CN111518768B - 一种适用于lmh细胞贴壁培养的低血清培养基及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种适用于LMH细胞贴壁培养的低血清培养基及其制备方法，属于生物制品领域，该培养基包括延胡索酸、琥珀酸盐、甜菜碱、半胱胺、右旋糖酐、磷酸吡哆醛、β‑巯基乙酸、吡啶甲酸铬、肉碱盐酸盐、力肽、硒代甲硫氨酸等物质。本发明制备的一种适用于LMH细胞贴壁培养的低血清培养基成分明确、无蛋白组分、无动物来源组分、血清用量低(2％‑3％)、病毒产量高，用于制备禽腺病毒滴度可达10⁹TCID₅₀/ml，用于培养LMH细胞，细胞生长均匀，不会聚团生长。

Description

一种适用于LMH细胞贴壁培养的低血清培养基及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物制品领域，具体涉及一种适用于LMH细胞贴壁培养的低血清培养基及其制备方法。

背景技术

2014年以来，在我国很多地区分离到Ⅰ亚群禽腺病毒。在2015年开始呈流行趋势，2017年在家禽上发病率降低，在水禽发病率升高。但从2018年3月开始在家禽发病率呈上升趋势，越来越严重，表现为包涵体肝炎和心包积水综合征，给禽类养殖和食品健康带来了重大危害。由此，我国的动物疫苗企业开始重视禽腺病毒，国家兽药信息数据库显示目前市场上尚无针对禽腺病毒的生物制品，但是申报临床试验的生物制品已达27个，其中，使用禽腺病毒作为抗原的产品有23个，这23个产品均使用贴壁LMH细胞来生产禽腺病毒。

LMH细胞(鸡肝癌细胞)系是由一位日本学者在1981年建立。LMH细胞呈典型上皮细胞特征，该细胞系保持了鸡肝细胞分化的大量表型特征，LMH细胞除了应用于禽腺病毒的制备，亦可应用于鸭瘟病毒制备。

公开号为CN 105420198 A的中国专利申请“鸡肝癌细胞系作为鸭瘟病毒宿主的应用”以LMH细胞系作为鸭瘟病毒宿主，但LMH细胞应用于生物制品疫苗生产存在很多困难。首先贴壁困难，其次易聚团生长，对血清的品质很挑剔，通常需使用10％胎牛血清的DMEM培养，生产成本昂贵，目前还没有商品化的适用于生产的低血清LMH细胞贴壁培养基，亦未见相关的LMH细胞培养基的专利。

发明内容

针对上述LMH细胞贴壁困难，易聚团生长，对血清的品质很挑剔，通常需使用10％胎牛血清的DMEM培养病毒，生产成本昂贵等缺陷，本发明提供一种适用于LMH细胞贴壁培养的低血清培养基，并针对LMH细胞，优化该培养基。

一种适用于LMH细胞贴壁培养的低血清培养基，包括如下组分：

本申请的技术方案中，核黄素为维生素类营养，右旋糖酐为多聚葡萄糖，LMH细胞有易于集聚成团生长特点，二者合并使用可使细胞不集聚生长，刺激细胞分裂，促进增殖，其中右旋糖酐不仅能给细胞提供碳源还可减少乳酸的形成；力肽促进正氮平衡，调节肌蛋白合成作用，防止细胞脱落，增强贴壁效果；β-巯基乙酸相当于胎牛血清作用，可直接刺激细胞增殖，且可使培养基中含硫化合物还原成谷胱甘肽诱导细胞增殖，使细胞高密度分裂不死亡，同时避免过氧化物对细胞的损伤；丙酮酸、抗坏血酸、谷胱甘肽3种抗氧化剂组合可替代培养基中血清白蛋白功能。甜菜碱提供甲基，部分替代胆碱合成磷脂酰胆碱，部分替代蛋氨酸合成肉碱盐酸盐，促进其他营养物质的作用，增强细胞的吸收，调节渗透压，稳定维生素，与氯化胆碱合并使用，可以避免单一使用氯化胆碱对维生素的破坏。磷酸吡哆醛为能量维生素，参与氨基酸的合成；吡啶甲酸铬参与细胞间的跨膜运输，提高了细胞对天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸的吸收，是葡萄糖耐量因子的组成成分，具有胰岛素作用，促进细胞对葡萄糖利用，促进葡萄糖磷酸化，促进糖原和脂肪酸的合成；亚油酸是一种主要的必需脂肪酸，可以提高维生素A，维生素D维生素E的吸收，促进细胞的分裂；葡萄糖酸锰促进细胞生长。本申请使用了3％的新生牛血清就可以达到10％胎牛血清的培养效果，生产成本低，且细胞贴壁牢固，均匀生长，不聚团。

