CN114606200A - Sp2/0细胞培养基及生产重组犬细小病毒单克隆抗体的方法 - Google Patents

Sp2/0细胞培养基及生产重组犬细小病毒单克隆抗体的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于细胞培养基技术领域，涉及一种SP2/0细胞培养基及生产重组犬细小病毒单克隆抗体的方法。所述培养基包括氨基酸、维生素、脂类、糖、微量元素、无机盐、细胞因子、次黄嘌呤、胸苷、胆固醇、复合大豆水解物和多胺等添加物。本发明的SP2/0细胞培养基不含血清、无动物源成分，具有成本低廉、安全性高、污染风险小、工艺操作简单、利于产物的纯化、生产批次稳定性等特点，适用于大规模生产，应用于SP2/0细胞的连续灌注培养，可满足规模化工业生产的重组犬细小病毒单克隆抗体养的需求，具有较大的应用前景。

Description

SP2/0细胞培养基及生产重组犬细小病毒单克隆抗体的方法
技术领域
本发明属于细胞培养基技术领域，具体涉及一种无血清、化学成分明确的SP2/0细胞培养基，和使用该培养基生产重组犬细小病毒单克隆抗体的方法。
背景技术
犬细小病毒(Canine Parvovirus，CPV)感染是犬的一种急性传染病。CPV感染的犬临床表现为出血性肠炎或非化脓性心肌炎，多发生于幼犬，病死率10％～50％；另外，该病毒感染还威胁到实验用犬。目前临床上主要是对症治疗，配合高免血清和单克隆抗体治疗。
当前比较先进的制备犬细小病毒单克隆抗体(Canine parvovirus monoclonalantibody，CPV McAb)的方法是：通过细胞融合技术，将犬细小病毒免疫的BALB/c小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，制备出能分泌抗犬细小病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株，筛选出特异性的杂交瘤细胞，接种生物反应器进行培养，培养液经纯化后制备特异性抗体。
在培养方式上，可用于动物细胞培养的现有技术包括贴壁培养、悬浮培养和灌流培养。在工业化生产中，悬浮培养工艺参数的放大原理和过程控制比其他培养系统更容易理解和掌握，而且具备培养条件均一、细胞收率高、蛋白产量高、可连续在线检测等优点，因此在规模化动物细胞培养生产中多选择悬浮细胞培养工艺。但悬浮培养的主要缺点是细胞悬浮游离生长，生产中细胞培养体积大，设备投入大，相对细胞密度较低。
与传统悬浮培养相比，灌注培养对设备的要求低，空间小更易于放大和工业化生产。尤其是连续灌流培养过程中，新鲜培养基连续地添加，不断地给细胞提供营养，培养上清可以间断或连续地收获，维持了细胞良好的生长环境，提高了反应器中细胞密度，降低了有害代谢产物的累积，延长了细胞的表达时间，从而提高细胞的产量。
由于动物细胞体外培养的复杂性，现有技术中多使用含血清的培养基，以确保细胞高密度生长，实现高产量。中国发明专利CN102120768B中提到了一种用生物反应器生产治疗性犬细小病毒单克隆抗体的方法，从种子复苏到细胞培养，全程采用85％DMEM培养基和15％犊牛血清培养，生产的犬细小病毒单克隆抗体的纯度较高，与传统免疫小鼠制备单抗相比取得了较大的进步，但由于培养基含有动物血清，有潜在的风险，且细胞培养时间较短，批次产量仍然不高，且该专利中收获的培养液犬细小病毒血凝抑制效价仅≥256。
由于在培养基中添加血清有潜在的动物病毒感染的风险，且不利于纯化。因此采用无血清培养基进行灌流培养成为当今细胞培养领域的一大趋势。采用无血清培养不但可降低成本，简化分离纯化步骤，还可避免病毒污染造成的危害。
此外，现有各种商业化的无血清培养基，不但成份不明确，而且对生产不同产物的细胞株适应性各不相同，缺乏广泛的通用性，即便采用稳定的商用无血清培养基，仍需针对每种细胞的生长代谢特性对培养过程进行优化，这个细胞驯化过程往往需要很长时间。目前，采用无血清且化学成分明确的培养基，对SP2/0细胞进行灌注培养并达到高细胞密度以高效生产犬重组犬细小病毒单克隆抗体的方法寥寥无几。
