CN104267025B - 环境水中非挥发性有机物雌激素活性检测方法 - Google Patents
环境水中非挥发性有机物雌激素活性检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
环境水中非挥发性有机物雌激素活性检测方法。本发明提供了一种检测环境水中非挥发性有机物雌激素活性的方法，用以评价环境水体中综合雌激素活性强度。本发明是通过固相萃取的方法，提取定量水样中的有机物，将所提取的有机物与重组酵母菌共同培养后，检测并评价水样中有机物的雌激素活性。本发明所用重组酵母菌的DNA序列整合有人的雌激素受体hER基因，当具有雌激素活性的物质与雌激素受体结合，可以分泌β‑半乳糖苷酶，它能分解底物β‑D半乳糖苷氯酚红，使其由黄色变为红色，通过检测波长540nm吸光度值，计算其雌激素活性的强度。同时，在水样有机物雌激素活性检测中，以17β‑雌二醇作为阳性对照物，结合其与重组酵母菌的反应模型，可推算出水样有机物的雌激素活性强度。
Description
技术领域
本发明属于环境科学领域，涉及环境水样评价技术，具体涉及环境水样中非挥发性有机物的雌激素活性检测与评价。
背景技术
环境中存在多种能模拟、干扰动物及人类内分泌系统的物质，这些外源性化学物进入机体后，干扰体内内分泌物质的合成、释放、运输、代谢、结合等过程，并且能够激活或抑制内分泌系统的功能，从而破坏机体内环境的稳定。这一大类物质被统称为环境内分泌干扰物(environmentalendocrine disrupters/environmental endocrine disruptingchemicals)。环境内分泌干扰物从来源上可以分为天然与人工合成两大类，前者如植物激素异黄酮类(isoflavones)、木酚素类(lignans)等，后者如药用雌激素DES(Diethylstilbestrol,己烯雌酚)、杀虫剂(O,p’-DDT、氯丹等)、除草剂(除草醚，甲草胺等)、工业化学物(多氯联苯，二噁英，铅、汞、镉等重金属)、塑料工业原料(酞酸酯类，烷基酚类)等。从作用效应上，环境内分泌干扰物有拟雌激素作用和拟雄激素作用，但大多数化学物质是以雌激素效应为主，故大部分环境内分泌干扰物亦可称为环境雌激素。Carlsen在1992年撰文指出，近50年以来人类精子质量不断下降，成年男性精液量减少，精子数量下降了50％。同时，男性生殖系统发育异常与病变(隐睾、尿道下裂、睾丸和前列腺癌)增加了近一倍。许多学者把这种现象的发生归因于环境雌激素的污染。研究表明，环境雌激素对机体甲状腺素、儿茶酚胺、睾酮等有明显的干扰效应，临床上表现为畸型胎、性别畸型、发育异常、生殖功能障碍、代谢紊乱，甚至癌症等。人群流行病学调查也显示人类的生殖障碍，发育异常，以及某些癌症与内分泌干扰有关。环境雌激素的毒理学研究是目前的一大热点。研究发现，在雄性小鼠性分化的关键时期，环境内分泌干扰物邻苯二甲酸二辛酯(DEHP)可导致其隐睾发生，且其发生率与剂量存在一定的相关性。近来人们认为，环境内分泌干扰物不仅对生殖系统有影响，对非生殖系统尤其是免疫系统也有直接的或者间接的影响。淋巴器官尤其是能够分化出T细胞的胸腺可以影响生殖器官，免疫系统可以通过中枢神经系统－胸腺－性腺轴影响到生殖系统，而性腺激素也可以通过影响淋巴器官而间接影响免疫能力。由于自身免疫性疾病如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮的发生与机体内性激素水平的变化有关，而环境内分泌干扰物可以直接打破激素平衡，所以有人认为与后者的接触增大了自身免疫病的发病风险。
