CN103911298B

CN103911298B - 培养基组合物和培养基及对菌株进行活菌计数的方法

Info

Publication number: CN103911298B
Application number: CN201210592962.1A
Authority: CN
Inventors: 梁恒宇; 林海龙
Original assignee: Cofco Corp; Cofco Nutrition and Health Research Institute Co Ltd
Current assignee: Cofco Corp; Cofco Nutrition and Health Research Institute Co Ltd
Priority date: 2012-12-31
Filing date: 2012-12-31
Publication date: 2016-08-10
Anticipated expiration: 2032-12-31
Also published as: CN103911298A

Abstract

本发明公开了一种培养基组合物，该培养基组合物含有氮源，其特征在于，所述氮源含有尿素和/或氨基酸，以氮元素计，尿素和/或氨基酸占氮源总含量的80重量%以上，以培养基组合物的总重量为基准，以氮元素计，所述氮源的总含量为0.02‑15重量%。还公开了一种培养基，该培养基含有本发明提供的培养基组合物和水，其中，所述培养基组合物与水的重量比为1:20‑30。另外公开了一种对菌株进行活菌计数的方法，该方法包括：将菌株在培养基上进行平板培养，对培养后的菌株进行平板计数，其中，所述培养基为本发明提供的所述培养基。通过本发明的方法，根据菌落形态和颜色的不同可以对不同菌株进行活菌计数。

Description

培养基组合物和培养基及对菌株进行活菌计数的方法

技术领域

本发明涉及一种培养基组合物和含有该培养基组合物的培养基，以及利用该培养基对菌株进行活菌计数的方法。

背景技术

葡萄酒酿造是一个复杂的微生物学过程，其中酵母菌是占主导地位的微生物。葡萄酒的酒精发酵主要是在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的作用下，采用自然发酵、纯种发酵或混合发酵，将葡萄汁中的营养成分转化成酒精和其他风味物质的过程。

在葡萄酒酿造过程中，经常采用单一酿酒酵母菌株进行酒精发酵，但是近年来的研究充分表明，不同的酿酒酵母菌株所酿的葡萄酒在风格、品质及色、香和味上均有很大差异，也有越来越多的研究采用不同的酿酒酵母菌株对葡萄酒进行双菌株混合发酵，以期提高葡萄酒的品质或改良产品风味。在这种混合发酵过程中，为研究酿酒酵母不同菌株之间在数量上的演替关系，就需要在同一葡萄酒发酵体系中对酿酒酵母不同菌株进行活菌计数。但是，长期以来酵母菌的检测通常使用YEPD培养基、马铃薯培养基、麦芽汁培养基、察氏培养基等，这些培养基上生长的酵母菌往往形态极为相似，尤其是在对酿酒酵母进行检测时，很难对酿酒酵母不同菌株进行准确计数。WL培养基是一种用于酵母菌和细菌计数的培养基，该培养基可以用来检测并判别一些不同属种的酵母菌株，但是对于同一属种的酿酒酵母，即使是不同来源，也不能在一块培养平板上以菌落形态的不同加以区分。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术提供的培养基难以实现对酿酒酵母不同菌株同时进行活菌计数的缺陷，提供一种可以对菌株进行活菌计数的培养基组合物、培养基及活菌计数方法。

本发明的发明人发现，在所有的氮源中铵离子是最容易被酿酒酵母利用的氮源，而尿素以及氨基酸，特别是脯氨酸、尿素、亮氨酸、异亮氨酸、精氨酸、甘氨酸等，是酿酒酵母较难利用的氮源。当培养基中存在铵离子时，酿酒酵母优先利用铵离子；当培养基中铵离子的量受限或被消耗殆尽时，不同酿酒酵母菌株利用尿素以及脯氨酸等氨基酸较难利用的氮源的能力有着显著的差异，在培养基上生长时会显示出不同的生长速度，致使菌落直径大小出现差异，因此在培养基上容易辨别。