中国发明专利申请CN103773732A中提到了用一种化学成确定的培养基可提高细胞密度并提高目的产物产量，用此培养基在药瓶中培养SP2/0细胞达到的细胞密度峰值为5-6×106cells/mL，培养时长6-7天。该培养基的细胞密度低，产量低，成本高。
综上，科研和医药应用领域亟需一种安全高效无血清、化学成分明确的培养基，用来对SP2/0细胞进行灌注培养，以及一种高产量生产重组犬细小病毒单克隆抗体的方法。
发明内容
鉴于现有的犬细小病毒单克隆抗体的培养方法中存在的培养基含有血清，现有无血清培养基表达低，表达时间短，批次产品低等众多问题，本发明提供一种无血清、化学成分明确的培养基以及采用该培养基进行灌注培养生产犬细小病毒单克隆抗体的方法，用于解决现存的培养基或培养工艺问题。
为了实现上述目的，本发明提供了一种无血清SP2/0细胞灌注培养基，培养基成份包括：氨基酸、维生素、脂类、糖、微量元素、无机盐、复合大豆水解物、多胺、次黄嘌呤、胸苷、胆固醇、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、P188(即：泊洛沙姆188)和苹果酸。
优选的，所述氨基酸包括谷氨酰胺。
优选的，所述培养基包括细胞因子，所述细胞因子为重组人源胰岛素。
优选的，所述胆固醇为非动物来源的胆固醇。
优选的，所述氨基酸包括：
300-500mg/L的L-精氨酸，100-300mg/L的L-精氨酸盐酸，800-1000mg/L的L-天冬酰胺，300-500mg/L的L-天冬氨酸，600-800mg/L的羟基脯氨酸，300-500mg/L的L-异亮氨酸，200-300mg/L的L-半胱氨酸，200-400mg/L的L-半胱氨酸-2-盐酸，200-400mg/L的L-甲硫氨酸，300-500mg/L的L-谷氨酸，50-80mg/L的甘氨酸，30-50mg/L的牛磺酸，350-500mg/L的L-组氨酸盐酸，400-600mg/L的L-亮氨酸，400-600mg/L的L-赖氨酸一水合物，200-400mg/L的L-脯氨酸，300-500mg/L的L-丝氨酸，200-400mg/L的L-苏氨酸，100-300mg/L的L-色氨酸，100-300mg/L的酪氨酸，5-10mg/L的L-a-氨基-n-丁酸，100-300mg/L的胱氨酸-2盐酸，100-300mg/L的L-苯丙氨酸，200-400mg/L的L-酪氨酸二钠二水合物，200-400mg/L的L-缬氨酸，3-5mg/L的还原型谷胱甘肽，1-4g/L的谷氨酰胺；
优选的，所述维生素包括：
0.1-0.3mg/L的生物素，50-70mg/L的氯化胆碱，2-4mg/L的维生素B12，10-15mg/L的叶酸，100-150mg/L的肌醇，18-25mg/L的D-泛酸钙，15-20mg/L的盐酸吡哆醇，1-3mg/L的核黄素，12-15mg/L的盐酸硫胺素，0.5-1mg/L的烟酰胺，0.4-1mg/L的DL-α-硫辛酸，0.0005-0.001mg/L的生育酚；
优选的，所述脂类包括：0.04-0.1mg/L的亚油酸；
优选的，所述糖包括：
3000-5000mg/L的蔗糖，1000-2000mg/L的半乳糖，2000-4000mg/L一水麦芽糖，1000-3000mg/L的葡萄糖，100-140mg/L的丙酮酸钠；
优选的，所述微量元素包括：
60-100mg/L的氯化钙，300-500mg/L的柠檬酸铁铵，30-50mg/L的氯化镁，30-50mg/L的硫酸镁，800-1000mg/L的氯化钾，0.006-0.008mg/L的偏钒酸铵，0.005-0.008mg/L的四水钼酸铵，0.05-0.1mg/L的五水硫酸铜，0.001-0.003mg/L的亚硒酸钠，0.001-0.003mg/L的四水合氯化锰，0.004-0.006mg/L的一水硫酸锰，0.001-0.003mg/L的硫酸镍，0.004-0.006mg/L的九水偏钒酸钠，0.5-1.5mg/L的九水偏硅酸钠，0.001-0.002mg/L的二水氯化亚锡，0.2-0.5mg/L的七水硫酸亚铁，0.03-0.05mg/L的硝酸钾，2-10mg/L的七水硫酸锌，10-15mg/L的乙醇胺盐酸；
