CN113817666A - 一种全悬浮培养bhk-21细胞的cd培养基及其摇瓶培养工艺 - Google Patents

一种全悬浮培养bhk-21细胞的cd培养基及其摇瓶培养工艺 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种全悬浮培养BHK‑21细胞的CD培养基及其摇瓶培养工艺，包括下列步骤：1)按配比称量培养基中各组成分；2)将称量好的氨基酸组；维生素组；无机盐与微量元素组；脂类、糖类与缓冲剂组溶解；3)将溶解好的各组成分混合，用0.2μm的滤膜过滤，获得悬浮培养BHK‑21细胞的CD培养基；本发明所述悬浮培养BHK‑21细胞的CD培养基具有成本低廉、安全性高、污染风险小、批间差小且稳定好的特点，并且具有制作快速、高效、低成本的优异效果。

Description

一种全悬浮培养BHK-21细胞的CD培养基及其摇瓶培养工艺
技术领域
本发明涉及细胞培养生物技术领域，尤其涉及一种全悬浮培养BHK-21细胞的CD培养基及其摇瓶培养工艺。
背景技术
BHK-21是幼地鼠肾脏细胞，可用于多种疫苗的大规模生产，如口蹄疫疫苗和狂犬疫苗，同时日本乙型脑炎病毒、寨卡病毒以及特定的流感病毒株如A/WSN/33[H1N1](WSN)等也可在该细胞中增殖。因此该细胞在兽用疫苗中占据主要位置，市场份额巨大，前景广阔。
目前，国内生物疫苗生产企业培养BHK-21细胞生产口蹄疫疫苗时，会遇到细胞密度低，病毒产率低，生产成本高，培养和接毒过程中需要更换培养基等问题。
传统BHK-21细胞培养基中往往需要添加血清，血清作为细胞生长和维持的重要物质，在细胞培养过程中发挥重要作用的同时，也带来许多问题和弊端，例如血清的成分复杂，不能完全去除；血清批次间差异大，保质期短，不利于大规模连续生产；血清还可能携带动物源性的其他微生物，如病毒、支原体、衣原体等，影响生产的安全性；血清中还含有大量动物蛋白，影响下游的分离和纯化，增加人力和成本。虽然目前市面上已经开始有BHK-21细胞培养基生产出来，但是大多培养基还是添加有动物蛋白胰岛素、转铁蛋白和白蛋白等影响批间效果的物质，同样不利于大规模低成本化生产。无血清无蛋白化学成分限定的培养基是该工艺的实现产业化的技术难点，采用成分明确、细胞能高密度生长，而且还有较高的病毒表达量，将起到事半功倍的效果。现有技术中，国外细胞无血清培养基配方保密且价格高，同时市场上已有培养基(国内、国外)成分均不明确。
综合以上，目前国内亟需一种支持BHK-21细胞快速高密生长的、价格廉价的、化学成分限定的CD培养基及开发过程中涉及的培养工艺。
发明内容
本发明的提供一种全悬浮培养BHK-21细胞的CD培养基及其摇瓶培养工艺。
本发明的方案是：
一种全悬浮培养BHK-21细胞的CD培养基，包括下列原料组成，氨基酸组；维生素组；无机盐与微量元素组；脂类、糖类与缓冲剂组，其中，
氨基酸组
Figure BDA0003301057970000021
维生素组
Figure BDA0003301057970000022
无机盐与微量元素组
Figure BDA0003301057970000023
Figure BDA0003301057970000031
脂类、水解物与添加物组
Figure BDA0003301057970000032
本发明还公开了一种所述的全悬浮培养BHK-21细胞的CD培养基在无血清动物细胞培养中摇瓶培养工艺。
作为优选的技术方案，所述血清动物细胞为悬浮的幼仓鼠肾脏细胞。
作为优选的技术方案，所述全悬浮培养BHK-21细胞的CD培养基在悬浮的幼仓鼠肾脏细胞培养中使用多宁生物的125毫升的摇瓶培养。
本发明还公开了一种全悬浮培养BHK-21细胞的CD培养基在悬浮BHK-21细胞培养中使用125毫升摇瓶培养的培养工艺。
该BHK-21细胞在CD培养基中的摇瓶培养过程中的细胞接种密度、细胞传代代次、培养的二氧化碳浓度、培养温度对BHK-21细胞生长影响做了监测和统计，优选出适合的摇瓶培养工艺；