优选的，一种适用于LMH细胞贴壁培养的低血清培养基，包括如下组分：

优选的，一种适用于LMH细胞贴壁培养的低血清培养基，应用于LMH细胞贴壁培养的同时提高病毒滴度，还需在上述配方中添加如下组分，得到一种更加适用于LMH细胞贴壁培养并提高病毒滴度的低血清培养基，硒代甲硫氨酸0.001-0.01mg/L，延胡索酸1-10mg/L，琥珀酸盐5-10mg/L，半胱胺0.05-1mg/L，肉碱盐酸盐1-20mg/L。

更为优选的，一种适用于LMH细胞贴壁培养的低血清培养基，应用于LMH细胞贴壁培养的同时提高病毒滴度，还需在上述配方中添加如下组分，得到一种更加适用于LMH细胞贴壁培养并提高病毒滴度的低血清培养基，硒代甲硫氨酸0.05mg/L，延胡索酸6mg/L，琥珀酸盐7mg/L，半胱胺0.07mg/L，肉碱盐酸盐12mg/L。

其中，半胱胺解除生长抑素对细胞的抑制生长，促进蛋白质合成，从而提高病毒产量；延胡索酸调节酸碱平衡，琥珀酸盐参与三羧酸循环；肉碱盐酸盐提高细胞对氨的耐受性；硒代甲硫氨酸提高毒株活力，增强细胞耐受力。病毒滴度由之前的10⁸TCID₅₀提高至10⁹TCID₅₀。

一种适用于LMH细胞贴壁培养的低血清培养基的制备方法，包括如下步骤:

(1)取一洁净容器将吐温80加至10ml无水乙醇中，充分搅拌至完全溶解，维生素D3、亚油酸、亚麻酸、维生素E依次加入，待每种物质完全溶解后再加入另一种物质，得到脂类营养混合物；

(2)取一洁净容器，加入600ml超纯水，依次加入葡萄糖酸锰、延胡索酸、磷酸吡哆醛、吡啶甲酸铬、力肽，用磁力搅拌器搅拌8分钟后，再依次加入：草酰乙酸、无水磷酸二氢钠、氯化钙、氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、L盐酸精氨酸、天冬氨酸、胱氨酸二盐酸盐、谷氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸、甘氨酸、硒代甲硫氨酸、无水硫酸镁、葡萄糖、果糖、葡萄糖酸钙、视黄醇，碘化钾、丙酮酸、琥珀酸盐、右旋糖酐、β-巯基乙酸、肉碱盐酸盐、烟酰胺、维生素C、生物素、氯化胆碱、乙醇胺、七水硫酸亚铁、六水合氯化镁、丙酮酸钠、丁酸钠、亚硒酸钠、柠檬酸、β-胡萝卜素、硫酸铜、硫酸铁、盐酸吡哆醇、氢化可的松、D-泛酸钙、硫酸钴、硝酸钾、力肽、肌醇、酚红、孕酮、磷酸二氢钙、谷胱甘肽、甜菜碱、半胱胺、核黄素，谷氨酰胺，用磁力搅拌器搅拌20分钟后，补液至900ml，再加入提前溶解好的脂溶性维生素混合物，再次搅拌45min，定容至1000ml，加入碳酸氢钠调节pH至7.6；