优选的，所述无机盐包括：
800-1000mg/L的磷酸二氢钠，100-150mg/L的一水磷酸氢二钠，2000-3000mg/L的氯化钠；
优选的，所述次黄嘌呤含量为1-5mg/L，胸苷含量为1-5mg/L，4-羟乙基哌嗪乙磺酸50-100mg/L，P188 1000-5000mg/L，苹果酸300-500mg/L，胆固醇为0.5-1mg/L；
优选的，所述重组人源胰岛素含量为1-10mg/L；
优选的，所述复合大豆水解物的含量为1-5g/L；所述多胺为腐胺，含量为50-80mg/L。
本发明还提供了应用上述培养基采用灌注方法培养SP2/0细胞生产重组犬细小病毒单克隆抗体的方法，所述方法包括如下步骤：
1)将SP2/0细胞复苏活化后，使用上述培养基进行细胞活化和扩增培养，获得种子溶液；
2)将种子溶液接种反应器，当葡萄糖含量小于等于2g/L时，进行灌注培养；
3)当反应器细胞处于稳态后，开始收集灌注培养产生的培养液；当细胞活率低于80％时，停止收集培养液；
4)将收集的培养液过滤、浓缩、纯化、定量后即得重组犬细小病毒单克隆抗体成品。
优选的，所述步骤2)中接种后的溶液细胞密度为0.3-1.0×106/mL。
优选的，在所述灌注培养过程中，所述培养液中葡萄糖含量大于等于1g/L，且小于等于2g/L。
优选的，在所述灌注培养过程中，所述灌注培养的细胞特异性灌注速率为40-60p·L/(c·d)，维持细胞密度为2-4×107个/mL，优选细胞特异性灌注速率为50p·L/(c·d)，维持细胞密度为3.0-3.5×107个/mL。
优选的，所述种子溶液接种反应器后，在反应器中的培养条件为：培养温度33-37℃，pH 6.8-7.1，溶氧30％-60％，反应器转速180-250rpm；优选培养温度34℃，pH值7.0，溶氧40％，反应器转速200rpm。
所述反应器外接的中空纤维柱带有细胞截留装置，可以过滤培养液中的表达产物和代谢废物，同时中空纤维柱带有反向冲洗的功能，避免长时间截留细胞而发生纤维堵塞，提高了细胞的密度，延长了细胞的生产周期。
本发明还提供了采用上述方法制备得到的重组犬细小病毒单克隆抗体。
与现有技术相比，本发明达到的技术效果是：
(1)本发明的SP2/0细胞培养基不含血清、无动物源成分，具有成本低廉、安全性高、污染风险小、工艺操作简单、利于产物的纯化、生产批次稳定等特点，适用于大规模生产。
(2)通过向本发明提供的SP2/0细胞培养基中加入复合大豆水解物、重组人源胰岛素和谷氨酰胺，大幅度提高了SP2/0细胞密度、细胞活率和犬细小病毒血凝抑制效价。
(3)本发明还阐明了结合所述SP2/0细胞培养基用于灌注培养的生产工艺，就细胞接种密度、细胞培养维持密度、细胞培养时葡萄糖控制节点、培养温度、pH值、溶氧、转速等参数进行了明确，确定了最适合此培养基应用于SP2/0细胞连续灌注培养的生产工艺，完全满足了规模化工业生产高产高性能的重组犬细小病毒单克隆抗体养的需求。
附图说明
图1为实施例1细胞密度随时间变化曲线图；
图2为实施例1细胞活率随时间变化曲线图；
图3为实施例1中不同培养基培养获得的细胞的效价结果；
图4为实施例2细胞密度和活率随时间变化曲线图；
图5为实施例3细胞密度和活率随时间变化曲线图；
图6为实施例4细胞密度和活率随时间变化曲线图；
图7为实施例5细胞密度和活率随时间变化曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下实施例所用的仪器、耗材、试剂均为本领域常规仪器、耗材和试剂，如未特殊注明来源，本领域的专业技术人员均可以通过商业渠道获得。本发明中使用的复合大豆水解物购买自美国Kerry公司(产品名称：sheff-CHO PF ACF)。