作为优选的技术方案，包括低密和高密两种接种密度接种，其中低密的接种密度为3E5，高密的接种密度为10E5；选择经过不同代次的BHK21细胞，F10和F40，F10为复苏后经过10次传代的BHK21细胞，F40为复苏后经过40次传代的BHK21细胞；
作为优选的技术方案，包括5％CO2和8％CO2两种不同含量的二氧化碳浓度进行摇瓶培养测试BHK21细胞生长；
作为优选的技术方案，包括32.5℃和36.5℃两种不同温度进行摇瓶培养测试BHK21细胞生长。
由于采用了上述技术方案，获得了全悬浮培养BHK-21细胞的CD培养基及其配套的摇瓶培养工艺。
本发明的有益效果在于：
本发明所述悬浮培养BHK-21细胞的CD培养基，具有成本低廉、安全性高、污染风险小、批间差小且稳定好的特点，并且具有制备快速、高效、低成本的效果；该培养基能适用于多种不同无血清培养基培养的BHK-21细胞株，培养效果好，支持1E5～1E6区间的各种接种密度，1E6接种48小时内细胞密度超过1E7，细胞活率始终维持在99％以上，可同时做为口蹄疫病毒、新城疫病毒的直接接毒培养基，整个培养过程中无需更换培养基，培养基成分明确，有利于下游的分离和纯化。能够支持BHK21细胞生长、稳定传代和接毒的一体化培养基，完全满足了高密悬浮培养规模化工业生产的需求。
本发明还阐明了针对此款CD培养基还具有对应的摇瓶生产工艺，就细胞的接种密度、细胞的不同培养代次、培养时的二氧化碳浓度、培养温度进行了对比，确定了最适合此培养基的最适摇瓶培养工艺。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是悬浮的BHK21细胞在不同的市售培养基和本发明中的CD培养基中的生长对比图。
图2是BHK21细胞在CD培养基中不同密度接种的生长情况图，其中虚线为低密(3E5)接种的生长曲线和细胞活率，实线为高密(1E6)接种的生长曲线和细胞活率；浅色为CD培养基，深色为市售产品3。
图3是体外培养第10代(F10)和第40代(F40)在CD培养基中的生长曲线图。
图4是36.5℃时体外培养第10代(F10)的BHK21细胞在CD培养基中分别在5％CO2和8％CO2培养下的生长曲线图。
图5是8％CO2时体外培养第10代(F10)的BHK21细胞在CD培养基中分别在32.5℃和36.5℃培养下的生长曲线图。
具体实施方式
为了弥补以上不足，本发明提供了一种全悬浮培养BHK-21细胞的CD培养基及其摇瓶培养工艺，以解决上述背景技术中的问题。
一种悬浮培养BHK-21细胞的CD培养基，包括下列原料组成，氨基酸组；维生素组；无机盐与微量元素组；脂类、糖类与缓冲剂组，其中，
氨基酸组
Figure BDA0003301057970000051
维生素组
Figure BDA0003301057970000052
无机盐与微量元素组
Figure BDA0003301057970000053
脂类、水解物与添加物组
Figure BDA0003301057970000054
Figure BDA0003301057970000061
为了更好的阐述该CD培养基及其摇瓶培养工艺，以下分不同的实施例说明情况。
实施例1
各物料浓度如下：
氨基酸
Figure BDA0003301057970000062
维生素
成份 含量范围mg/L 成份 含量范围mg/L
α-硫辛酸 2 烟酰胺 3
氰钴胺素 1.1 硫胺盐酸盐 3.2
生物素 2.2 核黄素 0.35
叶酸 4 对氨基苯甲酸 1.2
维生素C 18 吡哆醇 4
泛酸钙 3 氯化胆碱 66
肌醇 85
无机盐和微量元素
Figure BDA0003301057970000063
Figure BDA0003301057970000071
脂类，糖类，缓冲剂
成份 含量范围mg/L 成份 含量范围mg/L
亚油酸 0.08 P188 1800
丙酮酸钠 160 HEPES 1500
葡萄糖 6000
1)按配比称量培养基中各组成分；
