限定培养基添加剂，该培养基添加剂可以添加至DMEM/F12培养基，从而获得化学限定培养基，该化学限定培养基能够用于对BHK21细胞进行悬浮培养，并且意外地实现了培养结团率的降低、增殖倍数的提高。
根据本申请的一些具体实施例，化学限定培养基添加剂包括：
成分 重量份（mg/L）
L-盐酸精氨酸 235
L-天门冬氨酸 325.6
L-门冬酰胺 497.5
L-半胱氨酸盐酸盐一水 160
L-胱氨酸二盐酸盐 15
L-谷氨酸 110
L-谷氨酰胺 438.5
甘氨酸 140
L-盐酸组氨酸一水 30
L-羟脯氨酸 275
L-异亮氨酸 390
L-亮氨酸 325
L-盐酸赖氨酸 103
L-甲硫氨酸 147
L-苯丙氨酸 165
L-脯氨酸 370
L-丝氨酸 182.5
L-苏氨酸 97.5
L-色氨酸 230
L-缬氨酸 200
还原型谷胱甘肽 0.427
七水硫酸亚铁 0.373
七水硫酸锌 0.387
维生素C 2.533
D-泛酸钙 2.133
叶酸 2.800
肌醇 26.000
烟酰胺 2.267
维生素B6 2.200
维生素B1 2.267
维生素B12 5.187
L-酪氨酸二钠盐无水 70.667
五水硫酸铜 0.002
六水氯化镁 46.943
D-生物素 0.133
氯化胆碱 30.667
次黄嘌呤 2.173
亚油酸 0.081
硫辛酸 0.207
1，4-丁二胺二盐酸盐 0.733
维生素B2 0.457
胸苷 0.380
对氨基苯甲酸 0.453
柠檬酸铁 15.000
氢化可的松 0.050
亚硒酸钠 0.003
重组人胰岛素 2.000
F68 1000
HEPES 3000
钼酸铵 0.001
二水氯化铜 0.001
氯化锂 0.002
氯化铝 0.020
九水偏硅酸钠 0.073
维生素E 醋酸酯 0.016
肉豆蔻酸 0.002
油酸 0.002
棕榈酸 0.002
硬脂酸 0.002
吐温80 0.490
根据本申请的实施例，该培养基添加剂可以添加至DMEM/F12培养基，从而获得化学限定培养基，该化学限定培养基能够用于对BHK21细胞进行悬浮培养，可进一步降低培养结团率和提高增殖倍数。
在本文中所使用的术语“化学限定培养基”是指化学成分完全明确，组成和浓度固定的培养基。化学限定培养基具有批间差异小、可重复性强、结果稳定、无动物源风险等优点。然而，化学限定培养基的通用性差，针对不同的细胞系，通常需要开发不同的培养基配方，才能实现有效地细胞扩增或者培养。在本申请的完成过程中，本申请的发明人进行了大量的优化和筛选实验，发现在调整添加剂的配方时，并无规律可以遵循，结果也是无法预测的。根据本申请实施例，通过采用本申请不含血清和蛋白、化学成分明确的培养基进行BHK-21细胞悬浮培养和病毒的扩增尤其是疫苗病毒的扩增生产，能够在提高产能效率的同时降低血清等动物源性添加物的安全风险，并减少生产过程中杂蛋白对病毒疫苗纯化制剂的压力，本发明对于无血清培养基的工业化应用具有极强的现实意义。
在本申请的第二方面，本申请提出了一种用于培养BHK21细胞的培养基，其包括：
DMEM/F12培养基；和第一方面描述的用于BHK21细胞的化学限定培养基添加剂。
根据本申请的实施例，DMEM/F12培养基含有：
成分 含量（mg/L）
L-丙氨酸 13.45
L-盐酸精氨酸 147.50
L-门冬酰胺 22.50
L-天门冬氨酸 19.65
L-半胱氨酸盐酸盐一水 17.50
L-胱氨酸二盐酸盐 31.30
L-谷氨酸 22.35
L-谷氨酰胺 365.06
甘氨酸 26.75
L-盐酸组氨酸一水 31.50
L-异亮氨酸 54.55
L-亮氨酸 59.00
L-盐酸赖氨酸 91.27
L-甲硫氨酸 17.29
L-苯丙氨酸 35.47
