CN107435037B - 一种用于bhk细胞的无血清培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于BHK细胞的无血清培养基，具体地，所述培养基包括：氨基酸、维生素、盐类、脂类、微量元素、缓冲剂、蛋白水解物、酸碱指示剂、添加剂，该培养基有利于产物的分离纯化，提高产品品质；支持BHK细胞长期传代培养，无需长期而复杂的适应过程；能良好地支持BHK细胞的悬浮生长，配制和使用容易，适于生物制品的大规模生产。

Description

一种用于BHK细胞的无血清培养基
技术领域
本发明涉及细胞培养领域，更具体地，本发明涉及用于BHK21细胞培养的无血清培养基及相应的培养方法。
背景技术
口蹄疫是人畜共患病，是一种高度传染的病毒性疾病.被国际兽医局列为全世界主要防治的动物病疫类之首。口蹄疫一旦暴发，能迅速演变为生物灾害，直接受到重大甚至于毁灭性打击的是畜牧业及相关产业，大批动物被扑杀销毁，引发严重的公共卫生问题，造成社会的恐慌。1999—2001年，口蹄疫席卷全球，亚、非、欧三大洲50多个国家相继暴发口蹄疫，多年无疫的英国、韩国、日本等国也发病，给全球畜牧业以沉重打击。仅英国就销毁牛羊450万头(只)，总损失90亿英磅。此次口蹄疫大暴发引起了全世界的震荡和恐慌，联合国粮农组织紧急呼吁世界各国采取“国际紧急行动”对付大流行。
目前，国内生物疫苗生产企业培养BHK21细胞生产口蹄疫疫苗时，普遍采用传统的转瓶细胞培养工艺。因为每个转瓶均是独立的细胞培养单元，每瓶的细胞质量、病毒产量和滴度都不同，导致疫苗批间差大，隐性污染引起高内毒素，副反应大等缺点。此外细胞密度低、病毒产率低、生产成本高、劳动强度大也是一直困扰从业者的难题。
应用动物细胞成规模生产口蹄疫疫苗，是将病毒适应到传代细胞，并在生物反应器上进行大规模的病毒繁殖和培养以实现口蹄疫疫苗的规模化生产，其优点主要是体现在能提高BHK21细胞密度，自动监控细胞生长或病毒繁殖时的最适生化条件，提高病毒滴度，其次工艺规模放大相对容易，管道化操作最大可能避免了污染的发生，能显著提高口蹄疫疫苗的质量。
当前利用动物细胞培养技术生产口蹄疫疫苗中应用最广泛的细胞是BHK21细胞。传统BHK21细胞生产口蹄疫疫苗的过程往往需要使用血清。血清作为细胞生长和维持的重要物质，在细胞培养中发挥重要作用的同时，也带有许多至今无法解决的问题和弊端，如：(1)血清中成分复杂，不能准确加以区分；(2)血清批次间差异很大，且血清的保存期短(不超过1年)，给批次生产的标准化和连续化带来限制；(3)血清中可能携带动物源性病毒、支原体、衣原体等(据统计，20-50％的胎牛血清都是病毒检测阳性的)，从而污染细胞培养过程，使生产的安全性受到质疑；(4)血清蛋白含量极高(蛋白含量超过45g/L)，会给后续目的蛋白的分离纯化带来极大困扰，增大成本。
因此，本领域迫切需要开发适于BHK21细胞的无血清培养基。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于BHK21细胞的培养基及相应的培养方法。
在本发明的第一方面，提供了一种用于乳仓鼠肾细胞BHK21的培养基，所述培养基包括碳源、氮源、必需氨基酸、维生素、盐类、和活性添加剂，其中，
所述必需氨基酸包括谷氨酰胺，并且所述谷氨酰胺的含量为1-100mg/g培养基，或100-2000mg/L培养基(按培养基的总体积计)，和/或谷氨酰胺占全体氨基酸的比例为10-70％(较佳地为5-50％)；
并且，所述的活性添加剂包括转铁蛋白、白蛋白和胰岛素，并且所述活性添加剂的总含量为0.1-20mg/g培养基，或10-400mg/L培养基(按培养基的总体积计)。
在另一优选例中，所述的必需氨基酸包括选自下组的16-19种氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
在另一优选例中，所述的培养基还含有胱氨酸。
在另一优选例中，胱氨酸的含量为0.1-5mg/g培养基，或10-70mg/L培养基，优选地为0.4-2.8mg/g培养基，或30-50mg/L培养基。
在另一优选例中，所述培养基中，胱氨酸：半胱氨酸的质量比为1：100-100：1，较佳地为1:60-60:1，更佳地为1:20-20:1，最佳地为1:10-10:1。
在另一优选例中，所述培养基中，谷氨酰胺的浓度为150-1500mg/L，更佳地为200-800mg/L(按培养基的总体积计)。
在另一优选例中，所述精氨酸的浓度为100-200mg/L，较佳地为120-180mg/L，更佳地为140-160mg/L(按培养基的总体积计)。
在另一优选例中，所述的活性添加剂中，转铁蛋白、白蛋白和胰岛素的质量比为：1-10：2-40：1-10。
在另一优选例中，所述培养基中，所述活性添加剂的总含量为20-200mg/L培养基，较佳地为40-150mg/L培养基。
在另一优选例中，所述的培养基还包括脂类、微量元素、蛋白水解物和任选的辅助添加剂。