2)将称量好的氨基酸组；维生素组；无机盐与微量元素组；脂类、糖类与缓冲剂组溶解；其中所述维生素组的成分中α-硫辛酸、叶酸、核黄素与生物素使用0.4mol/L的NaOH溶解；所述无机盐与微量元素组的成分中偏钒酸钠使用6mol/L HCl溶解；脂类、糖类与缓冲剂组的成分中亚油酸通过无水乙醇溶解；其他各组的成分使用超纯水溶解；
3)将溶解好的各组成分混合，调节pH在7.0～7.4；加水定容，随后利用氯化钠调节渗透压在280～350mOsm/kg；用0.22μm的滤膜过滤，获得悬浮培养BHK-21细胞的CD培养基，使用新复苏的F3-F10的BHK21细胞，以3E5的接种密度，30ml的体系培养于上海多宁的125ml摇瓶中，再放入上海多宁的DNSI0101摇床中培养，摇床设定参数为：8％CO2、36.5℃和110rmp，整个培养过程无需补糖补料，只在接种后的第三天开始每天取样记录活细胞密度即可。
如图1所示，此CD培养基与市售产品1(苏州天信和BHK21培养基)、市售产品2(甘肃建顺BHK21培养基)和市售产品3(源培生物BHK21培养基)在细胞的batch生长上对比发现，CD培养基均表现出显著的优势。
实施例2
氨基酸
Figure BDA0003301057970000072
Figure BDA0003301057970000081
维生素
成份 含量范围mg/L 成份 含量范围mg/L
α-硫辛酸 2 烟酰胺 3
氰钴胺素 1.1 硫胺盐酸盐 3.2
生物素 2.2 核黄素 0.35
叶酸 4 对氨基苯甲酸 1.2
维生素C 18.5 吡哆醇 4
泛酸钙 3 氯化胆碱 68
肌醇 85
无机盐和微量元素
成份 含量范围mg/L 成份 含量范围mg/L
氯化钾 720 硫酸亚铁 0.55
碳酸氢钠 2100 硅酸钠 0.45
氯化钙 55 氯化锰 0.01
磷酸氢二钠 700 偏钒酸钠 0.0035
氯化亚锡 0.05 钼酸钠 0.005
硫酸锌 2.7 亚硒酸钠 0.004
硫酸镁 75 硫酸铜 0.1
氯化锂 0.05 二氧化锗 0.01
脂类，糖类，缓冲剂
成份 含量范围mg/L 成份 含量范围mg/L
亚油酸 0.08 P188 1800
丙酮酸钠 163 HEPES 1480
葡萄糖 6000
1)按配比称量培养基中各组成分；
2)将称量好的氨基酸组；维生素组；无机盐与微量元素组；脂类、糖类与缓冲剂组溶解；其中所述维生素组的成分中α-硫辛酸、叶酸、核黄素与生物素使用0.4mol/L的NaOH溶解；所述无机盐与微量元素组的成分中偏钒酸钠使用6mol/L HCl溶解；脂类、糖类与缓冲剂组的成分中亚油酸通过无水乙醇溶解；其他各组的成分使用超纯水溶解；
3)将溶解好的各组成分混合，调节pH在7.0～7.4；加水定容，随后利用氯化钠调节渗透压在280～350mOsm/kg；用0.22μm的滤膜过滤，获得悬浮培养BHK-21细胞的CD培养基，然后使用新复苏的F3-F10的BHK21细胞，在3E5和10E5两种接种密度下，30ml的体系培养于上海多宁的125ml摇瓶中，再放入上海多宁的DNSI0101摇床中培养，摇床设定参数为：8％CO2、36.5℃和110rmp，整个培养过程无需补糖补料，只在接种后的第三天开始每天取样记录活细胞密度即可。
如图2所示，此CD培养基在低密和高密接种条件下均能很好适应细胞，最高活细胞密度一致，值得注意也与我们的假设一致，高密接种的细胞生长的最大活细胞密度所需的时间大大缩短。CD培养基对比市售产品3(源培生物BHK21培养基)，无论低密接种还是高密接种，市售产品均不及CD培养基，由此显示CD培养基具有非常稳定的特征。
实施例3
氨基酸
Figure BDA0003301057970000091
维生素
成份 含量范围mg/L 成份 含量范围mg/L
α-硫辛酸 2 烟酰胺 3
氰钴胺素 1.1 硫胺盐酸盐 3.2
生物素 2.2 核黄素 0.35
叶酸 4 对氨基苯甲酸 1.2
维生素C 18.5 吡哆醇 4
泛酸钙 3 氯化胆碱 66
肌醇 85
无机盐和微量元素
成份 含量范围mg/L 成份 含量范围mg/L
氯化钾 720 硫酸亚铁 0.52
碳酸氢钠 2100 硅酸钠 0.45
氯化钙 55 氯化锰 0.01