水污染作为一个世界性的难题在我国表现尤为突出。研究资料显示，我国各种水体都已受到不同程度的环境内分泌干扰物的污染，甚至包括人们赖以生存的水源水。检测评价这类物质在水中的存在意义十分重大。针对水体中存在多种微量具雌激素活性有机物的现状，本专利旨在提出一套检测与评价水中非挥发性混合有机物雌激素活性的方法。
发明内容
本发明的任务是提出一种环境水样中非挥发性有机物雌激素活性检测方法，用以评价不同环境水体中多种、微量有机物(天然、人工合成)综合的雌激素活性强度及其变化规律。与已有的检测与评价水中类雌激素污染物的方法相比，该方法快速简便，成本低廉，所需样品量少，灵敏度高，能够反映水中混合有机物雌激素受体的诱导效应，并且通过标准曲线计算得到样品中类雌激素污染物的毒性当量值。
实现本发明的技术方案是：通过固相萃取的方法，将水中的有机物进行吸附，然后进行洗脱、浓缩，将浓缩的有机物样本与重组酵母菌共同培养，该酵母菌的DNA序列整合有人的雌激素受体hER基因，当具有雌激素活性的物质与雌激素受体结合，可以分泌产生一种生物酶(β-半乳糖苷酶)，它能分解底物β-D半乳糖苷氯酚红(Chlorophenol red-β-dgalactopyranoside，CPRG)，使其由黄色变为红色，通过检测540nm吸光度值，计算其雌激素活性的强度；同时，以雌二醇作为阳性对照物，结合其与重组酵母菌的反应模型，推算出水样有机物样本的雌激素活性。
本发明所使用的酵母菌株为雌激素受体重组酵母菌(Saccharomycescerevisiae)，可根据以下文献所提出的方法进行构建。
①Benita S.Katzenellenbogen，Bhavna Bhardwaj，Henry Fang，B.Avery Ince，Farzad Pakde1，Joseph C.Reese，David Schodin and Carol K.Wrenn.Hormone bindingand transcription activation by estrogen receptors:Analyses using mammalianand yeast systems.The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology,1993，47:39-48；
②何世华，梁增辉，战威，贾凌志,晁福寰.环境雌激素重组酵母测评系统的建立.环境与健康杂志，2002，19(1):57-59；
③李剑，饶凯锋，马梅，王子健.酵母双杂交技术构建重组雌激素受体相关受体(ERR)基因酵母.环境科学学报，2011，31(1):33-39。
本发明提供的环境水样中非挥发性有机物雌激素活性检测方法，包括以下步骤：
步骤一：通过固相萃取的方法，对水中的微量有机物进行吸附、富集，然后进行洗脱、浓缩，得到浓缩有机物样本。
步骤二：酵母菌增殖培养基、测试培养基和酵母菌液的制备。
①酵母菌增殖培养基为液体培养基，每升包括以下成分：
KH2PO411.5～13.5g；
(NH4)2SO41.5～2.0g；
KOH 3.5～4.2g；
MgSO40.12～0.22g；
Fe2(SO4)30.65～0.80mg；
L-白氨酸31～50mg；
L-组氨酸40～60mg；
腺嘌呤33～50mg；
L-精氨酸-HCl 15～22mg；
L-甲硫氨酸15～22mg；
L-酪氨酸22～35mg；
L-异亮氨酸22～35mg；
L-赖氨酸-HCl 22～35mg；
L-苯丙氨酸19～25mg；
L-谷氨酸85～92mg；
L-缬氨酸130～156mg；
L-丝氨酸310～350mg；
L-天门冬氨酸90～110mg；
维生素B10.3～0.5mg；
维生素B60.3～0.5mg；
维生素B30.3～0.5mg；