L-脯氨酸 117.25
L-丝氨酸 37.25
L-苏氨酸 53.48
L-色氨酸 19.02
L-酪氨酸二钠盐无水 55.30
L-缬氨酸 52.94
苯酚红 8.10
氯化钠 6999.50
一水磷酸二氢钠 62.56
二水氯化钙 154.50
五水硫酸铜 0.001
氯化钾 311.80
六水氯化镁 59.20
无水硫酸镁 48.84
无水磷酸氢二钠 71.00
七水硫酸锌 0.43
七水硫酸亚铁 0.42
D-无水葡萄糖 3151.00
D-生物素 0.004
氯化胆碱 8.98
D-泛酸钙 2.24
叶酸 2.65
次黄嘌呤 1.95
肌醇 12.60
亚油酸 0.04
硫辛酸 0.11
烟酰胺 2.02
1，4-丁二胺二盐酸盐 0.08
维生素B6 0.03
维生素B2 0.22
丙酮酸钠 55.00
维生素B1 2.17
胸苷 0.37
维生素B12 0.68
盐酸吡哆醛 2.00
九水硝酸铁 0.05
根据本申请的实施例，添加剂在培养基中的终浓度为：
成分 终浓度（mg/L）
L-盐酸精氨酸 235
L-天门冬氨酸 325.6
L-门冬酰胺 497.5
L-半胱氨酸盐酸盐一水 160
L-胱氨酸二盐酸盐 15
L-谷氨酸 110
L-谷氨酰胺 438.5
甘氨酸 140
L-盐酸组氨酸一水 30
L-羟脯氨酸 275
L-异亮氨酸 390
L-亮氨酸 325
L-盐酸赖氨酸 103
L-甲硫氨酸 147
L-苯丙氨酸 165
L-脯氨酸 370
L-丝氨酸 182.5
L-苏氨酸 97.5
L-色氨酸 230
L-缬氨酸 200
还原型谷胱甘肽 0.427
七水硫酸亚铁 0.373
七水硫酸锌 0.387
维生素C 2.533
D-泛酸钙 2.133
叶酸 2.800
肌醇 26.000
烟酰胺 2.267
维生素B6 2.200
维生素B1 2.267
维生素B12 5.187
L-酪氨酸二钠盐无水 70.667
五水硫酸铜 0.002
六水氯化镁 46.943
D-生物素 0.133
氯化胆碱 30.667
次黄嘌呤 2.173
亚油酸 0.081
硫辛酸 0.207
1，4-丁二胺二盐酸盐 0.733
维生素B2 0.457
胸苷 0.380
对氨基苯甲酸 0.453
柠檬酸铁 15.000
氢化可的松 0.050
亚硒酸钠 0.003
重组人胰岛素 2.000
F68 1000
HEPES 3000
钼酸铵 0.001
二水氯化铜 0.001
氯化锂 0.002
氯化铝 0.020
九水偏硅酸钠 0.073
维生素E 醋酸酯 0.016
肉豆蔻酸 0.002
油酸 0.002
棕榈酸 0.002
硬脂酸 0.002
吐温80 0.490
在本申请的第三方面，本申请还提出了一种制备培养基的方法，其包括：配制DMEM/F12培养基；和在DMEM/F12培养基中添加第一方面所描述的添加剂，以便获得可以用于对BHK21细胞进行悬浮培养的培养基。
在本申请的第四方面，本申请还提出了一种培养BHK21细胞的方法，其包括：将BHK21细胞接种在第二方面的培养基中；和对BHK21细胞在适于细胞生长的条件下，进行悬浮培养。
在本申请的第五方面，本申请还提出了一种扩增病毒的方法，其包括：按照第四方面的方法，对BHK21细胞进行悬浮培养；和在培养液中接种病毒，以便对病毒进行扩增。
根据本申请的实施例，病毒包括新城疫病毒、口蹄疫病毒和狂犬病病毒中的至少之一。
在本申请的第六方面，本申请还提出了一种制备兽用疫苗的方法，其包括：按照第五方面的方法扩增病毒；和对经过扩增的病毒进行减毒或者灭活处理，以便获得兽用疫苗。