重组犬细小病毒检验标准为按照《中华人民共和国兽药典》(2015年版)附录进行检验，收获的培养液中犬细小病毒单克隆抗体的血凝抑制效价≥256为合格。
对收获的细胞培养液进行浓缩超滤后所得成品，按照《中华人民共和国兽药典》(2015年版)附录对成品进行检验，成品中犬细小病毒单克隆抗体的血凝抑制效价≥1024为合格。
实施例1不同培养基的摇瓶培养测试
(1)细胞复苏
从液氮罐取出一支表达重组犬细小病毒单抗SP2/0细胞，37℃水浴融化后，将细胞转移至15mL无菌离心管内，加入5mL 37℃预热的培养基，所述培养基为CDM4MAb(品牌：hyclone，美国Cytiva生产，不含血清)，轻轻吹打，混匀，800rpm，离心5min，弃掉上清，重新加入5mL新鲜CDM4MAb培养基重悬，将细胞悬液转移至125mL透气摇瓶内，补充15mL培养基，于37℃，120rpm，8％CO2，70％～90％湿度下培养。每隔一天取样计数，补充培养基，维持细胞密度2～3×106个/mL，细胞活率大于95％，连续传代2～3次后备用。
(2)摇瓶培养
取备用细胞，按照5×105个/mL的密度分别接种CDM4MAb、MAbMaxA、MAbMaxA1、MAbMaxA2和MAb MaxA3培养基(各培养基的差异见表1)，125mL细胞培养瓶，接种后体积30mL，培养温度36.5℃，转速120rpm，适度70～90％。每日取样计数，监测葡萄糖的含量(当葡萄糖含量低于4g/L时，补至6g/L)。细胞活率低于80％，停止培养。取上清，测犬细小病毒血凝抑制效价(结果见表3)。不同培养基培养的细胞密度、活率和获得的细胞的效价结果分别如图1、2、3所示。
表1测试培养基信息
名称 主要成份
CDM4MAb 不详
MAbMaxA 见表2
MAb MaxA1 在MAbMaxA的基础上增加复合大豆水解物2g/L
MAb MaxA2 在MAb MaxA1的基础上添加谷氨酰胺1g/L
MAb MaxA3 在MAb MaxA2的基础上添加重组人源胰岛素4mg/L
表2 MAbMaxA培养基成分及浓度
Figure BDA0003499637580000071
Figure BDA0003499637580000081
Figure BDA0003499637580000091
表3不同培养基摇瓶培养的效价结果
名称 效价
CDM4MAb 128
MAbMaxA 32
MAb MaxA1 128
MAb MaxA2 512
MAb MaxA3 1024
实施例2使用商用培养基CDM4Mab生产重组犬细小病毒单克隆抗体
(1)细胞复苏
从液氮罐取出一支表达重组犬细小病毒单抗SP2/0细胞，37℃水浴融化后，将细胞转移至15mL无菌离心管内，加入5mL37℃预热的培养基，所述培养基为CDM4MAb(品牌：hyclone，美国Cytiva生产，不含血清)，轻轻吹打，混匀，800rpm，离心5min，弃掉上清，重新加入5mL新鲜CDM4MAb培养基重悬，将细胞悬液转移至125mL透气摇瓶内，补充15mL培养基，于37℃，120rpm，8％CO2，70％～90％湿度下培养。每隔一天取样计数，补充培养基，维持细胞密度3～4×106个/mL。摇瓶的体积从125mL，250mL，500mL，1000mL逐步放大，经过5～7天的扩增，种子体积达到200mL，密度3.6×106个/mL。
(2)接种反应器
生物反应器接种后体积1.8L，细胞密度4.5×105个/mL，培养温度36.5℃，转速200rpm，溶氧40％，pH值7.0。每日取样计数，监测葡萄糖。
(3)灌注培养
当葡萄糖含量低于2g/L时，开始进行灌注培养，开启中空纤维截留装置的换液管路和澄清液收集管路，关闭清洗管路与反向冲洗管路，澄清液收集结束，开启反向冲洗，冲洗结束后，关闭管路，运行清洁管路进行主体持续清洁。灌注量随细胞密度的增加而增加，细胞特异性灌注速率(Cell Specific Perfusion Rate，CSPR)为50p·L(c·d)-1，维持细胞密度为3.0-3.5×107个/mL，多余的细胞使用蠕动泵抽除去，当细胞处于稳定状态后，降低培养温度至34℃，转速为200rpm，溶氧40％，pH值7.0，持续灌注并开始收液，维持葡萄糖含量大于等于1g/L，并小于等于2g/L；直至细胞活率低于80％，停止收液。