(3)用0.22微米孔径滤膜或滤芯过滤除菌即得，4℃避光保存。

一种适用于LMH细胞贴壁培养的低血清培养基的用途，及培养基在生长液和接毒维持液中的应用。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

(1)本申请基于禽源细胞的代谢特点，使用代谢流分析和均匀设计开发了适用于疫苗工业化生产的LMH细胞贴壁培养的低血清培养基，填补了空白，使用了2％-3％的新生牛血清就可以达到10％胎牛血清的培养效果，降低了生产成本，且细胞贴壁牢固，均匀生长，不聚团，此外病毒产量由之前的10⁸TCID₅₀提高至10⁹TCID₅₀。

(2)本发明的低血清培养基无蛋白成分，无动物来源成分，进一步降低了该培养基的生产成本；

(3)成分明确、简单，产品批间差异小，同时也简化了下游产品的纯化步骤；

(4)产品批间差异小，易于制备。

附图说明

图1是本发明所述低血清培养基(3％新生牛血清)与DMEM(10％胎牛血清)对比图；

图2是本发明所述低血清培养基接种禽腺病毒病变图片；

图3是本发明所述低血清培养基(3％新生牛血清)与DMEM(10％胎牛血清)生长曲线对比图；

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

一种适用于LMH细胞贴壁培养的低血清培养基的制备方法，包括如下步骤：

(1)取一洁净容器将吐温80加至10ml无水乙醇中，充分搅拌至完全溶解，维生素D3、亚油酸、亚麻酸、维生素E依次加入，待每种物质完全溶解后再加入另一种物质，得到脂类营养混合物；

(2)取一洁净容器，加入600ml超纯水，依次加入葡萄糖酸锰、延胡索酸、磷酸吡哆醛、吡啶甲酸铬、力肽，用磁力搅拌器搅拌8分钟后，再依次加入：草酰乙酸、无水磷酸二氢钠、氯化钙、氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、L盐酸精氨酸、天冬氨酸、胱氨酸二盐酸盐、谷氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸、甘氨酸、硒代甲硫氨酸、无水硫酸镁、葡萄糖、果糖、葡萄糖酸钙、视黄醇，碘化钾、丙酮酸、琥珀酸盐、右旋糖酐、β-巯基乙酸、肉碱盐酸盐、烟酰胺、维生素C、生物素、氯化胆碱、乙醇胺、七水硫酸亚铁、六水合氯化镁、丙酮酸钠、丁酸钠、亚硒酸钠、柠檬酸、β-胡萝卜素、硫酸铜、硫酸铁、盐酸吡哆醇、氢化可的松、D-泛酸钙、硫酸钴、硝酸钾、力肽、肌醇、酚红、孕酮、磷酸二氢钙、谷胱甘肽、甜菜碱、半胱胺、核黄素，谷氨酰胺，用磁力搅拌器搅拌20分钟后，补液至900ml，再加入提前溶解好的脂溶性维生素混合物，再次搅拌45min，定容至1000ml，加入碳酸氢钠调节pH至7.6；

(3)用0.22微米孔径滤膜或滤芯过滤除菌即得，4℃避光保存。

各实施例中，各成分的用量如下(单位mg)：

试验例1

将LMH细胞同时接种于实施例1中制得的培养基和含有10％血清浓度的DMEM培养基中，连续贴壁培养48h，每天观察细胞的生长状态，并拍照记录，图1显示两种培养基中细胞贴壁生长，由图1可以看出，LMH细胞贴壁培养的低血清培养基优于10％血清浓度的DMEM培养基；由图2中可以看出，LMH细胞贴壁培养的低血清培养基接种禽腺病毒可使病毒滴度达到10⁹TCID₅₀/1mL，解决了病毒滴度低的问题；从图1和图2中可以得出一种适用于LMH细胞贴壁培养的低血清培养基能够解决鸡肝细胞易成团问题、血清用量问题、病毒滴度问题，且该培养基具有无蛋白成分、无动物来源、成本低、产品批间差异小，易于制备等优点。