基于以上发现，本发明提供了一种培养基组合物，该培养基组合物含有氮源，其中，所述氮源含有尿素和/或氨基酸，以氮元素计,尿素和/或氨基酸占氮源总含量的80重量%以上，以培养基组合物的总重量为基准，以氮元素计，所述氮源的总含量为0.02-15重量%。

优选地，以氮元素计,尿素和/或氨基酸占氮源总含量的90重量%以上。

优选地，以培养基组合物的总重量为基准，以氮元素计，所述氮源的总含量为0.5-8重量%。

另一方面，本发明提供了一种培养基，该培养基含有一种培养基组合和水，其中，所述培养基组合物为本发明提供的培养基组合物，所述培养基组合物与水的重量比为1:20-30。

再一方面，本发明提供了一种对菌株进行活菌计数的方法，该方法包括：将菌株在培养基上进行平板培养，对培养后的菌株进行平板计数，其中，所述培养基为本发明提供的培养基。

由实施例和对比例可以看出，通过在培养基中添加酿酒酵母难以利用的氮源，并控制氮源的含量，优选的情况下，在培养基中还添加铋盐和亚硫酸盐，使得在该培养基中生长的酿酒酵母的不同菌株可以形成形态和颜色不同的菌落，从而可以区分酿酒酵母不同的菌株，因此，实现了对不同酿酒酵母菌株共同进行活菌计数的目的。

本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1显示了培养72小时后不同酿酒酵母菌株（CGMCC3284菌株和F15菌株）在培养基上的菌落直径和颜色；其中，CGMCC3284指酿酒酵母CGMCC3284菌株，F15指酿酒酵母F15菌株。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

一方面，本发明提供了一种培养基组合物，该培养基组合物含有氮源，其中，所述氮源含有尿素和/或氨基酸，以氮元素计,尿素和/或氨基酸占氮源总含量的80重量%以上，以培养基组合物的总重量为基准，以氮元素计，所述氮源的总含量为0.02-15重量%。

本发明中，所述氮源是指本发明所添加的尿素、氨基酸以及以铵盐形式存在的无机盐的总称。由于铋盐、维生素、酵母抽提物中所含有的含氮物质非常少，在计算培养基组合物中氮源的含量时，可以忽略不计，因此，这些物质中的含氮物质不作为本发明培养基组合物的氮源计算在内。

本发明基于利用酿酒酵母不同菌株利用难以利用的氮源的能力的不同而形成不同形态的菌落，从而对酿酒酵母不同菌株进行区分。但在保证酿酒酵母不同菌株在此培养基组合物配制成的培养基中可形成肉眼可区分的不同形态的菌落的前提下，培养基组合物中还可以含有可供酿酒酵母容易利用的氮源，例如，铵盐。因此，以氮元素计，尿素和/或氨基酸的含量可以是氮源总含量的80重量%以上，优选90重量%以上；以培养基组合物的总重量为基准，以氮元素计，所述氮源的总含量为0.02-15重量%。

优选地，为了进一步加强酿酒酵母不同菌株所形成的菌落的差异，以培养基组合物的总重量为基准，以氮元素计，所述氮源的总含量为0.5-8重量%。

本发明中，术语“菌落”是指由单个细胞在固体培养基表面生长繁殖到一定程度，形成的肉眼可见的、有一定形态、构造等特征的单个细胞的子细胞集团。

根据本发明，所述氨基酸可以是各种氨基酸，优选情况下，所述氨基酸选自脯氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、精氨酸和甘氨酸中的一种或多种，选用这些氨基酸可更进一步加强酿酒酵母不同菌株所形成的菌落形态的差异。

优选情况下，所述培养基组合物中还含有水溶性铋盐和水溶性亚硫酸盐。其中，对水溶性铋盐和水溶性亚硫酸盐的含量没有特别的限制，只要不对酿酒酵母产生毒害作用并且可实现本发明的目的即可，综合考虑成本和效果，以氮元素计的氮源的含量为100重量份，以铋元素计，所述水溶性铋盐的含量为24-462重量份，以亚硫酸根计，水溶性亚硫酸盐的含量为33-676重量份。