在另一优选例中，所述蛋白水解物为胰蛋白水解物。
在另一优选例中，所述蛋白水解物含量为500-6000mg/L，较佳地为1000-5000mg/L，更佳地为2000-4000mg/L(按培养基的总体积计)。
在另一优选例中，所述的辅助添加剂包括核酸类物质(如次黄嘌呤、胸苷、或其组合)。
在另一优选例中，所述的培养基还含有葡萄糖，其含量为1000-7000mg/L，较佳地为2000-5000mg/L。
在另一优选例中，所述的培养基还含有选自下组的成分：缓冲剂、酸碱指示剂、或其组合。
在另一优选例中，所述的缓冲剂为缓冲范围(能力)为pH6.0-8.0，较佳地为6.8-7.2的缓冲剂。
在另一优选例中，所述缓冲剂选自下组：碳酸氢钠、羟乙基哌嗪乙磺酸、或其组合。
在另一优选例中，所述的培养基为液态，或重构为液态时，pH为6.0-8.0，较佳地为6.8-7.2。
在另一优选例中，所述维生素选自下组：生物素、叶酸、烟酰胺、吡哆醇、硫胺素、硫辛酸、或其组合。
在另一优选例中，所述盐类选自下组：氯化镁、硫酸镁、氯化钙、氯化钾、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、丙酮酸钠、或其组合。
在另一优选例中，所述脂类选自下组：胆固醇、生育酚醋酸酯、豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、吐温80、嵌段式聚醚F68、或其组合。
在另一优选例中，所述微量元素选自下组：Cu、Fe、Zn、或其组合物，较佳地为硫酸铜、硝酸铁、硫酸亚铁、亚硒酸钠、或其组合。
在另一优选例中，所述酸碱指示剂为酚红。
在另一优选例中，所述的培养基中，包括选自下组的一种或多种组分：
丙氨酸 5-8mg/L，
精氨酸 100-200mg/L，
天冬酰胺 20-40mg/L，
天冬氨酸 10-30mg/L，
胱氨酸 30-50mg/L，
半胱氨酸 10-40mg/L，
谷氨酸 10-20mg/L，
甘氨酸 5-35mg/L，
组氨酸 20-70mg/L，
异亮氨酸 30-80mg/L，
亮氨酸 35-85mg/L，
赖氨酸 50-180mg/L，
甲硫氨酸 15-40mg/L，
苯丙氨酸 30-50mg/L，
脯氨酸 5-40mg/L，
丝氨酸 10-40mg/L，
苏氨酸 20-80mg/L，
色氨酸 10-30mg/L，
酪氨酸 30-80mg/L，
缬氨酸 30-80mg/L。
在另一优选例中，所述的培养基中，包括选自下组的一种或多种组分：
生物素 0.005-0.15mg/L，
叶酸 4-10mg/L，
烟酰胺 4-15mg/L，
吡哆醇 2-7mg/L，
硫胺素 2-7mg/L，
硫辛酸 0.4-1.0mg/L。
在另一优选例中，所述的培养基中，包括选自下组的一种或多种组分：
氯化镁 30-110mg/L，
硫酸镁 30-110mg/L，
氯化钙 150-200mg/L，
氯化钾 300-500mg/L，
氯化钠 2000-7000mg/L，
磷酸氢二钠 50-150mg/L，
磷酸二氢钠 50-150mg/L，
丙酮酸钠 100-200mg/L。
在另一优选例中，所述的培养基中，包括选自下组的一种或多种组分：
胆固醇 2-7mg/L，
生育酚醋酸酯 0.004-0.1mg/L，
豆蔻酸 0.004-0.1mg/L，
棕榈酸 0.004-0.1mg/L，
棕榈油酸 0.004-0.1mg/L，
硬脂酸 0.004-0.1mg/L，
吐温80 1-3.1mg/L，
嵌段式聚醚F680 3-1000mg/L。
在另一优选例中，所述的培养基中，包括选自下组的一种或多种组分：
硫酸铜 10-50mg/L，
硝酸铁 30-200mg/L，
硫酸亚铁 0.3-0.7mg/L，
亚硒酸钠 50-150mg/L。
在另一优选例中，所述的培养基中，包括选自下组的一种或多种组分：
碳酸氢钠 200-1000mg/L，
羟乙基哌嗪乙磺酸 1000-4000mg/L。
在另一优选例中，所述的培养基中，所述的酸碱指示剂浓度为0.1-20mg/L，较佳地为1-18mg/L，更佳地为5-10mg/L。
在另一优选例中，所述的培养基中，包括选自下组的一种或多种组分：
葡萄糖 1000-7000mg/L，
次黄嘌呤 2-10mg/L，
胸苷 0.1-0.7mg/L，
转铁蛋白 10-40mg/L，
白蛋白 20-200mg/L，
胰岛素 10-60mg/L。
在另一优选例中，所述的培养基包括选自下组的一种或多种组分(mg/L)：
丙氨酸(L-Alanine)5-8
精氨酸(L-Arginine Hydrochloride)100-200
天冬酰胺(L-Asparagine Monohydrate)20-40
天冬氨酸(L-Aspartic Acid)10-30
胱氨酸(L-Cysteine Dihydrochloride)30-50
半胱氨酸(L-Cysteine Hydrochloride Monohydrate)10-40
谷氨酸(L-Glutamic Acid)10-20
