CN114107178B - 一种Vero细胞无血清基础培养基及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种Vero细胞无血清基础培养基，包括如下有效成分：基础组分和重组表皮生长因子，所述基础组分由以下组分组成：无机盐、氨基酸及糖类、维生素、微量元素、脂类以及添加组分。其制备方法包括将基础组分按配比加入适量超纯水中混合均匀，用盐酸调节pH值在7.0～7.4范围内，加入重组表皮生长因子并混合均匀，加水定容，用氯化钠调节渗透压，用滤膜过滤，得到所述Vero细胞无血清基础培养基。本发明培养基的配置简便，原料的成本低，含极低的重组表皮生长因子、不含水解物，其稳定性相对较好，适合大规模工业化生产。

Description

一种Vero细胞无血清基础培养基及其制备方法
技术领域
本发明涉及Vero细胞培养基技术领域，具体涉及一种以基础组分和重组表皮生长因子组合优化的Vero细胞无血清基础培养基。
背景技术
血清是为细胞提供生长增殖所需的激素、生长因子等营养物质,但由于不同批次的血清之间存在批间差异,价格昂贵,存在容易被病毒和支原体感染的风险,含有大量成分复杂的蛋白质给细胞产品下游分离纯化带来很大的困难。
Vero细胞(African green kidney cell，Vero cell)是世界卫生组织和我国生物制品规程认可的疫苗生产细胞系。目前已用于多种疫苗的生产。Vero细胞无血清培养已在狂犬病疫苗、呼肠病毒、肾综合征出血热疫苗、流行性乙型脑炎疫苗、甲型肝炎疫苗、流感疫苗疫苗等的研发和生产应用。
国外无血清培养基gibco的VP-SFM的价格昂贵，所以迫切需要一款价格低廉、无血清、无动物源、应用于微载体贴壁工艺的Vero细胞无血清基础培养基。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种针对Vero细胞贴壁工艺的无血清、成分简单、质量相对可控的Vero细胞基础培养基。
本发明是采用如下技术方案实现的：
一种Vero细胞无血清基础培养基，包括如下有效成分：基础组分和重组表皮生长因子，所述基础组分由以下组分组成：无机盐、氨基酸及糖类、维生素、微量元素、脂类以及添加组分。
作为优选的技术方案，所述基础组分中，无机盐包括氯化钾、氯化钙、磷酸二氢钠、氯化钠和硫酸镁；氨基酸及糖类包括天冬酰胺、蛋氨酸、组氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、甘氨酸、精氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、谷氨酸、缬氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸、丙氨酸和葡萄糖；维生素包括维生素B6、维生素B1、生物素、维生素B12、泛酸、叶酸、烟酸、核黄素、氯化胆碱和肌醇；微量元素包括氯化铜、氯化锌、柠檬酸铁铵、氯化锰和亚硒酸钠；脂类以及添加组分包括亚油酸，乙醇胺、谷胱甘肽和精胺。
优选的，所述Vero细胞无血清基础培养基中各组分的含量范围如下：
无机盐部分：0.2-2.0g/L氯化钾、0.01-1.0g/L氯化钙、0.001-2.0g/L磷酸二氢钠、1.0-10.0g/L氯化钠、0.01-2.0g/L硫酸镁；
氨基酸及糖类部分：0.01-2.0g/L天冬酰胺、0.01-1.0g/L蛋氨酸、0.01-1.5g/L组氨酸、0.01-0.8g/L天冬氨酸、0.01-0.8g/L丝氨酸、0.02-1.0g/L甘氨酸、0.02-0.8g/L精氨酸、0.01-0.5g/L异亮氨酸、0.02-0.8g/L亮氨酸、0.01-2.0g/L谷氨酸、0.02-1.0g/L缬氨酸、0.02-1.2g/L赖氨酸、0.01-0.5g/L苯丙氨酸、0.01-0.6g/L脯氨酸、0.02-1.0g/L苏氨酸、0.2-0.8g/L谷氨酰胺、0.02-1.0g/L酪氨酸、0.04-0.8g/L丙氨酸、2-10g/L葡萄糖；
维生素部分：0.000001-0.001g/L维生素B6、0.000001-0.002g/L维生素B1、0.00000001-0.0002g/L生物素、0.000001-0.002g/L维生素B12、0.0000001-0.005g/L泛酸、0.00001-0.003g/L叶酸、0.00001-0.002g/L烟酸、0.0000001-0.001g/L核黄素、0.00001-0.1g/L氯化胆碱、0.000001-0.001g/L肌醇；