如前所述，通过采用本申请不含血清和蛋白、化学成分明确的培养基进行BHK-21细胞悬浮培养和病毒的扩增尤其是疫苗病毒的扩增生产，能够在提高产能效率的同时降低血清等动物源性添加物的安全风险，并减少生产过程中杂蛋白对病毒疫苗纯化制剂的压力，本发明对于无血清培养基的工业化应用具有极强的现实意义。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，这些实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
在本文中，术语“约”在本文中用来对在其前面的精确数值以及接近或近似之前有该术语的数值提供文字支持。在确定数值是否接近或近似具体陈述的数值中，该接近或近似的未陈述数值可以是这样的数值，在提供其的上下文中，其提供该具体陈述数值的实质性等同。术语“约”或“大约”是指由本领域技术人员确定的对于特定值可接受的误差，其部分取决于如何测量或确定该值。在某些实施方案中，术语“约”或“大约”指在1、2、3或4个标准偏差之内。在某些实施方案中，术语“约”或“大约”指在给定值或范围的30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％或0.05％之内。
一、配制培养基
通过市售可得的方式，获取DMEM/F12+培养基，并按照下表所列的成分和用量在DMEM培养基中添加额外成分，配制化学限定培养基（分别命名为CD1和CD2，其中CD1为本发明的化学限定培养基，CD2为对照化学限定培养基），同时配制DMEM/F12+10%血清的培养基作为血清培养基对照，市售商品培养基1（健顺BHK21无血清培养基）、商品培养基2（源培BHK21无血清培养基）作为对照：
原料名称 在CD1培养基中的终浓度（单位mg/L） 在CD2培养基中的终浓度（单位mg/L）
L-盐酸精氨酸 235 115.15
L-天门冬氨酸 325.6 166.16
L-门冬酰胺 497.5 268
L-半胱氨酸盐酸盐一水 160 120
L-胱氨酸二盐酸盐 15 8
L-谷氨酸 110 47
L-谷氨酰胺 438.5 205
甘氨酸 140 64
L-盐酸组氨酸一水 30 16.7
L-羟脯氨酸 275 109
L-异亮氨酸 390 198
L-亮氨酸 325 164
L-盐酸赖氨酸 103 65
L-甲硫氨酸 147 78
L-苯丙氨酸 165 75
L-脯氨酸 370 156
L-丝氨酸 182.5 84
L-苏氨酸 97.5 55
L-色氨酸 230 121
L-缬氨酸 200 109
还原型谷胱甘肽 0.427 0.32
七水硫酸亚铁 0.373 0.17
七水硫酸锌 0.387 0.23
维生素C 2.533 1.7
D-泛酸钙 2.133 1.32
叶酸 2.800 1.05
肌醇 26.000 12
烟酰胺 2.267 2.4
维生素B6 2.200 2.5
维生素B1 2.267 2.8
维生素B12 5.187 4.8
L-酪氨酸二钠盐无水 70.667 70.667
五水硫酸铜 0.002 0.002
六水氯化镁 46.943 46.943
D-生物素 0.133 0.08
氯化胆碱 30.667 17.8
次黄嘌呤 2.173 1.07
亚油酸 0.081 0.043
硫辛酸 0.207 0.109
1，4-丁二胺二盐酸盐 0.733 0.52
维生素B2 0.457 0.32
胸苷 0.380 0.1824
对氨基苯甲酸 0.453 0.21
柠檬酸铁 15.000 5
氢化可的松 0.050 0.03
亚硒酸钠 0.003 0.001
重组人胰岛素 2.000 1
F68 1000 800
HEPES 3000 3000
钼酸铵 0.001 0.002
二水氯化铜 0.001 0.002
氯化锂 0.002 0.002