谷氨酰胺(L-Glutamine)200-800
甘氨酸(Glycine)5-35
组氨酸(L-Histidine Hydrochloride Monohydrate)20-70
异亮氨酸(L-Isoleucine)30-80
亮氨酸(L-Leucine)35-85
赖氨酸(L-Lydine Hydrochloride)50-180
甲硫氨酸(L-Methionine)15-40
苯丙氨酸(L-Phenylalanine)30-50
脯氨酸(L-Proline)5-40
丝氨酸(L-Serine)10-40
苏氨酸(L-Threonine)20-80
色氨酸(L-Tryptophan)10-30
酪氨酸(L-Tyrosine Disodium Dihydrate)30-80
缬氨酸(L-Valine)30-80
生物素(D-Biotin)0.005-0.15
叶酸(Folic Acid)4-10
烟酰胺(Niacinamide)4-15
吡哆醇(Pyridoxine Hydrochloride)2-7
硫胺素(Thiamine Hydrochloride)2-7
硫辛酸(Lipoic Acid)0.4-1.0
氯化镁(Magnesium Chloride Hexahydrate)30-110
硫酸镁(Magnesium Sulfate)30-110
氯化钙(Calcium Chloride Dihydrate)150-200
氯化钾(Potassium Chloride)300-500
氯化钠(Sodium Bicarbonate)2000-7000
磷酸氢二钠(Dibasic Sodium Phosphate)50-150
磷酸二氢钠(Sodium Dihydrogen Phosphate)50-150
丙酮酸钠(Sodium Pyruvate)100-200
胆固醇(Cholesterol)2-7
生育酚醋酸酯(DL-Alpha-Tocopherol Acetate)0.004-0.1
豆蔻酸(Myristic Acid)0.004-0.1
棕榈酸(Palmitic Acid)0.004-0.1
棕榈油酸(Palmitoleic Acid)0.004-0.1
硬脂酸(Stearic Acid)0.004-0.1
吐温80(Tween 80)1-3.1
嵌段式聚醚F68 0.3-1000
硫酸铜(Cupric Sulfate Pentahydrate)10-50
硝酸铁(Ferric Nitrate Nonahydrate)30-200
硫酸亚铁(Ferrous Sulfate Heptahydrate)0.3-0.7
亚硒酸钠(Sodium Selenite)50-150
羟乙基哌嗪乙磺酸(Hydroxyethyl Piperazine Ethanesulfonic Acid)1000-4000
胰蛋白水解物(Lucaratone Tryptone USP)2000-4000
酚红(Sodium Phenol Red)5-10
葡萄糖(D-Glucose)1000-7000
次黄嘌呤(Hypoxanthine)2-10
胸苷(Thymidine)0.1-0.7
转铁蛋白(Transferrin)10-40
白蛋白(Bovine Serum Albumin)20-200
胰岛素(Insulin)10-60。
在另一优选例中，所述的培养基包括选自下组的一种或多种组分(mg/L)：
硫酸铜 10-50，
硝酸铁 30-200，
硫酸亚铁 0.3-0.7，
氯化镁 30-110，
硫酸镁 30-110，
氯化钙 150-200，
氯化钾 300-500，
氯化钠 2000-7000，
磷酸氢二钠 50-150，
磷酸二氢钠 50-150，
丙氨酸5-8，
精氨酸100-200，
天冬酰胺 20-40，
天冬氨酸 10-30，
胱氨酸 30-50，
半胱氨酸 10-40，
谷氨酸 10-20，
谷氨酰胺 200-800，
甘氨酸 5-35，
组氨酸 20-70，
异亮氨酸 30-80，
亮氨酸 35-85，
赖氨酸50-180，
甲硫氨酸 15-40，
苯丙氨酸 30-50，
脯氨酸 5-40，
丝氨酸 10-40，
苏氨酸 20-80，
色氨酸 10-30，
酪氨酸 30-80，
缬氨酸 30-80；
生物素 0.005-0.15，
叶酸 4-10，
烟酰胺 4-15，
吡哆醇 2-7，
硫胺素 2-7，
硫辛酸 0.4-1.0，
葡萄糖 1000-7000，
丙酮酸钠 100-200，
次黄嘌呤 2-10，
胸苷 0.1-0.7，
羟乙基哌嗪乙磺酸 1000-4000，
胆固醇 2-7，
生育酚醋酸酯 0.004-0.1，
豆蔻酸 0.004-0.1，
棕榈酸 0.004-0.1，
棕榈油酸 0.004-0.1，
硬脂酸 0.004-0.1，
吐温80 1-3.1，
转铁蛋白 10-40，
白蛋白 20-200，
胰岛素 10-60，
亚硒酸钠 50-150，
胰蛋白水解物 2000-4000，
嵌段式聚醚F68 0.3-1000，