微量元素部分：0.0000001-0.001g/L氯化铜、0.000001-0.001g/L氯化锌、0.0001-0.01g/L柠檬酸铁铵、0.0000001-0.0001g/L氯化锰、0.0000001-0.0005g/L亚硒酸钠；
脂类以及添加组分：0.00001～0.05g/L亚油酸、0.001-0.050g/L乙醇胺、0.0001-0.002g/L谷胱甘肽、0.0001-0.01g/L精胺；
重组表皮生长因子0.0001-0.5g/L。
作为更优选的技术方案，所述Vero细胞无血清基础培养基中各组分的含量范围如下：
无机盐部分：0.30-1.0g/L氯化钾、0.02-0.80g/L氯化钙、0.01-1.0g/L磷酸二氢钠、3.0-9.0g/L氯化钠、0.02-1.0g/L硫酸镁；
氨基酸及糖类部分：0.02-1.0g/L天冬酰胺、0.03-0.50g/L蛋氨酸、0.05-0.80g/L组氨酸、0.05-0.30g/L天冬氨酸、0.15-0.80g/L丝氨酸、0.15-0.30g/L甘氨酸、0.30-0.60g/L精氨酸、0.15-0.45g/L异亮氨酸、0.18-0.42g/L亮氨酸、0.10-0.50g/L谷氨酸、0.18-0.43g/L缬氨酸、0.20-0.65g/L赖氨酸、0.08-0.31g/L苯丙氨酸、0.07-0.26g/L脯氨酸、0.10-0.50g/L苏氨酸、0.4-0.6g/L谷氨酰胺、0.16-0.38g/L酪氨酸、0.10-0.22g/L丙氨酸、4-8g/L葡萄糖；
维生素部分：0.00001-0.0005g/L维生素B6、0.00001-0.001g/L维生素B1、0.0000005-0.00001g/L生物素、0.0001-0.001g/L维生素B12、0.00005-0.001g/L泛酸、0.0001-0.005g/L叶酸、0.00005-0.001g/L烟酸、0.00001-0.0005g/L核黄素、0.001-0.005g/L氯化胆碱、0.000005-0.0001g/L肌醇；
微量元素部分：0.000001-0.0001g/L氯化铜、0.00001-0.0005g/L氯化锌、0.0005-0.005g/L柠檬酸铁铵、0.000001-0.00001g/L氯化锰、0.000001-0.0001g/L亚硒酸钠；
脂类以及添加组分：0.0001～0.02g/L亚油酸、0.005-0.020g/L乙醇胺、0.0005-0.001g/L谷胱甘肽、0.0005-0.002g/L精胺；
重组表皮生长因子：0.001-0.01g/L。
作为进一步优选的技术方案，所述Vero细胞无血清基础培养基中各组分的含量如下：
无机盐部分:0.450g/L氯化钾、0.120g/L氯化钙、0.150g/L磷酸二氢钠、8.0g/L氯化钠、0.048g/L硫酸镁；
氨基酸及糖类部分：0.455g/L天冬酰胺、0.100g/L蛋氨酸、0.125g/L组氨酸、0.130g/L天冬氨酸、0.250g/L丝氨酸、0.225g/L甘氨酸、0.480g/L精氨酸、0.250g/L异亮氨酸、0.280g/L亮氨酸、0.168g/L谷氨酸、0.240g/L缬氨酸、0.300g/L赖氨酸、0.155g/L苯丙氨酸、0.120g/L脯氨酸、0.200g/L苏氨酸、0.500g/L谷氨酰胺、0.250g/L酪氨酸、0.125g/L丙氨酸、6g/L葡萄糖；
维生素部分：0.0001g/L维生素B6、0.0002g/L维生素B1、0.000001g/L生物素、0.0003g/L维生素B12、0.0005g/L泛酸、0.0003g/L叶酸、0.0005g/L烟酸、0.0002g/L核黄素、0.002g/L氯化胆碱、0.00006g/L肌醇；
微量元素部分：0.00005g/L氯化铜、0.0002g/L氯化锌、0.001g/L柠檬酸铁铵、0.000005g/L氯化锰、0.00001g/L亚硒酸钠；
脂类以及添加组分：0.0003g/L亚油酸、0.003g/L乙醇胺、0.0008g/L谷胱甘肽、0.001g/L精胺；
重组表皮生长因子：0.005g/L。
所述Vero细胞无血清基础培养基中还可以添加一定用量的消泡剂和培养基缓冲剂。所述消泡剂和培养基缓冲剂可以采用本领域的常用成分，例如消泡剂可以是泊洛沙姆188(P188)，培养基缓冲剂可以是NaHCO3。其添加量可以参考本领域常规用量，根据产物的实际情况进行合理调整，例如消泡剂的添加量可以是0.5-1.5g/L，优选0.8-1.2g/L；培养基缓冲剂的添加量可以是1.8-2.6g/L，优选2.0-2.4g/L。