试验例2

对实施例2制得的一种适用于LMH细胞贴壁培养的低血清培养基与DMEM培养基对比，研究LMH细胞贴壁生长状况，由图3知，一种适用于LMH细胞贴壁培养的低血清培养基中的细胞密度高于DMEM培养基，说明本申请的适用于一种适用于LMH细胞贴壁培养的低血清培养基有利于LMH细胞贴壁生长。

以上所述实施例仅表达了本申请的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。

Claims (1)

1.一种低血清培养基在LMH细胞贴壁培养中的应用，其特征在于，所述低血清培养基包括组分一或组分二；

其中，组分一包括如下组分：

草酰乙酸100

碳酸氢钠1850

无水磷酸二氢钠3500

氯化钙125

氯化钠3800

氯化钾500

磷酸二氢钾50

无水硫酸镁100

L盐酸精氨酸300

L天冬氨酸30

L天冬酰胺100

L胱氨酸二盐酸盐50

L谷氨酸5

L亮氨酸10

L异亮氨酸52

L甲硫氨酸63

L苯丙氨酸20

L丝氨酸50

L苏氨酸60

L色氨酸30

L缬氨酸80

甘氨酸46

L谷氨酰胺200

肉碱盐酸盐20

葡萄糖9000

果糖3.3

葡萄糖酸钙20

视黄醇4.5

碘化钾0.05

维生素D38

柠檬酸10

琥珀酸盐5

β-胡萝卜素0.02

力肽950

右旋糖酐4.5

β-巯基乙酸10

吐温8015

烟酰胺5

维生素E6

抗坏血酸11

生物素0.005

氯化胆碱20

乙醇胺7

七水硫酸亚铁30

六水合氯化镁160

丙酮酸钠30

丁酸钠59

亚油酸0.03

亚麻酸1

硫酸铜10

硫酸铁0.05

盐酸吡哆醇1.5

氢化可的松 1.5

地塞米松5

D-泛酸钙1

硫酸钴20

硝酸钾0.6

肌醇100

酚红15

孕酮0.005

磷酸二氢钙5

谷胱甘肽20

丙酮酸120

葡萄糖酸锰0.05

亚硒酸钠0.06

延胡索酸1

甜菜碱11

半胱胺0.05

核黄素2.2

磷酸吡哆醛5

吡啶甲酸铬 5

硒代甲硫氨酸0.001；

其中，组分二包括如下组分：

草酰乙酸500

碳酸氢钠2800

无水磷酸二氢钠2250

氯化钙210

氯化钠4200

氯化钾350

磷酸二氢钾10

无水硫酸镁20

L盐酸精氨酸150

L天冬氨酸50

L天冬酰胺30

L胱氨酸二盐酸盐20

L谷氨酸12

L亮氨酸48

L异亮氨酸100

L甲硫氨酸5

L苯丙氨酸44

L丝氨酸10

L苏氨酸10

L色氨酸5

L缬氨酸120

甘氨酸80

L谷氨酰胺300

肉碱盐酸盐1

葡萄糖1500

果糖0.5

葡萄糖酸钙2

视黄醇10

碘化钾2.8

维生素D35

柠檬酸65

琥珀酸盐10

β-胡萝卜素1

力肽500

右旋糖酐0.5

β-巯基乙酸20

吐温8030

烟酰胺10

维生素E5

抗坏血酸20

生物素0.06

氯化胆碱100

乙醇胺3

七水硫酸亚铁150

六水合氯化镁40

丙酮酸钠70

丁酸钠100

亚油酸0.0002

亚麻酸0.07

硫酸铜15

硫酸铁1.3

盐酸吡哆醇5

氢化可的松5

地塞米松0.001

D-泛酸钙6

硫酸钴1

硝酸钾0.1

肌醇2

酚红5

孕酮0.03

磷酸二氢钙0.23

谷胱甘肽5

丙酮酸5

葡萄糖酸锰5

亚硒酸钠0.02

延胡索酸10

甜菜碱20

半胱胺0.07

核黄素0.5

磷酸吡哆醛0.05

吡啶甲酸铬0.32

硒代甲硫氨酸0.05；

上述各组分含量的单位均为mg/L。