酚红 5-10。
本发明第二方面，提供一种培养乳仓鼠肾细胞BHK21的方法，包括步骤：在本发明第一方面所述的培养基中接种乳仓鼠肾细胞，然后在适合生长的条件下培养BHK21细胞一段时间。
在另一优选例中，所述适合生长的条件为36-37.5℃，3-9％ CO2下，较佳地为36.5-37.3℃，5-7％ CO2下。
本发明第三方面，提供一种如本发明第一方面所述的培养基用途，(a)用作培养乳仓鼠肾细胞BHK21；(b)用于基于BHK21细胞培养的口蹄疫的生产。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了BHK21细胞在本发明的无血清培养基I中悬浮培养的生长曲线坐标图Ⅰ。
图2显示了BHK21细胞在本发明的无血清培养基II中悬浮培养的生长曲线坐标图Ⅱ。
图3显示了BHK21细胞在本发明的无血清培养基III中悬浮培养的生长曲线坐标图Ⅲ。
图4显示了BHK21细胞在本发明的培养基C1中悬浮培养的生长曲线坐标图C1。
图5显示了BHK21细胞在本发明的培养基C2中悬浮培养的生长曲线坐标图C2。
图6显示了BHK21细胞在本发明的培养基C3中悬浮培养的生长曲线坐标图C3。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，意外发现一种适于BHK21细胞大规模悬浮培养的无血清培养基，能够去除血清对生产过程的干扰，降低生产成本，实现BHK21细胞高密度贴壁培养和单细胞悬浮培养，突破BHK21细胞对贴附基质的依赖，为生物制品的规模化生产提供方便。
在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处列举优选的方法和材料。
术语说明
BHK21细胞
BHK21细胞是指幼年叙利亚地鼠肾细胞(BabyHamster Syrian Kidney)，1961年建株。原始的细胞株是成纤维细胞，贴壁依赖性。1963年获得单细胞克隆细胞。后经无数次传代后细胞可悬浮生长，它广泛用于增殖各种病毒，生产兽用疫苗。应用BHK21细胞生产疫苗的优点主要有：对病毒敏感性较强，容易控制与培养，生长速度较快。
培养基(或培养液)
传统BHK21细胞生产口蹄疫疫苗的过程通常需要使用血清，为了能够去除血清对生产过程的干扰，本发明采用无血清培养基实现BHK21细胞高密度贴壁培养和单细胞悬浮培养。
本发明的无血清培养基主要是采用硝酸铁、转铁蛋白、亚硒酸钠、胸苷、次黄嘌呤、白蛋白和胰岛素等物质代替血清，以胆固醇、生育酚醋酸酯、豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、吐温80和嵌段式聚醚F68的组合物为BHK21细胞提供生长必需的脂类物质，同时加入氨基酸、维生素、盐类、微量元素和蛋白水解物等物质促进细胞生长与维持。
其中，氨基酸是生物功能大分子蛋白质的基本组成单位，为细胞生长、进行正常代谢和维持生命提供了物质基础；维生素是细胞代谢中必不可少的有机化合物，许多维生素是酶的辅酶或者是辅酶的组成分子，细胞的各种生长代谢活动离开了维生素都无法正常进行；盐类可以调节细胞膜的通透性，控制水分，维持正常渗透压和酸碱平衡，维持细胞的形态和功能，有些为无机或有机化合物以构成酶的辅基、激素、维生素、蛋白质和核酸的成分，或作为多种酶系统的激活剂，参与许多重要的重理功能；脂类具有能量储存、构成生物膜骨架、参与信号传递、酶激活剂、糖基载体、生长因子与抗氧化剂激素、参与信号识别和免疫、作为维生素和色素的前体等生物学功能；微量元素通过与蛋白质和其他有机基团结合，形成了酶、激素、维生素等生物大分子，发挥着重要的生理生化功能；缓冲剂能维持培养基正常渗透压和酸碱平衡，维持细胞的形态和功能；蛋白水解物为细胞生长提供重要的氨基酸、短肽等营养物，促进细胞生长；酸碱指示剂可以在线指示细胞培养液的酸碱度变化，方便更换新鲜培养液、细胞传代等操作；其他添加物中包括能源物质和血清替代物。
必需氨基酸
如本发明所用，必需氨基酸指细胞自身不能合成，必须依靠培养液提供的氨基酸。
在另一优选例中，所述必需氨基酸包括谷氨酰胺，并且所述谷氨酰胺的含量为1-100mg/g培养基，或100-2000mg/L培养基(按培养基的总体积计)，或谷氨酰胺占全体氨基酸的比例为10-70％(较佳地为5-50％)。
在另一优选例中，所述的必需氨基酸包括选自下组的16-19种氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、和缬氨酸。
在另一优选例中，所述的培养基还含有胱氨酸。
在另一优选例中，胱氨酸的含量为0.1-5mg/g培养基，或10-70mg/L培养基，优选地为0.4-2.8mg/g培养基，或30-50mg/L培养基。
本领域技术人员公知，目前大部分商业培养基中多数只添加半胱氨酸，而半胱氨酸进入细胞内，生成胱氨酸才能被细胞加以利用。在另一优选例中，本发明使用胱氨酸与半胱氨酸的组合，能够使细胞更快速地直接利用胱氨酸，有利于细胞密度的增加和细胞生长。