氯化铝 0.020 0.01
九水偏硅酸钠 0.073 0.032
维生素E 醋酸酯 0.016 0.021
肉豆蔻酸 0.002 0.0015
油酸 0.002 0.0015
棕榈酸 0.002 0.0015
硬脂酸 0.002 0.0015
吐温80 0.490 2
其中，DMEM/F12培养基含有：
成分 含量（mg/L）
L-丙氨酸 13.45
L-盐酸精氨酸 147.50
L-门冬酰胺 22.50
L-天门冬氨酸 19.65
L-半胱氨酸盐酸盐一水 17.50
L-胱氨酸二盐酸盐 31.30
L-谷氨酸 22.35
L-谷氨酰胺 365.06
甘氨酸 26.75
L-盐酸组氨酸一水 31.50
L-异亮氨酸 54.55
L-亮氨酸 59.00
L-盐酸赖氨酸 91.27
L-甲硫氨酸 17.29
L-苯丙氨酸 35.47
L-脯氨酸 117.25
L-丝氨酸 37.25
L-苏氨酸 53.48
L-色氨酸 19.02
L-酪氨酸二钠盐无水 55.30
L-缬氨酸 52.94
苯酚红 8.10
氯化钠 6999.50
一水磷酸二氢钠 62.56
二水氯化钙 154.50
五水硫酸铜 0.001
氯化钾 311.80
六水氯化镁 59.20
无水硫酸镁 48.84
无水磷酸氢二钠 71.00
七水硫酸锌 0.43
七水硫酸亚铁 0.42
D-无水葡萄糖 3151.00
D-生物素 0.004
氯化胆碱 8.98
D-泛酸钙 2.24
叶酸 2.65
次黄嘌呤 1.95
肌醇 12.60
亚油酸 0.04
硫辛酸 0.11
烟酰胺 2.02
1，4-丁二胺二盐酸盐 0.08
维生素B6 0.03
维生素B2 0.22
丙酮酸钠 55.00
维生素B1 2.17
胸苷 0.37
维生素B12 0.68
盐酸吡哆醛 2.00
九水硝酸铁 0.05
二、细胞培养和检测
在前面得到CD1培养基、CD2培养基、血清培养基、商品培养基1、商品培养基2后，按照下列方式对BHK21细胞进行悬浮摇瓶培养：
将细胞接种在250ml摇瓶中（不同的摇瓶内分别设置有100ml CD1培养基、100mlCD2培养基和100ml血清培养基），在37℃、5％CO2和110rpm的摇床培养箱内进行悬浮培养作为F1代，在培养48小时，取样按照0.5×106cells/ml的密度进行传代，并继续培养直到F5代培养结束。其中，在每代培养的开始时和结束时采用Countstar Biotech自动细胞计数仪对细胞的相关参数进行检测，具体的，所检测的细胞参数包括：
三、在每代培养开始时检测初始细胞密度、初始细胞存活率，在每代培养结束时，检测48h细胞密度、48h细胞存活率、结团率和细胞直径。
四、结果和分析
采用CD1培养基、CD2培养基、血清培养基、商品培养基1、商品培养基2进行五代培养的相关参数检测结果总结如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
Figure DEST_PATH_IMAGE004
Figure DEST_PATH_IMAGE006
Figure DEST_PATH_IMAGE008
通过比较表1~5中的数据可以看出，采用CD1培养基，可以显著提高48小时的细胞密度，且细胞结团率明显降低。与血清培养基相比，CD1培养基的48小时细胞密度平均提高了98.55%，而采用CD2培养基比血清培养基平均提高了18.76%；与商品培养基相比，CD1培养基比商品培养基1细胞密度平均提高了9.5%，比商品培养基2提高了11.48%，结团率比商品培养基2降低了10.51%。细胞结团率大小顺序依次为：商品培养基1（49.89%）＜CD1培养基（49.9%）＜CD2培养基（52.53%）＜血清培养基（53.39%）＜商品培养基2（55.14%），可以看出，CD1培养基和商品培养基1的结团率相当，都优于血清培养基。