内消旋肌醇Myo-inositol1.1～3.3mg；
Biotin维生素H 0.3～0.5mg；
L-苏氨酸1.9～2.8g；
硫酸铜5～9mg；
葡萄糖18～22g；
酵母菌增殖培养基的配制方法：在1升超纯水中依次加入以上各种成分，通过震荡使先加入的成分溶解后，再加入后一成分，直至最后成分溶解，混匀；再加入显色底物β-D半乳糖苷氯酚红(CPRG)100mg，即得到酵母菌增殖培养基；酵母菌增殖培养基配制完毕后应过滤除菌。
②酵母菌液的制备：将雌激素受体重组酵母菌株接种至酵母菌增殖培养基后，30℃振荡培养24h～48h得到酵母菌液，在此酵母菌液加入甘油，酵母菌液与甘油的体积比85：15，混匀后每2mL分装于1支无菌EP管中，保存于-80℃低温冰箱。
③测试培养基的配制：取50mL酵母菌增殖培养基加至无菌三角瓶中，从－80℃冰箱取含酵母菌液的EP管一支，将其解冻后取0.2mL加入到酵母菌增殖培养基中，30℃摇床中培养12～36h，在每升新配制的酵母菌增殖培养基中加入15～25mL培养了12～36h的酵母菌液，形成测试培养基，所加酵母菌液浓度需至少满足以下一条：①显微镜下计数约4×107个/mL；②波长640nm吸光度值为0.8～1.2。
步骤三：以17β-雌二醇作为阳性对照物，将雌二醇、浓缩有机物样本分别与重组酵母菌共同培养；即每次试验均设阳性对照(17β-雌二醇)和阴性对照(即溶剂对照，丙酮或无水乙醇)。每个受试水样至少设置三组平行对照。阳性对照、阴性对照和受试水样均由所设置的浓度梯度进行倍比稀释，然后将其置于无菌环境中，待溶剂挥发干燥后各加入200μL测试培养基，于30℃培养72h后，测量540nm和640nm吸光度值。
步骤四：以阳性对照物17β-雌二醇浓度为横坐标，以吸光度值为纵坐标绘制阳性对照标准曲线，得到拟合曲线及其方程，各测试水样的吸光度值则带入所得方程计算得出17β-雌二醇当量水平；
步骤五：对于具有雌激素活性的水样，采用水样量评价法和阳性物当量法来评价和比较其中有机物雌激素活性的强度。
水样量评价法：
即产生与阳性物同等效应所需要浓缩的水样量。用EC25-E2表示各水样中非挥发性有机物的雌激素活性相当于阳性对照物17β-雌二醇产生效应最大值1/4(1/4E2max)时所需要的水样量(mL)，其值越小，表示水样中非挥发性有机化合物的雌激素活性越高。将540nm下的吸光度与640nm下的吸光度相除以消除菌液浓度的影响，取校正后的吸光度与水样量进行曲线拟合，从所得的方程中求出产生与阳性对照物17β-雌二醇最大效应相当的25％活性的水样量，即EC25-E2，以mL表示。
阳性物当量法：
雌二醇当量(EEQs)表示一定体积水样的雌激素活性水平所对应的相当效应的阳性对照物17β-雌二醇浓度，值越大其雌激素活性越强。将540nm下的吸光度减去640nm下的吸光度以消除菌液浓度的影响，取校正后的阳性对照组阳性对照物17β-雌二醇吸光度最大值作为100％雌激素效应，对校正后的阳性对照吸光度系列进行曲线拟合，从所得的方程中求出50％雌激素效应的对应的阳性对照物17β-雌二醇浓度(ng)，再对校正后的样品吸光度系列进行曲线拟合，求出50％雌激素效应的水样的量(L)，由此计算得出各水样的EEQs，结果以ng/L表示。
本发明提供的检测方法可用于：①检测、评价与比较不同水体中有机物的雌激素活性强度水平。②水环境中多种、微量混合有机物综合的雌激素活性检测与评价。③使水中非挥发性有机物雌激素活性作为城镇自来水厂、污水处理厂评价水处理工艺效果的指标，方便其选择适合去除环境内分泌干扰物的水处理工艺和方法。
本发明方法具体操作：