在另一优选例中，所述培养基中，胱氨酸：半胱氨酸的质量比为1：100-100：1，较佳地为1:60-60:1，更佳地为1:20-20:1，最佳地为1:10-10:1。
在另一优选例中，所述培养基中，谷氨酰胺的浓度为150-1500mg/L，更佳地为200-800mg/L(按培养基的总体积计)。
在另一优选例中，所述精氨酸的浓度为100-200mg/L，较佳地为120-180mg/L，更佳地为140-160mg/L(按培养基的总体积计)。
培养基(培养液)用途
本发明的培养基可用作：(a)用作培养乳仓鼠肾细胞BHK21；(b)用于基于BHK21细胞培养的口蹄疫的生产。
培养方法
本发明所述的无血清培养基可采用常规的制备方法制取，即将上述组分溶解于无热源超纯水即可配制得所述的培养基。
本发明的优点为：
(1)本发明培养基无需添加血清，有效避免血清存在带来的种种不利因素，有利于产物的分离纯化，提高产品品质。
(2)本发明培养基特殊的含量配比(例如较高的谷氨酰胺比例)，使得本发明培养基性能优越。
(3)本发明培养基支持BHK21细胞长期传代培养，有利于快速达到生产所需的培养体积.
(4)本发明培养基能良好地支持BHK21细胞的悬浮生长，培养过程中无需使用微载体等支持细胞依附的基质，从而能有效地降低生产成本，减少生物制品的后期分离纯化负担；
(5)本发明培养基成分简单、配制和使用容易、成本不高，适于大规模生产。
具体实施方式
以下结合附图介绍本发明适于BHK21细胞大规模悬浮培养的无血清的具体实施方案，提供3个实施例。但应该指出，本发明的实施不限于以下的实施例。
实施例1-培养基I
一种适于BHK21细胞大规模悬浮培养的无血清培养基，包括氨基酸、维生素、盐类、脂类、微量元素、激素、缓冲剂、蛋白水解物及添加物，其各种成分的含量为：mg/L
硫酸铜(Cupric Sulfate Pentahydrate)10.21
硝酸铁(Ferric Nitrate Nonahydrate)30.19
硫酸亚铁(Ferrous Sulfate Heptahydrate)0.34
氯化镁(Magnesium Chloride Hexahydrate)31.38
硫酸镁(Magnesium Sulfate)32.44
氯化钙(Calcium Chloride Dihydrate)154.21
氯化钾(Potassium Chloride)302.45
氯化钠(Sodium Bicarbonate)2010.22
磷酸氢二钠(Dibasic Sodium Phosphate)52.14
磷酸二氢钠(Sodium Dihydrogen Phosphate)54.4
丙氨酸(L-Alanine)5.01
精氨酸(L-Arginine Hydrochloride)102.21
天冬酰胺(L-Asparagine Monohydrate)21.3
天冬氨酸(L-Aspartic Acid)10.2
胱氨酸(L-Cysteine Dihydrochloride)31.21
半胱氨酸(L-Cysteine Hydrochloride Monohydrate)10.35
谷氨酸(L-Glutamic Acid)10.25
谷氨酰胺(L-Glutamine)203.45
甘氨酸(Glycine)5.21
组氨酸(L-Histidine Hydrochloride Monohydrate)
异亮氨酸(L-Isoleucine)32.32
亮氨酸(L-Leucine)36.22
赖氨酸(L-Lydine Hydrochloride)51.34
甲硫氨酸(L-Methionine)15.15
苯丙氨酸(L-Phenylalanine)30.57
脯氨酸(L-Proline)5.98
丝氨酸(L-Serine)12.02
苏氨酸(L-Threonine)23.33
色氨酸(L-Tryptophan)10.21
酪氨酸(L-Tyrosine Disodium Dihydrate)31.34
缬氨酸(L-Valine)32.22
生物素(D-Biotin)0.0057
叶酸(Folic Acid)4.22
烟酰胺(Niacinamide)4.44
吡哆醇(Pyridoxine Hydrochloride)2.43
硫胺素(Thiamine Hydrochloride)2.19
硫辛酸(Lipoic Acid)0.452
葡萄糖(D-Glucose)1000
丙酮酸钠(Sodium Pyruvate)104
次黄嘌呤(Hypoxanthine)2.43
胸苷(Thymidine)0.155
羟乙基哌嗪乙磺酸(Hydroxyethyl Piperazine Ethanesulfonic Acid)1009
胆固醇(Cholesterol)2.23
生育酚醋酸酯(DL-Alpha-Tocopherol Acetate)0.01
豆蔻酸(Myristic Acid)0.01
棕榈酸(Palmitic Acid)0.01
棕榈油酸(Palmitoleic Acid)0.01