在酿酒酵母细胞中，硫化氢是硫酸盐还原序列（sulphate reductionsequence）途径的产物，并扮演着含硫氨基酸生物合成的中间产物。硫化氢的合成速率受到酿酒酵母细胞对含硫氨基酸需求和胞内氮源储备的调控。因此，酿酒酵母不同菌株产生硫化氢的能力是不同的，并且酿酒酵母的生长状况可严重影响其产生硫化氢的能力。亚硫酸铋可被酵母产生的硫化氢等还原性物质还原形成硫酸铋，这些硫酸铋积聚在酵母细胞内可形成带有不同颜色（无色、浅棕色、棕色、棕黑色等）的菌落。酿酒酵母细胞产硫化氢的能力越强，则对亚硫酸铋的还原能力越强，则形成的硫酸铋越多，菌落的颜色就越深。因此，通过在培养基中添加一定量的铋盐和亚硫酸盐，可以根据不同酿酒酵母细胞体内产硫化氢能力的强弱，得到颜色深浅不同的菌落来进一步区分酿酒酵母不同的菌株。

本发明中，所述铋盐和亚硫酸盐的来源没有特别的限制，例如，所述铋盐可以为柠檬酸铋铵，所述亚硫酸盐可以为亚硫酸钠和/或亚硫酸钾。

通常情况下，用于微生物培养的培养基中还含有微生物生长所需的碳源、磷源、无机盐、维生素和琼脂等成分，因此，本发明的培养基组合物中还含有碳源、磷源、无机盐、维生素和琼脂。本发明中，以上各物质的种类和含量可以为本领域常规的用于培养酿酒酵母的培养基中各物质种类和的含量，例如，以氮元素计的氮源的含量为100重量份，所述碳源的含量为315-4445重量份，所述磷源的含量为0.25-23重量份，所述无机盐的含量为0.26-4.9重量份，所述维生素的含量为0.15-5.2重量份，所述琼脂的含量为473-4445重量份。

根据本发明，所述碳源可以为葡萄糖，所述磷源可以为磷酸氢二铵、磷酸二氢铵、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾和磷酸二氢钾中的一种或多种；所述无机盐可以为七水硫酸镁、氯化钙、硫酸锌和五水硫酸铜中的一种或多种，所述维生素可以为生物素、泛酸钙、叶酸、肌醇、烟酸、维生素B6、核黄素、盐酸硫胺素和麦角固醇中的一种或多种。

根据本发明，所述无机盐是指本领域配制培养基组合物的常规的各种无机盐，而本发明所添加的铋盐以及亚硫酸盐不属于本发明所述的无机盐范畴。并且，对于本发明中可同时提供多种可被酿酒酵母利用的营养元素的物质，可根据需要将其定义为某一种具体的营养源，例如，磷酸二氢铵可根据需要将其定义为磷源，也可根据需要将其定义为氮源。

在本发明一种优选的实施方式中，所述碳源为葡萄糖，所述磷源为磷酸氢二铵、磷酸二氢铵、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾和磷酸二氢钾中的一种或多种；所述无机盐为七水硫酸镁、氯化钙、硫酸锌和五水硫酸铜，所述维生素为生物素、泛酸钙、叶酸、肌醇、烟酸、维生素B6、核黄素、盐酸硫胺素和麦角固醇；以氮元素计的氮源的含量为100重量份，七水硫酸镁的含量为0.13-2.3重量份，氯化钙的含量为0.13-2.3重量份，硫酸锌的含量为0.005-0.22重量份，五水硫酸铜的含量为0.0013-0.023重量份，生物素的含量为0.00005-0.0023重量份，泛酸钙的含量为0.01-0.23重量份，叶酸的含量为0.00005-0.0012重量份，肌醇的含量为0.00005-0.0012重量份，烟酸的含量为0.005-0.12重量份，维生素B6的含量为0.005-0.12重量份，核黄素的含量为0.00027-0.067重量份，盐酸硫胺素的含量为0.005-0.12重量份，麦角固醇的含量为0.13-4.5重量份。

