CN109536435A - 一种无血清无蛋白培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种无血清无蛋白培养基，包括氨基酸、维生素、无机盐、缓冲剂、酚红、右旋糖、丙酮酸钠、碳酸氢钠；所述氨基酸为L‑丙氨酸、L‑精氨酸盐酸盐、L‑天冬酰胺、L‑谷氨酸、L‑天冬氨酸、L‑胱氨酸二盐酸、L‑谷氨酰胺、L‑甘氨酸、L‑异亮氨酸、L‑组氨酸盐酸盐、L亮氨酸、L‑赖氨酸、L‑蛋氨酸、L‑苯丙氨酸、L‑脯氨酸、L‑丝氨酸、L‑苏氨酸、L‑色氨酸、L‑络氨酸二钠盐、L‑缬氨酸中的至少一种。本发明的优点是结构稳定，保持稳定的pH值范围，同时酚红能够有效显示培养基的pH值状态；上述培养基完全不含蛋白、血清，生产成本较低，是一种化学成分确定的培养基，有利于产物的分离提纯，提高产物的品质。

Description

一种无血清无蛋白培养基
技术领域
本发明涉及培养基技术领域，特别是涉及一种无血清无蛋白培养基。
背景技术
通常，动物细胞的生长均有赖于血清的存在，在普通培养基中，如不加血清，绝大部分细胞不能增值。目前，血清培养基中通常添加的比较好的血清是牛血清。血清除了供给细胞的营养成分外，还能促进细胞开始合成DNA，对细胞的增殖有很大的作用。实验证明，血清在细胞的体外培养中提供了细胞增殖所必需的生长因子。但哺乳动物的血清价格昂贵，成本高不适于大规模工业化生产。而且哺乳动物血清作为补加物，存在许多问题，首先血清的来源存在问题，血清来源于特定的地区，因而如果该地区发生灾荒或牛群中流行疾病，都可导致血清失去供应源。血清批量之间的差异大，重复性差，由于血清来源于动物，动物个体或群体的差异及时间上的差异都能导致每个批号的血清不完全一样。
从血清培养所面临的问题，我们不难看出：人们急切地需要找到能够替代血清的物质，从而解决血清培养所面临的这一问题。五十年代起，科学家就开始研究无血清培养基。目前的无血清培养基已进入第三代，第一代无血清培养基虽然不含有血清，但含有大量的动物或植物蛋白，如BSA或激素等，虽然它所含的总体蛋白要低于血清，但蛋白的含量依然很高，八十年代末，九十年代初，研究人员开发出了第二代无血清培养基，它完全不用动物来源的蛋白，如LTI公司生产的CH0～S—SFM I，它采用悬浮的CHO表达蛋白，培养基蛋白含量很低(少于100g/m1)，使重组蛋白的纯化简单，目前市售的无血清培养基主要是这一类。第三代无血清培养基现在已经出现，它完全不含有蛋白或含量极低。培养基不含任何蛋白质，没有任何动物、人类蛋白或多肽，为表达产品的下游处理工作提供极大方便。
随着无血清培养基的发展进步，在未来对细胞的培养将会越来越简化，为生物学研究提供方便，目前无血清培养基的价格比较高，因此降低无血清培养基的成本，开发出低成本的无血清培养基势在必行。
发明内容
发明目的：针对上述问题，本发明的目的之一是提供一种无血清无蛋白培养基，以解决无血清培养基的价格高的技术问题。
技术方案：
一种无血清无蛋白培养基，包括氨基酸、维生素、无机盐、缓冲剂、酚红、右旋糖、丙酮酸钠、碳酸氢钠。
在其中一个实施例中，所述氨基酸为L-丙氨酸、L-精氨酸盐酸盐、L-天冬酰胺、L-谷氨酸、L-天冬氨酸、L-胱氨酸二盐酸、L-谷氨酰胺、L-甘氨酸、L-异亮氨酸、L-组氨酸盐酸盐、L亮氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-络氨酸二钠盐、L-缬氨酸中的至少一种。
在其中一个实施例中，所述维生素为生物素、泛酸钙、氯化胆碱、叶酸、肌醇、烟酰胺、核黄素、盐酸吡哆醛、盐酸硫胺、维生素B12中的至少一种。
在其中一个实施例中，所述无机盐为无水氯化钙、氯化钾、硝酸钾、氯化钠、磷酸二氢钠中的至少一种。
在其中一个实施例中，所述缓冲剂为HEPES。