硬脂酸(Stearic Acid)0.01
吐温80(Tween 80)1.1
转铁蛋白(Transferrin)11.2
白蛋白(Bovine Serum Albumin)21.7
胰岛素(Insulin)11.22
亚硒酸钠(Sodium Selenite)52.7
胰蛋白水解物(Lucaratone Tryptone USP)2090
嵌段式聚醚F68(Pluronic F68)0.32
酚红(Sodium Phenol Red)5.63
将上述组分溶解于无热源超净水中进行配制，可得适合BHK细胞大规模悬浮培养的无血清培养基I。
将用于生产口蹄疫疫苗的BHK21细胞至于培养基I中进行单细胞悬浮培养：接种于美国Corning公司的125毫升摇瓶中，培养液体积为30毫升，接种密度5×105细胞/毫升，培养至72小时时活细胞密度达到最高，为99.88×105细胞/毫升，结果见附图1，图中：■为活细胞密度曲线；▲为比生长速率曲线。
从图1中的曲线可以得知，培养基I能够良好地支持细胞的正常生长，其最高细胞密度甚至超过已知的商业培养基。
实施例2-培养基II
一种适于BHK21细胞大规模悬浮培养的无血清培养基，包括氨基酸、维生素、盐类、脂类、微量元素、激素、缓冲剂、蛋白水解物及添加物，其各种成分的含量为：mg/L
硫酸铜(Cupric Sulfate Pentahydrate)50.21
硝酸铁(Ferric Nitrate Nonahydrate)198.19
硫酸亚铁(Ferrous Sulfate Heptahydrate)0.64
氯化镁(Magnesium Chloride Hexahydrate)108.38
硫酸镁(Magnesium Sulfate)109.44
氯化钙(Calcium Chloride Dihydrate)194.21
氯化钾(Potassium Chloride)492.45
氯化钠(Sodium Bicarbonate)6980.22
磷酸氢二钠(Dibasic Sodium Phosphate)142.14
磷酸二氢钠(Sodium Dihydrogen Phosphate)144.4
丙氨酸(L-Alanine)7.81
精氨酸(L-Arginine Hydrochloride)192.21
天冬酰胺(L-Asparagine Monohydrate)38.3
天冬氨酸(L-Aspartic Acid)28.2
胱氨酸(L-Cysteine Dihydrochloride)49.21
半胱氨酸(L-Cysteine Hydrochloride Monohydrate)39.35
谷氨酸(L-Glutamic Acid)19.25
谷氨酰胺(L-Glutamine)793.45
甘氨酸(Glycine)34.21
组氨酸(L-Histidine Hydrochloride Monohydrate)68.11
异亮氨酸(L-Isoleucine)77.32
亮氨酸(L-Leucine)84.22
赖氨酸(L-Lydine Hydrochloride)178.34
甲硫氨酸(L-Methionine)35.15
苯丙氨酸(L-Phenylalanine)47.57
脯氨酸(L-Proline)39.98
丝氨酸(L-Serine)38.02
苏氨酸(L-Threonine)77.33
色氨酸(L-Tryptophan)29.21
酪氨酸(L-Tyrosine Disodium Dihydrate)78.34
缬氨酸(L-Valine)79.22
生物素(D-Biotin)0.148
叶酸(Folic Acid)9.22
烟酰胺(Niacinamide)1 4.44
吡哆醇(Pyridoxine Hydrochloride)6.43
硫胺素(Thiamine Hydrochloride)6.19
硫辛酸(Lipoic Acid)0.952
葡萄糖(D-Glucose)6800
丙酮酸钠(Sodium Pyruvate)194
次黄嘌呤(Hypoxanthine)9.43
胸苷(Thymidine)0.655
羟乙基哌嗪乙磺酸(Hydroxyethyl Piperazine Ethanesulfonic Acid)3909
胆固醇(Cholesterol)6.83
生育酚醋酸酯(DL-Alpha-Tocopherol Acetate)0.09
豆蔻酸(Myristic Acid)0.09
棕榈酸(Palmitic Acid)0.09
棕榈油酸(Palmitoleic Acid)0.09
硬脂酸(Stearic Acid)0.09
吐温80(Tween 80)3.0
转铁蛋白(Transferrin)39.2
白蛋白(Bovine Serum Albumin)199.7
胰岛素(Insulin)58.22
亚硒酸钠(Sodium Selenite)148.7
胰蛋白水解物(Lucaratone Tryptone USP)3990
嵌段式聚醚F68(Pluronic F68)997