根据本发明，根据所培养的酿酒酵母生长的需要，本发明的培养基组合物中还可以选择性的含有酵母抽提物。综合考虑本发明的目的，以氮元素计的氮源的含量为100重量份，所述酵母抽提物的含量为2.6-180重量份，优选为2.5-111重量份。

本发明中，术语“酵母抽提物”是指以食用酵母为原料,采用自溶、酶解、分离、浓缩等技术，将酵母细胞内的蛋白质、核酸等进行降解后精制而成的一种棕黄色可溶性膏状或浅黄色粉状的纯天然制品。是常用的一种配制生物培养基的原料和发酵工业中的主要原料。所述酵母抽提物可以通过商购获得，例如，可以购自上海味泽生物制品有限公司，货号为WZ202-1。

根据本发明，所述培养基组合物的制备方法包括将以上各种物质成分按照本发明的范围进行混合即可。

另一方面，本发明提供了一种培养基，该培养基含有一种培养基组合物和水，其中，所述培养基组合物为本发明提供的培养基组合物，所述培养基组合物与水的重量比为1:20-30。

其中，所述培养基的pH值为本领域培养酿酒酵母的培养基的常规的pH值，例如，所述培养基的pH值可以为5.5-6.5。

本发明中，所述培养基的制备方法包括将本发明提供的培养基组合物和水按照以上比例进行混合，使所述培养基组合物充分溶解于添加的水中，然后调节pH值并进行灭菌即可得到本发明的培养基。

根据本发明，在调节所述培养基组合物的pH值时可以使用0.1-2.0mol/L的碳酸氢钠或0.1-2.0mol/L的稀盐酸。

所述灭菌的条件在保证琼脂粉完全溶化的前提下，优选在115-121℃下灭菌15-20分钟。

另一方面，本发明提供了一种对菌株进行活菌计数的方法，该方法包括：将菌株在培养基上进行平板培养，对培养后的菌株进行平板计数，其中，所述培养基为本发明提供的培养基。

根据本发明，所述菌株可以为各种对本发明培养基中添加的氮源难以利用的菌株，优选情况下，所述菌株为酿酒酵母菌株，更优选葡萄酒酿酒酵母的不同菌株。

本发明中，术语“平板培养”是指将琼凝胶状固体培养基制成平面状，然后在此平面上培养所述酿酒酵母菌株。术语“平板计数”是指将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释液涂布到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。

本发明中，所述平板培养的方法为本领域技术人员所公知，例如，在无菌条件下，将熔化好的培养基倾注于平板中，待其冷却凝固后吸取0.1-0.5mL稀释好的菌悬液，然后在凝固的培养基上用玻璃、不锈钢或一次性塑料制成的涂布棒将所添加的菌悬液均匀涂布。

所述培养的条件也为本领域技术人员所公知，例如，可将上述涂布好的平板倒置在培养箱中进行培养，培养的温度可以为30-40℃，培养的时间可以为20-72小时。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

本发明所描述实施例和对比例中所选用的菌株包括：CGMCC3284菌株和CGMCC3732菌株来源于中国科学院微生物研究所中国普通微生物菌种保藏管理中心，并分别公开在公开号为CN101792719A和公开号为CN101838615A的专利申请中，CICC1450菌株，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，T73菌株、BH8菌株、D254菌株和F15菌株，分别购自ChristianHanson（Fresno,USA）、Gist Brocades（Fresno,USA）、Scott Labs.（Petaluma,USA）和Laffort（France）。

双蒸水是指将经过一次蒸馏后的水，再次蒸馏所得到的水。

原液是指将酿酒酵母培养18h后得到的菌液，即稀释前的菌液。

酵母抽提物购自上海味泽生物制品有限公司，货号为WZ202-1。

其它各培养基成分均购自北京蓝弋化工产品有限责任公司。

本发明所描述培养基组合物、培养基及培养方法不限于以上葡萄酒酿酒酵母菌株，对其它酿酒酵母菌株同样适用。

实施例1

本实施例说明酿酒酵母不同菌株的预培养

（1）YEPD培养基的制备

准确称取酵母抽提物10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，并使用双蒸水定容至1000mL，溶解后使用0.1mol/L的碳酸氢钠调节其pH至6.0，并于115℃下湿热灭菌20min。