从接种反应器算起整个灌注培养一共维持了14天，细胞密度和细胞活率如图4所示，共收液体20L，为培养体积的11倍，收获的培养液中犬细小病毒单克隆抗体的血凝抑制效价≥512。
根据细胞培养液中治疗性单抗的效价，使用超滤系统对细胞培养液进行浓缩超滤，使用过滤系统去除收获液细胞碎片，收获的滤过液-20℃以下保存。依据《中华人民共和国兽药典》(2015年版)附录对浓缩液进行检测，无细菌、霉菌和支原体生长，浓缩液的犬细胞病毒单克隆抗体的血凝抑制效价≥4096。将纯化的治疗性单抗经过稀释后，无菌、定量分装至无菌容器内，放置灭菌塞、压盖后即得成品，-20℃以下保存。
相关结果如表5。
实施例3使用培养基MAb MaxA4生产重组犬细小病毒单克隆抗体
(1)MAb MaxA4培养基制备
实施例3的培养基(MAb MaxA4培养基)成分和用量见表4。
表4培养基成分及含量
Figure BDA0003499637580000101
Figure BDA0003499637580000111
Figure BDA0003499637580000121
干粉培养基的制备方法为：
1)按照体积比，称取上述原料，并将所述原料混合均匀，得到混合原料；
2)对于无法直接称量的物料，配制成浓缩液，滴加到氯化钠或者葡萄糖等物质中，生物安全柜内过夜风干后，加入混合原料中；
3)研磨：使用不锈钢研磨罐研磨混合原料，研磨球为二氧化锆材质，其中干粉培养基体积：二氧化锆球体积：剩余的罐体积＝1:1:1；研磨参数：300rpm，20min/次；使用标准筛测试研磨后干粉的粒径，粒径控制范围是200目标准筛50％以上通过率；
4)球粉分离，干粉分装，贴标签；
5)2～8℃，避光保存。
液体培养基的配制：
1)量取配制液体培养基终体积90％的超纯水(18～25℃)于指定容器内，缓慢加入19～30g/L上述干粉培养基，剧烈搅拌10～30min，直至干粉全部溶解成为混悬液；
2)缓慢加入5mol/L的氢氧化钠溶液2.26mL/L，搅拌10～30min；
3)按照2.33g/L的量加入碳酸氢钠粉末，搅拌10～20min，直至所有成份完全溶解；
4)使用12mol/L的浓盐酸调节培养基的pH值至6.7～6.8，搅拌3～5min；
5)使用超纯水定容至1L，继续搅拌5～10min；
6)测量培养基的最终pH值(6.7～7.4)和渗透压(280～340mOsmol/kg)；
7)0.22μm膜过滤；
8)2～8℃，避光保存，备用。
(2)细胞复苏
细胞复苏方式与实施例2相同，不同之处在于，使用MAb MaxA4液体培养基。
(3)接种反应器和(4)灌注培养
接种反应器和灌注培养过程与实施例2相同；不同之处在于：从接种反应器算起整个灌注培养一共维持了20天，细胞密度和细胞活率如图5所示，共收液体35L，为培养体积的19倍，收获的培养液犬细小病毒备凝抑制效价≥2048。
根据细胞培养液中治疗性单抗的效价，使用超滤系统对细胞培养液进行浓缩超滤，使用过滤系统去除收获液细胞碎片，收获的滤过液-20℃以下保存。
依据《中华人民共和国兽药典》(2015年版)附录对浓缩液进行检测，无细菌、霉菌和支原体生长，浓缩液的犬细胞病毒血凝抑制效价≥20480。
将纯化的治疗性单抗经过稀释后，无菌、定量分装至无菌容器内，放置灭菌塞、压盖后即得成品，-20℃以下保存。
实施例4使用培养基MAb MaxA5生产重组犬细小病毒单克隆抗体
(1)MAb MaxA5培养基制备
MAb MaxA5培养基成分及用量见表4，干粉及液体培养基制备方法与实施例3中的步骤相同，此处不再赘述。
(2)细胞复苏
细胞复苏方式与实施例2相同，不同之处在于，使用MAb MaxA5液体培养基。
(3)接种反应器和(4)灌注培养