酚红(Sodium Phenol Red)9.63
将上述组分溶解于无热源超净水中进行配制，可得适合BHK21细胞大规模悬浮培养的无血清培养基II。
将用于生产口蹄疫疫苗的BHK21细胞至于培养基II中进行单细胞悬浮培养：接种于美国Corning公司的125毫升摇瓶中，培养液体积为30毫升，接种密度5×105细胞/毫升，培养至72小时时活细胞密度达到最高，为107.45×105细胞/毫升，结果见附图2，图中：■为活细胞密度曲线；▲为比生长速率曲线。
从图2中的曲线可以得知，培养基II能够良好地支持细胞的正常生长，其最高细胞密度甚至超过已知的商业培养基。
实施例3-培养基III
一种适于BHK21细胞大规模悬浮培养的无血清培养基，包括氨基酸、维生素、盐类、脂类、微量元素、激素、缓冲剂、蛋白水解物及添加物，其各种成分的含量为：mg/L
硫酸铜(Cupric Sulfate Pentahydrate)30.32
硝酸铁(Ferric Nitrate Nonahydrate)119.44
硫酸亚铁(Ferrous Sulfate Heptahydrate)0.54
氯化镁(Magnesium Chloride Hexahydrate)71.55
硫酸镁(Magnesium Sulfate)72.49
氯化钙(Calcium Chloride Dihydrate)174.24
氯化钾(Potassium Chloride)402.43
氯化钠(Sodium Bicarbonate)4600.22
磷酸氢二钠(Dibasic Sodium Phosphate)102.14
磷酸二氢钠(Sodium Dihydrogen Phosphate)104.4
丙氨酸(L-Alanine)7.04
精氨酸(L-Arginine Hydrochloride)162.21
天冬酰胺(L-Asparagine Monohydrate)31.3
天冬氨酸(L-Aspartic Acid)20.2
胱氨酸(L-Cysteine Dihydrochloride)41.21
半胱氨酸(L-Cysteine Hydrochloride Monohydrate)26.35
谷氨酸(L-Glutamic Acid)16.25
谷氨酰胺(L-Glutamine)505.45
甘氨酸(Glycine)22.21
组氨酸(L-Histidine Hydrochloride Monohydrate)46.11
异亮氨酸(L-Isoleucine)58.32
亮氨酸(L-Leucine)62.22
赖氨酸(L-Lydine Hydrochloride)118.34
甲硫氨酸(L-Methionine)30.15
苯丙氨酸(L-Phenylalanine)42.57
脯氨酸(L-Proline)24.98
丝氨酸(L-Serine)26.02
苏氨酸(L-Threonine)53.33
色氨酸(L-Tryptophan)20.21
酪氨酸(L-Tyrosine Disodium Dihydrate)58.34
缬氨酸(L-Valine)52.22
生物素(D-Biotin)0.087
叶酸(Folic Acid)7.22
烟酰胺(Niacinamide)10.44
吡哆醇(Pyridoxine Hydrochloride)5.43
硫胺素(Thiamine Hydrochloride)5.19
硫辛酸(Lipoic Acid)0.752
葡萄糖(D-Glucose)4400
丙酮酸钠(Sodium Pyruvate)164
次黄嘌呤(Hypoxanthine)7.43
胸苷(Thymidine)0.455
羟乙基哌嗪乙磺酸(Hydroxyethyl Piperazine Ethanesulfonic Acid)2509
胆固醇(Cholesterol)4.83
生育酚醋酸酯(DL-Alpha-Tocopherol Acetate)0.05
豆蔻酸(Myristic Acid)0.05
棕榈酸(Palmitic Acid)0.05
棕榈油酸(Palmitoleic Acid)0.05
硬脂酸(Stearic Acid)0.05
吐温80(Tween 80)2.7
转铁蛋白(Transferrin)28.2
白蛋白(Bovine Serum Albumin)111.7
胰岛素(Insulin)37.22
亚硒酸钠(Sodium Selenite)100.7
胰蛋白水解物(Lucaratone Tryptone USP)3090
嵌段式聚醚F68(Pluronic F68)540.32
酚红(Sodium Phenol Red)8.63
将上述组分溶解于无热源超净水中进行配制，可得适合BHK21细胞大规模悬浮培养的无血清培养基III。
将用于生产口蹄疫疫苗的BHK21细胞至于培养基III中进行单细胞悬浮培养：接种于美国Corning公司的125毫升摇瓶中，培养液体积为30毫升，接种密度5×105细胞/毫升，培养至72小时时活细胞密度达到最高，为115.25×105细胞/毫升，结果见图3，图中：■为活细胞密度曲线；▲为比生长速率曲线。