在其中一个实施例中，所述氨基酸的成分含量为：L-丙氨酸5～40mg/L、L-精氨酸盐酸盐10～100mg/L、L-天冬酰胺10～500mg/L、L-谷氨酸10～100mg/L、L-天冬氨酸10～60mg/L、L-胱氨酸二盐酸50～200mg/L、L-谷氨酰胺100～1000mg/L、L-甘氨酸10～60mg/L、L-异亮氨酸50～200mg/L、L-组氨酸盐酸盐10～80mg/L、L亮氨酸50～200mg/L、L-赖氨酸100～300mg/L、L-蛋氨酸10～100mg/L、L-苯丙氨酸40～100mg/L、L-脯氨酸20～80mg/L、L-丝氨酸10～80mg/L、L-苏氨酸50～300mg/L、L-色氨酸10～40mg/L、L-络氨酸二钠盐50～300mg/L、L-缬氨酸50～400mg/L。
在其中一个实施例中，所述维生素的成分含量为：生物素0.005～0.2mg/L、泛酸钙1～10mg/L、氯化胆碱1～10mg/L、叶酸1～10mg/L、肌醇3～20mg/L、烟酰胺1～10mg/L、核黄素0.1～1mg/L、盐酸吡哆醛1～10mg/L、盐酸硫胺1～10mg/L、维生素B12 0.005～0.025mg/L。
在其中一个实施例中，所述无机盐的成分含量为：无水氯化钙100～500mg/L、氯化钾200～800mg/L、硝酸钾0.01～0.2mg/L、硫酸镁50～300mg/L、氯化钠2000～8000mg/L、磷酸二氢钠100～500mg/L。
在其中一个实施例中，各成分含量分别为：右旋糖1000～10000mg/L、缓冲剂3000～10000mg/L、酚红5～30mg/L、丙酮酸钠80～200mg/L、碳酸氢钠2000～5000mg/L。
有益效果：与现有技术相比，本发明的优点是上述无血清无蛋白培养基，结构稳定，保持稳定的pH值范围，同时酚红能够有效显示培养基的pH值状态；上述培养基完全不含蛋白、血清，生产成本较低，是一种化学成分确定的培养基，有利于产物的分离提纯，提高产物的品质。
具体实施方式
实施例1
一种无血清无蛋白培养基，包括以下各成分：氨基酸的成分含量为：L-丙氨酸40mg/L、L-精氨酸盐酸盐100mg/L、L-天冬酰胺500mg/L、L-谷氨酸100mg/L、L-天冬氨酸60mg/L、L-胱氨酸二盐酸200mg/L、L-谷氨酰胺1000mg/L、L-甘氨酸60mg/L、L-异亮氨酸200mg/L、L-组氨酸盐酸盐80mg/L、L亮氨酸200mg/L、L-赖氨酸300mg/L、L-蛋氨酸100mg/L、L-苯丙氨酸100mg/L、L-脯氨酸80mg/L、L-丝氨酸80mg/L、L-苏氨酸300mg/L、L-色氨酸40mg/L、L-络氨酸二钠盐300mg/L、L-缬氨酸400mg/L、生物素0.2mg/L、泛酸钙10mg/L、氯化胆碱10mg/L、叶酸10mg/L、肌醇20mg/L、烟酰胺10mg/L、核黄素1mg/L、盐酸吡哆醛10mg/L、盐酸硫胺10mg/L、维生素B12 0.025mg/L、无水氯化钙500mg/L、氯化钾800mg/L、硝酸钾0.2mg/L、硫酸镁300mg/L、氯化钠8000mg/L、磷酸二氢钠500mg/L、右旋糖10000mg/L、HEPES 10000mg/L、酚红30mg/L、丙酮酸钠200mg/L、碳酸氢钠5000mg/L，其中，pH值为7.4。
上述无血清无蛋白培养基的制备方法为：按照配方量分别称取上述各成分，后将各成分都溶于超纯水中，过滤除菌即可得到无血清无蛋白培养基。
实施例2
