CN110592000A - 一种支持bhk细胞高密度悬浮培养的无血清培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种支持BHK细胞高密度悬浮培养的无血清培养基,涉及生物培养领域,包括氨基酸、维生素、无机盐、蛋白水解物、脂类和添加物,本发明所提供的培养基化学成分明确,安全性高,污染风险小,能适用于多种不同BHK细胞株生长,细胞培养效果好,有利于下游分离和纯化,培养基中不包含有蛋白、水解产物或未知结构的组分,所有的成分均为已知的化学结构,能够支持细胞生长和稳定传代的无血清培养基,可适用于工业规模生产。

Description

一种支持BHK细胞高密度悬浮培养的无血清培养基
技术领域
本发明属于生物培养领域,具体涉及一种支持BHK细胞高密度悬浮培养的无血清培养基。
背景技术
细胞培养技术是通过模拟细胞体内生长环境实现细胞体外培养。培养基为细胞体外培养提供营养并促进细胞生长和增殖。根据来源及成分的明确程度,细胞培养基分为天然培养基、合成培养基和无血清培养基三个阶段。
中国幼仓鼠肾细胞(Baby Hamster Kidney Cell),是目前生产口蹄疫疫苗的最主要工程细胞,在细胞培养过程中,培养基主要采用添加一定浓度的血清的常规培养基。血清的主要作用在于向细胞提供激素(生化因子)、转移蛋白和其它营养物质等,能提高细胞活力以及重组蛋白质的产量,但在过去近20年中,逐渐发现含有血清的培养基所获得的基因重组蛋白质,会存在外源因子污染的风险。血清是未表征的物质的混合物,其可能随批次而变化。且来自动物或人来源的血清或其他补充物还有外源因子污染的风险,例如支原体、朊病毒和病毒污染。
因此急需提供一种化学成分明确,污染风险小,细胞培养效果好,适用于工业规模生产的支持BHK细胞高密度悬浮培养的无血清培养基。
发明内容
本发明的目的是针对现有支持BHK细胞的无血清培养基的不足,提供一种支持BHK细胞高密度悬浮培养的无血清培养基。
本发明提供了如下的技术方案:
一种支持BHK细胞高密度悬浮培养的无血清培养基,包括氨基酸、维生素、无机盐、蛋白水解物、脂类和添加物;
a.氨基酸包括:
甘氨酸50-90mg/L、
M-丙氨酸5-30mg/L、
L-精氨酸盐盐酸200-300mg/L、
L-天冬酰胺100-150mg/L、
L-天冬氨酸300-400mg/L、
L-半胱氨酸盐酸盐10-50mg/L、
L-谷氨酸50-150mg/L、
L-组氨酸盐酸盐50-150mg/L、
L-异亮氨酸125-225mg/L、
L-亮氨酸50-450mg/L、
L-赖氨酸盐酸盐55-280mg/L、
L-蛋氨酸45-375mg/L、
L-苯丙氨酸30-160mg/L、
L-脯氨酸50-90mg/L、
L-丝氨酸220-330mg/L、
L-苏氨酸120-350mg/L、
L-色氨酸110-230mg/L、
L-酪氨酸二钠250-450mg/L、
L-缬氨酸250-460mg/L、
L-胱氨酸100-300mg/L、
L-羟脯氨酸2.4-3.5mg/L;
b.维生素包括:
氯化胆碱130-250mg/L、
D-泛酸钙6-9mg/L、
叶酸1.7-3.5mg/L、
烟酰胺3.8-4.0mg/L、
盐酸吡哆醇6.5-9.5mg/L、
核黄酸0.5-2.3mg/L、
硫胺素盐酸盐3.8-5.6mg/L、
维生素B12 1-10mg/L、
肌醇10-100mg/L、
硫酸锌5-10mg/L、
生物素0.003-0.03mg/L、
视黄醇0.005-0.5mg/L、
对氨基苯甲酸0.008-0.15mg/L;
c.无机盐包括:
二水氯化钙100-200mg/L、
碳酸氢钠1000-4000mg/L、
七水硫酸镁50-150mg/L、
氯化钾500-950mg/L、
氯化钠2500-5000mg/L、
七水合磷酸氢二钠100-300mg/L;
d.蛋白水解物包括:
酵母超滤物500-4000mg/L、
棉籽水解物500-4000mg/L、
大米水解物500-2000mg/L、
大豆蛋白水解物500-4000mg/L
麦麸水解物500-4000mg/L;
e.脂类包括:
亚油酸0.1-0.3mg/L、
大豆卵磷脂15-20mg/L、