接种反应器和灌注培养过程与实施例2相同；不同之处在于：从接种反应器算起整个灌注培养一共维持了24天，细胞密度和细胞活率如图6所示，共收液体45L，为培养体积的25倍，收获的培养液犬细小病毒血凝抑制效价≥4096。
根据细胞培养液中治疗性单抗的效价，使用超滤系统对细胞培养液进行浓缩超滤，使用过滤系统去除收获液细胞碎片，收获的滤过液-20℃以下保存。
依据《中华人民共和国兽药典》(2015年版)附录对浓缩液进行检测，无细菌、霉菌和支原体生长，浓缩液的犬细胞病毒血凝抑制效价≥40960。
将纯化的治疗性单抗经过稀释后，无菌、定量分装至无菌容器内，放置灭菌塞、压盖后即得成品，-20℃以下保存。
实施例5使用培养基MAb MaxA6生产重组犬细小病毒单克隆抗体
(1)MAb MaxA6培养基制备
MAb MaxA6培养基成分及用量见表4，干粉及液体培养基制备方法与实施例3中的步骤相同，此处不再赘述。
(2)细胞复苏
细胞复苏方式与实施例2相同，不同之处在于，使用MAb MaxA6液体培养基。
(3)接种反应器和(4)灌注培养
接种反应器和灌注培养过程与实施例2相同；不同之处在于：从接种反应器算起整个灌注培养一共维持了21天，细胞密度和细胞活率如图7所示，共收液体38L，为培养体积的21倍，收获的培养液犬细小病毒血凝抑制效价≥2048。
根据细胞培养液中治疗性单抗的效价，使用超滤系统对细胞培养液进行浓缩超滤，使用过滤系统去除收获液细胞碎片，收获的滤过液-20℃以下保存。
依据《中华人民共和国兽药典》(2015年版)附录对浓缩液进行检测，无细菌、霉菌和支原体生长，浓缩液的犬细胞病毒血凝抑制效价≥20480。
将纯化的治疗性单抗经过稀释后，无菌、定量分装至无菌容器内，放置灭菌塞、压盖后即得成品，-20℃以下保存。
表5不同培养基培养效果
Figure BDA0003499637580000141
Figure BDA0003499637580000151
综上，本发明公开的无血清培养基成本低廉，适于工业化生产使用。连续灌注培养的生物反应器外接的中空纤维柱，带有细胞截留装置，可以过滤培养液中的表达产物和代谢废物，同时中空纤维柱带有反向冲洗的功能，避免长时间截留细胞而发生纤维堵塞，提高了细胞的密度，具有较高的利用价值。
本文的实施例旨在说明本发明的使用原理和应用效果，而非对本发明的限制，本领域的专业技术人员在不违背本发明的精神和范围内，可进行适当改动，本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (10)

1.一种SP2/0细胞培养基，其特征在于，包括：氨基酸、维生素、脂类、糖、微量元素、无机盐、复合大豆水解物、多胺、次黄嘌呤、胸苷、胆固醇、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、P188和苹果酸。
2.根据权利要求1所述的SP2/0细胞培养基，其特征在于，所述氨基酸包括谷氨酰胺。
3.根据权利要求2所述的SP2/0细胞培养基，其特征在于，所述培养基还包括细胞因子。
4.根据权利要求3所述的SP2/0细胞培养基，其特征在于，所述细胞因子为重组人源胰岛素。
5.根据权利要求4所述的SP2/0细胞培养基，其特征在于，
所述氨基酸包括：
300-500mg/L的L-精氨酸，100-300mg/L的L-精氨酸盐酸，800-1000mg/L的L-天冬酰胺，300-500mg/L的L-天冬氨酸，600-800mg/L的羟基脯氨酸，300-500mg/L的L-异亮氨酸，200-300mg/L的L-半胱氨酸，200-400mg/L的L-半胱氨酸-2-盐酸，200-400mg/L的L-甲硫氨酸，300-500mg/L的L-谷氨酸，50-80mg/L的甘氨酸，30-50mg/L的牛磺酸，350-500mg/L的L-组氨酸盐酸，400-600mg/L的L-亮氨酸，400-600mg/L的L-赖氨酸一水合物，200-400mg/L的L-脯氨酸，300-500mg/L的L-丝氨酸，200-400mg/L的L-苏氨酸，100-300mg/L的L-色氨酸，100-300mg/L的酪氨酸，5-10mg/L的L-a-氨基-n-丁酸，100-300mg/L的胱氨酸-2盐酸，100-300mg/L的L-苯丙氨酸，200-400mg/L的L-酪氨酸二钠二水合物，200-400mg/L的L-缬氨酸，3-5mg/L的还原型谷胱甘肽，1-4g/L的谷氨酰胺；和/或；