磷酸氢二钠 700 偏钒酸钠 0.0035
氯化亚锡 0.05 钼酸钠 0.005
硫酸锌 2.7 亚硒酸钠 0.004
硫酸镁 75 硫酸铜 0.1
氯化锂 0.05 二氧化锗 0.01
脂类，糖类，缓冲剂
成份 含量范围mg/L 成份 含量范围mg/L
亚油酸 0.08 P188 1800
丙酮酸钠 160 HEPES 1500
葡萄糖 6000
1)按配比称量培养基中各组成分；
2)将称量好的氨基酸组；维生素组；无机盐与微量元素组；脂类、糖类与缓冲剂组溶解；其中所述维生素组的成分中α-硫辛酸、叶酸、核黄素与生物素使用0.4mol/L的NaOH溶解；所述无机盐与微量元素组的成分中偏钒酸钠使用6mol/L HCl溶解；脂类、糖类与缓冲剂组的成分中亚油酸通过无水乙醇溶解；其他各组的成分使用超纯水溶解；
3)将溶解好的各组成分混合，调节pH在7.0～7.4；加水定容，随后利用氯化钠调节渗透压在280～350mOsm/kg；用0.22μm的滤膜过滤，获得悬浮培养BHK-21细胞的CD培养基，使用F10和F40代BHK21细胞在30ml的体系培养于上海多宁的125ml摇瓶中，再放入上海多宁的DNSI0101摇床中培养，摇床设定如下：
条件1：8％CO2、36.5℃和110rmp
条件2：5％CO2、36.5℃和110rmp
条件3：8％CO2、32.5℃和110rmp
上述条件下进行batch培养，整个培养过程无需补糖补料，只在接种后的第三天开始每天取样记录活细胞密度即可。
如图3-图5所示，此CD培养基最适合的摇瓶培养工艺是条件1：8％CO2、36.5℃和110rmp。
以上结果显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (6)

1.一种全悬浮培养BHK-21细胞的CD培养基，其特征在于，包括下列原料组成，氨基酸组；维生素组；无机盐与微量元素组；脂类、糖类与缓冲剂组，其中，
氨基酸组
Figure FDA0003301057960000011
维生素组
Figure FDA0003301057960000012
无机盐与微量元素组
Figure FDA0003301057960000013
Figure FDA0003301057960000021
脂类、水解物与添加物组
Figure FDA0003301057960000022
2.一种制备如权利要求1中所述的全悬浮培养BHK-21细胞的CD培养基的方法，其特征在于，包括下列步骤：
1)按配比称量培养基中各组成分；
2)将称量好的氨基酸组；维生素组；无机盐与微量元素组；脂类、糖类与缓冲剂组溶解；其中所述维生素组的成分中α-硫辛酸、叶酸、核黄素与生物素使用0.4mol/L的NaOH溶解；所述无机盐与微量元素组的成分中偏钒酸钠使用6mol/L HCl溶解；脂类、糖类与缓冲剂组的成分中亚油酸通过无水乙醇溶解；其他各组的成分使用超纯水溶解；
3)将溶解好的各组成分混合，调节pH在7.0～7.4；加水定容，随后利用氯化钠调节渗透压在280～350mOsm/kg；用0.22μm的滤膜过滤，获得悬浮培养BHK-21细胞的CD培养基。
3.一种如权利要求1至2任一项所述全悬浮培养BHK-21细胞的CD培养基在悬浮BHK-21细胞培养中使用125毫升摇瓶培养的培养工艺。
4.如权利要求3所述的工艺，其特征在于：包括低密与高密两种接种密度接种，其中低密的接种密度为3E5，高密的接种密度为10E5；选择经过不同代次传代的BHK21细胞，F10和F40，F10为复苏后经过10次传代的悬浮BHK21细胞，F40为复苏后经过40次传代的悬浮BHK21细胞，F40代后细胞趋于老化。
5.如权利要求3所述的工艺，其特征在于：包括5％CO2与8％CO2两种不同含量的二氧化碳浓度进行摇瓶培养测试BHK21细胞生长。
6.如权利要求3所述的工艺，其特征在于：包括32.5℃与36.5℃两种不同温度进行摇瓶培养测试BHK21细胞生长。
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