本发明还进一步公开了上述Vero细胞无血清基础培养基的制备方法，包括如下步骤：将基础组分按配比加入适量超纯水中混合均匀，分别加入消泡剂和培养基缓冲剂并混合均匀，用盐酸调节pH值在7.0～7.4范围内，加入重组表皮生长因子并混合均匀，加水定容，用氯化钠调节渗透压在280～320mOsm/kg，最后用0.22μm滤膜过滤，得到所述Vero细胞无血清基础培养基。
本发明Vero细胞无血清基础培养基，具有以下优点：
1)Vero细胞无血清基础培养基成分明确，含极低的重组表皮生长因子，不含动物来源成分，不含水解物，批次间的差异性小；
2)用于生产Vero细胞无血清基础培养基的原料价格低廉，工艺操作简单，适合大批量工业生产；
3)Vero细胞无血清基础培养基与国外培养基对比在细胞生长，细胞形态差异不明显，价格低廉，因而应用前景明朗。
以下结合附图及实施例进一步说明本发明。
附图说明
图1是本发明实施例1TransVero基础培养基培养VERO细胞72h后细胞形态图片；
图2是对比例1培养基培养VERO细胞72h后细胞形态图片；
图3是对比例2培养基培养VERO细胞72h后细胞形态图片；
图4是各实施例和对比例培养VERO细胞72h后收获的活细胞总数结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的优选实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明中的试剂或仪器未注明生产厂商的，均为常规商业化试剂或仪器。其中重组表皮生长因子采用武汉禾元生物科技股份有限公司货号HYC020M01的产品，DMEM基础培养基采用HyClone公司SH30004.04型号的产品，胎牛血清采用上海多宁生物科技有限公司DNFBS01UC-500U型号的产品。
实施例中，细胞形态采用广州市明美光电技术有限公司MF52-N型号倒置荧光显微镜进行拍摄，放大倍数为40倍。
实施例中，本发明Vero细胞无血清基础培养基(以下简称“TransVero基础培养基”)的各组分含量如下：
无机盐部分:0.450g/L氯化钾、0.120g/L氯化钙、0.150g/L磷酸二氢钠、8.0g/L氯化钠、0.048g/L硫酸镁；
氨基酸及糖类部分：0.455g/L天冬酰胺、0.100g/L蛋氨酸、0.125g/L组氨酸、0.130g/L天冬氨酸、0.250g/L丝氨酸、0.225g/L甘氨酸、0.480g/L精氨酸、0.250g/L异亮氨酸、0.280g/L亮氨酸、0.168g/L谷氨酸、0.240g/L缬氨酸、0.300g/L赖氨酸、0.155g/L苯丙氨酸、0.120g/L脯氨酸、0.200g/L苏氨酸、0.500g/L谷氨酰胺、0.250g/L酪氨酸、0.125g/L丙氨酸、6g/L葡萄糖；
维生素部分：0.0001g/L维生素B6、0.0002g/L维生素B1、0.000001g/L生物素、0.0003g/L维生素B12、0.0005g/L泛酸、0.0003g/L叶酸、0.0005g/L烟酸、0.0002g/L核黄素、0.002g/L氯化胆碱、0.00006g/L肌醇；
微量元素部分：0.00005g/L氯化铜、0.0002g/L氯化锌、0.001g/L柠檬酸铁铵、0.000005g/L氯化锰、0.00001g/L亚硒酸钠；
脂类以及添加组分：0.0003g/L亚油酸、0.003g/L乙醇胺、0.0008g/L谷胱甘肽、0.001g/L精胺；
重组表皮生长因子：0.005g/L；
P188消泡剂1.0g/L、NaHCO3缓冲剂2.2g/L。
配制TransVero基础培养基的方法如下：
(1)取800mL超纯水，按配比加入基础组分，将搅拌器的转速调节至800r/min，磁力搅拌10min；
(2)向步骤(1)中加入1.0g P188，搅拌10min；
(3)向步骤(2)中加入NaHCO3的2.2g，搅拌10min；
(4)利用6N的HCl调节步骤(3)中溶液的pH值，使其在7.0～7.4范围内；
(5)向步骤(4)中加入重组表皮生长因子溶液，搅拌10min；
(6)加水定容至1L；
(7)测量步骤(6)得到的溶液的渗透压，其值应该在280～320mOsm/kg；
(8)采用0.22μm滤膜过滤，即得TransVero基础培养基。
实施例1