一种无血清无蛋白培养基，包括以下各成分：L-丙氨酸5mg/L、L-精氨酸盐酸盐10mg/L、L-天冬酰胺10mg/L、L-谷氨酸10mg/L、L-天冬氨酸10mg/L、L-胱氨酸二盐酸50mg/L、L-谷氨酰胺100mg/L、L-甘氨酸10mg/L、L-异亮氨酸50mg/L、L-组氨酸盐酸盐10mg/L、L亮氨酸50mg/L、L-赖氨酸100mg/L、L-蛋氨酸10mg/L、L-苯丙氨酸40mg/L、L-脯氨酸20mg/L、L-丝氨酸10mg/L、L-苏氨酸50mg/L、L-色氨酸10mg/L、L-络氨酸二钠盐50mg/L、L-缬氨酸50mg/L、生物素0.005mg/L、泛酸钙1mg/L、氯化胆碱1mg/L、叶酸1mg/L、肌醇3mg/L、烟酰胺1mg/L、核黄素0.1mg/L、盐酸吡哆醛1mg/L、盐酸硫胺1mg/L、维生素B12 0.005mg/L、无水氯化钙100mg/L、氯化钾200mg/L、硝酸钾0.01mg/L、硫酸镁50mg/L、氯化钠2000mg/L、磷酸二氢钠100mg/L、右旋糖1000mg/L、HEPES 3000mg/L、酚红5mg/L、丙酮酸钠80mg/L、碳酸氢钠2000mg/L，其中，pH值为7.4。
上述无血清无蛋白培养基的制备方法为：按照配方量分别称取上述各成分，后将各成分都溶于超纯水中，过滤除菌即可得到无血清无蛋白培养基。
实施例3
一种无血清无蛋白培养基，包括以下各成分：L-丙氨酸20mg/L、L-精氨酸盐酸盐60mg/L、L-天冬酰胺300mg/L、L-谷氨酸50mg/L、L-天冬氨酸30mg/L、L-胱氨酸二盐酸110mg/L、L-谷氨酰胺600mg/L、L-甘氨酸40mg/L、L-异亮氨酸120mg/L、L-组氨酸盐酸盐40mg/L、L亮氨酸130mg/L、L-赖氨酸210mg/L、L-蛋氨酸60mg/L、L-苯丙氨酸70mg/L、L-脯氨酸50mg/L、L-丝氨酸40mg/L、L-苏氨酸170mg/L、L-色氨酸25mg/L、L-络氨酸二钠盐170mg/L、L-缬氨酸220mg/L、生物素0.105mg/L、泛酸钙4mg/L、氯化胆碱6mg/L、叶酸6mg/L、肌醇13mg/L、烟酰胺7mg/L、核黄素0.6mg/L、盐酸吡哆醛6mg/L、盐酸硫胺7mg/L、维生素B12 0.014mg/L、无水氯化/310mg/L、氯化钾520mg/L、硝酸钾0.12mg/L、硫酸镁180mg/L、氯化钠4300mg/L、磷酸二氢钠310mg/L、右旋糖6000mg/L、HEPES 7000mg/L、酚红17mg/L、丙酮酸钠130mg/L、碳酸氢钠3600mg/L，其中，pH值为7.4。
对比例1
对比例1与实施例1的区别点在于：本对比例1中，不添加HEPES成分。
对比例2
对比例2为Sigma公司的DMEM培养基，其中，pH值为7.4。
性能测试
1、将Hela细胞株按照5×104细胞/mL的浓度分别在实施例1～3及对比例1～2的培养基中接种，在37℃、110r/min、二氧化碳浓度为5.0％条件下进行培养，培养8天，细胞生长及pH值变化数据如表1所示。
表1实施例1～3及对比例1～2的培养基中Hela细胞的细胞数及pH值变化数据
由表1可知，本发明的无血清无蛋白培养基，能够使Hela细胞得到稳步增长，且pH值变化不大，虽然对比例2中Hela细胞也得到了增长，但是pH值有一定降低，影响Hela细胞的存活量，对比例1中，由于Hela细胞大量生长，释放大量二氧化碳，导致pH值下降，Hela细胞在酸性条件下较难生存，因此，对比例1在8天后得到的Hela细胞数明显低于实施例1的细胞数。
2、将Hela细胞株按照6×104细胞/mL的浓度分别在实施例1～3及对比例1～2的培养基中接种，在37℃、110r/min、二氧化碳浓度为5.0％条件下进行培养，培养14天，细胞生长及pH值变化数据如表2所示。
表2实施例1～3及对比例1～2的培养基中Hela细胞的细胞数及pH值变化数据