胆固醇6-15mg/L、
腐胺0.4-0.8mg/L、
乙醇胺5-30mg/L;
f.添加物包括:
柠檬酸铁0.02-1mg/L、
维生素E 6-15mg/L、
还原型谷胱甘肽0.01-0.9mg/L、
亚硒酸钠0.1-8mg/L、
硫酸锌0.05-0.6mg/L、
重组人胰岛素3-15mg/L、
次黄嘌呤钠盐0.1-5mg/L、
普朗尼克68500-1000mg/L、
胸腺嘧啶0.1-0.9mg/L。
优选的,将原料物质根据权利要求1中的量和其各自溶解特性分类,加入水溶解后进行混合,调节pH值至7.0-7.4,渗透压至300-350mOsm/kg。
优选的,使用工业滤芯对权利要求2中的混合液体进行过滤,在氮气保护的条件下进行分装。
本发明的有益效果是:
本发明所提供的培养基化学成分明确,安全性高,污染风险小,能适用于多种不同BHK细胞株生长,细胞培养效果好,有利于下游分离和纯化。培养基中不包含有蛋白、水解产物或未知结构的组分,所有的成分均为已知的化学结构。是在商业化出售的培养基DMEM/F12基础上进行开发,能够支持细胞生长和稳定传代的无血清培养基,可适用于工业规模生产。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解,并且构成说明书的一部分,与本发明的实施例一起用于解释本发明,并不构成对本发明的限制。在附图中:
图1是BHK细胞从市售的培养基中转入实施例3制成的培养基中连续传代培养的细胞密度;
图2是在显微镜下观察的BHK细胞在实施例3制成的培养基中的生长图;
图3是BHK细胞在实施例3制成的培养基中批次培养的生长曲线及对应细胞活率;
图4是BHK细胞在实施例3制成的培养基中批次培养收集抗体表达量。
具体实施方式
实施例1
一种支持BHK细胞高密度悬浮培养的无血清培养基,包括氨基酸、维生素、无机盐、蛋白水解物、脂类和添加物;
各原料的浓度为:
氨基酸
甘氨酸50mg/L
L-丙氨酸5mg/L
L-精氨酸盐盐酸200mg/L
L-天冬酰胺100mg/L
L-天冬氨酸300mg/L
L-半胱氨酸盐酸盐10mg/L
L-谷氨酸50mg/L
L-组氨酸盐酸盐50mg/L
L-异亮氨酸125mg/L
L-亮氨酸50mg/L
L-赖氨酸盐酸盐55mg/L
L-蛋氨酸45mg/L
L-苯丙氨酸30mg/L
L-脯氨酸50mg/L
L-丝氨酸220mg/L
L-苏氨酸120mg/L
L-色氨酸110mg/L
L-酪氨酸二钠250mg/L
L-缬氨酸250mg/L
L-胱氨酸100mg/L
L-羟脯氨酸2.4mg/L
维生素
氯化胆碱130mg/L
D-泛酸钙6mg/L
叶酸1.7mg/L
烟酰胺3.8mg/L
盐酸吡哆醇6.5mg/L
核黄酸0.5mg/L
硫胺素盐酸盐3.8mg/L
维生素B12 1mg/L
肌醇10mg/L
硫酸锌5mg/L
生物素0.003mg/L
视黄醇0.005mg/L
对氨基苯甲酸0.0085mg/L
无机盐
二水氯化钙100mg/L
碳酸氢钠1000mg/L
七水硫酸镁100mg/L
氯化钾500mg/L
氯化钠2500mg/L
七水合磷酸氢二钠100mg/L
蛋白水解物
酵母超滤物500mg/L
棉籽水解物500mg/L
大米水解物500mg/L
大豆蛋白水解物500mg/L
麦麸水解物500mg/L
脂类
亚油酸0.1mg/L
大豆卵磷脂15mg/L
胆固醇6mg/L
腐胺0.4mg/L
乙醇胺5mg/L
添加物
柠檬酸铁0.2mg/L
维生素E 6mg/L
还原型谷胱甘肽0.01mg/L
亚硒酸钠0.1mg/L
硫酸锌0.05mg/L
重组人胰岛素3mg/L
次黄嘌呤钠盐0.1mg/L
普朗尼克68500mg/L
胸腺嘧啶0.1mg/L
将原料物质根据权利要求1中的量和其各自溶解特性分类,加入水溶解后进行混合,调节pH值至7.0,渗透压至300mOsm/kg。使用工业滤芯对混合溶液进行过滤,在氮气保护的条件下进行分装。
实施例2
一种支持BHK细胞高密度悬浮培养的无血清培养基,包括氨基酸、维生素、无机盐、蛋白水解物、脂类和添加物;
各原料的浓度为:
氨基酸
甘氨酸70mg/L
L-丙氨酸17.5mg/L
L-精氨酸盐盐酸250mg/L
