CN101381702A

CN101381702A - 无动物组分细胞培养基

Info

Publication number: CN101381702A
Application number: CNA2008100511406A
Authority: CN
Inventors: 王雷
Original assignee: JILIN SAIDA BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: Changchun Meineng Biological Engineering Co., Ltd.
Priority date: 2008-09-10
Filing date: 2008-09-10
Publication date: 2009-03-11

Abstract

本发明提供一种无动物组分细胞培养基，是由氯化钙、氯化钾、无水硫酸镁、氯化钠、无水磷酸二氢钠、L－精氨酸盐酸盐、L－胱氨酸盐酸盐、L－谷氨酰胺、L－亮氨酸、L－异亮氨酸、L－组氨酸盐酸盐、L－酪氨酸、D葡萄糖、氯化胆碱、叶酸、烟酰胺、盐酸吡哆醛、核黄素、盐酸硫胺等按比例混合制成的。细胞可直接在本发明的细胞培养基上培养，而不必逐步驯化和培养，增加了所培养细胞的密度及收获次数，提高表达量，从而提高医药领域的疫苗产量；可有效的避免动物源性对所培养动物或人细胞的干扰。解决了现有无血清培养基培养细胞过早死亡、形态不饱和的问题。

Description

无动物组分细胞培养基

技术领域

本发明是对现有细胞培养基组分的改进，尤其是提供了一种无动物组分细胞培养基，属于生物材料技术领域。

背景技术

细胞培养基是生物技术领域中培养细胞主要的生物材料，直接影响到细胞的质量，只有好的培养基才能筛选、驯化出优质细胞。现有的细胞培养基中基本都含有小牛血清，用于维持细胞在体外较长时间生长繁殖，鉴于血清含有一些对细胞产生毒性的物质，会影响细胞的生长，甚至会造成细胞死亡，同时也增加了工业化生产中分离纯化的难度，目前，已有无血清培养基问世，但是在原代培养或者细胞生长状况不良时还是只能先用无血清的培养液进行培养，待细胞生长旺盛以后才能再换成现有无血清培养液；而且多数细胞转入现有的无血清培养基培养要有一个适应的过程，一般要逐步降低血清浓度，直至无血清培养。由于目前的无血清培养基包含非常少的蛋白质，所以更易于受外界因素影响，并缺乏血清中天然中和毒素、保护细胞大分子，容易导致所培养细胞的致死性损害。

发明内容

本发明提供一种无动物组分细胞培养基，解决了现有无血清培养基不能直接培养生长状况不良的细胞，多数细胞要逐步降低血清浓度才能适应现有的无血清培养基及易受外界因素影响、容易造成致死性损害的问题。

本发明无动物组分细胞培养基是由以下物质制成的：

细胞培养基中含196-204mg氯化钙、392-408mg氯化钾、95.72-99.62mg无水硫酸镁、6664-6936mg氯化钠、119.31-124.17mg无水磷酸二氢钠、123.48-128.52mg L-精氨酸盐酸盐、30.66-31.92mg L-胱氨酸盐酸盐、286.16-297.84mg L-谷氨酰胺、50.96-53.04mg L-亮氨酸、50.96-53.04mg L-异亮氨酸、41.16-42.84mg L-组氨酸盐酸盐、35.28-36.72mg L-酪氨酸、980-1020mg D葡萄糖、0.99-1.01mg氯化胆碱、0.99-1.01mg叶酸、0.99-1.01mg烟酰胺、0.99-1.01mg盐酸吡哆醛、0.09-0.11mg核黄素、0.99-1.01mg盐酸硫胺。

在上述组方中还含有：71.05-73.95mg L-赖氨酸盐酸盐、14.70-15.30mg L-蛋氨酸、31.36-32.64mg L-苯丙氨酸、45.08-46.92mg L-缬氨酸、47.04-48.96mgL-苏氨酸、9.80-10.20mg L-色氨酸、1.98-2.02mg i-肌醇、9.98-10.02mg酚红、0.99-1.01mg D泛酸钙。

本发明的无动物组分细胞培养基的制备工艺如下：

按上述比例称取原料，混合均匀即得本发明细胞培养基。

使用时，将本发明培养基溶于1000ml水中，经除菌过滤后即可使用。

本发明细胞培养基使用多种氨基酸以化学加工合成，完全替代血清培养基中的氨基酸组分，同时也减轻了后期分离纯化的工作压力。

本发明细胞培养基可用于培养CHO细胞、NSO细胞、BHK21细胞、VERO细胞、HEK293细胞、MDCK细胞、HeLa细胞、MDBK细胞等细胞。

对于必须添加血清培养的特殊细胞，如：Marc145细胞、骨髓间充质干细胞等，在本发明的细胞培养基中添加<3％质量的低量血清后即可实现成功培养，而现有血清培养基中则必须加入量为质量的8％～10％。