（2）酿酒酵母不同菌株的单独培养

将CGMCC3284菌株、CGMCC3732菌株、CICC1450菌株、T73菌株、BH8菌株、D254菌株和F15菌株分别接种在100mL上述YEPD培养基中，接种量为10⁶CFU/mL，37℃下培养18小时。

分别取1mL单独培养至对数期的上述各酿酒酵母，用8.5重量%的生理盐水分别将其稀释10⁶倍得到相应的稀释后菌悬液C1（CGMCC3284）、菌悬液C2（CGMCC3732）、菌悬液C3（CICC1450）、菌悬液C4（T7）、菌悬液C5（BH8）、菌悬液C6（D254）和菌悬液C7（F15）。

（3）CGMCC3284菌株和CICC1450菌株的混合培养：

将CGMCC3284菌株和CICC1450菌株共同接种在100mL上述YEPD培养基中，接种接种量均为10⁶CFU/mL，37℃下培养18小时。

取1mL含有上述混合培养的CGMCC3284菌株和CICC1450菌株的菌液，用8.5重量%的生理盐水分别将其稀释10⁶倍得到稀释后的菌悬液C8。

（4）酿酒酵母CGMCC3284菌株、CGMCC3732菌株、F15菌株及D254菌株单独培养后的混合液的制备

分别取10mL含有本实施例（2）中单独培养的酿酒酵母CGMCC3284菌株的菌液、CGMCC3732菌株的菌液、F15菌株的菌液以及D254菌株的菌液在无菌三角瓶中进行混合得到混合液，然后在培养后的混合液中吸取1mL液体，用8.5重量%的生理盐水分别将其稀释10⁶倍得到稀释后的菌悬液C9。

（5）CGMCC3284菌株和F15菌株的混合培养：

将CGMCC3284菌株和F15菌株共同接种在100mL上述YEPD培养基组合物中，接种量均为10⁶CFU/mL，37℃下培养18小时。

分别取10mL含有本实施例（2）中单独培养的酿酒酵母CGMCC3284菌株的菌液和F15菌株的菌液在无菌三角瓶中进行混合得到混合液，然后分别在混合培养后的菌液中以及培养后的混合液中吸取1mL液体，用8.5重量%的生理盐水分别将其稀释10⁶倍得到稀释后的菌悬液C10和菌悬液C11。

（6）BH8菌株和D254菌株的混合培养：

将BH84菌株和D254菌株共同接种在1L上述YEPD培养基中，接种量均为10⁶CFU/mL，37℃下培养18小时，得到混合培养液C12。

实施例2-6

下面的实施例用于说明本发明提供的培养基组合物和培养基

实施例2

准确称取葡萄糖15g、磷酸氢二铵30mg、酵母抽提物0.5g、柠檬酸铋铵4.5g、脯氨酸5g、亚硫酸钠2.5g、生物素5μg、泛酸钙500μg、叶酸5μg、肌醇5μg、烟酸500μg、维生素B6250μg、核黄素250μg、盐酸硫胺素250μg、麦角固醇10mg、七水硫酸镁10mg、氯化钙10mg、硫酸锌0.5mg、五水硫酸铜100μg以及琼脂粉18g，加入到2000mL三角瓶中，混合均匀，得到本发明的培养基组合物A1。其中，以氮元素计，所述氮源的总含量为1.35重量%，所述氮源含有以氮元素计氮源总含量99重量%的脯氨酸。

向上述装有该培养基组合物A1的三角瓶中加入双蒸水并定容至1000mL，加热溶化后使用0.1mol/L的碳酸氢钠将pH调节至6.0。然后分装在250mL玻璃容器中，于115℃下湿热灭菌15分钟，得到本发明的培养基B1。