L-天冬酰胺125mg/L
L-天冬氨酸350mg/L
L-半胱氨酸盐酸盐30mg/L
L-谷氨酸100mg/L
L-组氨酸盐酸盐100mg/L
L-异亮氨酸175mg/L
L-亮氨酸250mg/L
L-赖氨酸盐酸盐167.5mg/L
L-蛋氨酸210mg/L
L-苯丙氨酸95mg/L
L-脯氨酸70mg/L
L-丝氨酸275mg/L
L-苏氨酸235mg/L
L-色氨酸170mg/L
L-酪氨酸二钠350mg/L
L-缬氨酸355mg/L
L-胱氨酸200mg/L
L-羟脯氨酸2.95mg/L
维生素
氯化胆碱190mg/L
D-泛酸钙7.5mg/L
叶酸2.6mg/L
烟酰胺3.9mg/L
盐酸吡哆醇8mg/L
核黄酸1.4mg/L
硫胺素盐酸盐4.7mg/L
维生素B12 5.5mg/L
肌醇55mg/L
硫酸锌7.5mg/L
生物素0.0165mg/L
视黄醇0.0275mg/L
对氨基苯甲酸0.079mg/L
无机盐
二水氯化钙150mg/L
碳酸氢钠2500mg/L
七水硫酸镁200mg/L
氯化钾725mg/L
氯化钠3750mg/L
七水合磷酸氢二钠200mg/L
蛋白水解物
酵母超滤物2250mg/L
棉籽水解物450mg/L
大米水解物1250mg/L
大豆蛋白水解物2250mg/L
麦麸水解物2250mg/L
脂类
亚油酸0.2mg/L
大豆卵磷脂17.5mg/L
胆固醇10.5mg/L
腐胺0.6mg/L
乙醇胺17.5mg/L
添加物
柠檬酸铁0.6mg/L
维生素E 10.5mg/L
还原型谷胱甘肽0.455mg/L
亚硒酸钠4.05mg/L
硫酸锌0.325mg/L
重组人胰岛素9mg/L
次黄嘌呤钠盐2.55mg/L
普朗尼克68750mg/L
胸腺嘧啶0.5mg/L
将原料物质根据权利要求1中的量和其各自溶解特性分类,加入水溶解后进行混合,调节pH值至7.2,渗透压至330mOsm/kg。使用工业滤芯对混合溶液进行过滤,在氮气保护的条件下进行分装。
实施例3
一种支持BHK细胞高密度悬浮培养的无血清培养基,包括氨基酸、维生素、无机盐、蛋白水解物、脂类和添加物;
各原料的浓度为:
氨基酸
甘氨酸90mg/L
L-丙氨酸30mg/L
L-精氨酸盐盐酸300mg/L
L-天冬酰胺150mg/L
L-天冬氨酸400mg/L
L-半胱氨酸盐酸盐50mg/L
L-谷氨酸150mg/L
L-组氨酸盐酸盐150mg/L
L-异亮氨酸225mg/L
L-亮氨酸450mg/L
L-赖氨酸盐酸盐280mg/L
L-蛋氨酸375mg/L
L-苯丙氨酸160mg/L
L-脯氨酸90mg/L
L-丝氨酸330mg/L
L-苏氨酸350mg/L
L-色氨酸230mg/L
L-酪氨酸二钠450mg/L
L-缬氨酸460mg/L
L-胱氨酸300mg/L
L-羟脯氨酸3.5mg/L
维生素
氯化胆碱250mg/L
D-泛酸钙9mg/L
叶酸3.5mg/L
烟酰胺4.0mg/L
盐酸吡哆醇9.5mg/L
核黄酸2.3mg/L
硫胺素盐酸盐5.6mg/L
维生素B12 10mg/L
肌醇100mg/L
硫酸锌10mg/L
生物素0.03mg/L
视黄醇0.05mg/L
对氨基苯甲酸0.15mg/L
无机盐
二水氯化钙200mg/L
碳酸氢钠4000mg/L
七水硫酸镁300mg/L
氯化钾950mg/L
氯化钠5000mg/L
七水合磷酸氢二钠300mg/L
蛋白水解物
酵母超滤物4000mg/L
棉籽水解物400mg/L
大米水解物2000mg/L
大豆蛋白水解物4000mg/L
麦麸水解物4000mg/L
脂类
亚油酸0.3mg/L
大豆卵磷脂20mg/L
胆固醇15mg/L
腐胺0.8mg/L
乙醇胺30mg/L
添加物
柠檬酸铁1mg/L
维生素E 15mg/L
还原型谷胱甘肽0.9mg/L
亚硒酸钠8mg/L
硫酸锌0.6mg/L
重组人胰岛素15mg/L
次黄嘌呤钠盐5mg/L
普朗尼克681000mg/L
胸腺嘧啶0.9mg/L
将原料物质根据权利要求1中的量和其各自溶解特性分类,加入水溶解后进行混合,调节pH值至7.5,渗透压至350mOsm/kg。使用工业滤芯对混合溶液进行过滤,在氮气保护的条件下进行分装。
实验例