由表1可知，本发明的无血清无蛋白培养基，能够使Hela细胞得到稳步增长，且pH值变化不大，虽然对比例2中Hela细胞也得到了增长，但是pH值有一定降低，影响Hela细胞的存活量，对比例1中，由于Hela细胞大量生长，释放大量二氧化碳，导致pH值下降，Hela细胞在酸性条件下较难生存，因此，对比例1在14天后得到的Hela细胞数明显低于实施例1的细胞数，说明本发明的无血清无蛋白培养基能够有效稳定pH值，对细胞的增长起到促进作用。

Claims (9)

1.一种无血清无蛋白培养基，其特征在于，包括氨基酸、维生素、无机盐、缓冲剂、酚红、右旋糖、丙酮酸钠、碳酸氢钠。
2.根据权利要求1所述的一种无血清无蛋白培养基，其特征在于，所述氨基酸为L-丙氨酸、L-精氨酸盐酸盐、L-天冬酰胺、L-谷氨酸、L-天冬氨酸、L-胱氨酸二盐酸、L-谷氨酰胺、L-甘氨酸、L-异亮氨酸、L-组氨酸盐酸盐、L亮氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-络氨酸二钠盐、L-缬氨酸中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的一种无血清无蛋白培养基，其特征在于，所述维生素为生物素、泛酸钙、氯化胆碱、叶酸、肌醇、烟酰胺、核黄素、盐酸吡哆醛、盐酸硫胺、维生素B12中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的一种无血清无蛋白培养基，其特征在于，所述无机盐为无水氯化钙、氯化钾、硝酸钾、氯化钠、磷酸二氢钠中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的一种无血清无蛋白培养基，其特征在于，所述缓冲剂为HEPES。
6.根据权利要求1所述的一种无血清无蛋白培养基，其特征在于，所述氨基酸的成分含量为：L-丙氨酸5～40mg/L、L-精氨酸盐酸盐10～100mg/L、L-天冬酰胺10～500mg/L、L-谷氨酸10～100mg/L、L-天冬氨酸10～60mg/L、L-胱氨酸二盐酸50～200mg/L、L-谷氨酰胺100～1000mg/L、L-甘氨酸10～60mg/L、L-异亮氨酸50～200mg/L、L-组氨酸盐酸盐10～80mg/L、L亮氨酸50～200mg/L、L-赖氨酸100～300mg/L、L-蛋氨酸10～100mg/L、L-苯丙氨酸40～100mg/L、L-脯氨酸20～80mg/L、L-丝氨酸10～80mg/L、L-苏氨酸50～300mg/L、L-色氨酸10～40mg/L、L-络氨酸二钠盐50～300mg/L、L-缬氨酸50～400mg/L。
7.根据权利要求1所述的一种无血清无蛋白培养基，其特征在于，所述维生素的成分含量为：生物素0.005～0.2mg/L、泛酸钙1～10mg/L、氯化胆碱1～10mg/L、叶酸1～10mg/L、肌醇3～20mg/L、烟酰胺1～10mg/L、核黄素0.1～1mg/L、盐酸吡哆醛1～10mg/L、盐酸硫胺1～10mg/L、维生素B12 0.005～0.025mg/L。
8.根据权利要求1所述的一种无血清无蛋白培养基，其特征在于，所述无机盐的成分含量为：无水氯化钙100～500mg/L、氯化钾200～800mg/L、硝酸钾0.01～0.2mg/L、硫酸镁50～300mg/L、氯化钠2000～8000mg/L、磷酸二氢钠100～500mg/L。
9.根据权利要求1所述的一种无血清无蛋白培养基，其特征在于，各成分含量分别为：右旋糖1000～10000mg/L、缓冲剂3000～10000mg/L、酚红5～30mg/L、丙酮酸钠80～200mg/L、碳酸氢钠2000～5000mg/L。
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