实施例3

准确称取葡萄糖12g、磷酸氢二铵100mg、酵母抽提物0.3g、柠檬酸铋铵3g、亮氨酸2g、亚硫酸钾6g、生物素2μg、泛酸钙1000μg、叶酸2μg、肌醇3μg、烟酸400μg、维生素B6500μg、核黄素100μg、盐酸硫胺素500μg、麦角固醇5mg、七水硫酸镁5mg、氯化钙5mg、硫酸锌1mg、五水硫酸铜50μg以及琼脂粉20g，加入到2000mL三角瓶中，混合均匀，得到本发明的培养基组合物A2。其中，以氮元素计，所述氮源的总含量为0.54重量%，所述氮源含有以氮元素计氮源总含量91重量%的亮氨酸。

向上述装有该培养基组合物A2的三角瓶中加入双蒸水并定容至1000mL，加热溶化后使用0.1mol/L的碳酸氢钠将pH调整到5.5。然后分装在250mL玻璃容器中，于121℃下湿热灭菌15分钟，得到本发明的培养基B2。

实施例4

准确称取葡萄糖20g、磷酸氢二钠5mg、磷酸二轻钾5mg、酵母抽提物0.1g、柠檬酸铋铵2g、尿素8g、亚硫酸钠2g、生物素10μg、泛酸钙400μg、叶酸3μg、肌醇2μg、烟酸200μg、维生素B6200μg、核黄素300μg、盐酸硫胺素200μg、麦角固醇20mg、七水硫酸镁7mg、氯化钙6mg、硫酸锌0.2mg、五水硫酸铜80μg和琼脂粉19g，加入到2000mL三角瓶中，混合均匀，得到本发明的培养基组合物A3。其中，以氮元素计，所述氮源的总含量为7.3重量%。，所述氮源含有以氮元素计氮源总含量100重量%的尿素。

向上述装有该培养基组合物A3的三角瓶中加入双蒸水并定容至1000mL，加热溶化后使用0.1mol/L的碳酸氢钠将pH调整到6.5。然后分装在250mL玻璃容器中，于115℃下湿热灭菌15分钟，得到本发明的培养基B3。

实施例5

按照实施例2的方法进行培养基组合物和培养基的配制。不同的是，培养基组合物中不添加铋盐，得到本发明的培养基B4。

实施例6

按照实施例2的方法进行培养基组合物和培养基的配制。不同的是，添加的氮源的量，本实施例中添加了50g的甘氨酸，其中，以氨元素计氮源的总含量为10.3重量%，所述氮源含有以氮元素计约氮源总含量100重量%的甘氨酸，得到本发明的培养基B5。

对比例1

本对比例用于说明现有技术的氮源

按照实施例2的方法进行培养基组合物和培养基的配制。不同的是，添将2.9g的硫酸铵替代了5g的脯氨酸，以氨元素计氮源的总含量为0.62g，以氮元素计,硫酸铵占氮源总含量的99重量%。

实施例7-13

下面的实施例用于说明本发明提供的对菌株进行活菌计数方法

实施例7

将灭菌后的培养基B1在无菌条件下倒入直径为70mm的一次性塑料培养皿中，每个培养皿中倒入的培养基的厚度为3-5毫米，无菌条件下使其冷却凝固，备用。

分别吸取0.1mL实施例1中制备的菌悬液C1、菌悬液C2、菌悬液C3、菌悬液C4、菌悬液C5、菌悬液C6和菌悬液C7，分别将其滴加在上述含有本发明培养基B1的培养皿中，用一次性涂布棒在整个培养基表面均匀涂布。涂布好后于30℃培养箱中恒温倒置培养72小时，此期间内每隔6小时观察并记录不同酿酒酵母菌株长出菌落的时间，72小时后观察并记录不同酿酒酵母菌株在培养基上的菌落直径和颜色。具体结果见表1。

表1

菌株编号	长出菌落时间（小时）	72h后菌落平均直径（毫米）	72h后菌落颜色
				CGMCC3284	21	2.2	乳黄色
CGMCC3732	30	1.7	棕色
				CICC1450	24	1.8	棕黑色
T73	33	1.4	棕褐色
				BH8	30	1.8	乳黄色
D254	39	0.8	黄棕色
				F15	42	0.5	乳白色