具体方法为将在市售培养基中稳定培养的BHK细胞以0.5e6cells/ml的密度接种至实施例3制成的成品培养基中。在125mL摇瓶中进行培养,接种体积为30mL。培养条件为5%CO2,温度为37℃,摇床转速110r/min。接种后每天连续取样进行细胞计数,同时采取台盼蓝染色法计算细胞的活率。
如图1至图4所示,悬浮BHK细胞在该无血清培养基中生长状态较好,细胞单个分散悬浮,无明显细胞结团。细胞活力高,批次培养,在平台期之前活率都能维持在95%以上,且连续培养表现稳定。
因此,在此培养基中,细胞表达外源蛋白能力也明显增强。批次培养,每升培养物中可收获蛋白产物达500mg/L。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,对于本领域的技术人员来说,其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种支持BHK细胞高密度悬浮培养的无血清培养基,其特征在于,包括氨基酸、维生素、无机盐、蛋白水解物、脂类和添加物;
a.氨基酸包括:
甘氨酸50-90mg/L、
L-丙氨酸5-30mg/L、
L-精氨酸盐盐酸200-300mg/L、
L-天冬酰胺100-150mg/L、
L-天冬氨酸300-400mg/L、
L-半胱氨酸盐酸盐10-50mg/L、
L-谷氨酸50-150mg/L、
L-组氨酸盐酸盐50-150mg/L、
L-异亮氨酸125-225mg/L、
L-亮氨酸50-450mg/L、
L-赖氨酸盐酸盐55-280mg/L、
L-蛋氨酸45-375mg/L、
L-苯丙氨酸30-160mg/L、
L-脯氨酸50-90mg/L、
L-丝氨酸220-330mg/L、
L-苏氨酸120-350mg/L、
L-色氨酸110-230mg/L、
L-酪氨酸二钠250-450mg/L、
L-缬氨酸250-460mg/L、
L-胱氨酸100-300mg/L、
L-羟脯氨酸2.4-3.5mg/L;
b.维生素包括:
氯化胆碱130-250mg/L、
D-泛酸钙6-9mg/L、
叶酸1.7-3.5mg/L、
烟酰胺3.8-4.0mg/L、
盐酸吡哆醇6.5-9.5mg/L、
核黄酸0.5-2.3mg/L、
硫胺素盐酸盐3.8-5.6mg/L、
维生素B121-10mg/L、
肌醇10-100mg/L、
硫酸锌5-10mg/L、
生物素0.003-0.03mg/L、
视黄醇0.005-0.5mg/L、
对氨基苯甲酸0.008-0.15mg/L;
c.无机盐包括:
二水氯化钙100-200mg/L、
碳酸氢钠1000-4000mg/L、
七水硫酸镁50-150mg/L、
氯化钾500-950mg/L、
氯化钠2500-5000mg/L、
七水合磷酸氢二钠100-300mg/L;
d.蛋白水解物包括:
酵母超滤物500-4000mg/L、
棉籽水解物500-4000mg/L、
大米水解物500-2000mg/L、
大豆蛋白水解物500-4000mg/L、
麦麸水解物500-4000mg/L;
e.脂类包括:
亚油酸0.1-0.3mg/L、
大豆卵磷脂15-20mg/L、
胆固醇6-15mg/L、
腐胺0.4-0.8mg/L、
乙醇胺5-30mg/L;
f.添加物包括:
柠檬酸铁0.02-1mg/L、
维生素E6-15mg/L、
还原型谷胱甘肽0.01-0.9mg/L、
亚硒酸钠0.1-8mg/L、
硫酸锌0.05-0.6mg/L、
重组人胰岛素3-15mg/L、
次黄嘌呤钠盐0.1-5mg/L、
普朗尼克68500-1000mg/L、
胸腺嘧啶0.1-0.9mg/L。
2.根据权利要求1所述的一种支持BHK细胞高密度悬浮培养的无血清培养基,其特征在于,将原料物质根据权利要求1中的量和其各自溶解特性分类,加入水溶解后进行混合,调节pH值至7.0-7.4,渗透压至300-350mOsm/kg。
3.根据权利要求2所述的一种支持BHK细胞高密度悬浮培养的无血清培养基,其特征在于,使用工业滤芯对权利要求2中的混合液体进行过滤,在氮气保护的条件下进行分装。
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