然而采用CD2培养基进行培养BHK21细胞，并不能有效地降低细胞结团率，与血清培养基相比，细胞结团率并无明显差异。由此，发明人结合众多筛选实验发现，对于化学限定培养基而言，化学限定培养基的组成对于培养效果例如细胞结团率和细胞密度而言是至关重要的，但同时也是没有规律可以遵循的，能够获得可以展示优异培养性能的CD1是经过大量优化对照实验获得的，这里所列出的对照培养基CD2是作为示例提供的。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、 “示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (8)

1.一种用于培养BHK21细胞的化学限定培养基添加剂，其特征在于，所述化学限定培养基添加剂用于与DMEM/F12配合，所述化学限定培养基添加剂的组成及在培养基中的终浓度为：
终浓度为235mg/L的L-盐酸精氨酸，终浓度为325.6mg/L的L-天门冬氨酸，终浓度为497.5mg/L的L-门冬酰胺，终浓度为160mg/L的L-半胱氨酸盐酸盐一水，终浓度为15mg/L的L-胱氨酸二盐酸盐，终浓度为110mg/L的L-谷氨酸，终浓度为438.5mg/L的L-谷氨酰胺，终浓度为140mg/L的甘氨酸，终浓度为30mg/L的L-盐酸组氨酸一水，终浓度为275mg/L的L-羟脯氨酸，终浓度为390mg/L的L-异亮氨酸，终浓度为325mg/L的L-亮氨酸，终浓度为103mg/L的L-盐酸赖氨酸，终浓度为147mg/L的L-甲硫氨酸，终浓度为165mg/L的L-苯丙氨酸，终浓度为370mg/L的L-脯氨酸，终浓度为182.5mg/L的L-丝氨酸，终浓度为97.5mg/L的L-苏氨酸，终浓度为230mg/L的L-色氨酸，终浓度为200mg/L的L-缬氨酸，终浓度为0.427mg/L的还原型谷胱甘肽，终浓度为0.373mg/L的七水硫酸亚铁，终浓度为0.387mg/L的七水硫酸锌，终浓度为2.533mg/L的维生素C，终浓度为2.133mg/L的D-泛酸钙，终浓度为2.8mg/L的叶酸，终浓度为26mg/L的肌醇，终浓度为2.267mg/L的烟酰胺，终浓度为2.2mg/L的维生素B6，终浓度为2.267mg/L的维生素B1，终浓度为5.187mg/L的维生素B12，终浓度为70.667mg/L的L-酪氨酸二钠盐无水，终浓度为0.002mg/L的五水硫酸铜，终浓度为46.943mg/L的六水氯化镁，终浓度为0.133mg/L的D-生物素，终浓度为30.667mg/L的氯化胆碱，终浓度为2.173mg/L的次黄嘌呤，终浓度为0.081mg/L的亚油酸，终浓度为0.207mg/L的硫辛酸，终浓度为0.733mg/L的1，4-丁二胺二盐酸盐，终浓度为0.457mg/L的维生素B2，终浓度为0.38mg/L的胸苷，终浓度为0.453mg/L的对氨基苯甲酸，终浓度为15mg/L的柠檬酸铁，终浓度为0.05mg/L的氢化可的松，终浓度为0.003mg/L的亚硒酸钠，终浓度为2mg/L的重组人胰岛素，终浓度为1000mg/L的F68，终浓度为3000mg/L的HEPES，终浓度为0.001mg/L的钼酸铵，终浓度为0.001mg/L的二水氯化铜，终浓度为0.002mg/L的氯化锂，终浓度为0.02mg/L的氯化铝，终浓度为0.073mg/L的九水偏硅酸钠，终浓度为0.016mg/L的维生素E 醋酸酯，终浓度为0.002mg/L的肉豆蔻酸，终浓度为0.002mg/L的油酸，终浓度为0.002mg/L的棕榈酸，终浓度为0.002mg/L的硬脂酸，终浓度为0.49mg/L的吐温80。