从图3中的曲线可以得知，培养基III能够良好地支持细胞的正常生长，其最高细胞密度甚至超过已知的商业培养基。
对比例1-培养基C1：
重复实施例1，不同点在于，谷氨酰胺的含量为<50mg/L。
结果见图4，图中：■为活细胞密度曲线；▲为比生长速率曲线。
从图4中的曲线可以得知，培养基C1不能够良好地支持细胞的正常生长。
对比例2-培养基C2：
同实施例1，不同点在于，采用10％的血清+DMEM为培养基。
结果见图5，图中：■为活细胞密度曲线；▲为比生长速率曲线。
从图5中的曲线可以得知，培养基C2的全血清培养基不能够良好地支持细胞的正常生长。
对比例3-培养基C3：
同实施例1，不同点在于，不添加转铁蛋白、白蛋白和胰岛素。
结果见图6，图中：■为活细胞密度曲线；▲为比生长速率曲线。
从图6中的曲线可以得知，培养基C3的培养基不能够良好地支持细胞的正常生长。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (8)

1.一种用于乳仓鼠肾细胞BHK21的培养基，其特征在于，所述培养基包括葡萄糖、蛋白水解物、必需氨基酸、维生素、盐类、脂类、微量元素、核酸类物质和活性添加剂，其中，
所述必需氨基酸为谷氨酰胺，含量为200-800 mg/L培养基，
丙氨酸 5-8mg/L，
精氨酸 100-200mg/L，
天冬酰胺 20-40mg/L，
天冬氨酸 10-30mg/L，
胱氨酸 30-50mg/L，
半胱氨酸 10-40mg/L，
谷氨酸 10-20mg/L，
甘氨酸 5-35mg/L，
组氨酸 20-70mg/L，
异亮氨酸 30-80mg/L，
亮氨酸 35-85mg/L，
赖氨酸 50-180mg/L，
甲硫氨酸 15-40mg/L，
苯丙氨酸 30-50mg/L，
脯氨酸 5-40mg/L，
丝氨酸 10-40mg/L，
苏氨酸 20-80mg/L，
色氨酸 10-30mg/L，
酪氨酸 30-80mg/L，和
缬氨酸 30-80mg/L，按培养基的总体积计；
所述的活性添加剂为转铁蛋白、白蛋白和胰岛素，其中，所述白蛋白的含量为20-200mg/L，所述转铁蛋白的含量为10-40mg/L，所述胰岛素的含量为10-60mg/L，按培养基的总体积计；
所述维生素为：生物素 0.005-0.15mg/L，叶酸 4-10mg/L，烟酰胺 4-15mg/L，吡哆醇2-7mg/L，硫胺素 2-7mg/L和硫辛酸 0.4-1.0mg/L；
所述盐类为：氯化镁 30-110mg/L，硫酸镁 30-110mg/L，氯化钙 150-200mg/L，氯化钾300-500mg/L，氯化钠 2000-7000mg/L，磷酸氢二钠 50-150mg/L，磷酸二氢钠 50-150mg/L和丙酮酸钠 100-200mg/L；
所述脂类为：胆固醇 2-7mg/L，生育酚醋酸酯 0.004-0.1mg/L，豆蔻酸 0.004-0.1mg/L，棕榈酸 0.004-0.1mg/L，棕榈油酸 0.004-0.1mg/L，硬脂酸 0.004-0.1mg/L，吐温80 1-3.1mg/L，嵌段式聚醚F68 0.3-1000mg/L；
所述的微量元素为：硫酸铜 10-50mg/L，硝酸铁 30-200mg/L，硫酸亚铁 0.3-0.7mg/L，亚硒酸钠 50-150mg/L；
所述核酸类物质为：次黄嘌呤 2-10 mg/L，胸苷 0.1-0.7mg/L；
所述蛋白水解物为胰蛋白水解物，2000-4000 mg/L；葡萄糖含量为1000-7000 mg/L。
2.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述精氨酸的浓度为120-180 mg/L，按培养基的总体积计。
3. 如权利要求2所述的培养基，其特征在于，所述精氨酸的浓度为140-160 mg/L，按培养基的总体积计。
4.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述的活性添加剂中，转铁蛋白、白蛋白和胰岛素的质量比为：1-10：2-40：1-10。
5. 如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述的葡萄糖的含量为2000-5000 mg/L。
6.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述的培养基还含有选自下组的成分：缓冲剂、酸碱指示剂、或其组合。
7.一种培养乳仓鼠肾细胞BHK21的方法，包括步骤：在权利要求1所述的培养基中接种乳仓鼠肾细胞，然后在适合生长的条件下培养BHK21细胞一段时间。
8.一种如权利要求1所述的培养基用途，其特征在于，(a)用作培养乳仓鼠肾细胞BHK21；(b)用于基于BHK21细胞培养的口蹄疫疫苗的生产。
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