从液氮罐中取一支vero细胞冻存管，在37℃水浴中震荡溶解，加入到含有10mL新鲜TransVero基础培养基的15mL离心管中，混匀。随后，在800rp/min下离心5min，弃去上清液。用12mL TransVero基础培养基重悬细胞，接种到T75瓶中进行培养。调整好细胞状态的Vero细胞用胰酶消化重悬后进行计数，按照1E5/ml密度、2ml体积接种到6孔板中，培养条件：37℃，5％CO2，培养72小时后，将细胞用胰酶消化收集并计数，并对细胞形态进行拍照。
72h后细胞形态图片见图1，活细胞总数如图4所示，为2.61×106。
对比例1
选取GIbico的VP-SFM(货号：11681020)为对比例，按照1E5/ml密度、2ml体积接种到6孔板中，培养条件：37℃，5％CO2，培养72小时后，将细胞用胰酶消化收集并计数后，并对细胞形态进行拍照。
72h后细胞形态图片见图2，活细胞总数如图4所示，为1.65×106。
对比例2
选取DMEM+5％FBS为对比例，按照1E5/ml密度、2ml体积接种到6孔板中，培养条件：37℃，5％CO2，培养72小时后，将细胞用胰酶消化收集并计数后，并对细胞形态进行拍照。
72h后细胞形态图片见图3，活细胞总数如图4所示，为3.84×106。
实验结果显示，本发明的Vero细胞无血清培养基在细胞形态上与VP-SFM比较更接近经典培养基DMEM+5％FBS形态，按照2ml体积1E5/mL密度接种培养72后活细胞总数与VP-SFM比较显著高与经典培养基DMEM+5％FBS比较虽然低但比较接近。本发明Vero细胞无血清基础培养能支持Vero细胞的生长代谢，满足大规模生产微载体工艺的需求，具有较大的应用前景。
需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、组分或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、组分或者设备所固有的要素。
本领域的技术人员应理解，上述描述及附图中所示的本发明的实施例只作为举例而并不限制本发明。本发明的目的已经完整并有效地实现。本发明的功能及结构原理已在实施例中展示和说明，在没有背离所述原理下，本发明的实施方式可以有任何变形或修改。

Claims (2)

1.一种Vero细胞无血清基础培养基，其特征在于，由如下有效成分组成：基础组分、重组表皮生长因子、消泡剂和培养基缓冲剂，所述基础组分由以下组分组成：无机盐、氨基酸及糖类、维生素、微量元素、脂类以及添加组分；所述消泡剂是P188，所述培养基缓冲剂是NaHCO3；各组分的含量如下：
无机盐部分：0.450g/L氯化钾、0.120g/L氯化钙、0.150g/L磷酸二氢钠、8.0g/L氯化钠和0.048g/L硫酸镁；
氨基酸及糖类部分：0.455g/L天冬酰胺、0.100g/L蛋氨酸、0.125g/L组氨酸、0.130g/L天冬氨酸、0.250g/L丝氨酸、0.225g/L甘氨酸、0.480g/L精氨酸、0.250g/L异亮氨酸、0.280g/L亮氨酸、0.168g/L谷氨酸、0.240g/L缬氨酸、0.300g/L赖氨酸、0.155g/L苯丙氨酸、0.120g/L脯氨酸、0.200g/L苏氨酸、0.500g/L谷氨酰胺、0.250g/L酪氨酸、0.125g/L丙氨酸和6g/L葡萄糖；
维生素部分：0.0001g/L维生素B6、0.0002g/L维生素B1、0.000001g/L生物素、0.0003g/L维生素B12、0.0005g/L泛酸、0.0003g/L叶酸、0.0005g/L烟酸、0.0002g/L核黄素、0.002g/L氯化胆碱和0.00006g/L肌醇；
微量元素部分：0.00005g/L氯化铜、0.0002g/L氯化锌、0.001g/L柠檬酸铁铵、0.000005g/L氯化锰和0.00001g/L亚硒酸钠；
脂类以及添加组分：0.0003g/L亚油酸、0.003 g/L乙醇胺、0.0008 g/L谷胱甘肽和0.001g/L精胺；
重组表皮生长因子：0.005 g/L；
P188消泡剂1 .0g/L和NaHCO3缓冲剂2 .2g/L。
2. 权利要求1所述Vero细胞无血清基础培养基的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将基础组分按配比加入适量超纯水中混合均匀，分别加入消泡剂和培养基缓冲剂并混合均匀，用盐酸调节pH值在7.0 ~ 7.4范围内，加入重组表皮生长因子并混合均匀，加水定容，用氯化钠调节渗透压在280~320mOsm/kg，最后用0.22μm滤膜过滤，得到所述Vero细胞无血清基础培养基。
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