2.一种用于培养BHK21细胞的培养基，其特征在于，其组成为：
DMEM/F12培养基；和
权利要求1所述的用于培养BHK21细胞的化学限定培养基添加剂。
3.根据权利要求2所述的培养基，其特征在于，所述DMEM/F12培养基的组成为：
含量为13.45mg/L的L-丙氨酸，
含量为147.5mg/L的L-盐酸精氨酸，
含量为22.5 mg/L的L-门冬酰胺，
含量为19.65mg/L的L-天门冬氨酸，
含量为17.5mg/L的L-半胱氨酸盐酸盐一水，
含量为31.3mg/L的L-胱氨酸二盐酸盐，
含量为22.35mg/L的L-谷氨酸，
含量为365.06mg/L的L-谷氨酰胺，
含量为26.75mg/L的甘氨酸，
含量为31.5mg/L的L-盐酸组氨酸一水，
含量为54.55mg/L的L-异亮氨酸，
含量为59mg/L的L-亮氨酸，
含量为91.27mg/L的L-盐酸赖氨酸，
含量为17.29mg/L的L-甲硫氨酸，
含量为35.47mg/L的L-苯丙氨酸，
含量为117.25mg/L的L-脯氨酸，
含量为37.25mg/L的L-丝氨酸，
含量为53.48mg/L的L-苏氨酸，
含量为19.02mg/L的L-色氨酸，
含量为55.3mg/L的L-酪氨酸二钠盐无水，
含量为52.94mg/L的L-缬氨酸，
含量为8.1mg/L的苯酚红，
含量为6999.5mg/L的氯化钠，
含量为62.56mg/L的一水磷酸二氢钠，
含量为154.5mg/L的二水氯化钙，
含量为0.001mg/L的五水硫酸铜，
含量为311.8mg/L的氯化钾，
含量为59.2mg/L的六水氯化镁，
含量为48.84mg/L的无水硫酸镁，
含量为71mg/L的无水磷酸氢二钠，
含量为0.43mg/L的七水硫酸锌，
含量为0.42mg/L的七水硫酸亚铁，
含量为3151mg/L的D-无水葡萄糖，
含量为0.004mg/L的D-生物素，
含量为8.98mg/L的氯化胆碱，
含量为2.24mg/L的D-泛酸钙，
含量为2.65mg/L的叶酸，
含量为1.95mg/L的次黄嘌呤，
含量为12.6mg/L的肌醇，
含量为0.04mg/L的亚油酸，
含量为0.11mg/L的硫辛酸，
含量为2.02mg/L的烟酰胺，
含量为0.08mg/L的1，4-丁二胺二盐酸盐，
含量为0.03mg/L的维生素B6，
含量为0.22mg/L的维生素B2，
含量为55mg/L的丙酮酸钠，
含量为2.17mg/L的维生素B1，
含量为0.37mg/L的胸苷，
含量为0.68mg/L的维生素B12，
含量为2mg/L的盐酸吡哆醛，
含量为0.05mg/L的九水硝酸铁。
4.一种如权利要求2或3所述的用于培养BHK21细胞的培养基的制备方法，其特征在于，包括：
配制DMEM/F12培养基；和
在所述DMEM/F12培养基中添加权利要求1所述的添加剂，即得。
5.一种培养BHK21细胞的方法，其特征在于，包括：
将BHK21细胞接种在权利要求2或3所述的培养基中；和
对所述BHK21细胞在适于细胞生长的条件下，进行悬浮培养。
6.一种扩增病毒的方法，其特征在于，包括：
按照权利要求5所述的方法，对BHK21细胞进行悬浮培养；和
在所得培养液中接种病毒，以便对所述病毒进行扩增。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述病毒包括新城疫病毒、口蹄疫病毒和狂犬病病毒中的至少之一。
8.一种制备兽用疫苗的方法，其特征在于，包括：
按照权利要求6或7所述的方法扩增病毒；
对经过扩增的病毒进行减毒或者灭活处理，以便获得所述兽用疫苗。
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