所述维生素包括：
0.1-0.3mg/L的生物素，50-70mg/L的氯化胆碱，2-4mg/L的维生素B12，10-15mg/L的叶酸，100-150mg/L的肌醇，18-25mg/L的D-泛酸钙，15-20mg/L的盐酸吡哆醇，1-3mg/L的核黄素，12-15mg/L的盐酸硫胺素，0.5-1mg/L的烟酰胺，0.4-1mg/L的DL-α-硫辛酸，0.0005-0.001mg/L的生育酚；和/或
所述脂类包括：
0.04-0.1mg/L的亚油酸；和/或；
所述糖包括：
3000-5000mg/L的蔗糖，1000-2000mg/L的半乳糖，2000-4000mg/L一水麦芽糖，1000-3000mg/L的葡萄糖，100-140mg/L的丙酮酸钠；和/或；
所述微量元素包括：
60-100mg/L的氯化钙，300-500mg/L的柠檬酸铁铵，30-50mg/L的氯化镁，30-50mg/L的硫酸镁，800-1000mg/L的氯化钾，0.006-0.008mg/L的偏钒酸铵，0.005-0.008mg/L的四水钼酸铵，0.05-0.1mg/L的五水硫酸铜，0.001-0.003mg/L的亚硒酸钠，0.001-0.003mg/L的四水合氯化锰，0.004-0.006mg/L的一水硫酸锰，0.001-0.003mg/L的硫酸镍，0.004-0.006mg/L的九水偏钒酸钠，0.5-1.5mg/L的九水偏硅酸钠，0.001-0.002mg/L的二水氯化亚锡，0.2-0.5mg/L的七水硫酸亚铁，0.03-0.05mg/L的硝酸钾，2-10mg/L的七水硫酸锌，10-15mg/L的乙醇胺盐酸；
和/或；
所述无机盐包括：
800-1000mg/L的磷酸二氢钠，100-150mg/L的一水磷酸氢二钠，2000-3000mg/L的氯化钠；和/或；
所述多胺为腐胺，含量为50-80mg/L；和/或；
所述次黄嘌呤含量为1-5mg/L，胸苷含量为1-5mg/L，4-羟乙基哌嗪乙磺酸50-100mg/L，P188 1000-5000mg/L，苹果酸300-500mg/L，胆固醇为0.5-1mg/L；所述复合大豆水解物的含量为1-5g/L；和/或；
所述重组人源胰岛素含量为1-10mg/L。
6.一种生产重组犬细小病毒单克隆抗体的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将表达重组犬细小病毒单抗的SP2/0细胞复苏活化后，使用权利要求1-5任意一项所述的培养基进行细胞活化和扩增培养，获得种子溶液；
2)将种子溶液接种反应器，当葡萄糖含量小于等于2g/L时，进行灌注培养，产生培养液；
3)当反应器细胞处于稳态后，开始收集所述灌注培养产生的培养液；当细胞活率低于80％时，停止收集培养液；
4)将收集的培养液过滤、浓缩、纯化、定量后即得重组犬细小病毒单克隆抗体成品。
7.根据权利要求6所述的生产重组犬细小病毒单克隆抗体的方法，其特征在于：所述步骤2)中接种后的溶液中细胞密度为0.3-1.0×106个/mL。
8.根据权利要求6所述的生产重组犬细小病毒单克隆抗体的方法，其特征在于：在所述灌注培养过程中，所述培养液中葡萄糖含量大于等于1g/L，且小于等于2g/L。
9.根据权利要求6所述的生产重组犬细小病毒单克隆抗体的方法，其特征在于：在所述灌注培养过程中，所述灌注培养的细胞特异性灌注速率为40-60p·L/(c·d)，维持细胞密度为3.0-3.5×107个/mL。
10.根据权利6-9任一项所述的生产重组犬细小病毒单克隆抗体的方法制备得到的重组犬细小病毒单克隆抗体。
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