下面通过培养VERO细胞的对比试验表明本发明的积极效果：

使用本发明制备的细胞培养基和普通MEM细胞培养基(产品代码：MD600，批号：080312)在37℃的条件下直接培养复苏后的VERO细胞，并用显微镜观察各组细胞形态及生长增殖情况。

表1

项目	普通MEM细胞培养基	本发明细胞培养基
项目	普通MEM细胞培养基	本发明细胞培养基	新生牛血清量	10％	0
接种细胞密度	5×10⁴	5×10⁴	新生牛血清量	10％	0
接种细胞密度	5×10⁴	5×10⁴	pH(接种时)	7.0	7.0
细胞贴壁百分率(24h)	85	85	pH(接种时)	7.0	7.0
细胞贴壁百分率(24h)	85	85	细胞分裂百分率(24h)	80	85
细胞长成单层时间(小时)	24	24	细胞分裂百分率(24h)	80	85
细胞长成单层时间(小时)	24	24	换液次数	1	1
细胞形态	正常	正常	换液次数	1	1

本发明培养基培养的细胞分裂百分率明显优于普通MEM细胞培养基，培养基中细胞长成单层的时间与传统培养基相同，而且细胞形态基本一致(VERO细胞在不同培养基中的形态分别如图1和图2所示)。

本发明培养基的营养成分优于普通血清培养基，培养基中细胞增殖迅速，代谢旺盛，细胞分裂百分率(24h)明显高于普通血清培养基。

本发明相对于现有技术具有的优点和进步：细胞可直接在细胞培养基上培养，而不必逐步驯化和培养，增加了所培养细胞的密度及收获次数，提高表达量，从而提高医药领域的疫苗产量；可有效的避免动物源性对所培养动物或人细胞的干扰。解决了现有无血清培养基培养细胞过早死亡、形态不饱和的问题。本发明培养基培养的细胞不易发生老化脱落现象，细胞增殖迅速、代谢旺盛，细胞成活率高达95％以上，简化了后期的分离纯化工艺，使杂质含量降低，提高产品纯度，降低生产成本。

附图说明

图1、为本发明细胞培养基在Vero细胞捕捉照片；

图2、为GIBCO公司(美国)培养基在Vero细胞捕捉照片。

具体实施方式

通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。

实施例1

细胞培养基中含196mg氯化钙、392mg氯化钾、95.72mg无水硫酸镁、6664mg氯化钠、119.31mg无水磷酸二氢钠、123.48mg L-精氨酸盐酸盐、30.66mg L-胱氨酸盐酸盐、286.16mg L-谷氨酰胺、50.96mg L-亮氨酸、50.96mg L-异亮氨酸、41.16mg L-组氨酸盐酸盐、35.28mg L-酪氨酸、980mg D葡萄糖、0.99mg氯化胆碱、0.99mg叶酸、0.99mg烟酰胺、0.99mg盐酸吡哆醛、0.09mg核黄素、0.99mg盐酸硫胺，混合均匀即可。

实施例2

在实施例1的原料中添加：73.95mg L-赖氨酸盐酸盐、15.30mg L-蛋氨酸、32.64mg L-苯丙氨酸、46.92mg L-缬氨酸、48.96mg L-苏氨酸、10.20mg L-色氨酸、2.04mg i-肌醇、10.20mg酚红、1.02mg D泛酸钙，混合均匀即可。

实施例3

本发明细胞培养基的制备

无动物组分细胞培养基由200mg氯化钙、400mg氯化钾、97.67mg无水硫酸镁、6800mg氯化钠、121.74mg无水磷酸二氢钠、126mg L-精氨酸盐酸盐、31.92mgL-胱氨酸盐酸盐、292mg L-谷氨酰胺、42mg L-组氨酸盐酸盐、52mg L-异亮氨酸、52mg L-亮氨酸、72.5mg L-赖氨酸盐酸盐、15mg L-蛋氨酸、32mg L-苯丙氨酸、48mg L-苏氨酸、10mg L-色氨酸、36mg L-酪氨酸、46mg L-缬氨酸、1000mg D葡萄糖、10mg酚红、1mg D泛酸钙、1mg氯化胆碱、1mg叶酸、2mg i-肌醇、1mg烟酰胺、1mg盐酸吡哆醛、0.1mg核黄素、1mg盐酸硫胺混合均匀制成。

实施例4

本发明细胞培养基的制备

由204mg氯化钙、408mg氯化钾、99.62mg无水硫酸镁、6936mg氯化钠、124.17mg无水磷酸二氢钠、128.52mg L-精氨酸盐酸盐、31.60mg L-胱氨酸盐酸盐、297.84mg L-谷氨酰胺、42.84mg L-组氨酸盐酸盐、53.04mg L-异亮氨酸、53.04mg L-亮氨酸、73.95mg L-赖氨酸盐酸盐、15.30mg L-蛋氨酸、32.64mg L-苯丙氨酸、48.96mg L-苏氨酸、10.20mg L-色氨酸、36.72mg L-酪氨酸、46.92mgL-缬氨酸、1020mg D葡萄糖、10.02mg酚红、1.01mg D泛酸钙、1.01mg氯化胆碱、1.01mg叶酸、2.02mg i-肌醇、1.01mg烟酰胺、1.01mg盐酸吡哆醛、0.11mg核黄素、1.01mg盐酸硫胺混合均匀制成。