实施例8

分别吸取0.1mL实施例1中制备的菌悬液C2、菌悬液C3和菌悬液C8，分别将其滴加在上述含有本发明培养基B1的培养皿中，用一次性涂布棒在整个培养基表面均匀涂布。涂布好后于30℃培养箱中恒温倒置培养72小时，72小时后观察并记录不同酿酒酵母菌株在培养基上的菌落直径和颜色，并对不同培养体系中酿酒酵母进行计数，并按公式（1）计算得到相应的原液中的菌体浓度，结果见表2。

原液菌体浓度=培养皿中的相应菌株的菌落数×10×10⁶ （1）

表2

实施例9

将灭菌后的培养基B2在无菌条件下倒入直径为70mm的一次性塑料培养皿中，每个培养皿中倒入的培养基的厚度为3-5毫米，无菌条件下使其冷却凝固，备用。

分别吸取0.1mL实施例1制备的菌悬液C1、菌悬液C2、菌悬液C6、菌悬液C7和菌悬液C9，分别将其滴加在上述含有本发明培养基B2的培养皿中，用一次性涂布棒在整个培养基表面均匀涂布。涂布好后于37℃培养箱中恒温倒置培养72小时，72小时后观察并记录不同酿酒酵母菌株在培养基组上的菌落直径和颜色，并对不同培养体系中酿酒酵母进行计数，并按公式（1）计算得到相应的原液中的菌体浓度。结果见表3。

表3

实施例10

将灭菌后的培养基B3在无菌条件下倒入直径为70mm的一次性塑料培养皿中，每个培养皿中倒入的培养基的厚度为3-5毫米，无菌条件下使其冷却凝固，备用。

分别吸取0.1mL实施例1中制备的菌悬液C1、菌悬液C7、菌悬液C10和菌悬液C11，分别将其滴加在上述含有本发明培养基B3的培养皿中，用一次性涂布棒在整个培养基表面均匀涂布。涂布好后于30℃培养箱中恒温倒置培养72小时，72小时后观察并记录不同酿酒酵母菌株在培养基组上的菌落直径和颜色，并对不同培养体系中酿酒酵母进行计数，并按公式（1）计算得到相应的原液中的菌体浓度。结果见表4。

表4

实施例11

分别将含有实施例1中制备的菌悬液C5的原液、菌悬液C6的原液和混合培养液C12，以10⁶CFU/mL的接种量接种于50升2011年产赤霞珠葡萄汁中，在20-24℃下进行葡萄酒发酵，发酵过程中分别对单独培养和混合培养的葡萄汁进行取样，稀释至10^-6后并按照实施例7中的方法进行菌落计数，共发酵7天，具体结果见表5。

表5

实施例12

按照实施例7的方法进行酿酒酵母不同菌株的活菌计数，不同的是，所用的培养基为实施例5提供的培养基B4，结果见表6。

表6

实施例13

按照实施例2的方法进行酿酒酵母不同菌株的活菌计数，不同的是，所用的培养基为实施例6提供的培养基B5，结果见表7。

表7

对比例2

本实施例用于说明采用现有的WL培养基对酿酒酵母不同菌株进行计数的方法

按照实施例2的方法进行酿酒酵母不同菌株的活菌计数，不同的是，所用的培养基为对比例1提供的培养基D1。结果显示，所述酿酒酵母CGMCC3284菌株和CICC1450菌株的形态以及颜色无差异。

通过以上实施例7-13和对比例2可以看出，采用本发明的培养基对酿酒酵母的不同菌株进行活菌计数，可有效的对不同的菌株进行区分。本发明的实施例12没有添加铋盐，因此酿酒酵母的不同菌株的菌落不会形成不同的颜色，因此可区分菌落大小不同的菌株；实施例13中的氮源含量较高，因此，酿酒酵母不同的菌株生长受抑制的程度明显减小，菌落的形态较为接近，因此，可根据其颜色的不同进行区分；而本发明的实施例7-11由于添加了铋盐以及将氮源的种类和含量控制在优选范围内，因此，酿酒酵母不同菌株形成的菌落的区分效果达到了最佳。

Claims

1.一种培养基组合物，该培养基组合物含有氮源，其特征在于，所述氮源含有尿素和/或氨基酸，以氮元素计，尿素和/或氨基酸占氮源总含量的80重量％以上，以培养基组合物的总重量为基准，以氮元素计，所述氮源的总含量为0.02-15重量％；

其中，所述培养基中含有碳源、磷源、无机盐、维生素和琼脂，以氮元素计的氮源的含量为100重量份，所述碳源的含量为315-4445重量份，所述磷源的含量为0.25-23重量份，所述无机盐的含量为0.26-4.9重量份，所述维生素的含量为0.15-5.2重量份，所述琼脂的含量为473-4445重量份；

其中，所述碳源为葡萄糖，所述磷源为磷酸氢二铵、磷酸二氢铵、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾和磷酸二氢钾中的一种或多种，所述无机盐为七水硫酸镁、氯化钙、硫酸锌和五水硫酸铜，所述维生素为生物素、泛酸钙、叶酸、肌醇、烟酸、维生素B6、核黄素、盐酸硫胺素和麦角固醇；以氮元素计的氮源的含量为100重量份，七水硫酸镁的含量为0.13-2.3重量份，氯化钙的含量为0.13-2.3重量份，硫酸锌的含量为0.005-0.22重量份，五水硫酸铜的含量为0.0013-0.023重量份，生物素的含量为0.00005-0.0023重量份，泛酸钙的含量为0.01-0.23重量份，叶酸的含量为0.00005-0.0012重量份，肌醇的含量为0.00005-0.0012重量份，烟酸的含量为0.005-0.12重量份，维生素B6的含量为0.005-0.12重量份，核黄素的含量为0.00027-0.067重量份，盐酸硫胺素的含量为0.005-0.12重量份，麦角固醇的含量为0.13-4.5重量份。

2.根据权利要求1所述的培养基组合物，其中，以氮元素计，尿素和/或氨基酸占氮源总含量的90重量％以上。

3.根据权利要求1所述的培养基组合物，其中，以培养基组合物的总重量为基准，以氮元素计，所述氮源的总含量为0.5-8重量％。

4.根据权利要求1、2或3所述的培养基组合物，其中，所述氨基酸选自脯氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、精氨酸和甘氨酸中的一种或多种。

5.根据权利要求1、2或3所述的培养基组合物，其中，所述培养基中还含有水溶性铋盐和水溶性亚硫酸盐；以氮元素计的氮源的含量为100重量份，以铋元素计，所述水溶性铋盐的含量为24-462重量份，以亚硫酸根计，水溶性亚硫酸盐的含量为33-676重量份。

6.根据权利要求5所述的培养基组合物，其中，所述铋盐为柠檬酸铋铵，所述亚硫酸盐为亚硫酸钠和/或亚硫酸钾。

7.根据权利要求1、2、3或6所述的培养基组合物，其中，所述培养基中还含有酵母抽提物，以氮元素计的氮源的含量为100重量份，所述酵母抽提物的含量为2.6-180重量份。

8.根据权利要求1、2、3或6所述的培养基组合物，其中，所述培养基中还含有酵母抽提物，以氮元素计的氮源的含量为100重量份，所述酵母抽提物的含量为2.5-111重量份。

9.一种培养基，该培养基含有一种培养基组合物和水，其特征在于，所述培养基组合物为权利要求1-8中任意一项所述的培养基组合物，所述培养基组合物与水的重量比为1:20-30。

10.根据权利要求9所述的培养基，其中，所述培养基的pH值为5.5-6.5。

11.一种对菌株进行活菌计数的方法，该方法包括：将菌株在培养基上进行平板培养，对培养后的菌株进行平板计数，其特征在于，所述培养基为权利要求9或10所述的培养基。

12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述菌株为酿酒酵母菌株。

13.根据权利要求11或12所述的方法，其中，所述菌株为至少两种酿酒酵母菌的菌株。

14.根据权利要求11或12所述的方法，其中，所述平板培养的条件包括：培养的温度为30-40℃，培养的时间为20-72小时。