实施例5

细胞培养基中含204mg氯化钙、408mg氯化钾、99.62mg无水硫酸镁、6936mg氯化钠、124.17mg无水磷酸二氢钠、128.52mg L-精氨酸盐酸盐、31.92mg L-胱氨酸盐酸盐、197.84mg L-谷氨酰胺、53.04mg L-亮氨酸、53.04mg L-异亮氨酸、42.84mg L-组氨酸盐酸盐、36.72mg L-酪氨酸、1020mg D葡萄糖、1.01mg氯化胆碱、1.01mg叶酸、1.01mg烟酰胺、1.01mg盐酸吡哆醛、0.11mg核黄素、1.01mg盐酸硫胺混合均匀即可。

实施例6

在实施例5中还含有：71.05mg L-赖氨酸盐酸盐、14.70mg L-蛋氨酸、31.36mgL-苯丙氨酸、45.08mg L-缬氨酸、47.04mg L-苏氨酸、9.80mg L-色氨酸、1.98mgi-肌醇、9.98mg酚红、0.99mg D泛酸钙混合均匀即可。

实施例7

本发明细胞培养基的制备

由196mg氯化钙、392mg氯化钾、95.72mg无水硫酸镁、6664mg氯化钠、119.31mg无水磷酸二氢钠、123.48mg L-精氨酸盐酸盐、30.66mg L-胱氨酸盐酸盐、286.16mg L-谷氨酰胺、41.16mg L-组氨酸盐酸盐、50.96mg L-异亮氨酸、50.96mg L-亮氨酸、71.05mg L-赖氨酸盐酸盐、14.70mg L-蛋氨酸、31.36mg L-苯丙氨酸、47.04mg L-苏氨酸、9.80mg L-色氨酸、35.28mg L-酪氨酸、45.08mgL-缬氨酸、980mg D葡萄糖、9.98mg酚红、0.99mg D泛酸钙、0.99mg氯化胆碱、0.99mg叶酸、1.98mg i-肌醇、0.99mg烟酰胺、0.99mg盐酸吡哆醛、0.09mg核黄素、0.99mg盐酸硫胺混合均匀即可。

实施例8

细胞培养基中含200mg氯化钙、400mg氯化钾、97.67mg无水硫酸镁、6800mg氯化钠、121.74mg无水磷酸二氢钠、126mg L-精氨酸盐酸盐、31.29mg L-胱氨酸盐酸盐、292mg L-谷氨酰胺、52mg L-亮氨酸、52mg L-异亮氨酸、42mg L-组氨酸盐酸盐、36mg L-酪氨酸、1000mg D葡萄糖、1mg氯化胆碱、1mg叶酸、0.99-1.01mg烟酰胺、1mg盐酸吡哆醛、0.1mg核黄素、1mg盐酸硫胺，混合均匀制成。

实施例9

在实施例8中还含有：72.5mg L-赖氨酸盐酸盐、15mg L-蛋氨酸、32mg L-苯丙氨酸、46mg L-缬氨酸、48mg L-苏氨酸、10mg L-色氨酸、2mg i-肌醇、10mg酚红、1mg D泛酸钙。

Claims

1、一种无动物组分细胞培养基，是由以下物质制成的：

细胞培养基中，含196-204mg氯化钙、392-408mg氯化钾、95.72-99.62mg无水硫酸镁、6664-6936mg氯化钠、119.31-124.17mg无水磷酸二氢钠、123.48-128.52mg L-精氨酸盐酸盐、30.66-31.92mg L-胱氨酸盐酸盐、286.16-297.84mg L-谷氨酰胺、50.96-53.04mg L-亮氨酸、50.96-53.04mg L-异亮氨酸、41.16-42.84mg L-组氨酸盐酸盐、35.28-36.72mgL-酪氨酸、980-1020mg D葡萄糖、0.99-1.01mg氯化胆碱、0.99-1.01mg叶酸、0.99-1.01mg烟酰胺、0.99-1.01mg盐酸吡哆醛、0.09-0.11mg核黄素、0.99-1.01mg盐酸硫胺。

2、权利要求1所述的细胞培养基，其特征在于：含有71.05-73.95mg L-赖氨酸盐酸盐、14.70-15.30mg L-蛋氨酸、31.36-32.64mg L-苯丙氨酸、45.08-46.92mg L-缬氨酸、47.04-48.96mg L-苏氨酸、9.80-10.20mg L-色氨酸、1.98-2.02mg i-肌醇、9.98-10.02mg酚红、0.99-1.01mg D泛酸钙。

3、权利要求1或2所述的细胞培养基的制备工艺如下：

按比例称取原料，混合均匀即得。