环境水样收集：收集容器：5L棕色玻璃瓶(预处理方法)，玻璃器皿的预处理如下：使用前需浸泡浓硫酸重铬酸钾洗液24h，取出以超纯水冲洗至少3次洗净，置于450℃烘烤2h。
环境水样中非挥发性有机物提取方法：
C18柱的活化
活化：使用5mL甲醇(色谱纯)浸润10min后，以5mL/min的速率抽滤，重复两次；再使用5mL超纯水浸润10min后，以5mL/min的速率抽滤，重复两次。
水样过柱：各水样以约2mL/min的流速通过活化完毕的C18柱富集水样中的有机物。全程监测TOC以确保吸附柱的未饱和。
有机物提取：有机物的提取按照以下步骤依次进行：
①淋洗：使用5mL超纯水以5mL/min的速率抽滤；
②冷冻干燥:将淋洗之后的C18柱放置于真空冷冻干燥机中冻干3h；
③洗脱：使用2mL甲醇(色谱纯)浸润10min后，以1mL/min的速率抽滤，重复一次；再使用2mL二氯甲烷(色谱纯)浸润10min后，以1mL/min的速率抽滤；最后使用2mL正己烷(色谱纯)浸润10min后，以1mL/min的速率抽滤。
④将所得的洗脱液置于氮吹仪中，40℃，氮吹至干品；
⑤溶剂定容，使用无水乙醇或者丙酮定容，定容后使得0.1mL溶液中含250mL水样的有机物；
⑥把定容后的样品放置于4℃冰箱中避光保存。
培养基的配制
每升酵母菌增殖培养基成分包括以下成分：
KH2PO411.5～13.5g；(NH4)2SO41.5～2.0g；KOH 3.5～4.2g；MgSO40.12～0.22g；Fe2(SO4)30.65～0.80mg；L-白氨酸31～50mg；L-组氨酸40～60mg；腺嘌呤33～50mg；L-精氨酸-HCl 15～22mg；L-甲硫氨酸15～22mg；L-酪氨酸22～35mg；L-异亮氨酸22～35mg；L-赖氨酸-HCl 22～35mg L-苯丙氨酸19～25mg；L-谷氨酸85～92mg；L-缬氨酸130～156mg；L-丝氨酸310～350mg；L-天门冬氨酸90～110mg；维生素B10.3～0.5mg；维生素B60.3～0.5mg；维生素B30.3～0.5mg；内消旋肌醇Myo-inositol1.1～3.3mg；Biotin维生素H 0.3～0.5mg；L-苏氨酸1.9～2.8g；硫酸铜5～9mg；葡萄糖18～22g。
在1升超纯水中依次加入以上各个物质，边加边震荡混匀。之后加入显色底物β-D半乳糖苷氯酚红(CPRG)100mg。酵母菌增殖培养基配置完毕后应过滤除菌。
测试培养基的配制：
在每升增殖培养基中加入15～25mL培养了12～36h酵母菌液形成测试培养基。所加酵母菌液浓度(需至少满足以下一条)：①显微镜下计数约4×107个/mL；②吸光度值(640nm)为0.8～1.2。
有机物的雌激素活性检测
试验组设阳性对照物17β-雌二醇、阴性对照(即溶剂对照，丙酮或无水乙醇)和环境水样有机浓缩物待测组。在无菌96孔板中将阳性对照组、阴性对照组和受试水样组均由设置浓度梯度进行倍比稀释。将96孔板置于无菌环境中待溶剂挥发干燥后每孔各加入200μL测试培养基后置于生化培养箱中30℃培养72h后测量540nm和640nm吸光度值。
结果计算：
1.EC25-E2：将540nm下的吸光度与640nm下的吸光度相除以消除菌液浓度的影响，取校正后的吸光度与水样量进行多项式拟合：
Y＝aX3+bX2+cX+d
从所得的方程中求出产生与阳性对照物17β-雌二醇最大效应相当的25％活性的水样量，即EC25-E2，以mL表示。
2.雌二醇当量(EEQs):将540nm下的吸光度减去640nm下的吸光度以消除菌液浓度的影响，取校正后的阳性对照组阳性对照物17β-雌二醇吸光度最大值作为100％雌激素效应，对校正后的阳性对照吸光度系列进行曲线拟合(多项式拟合)，从所得的方程中求出50％雌激素效应的对应的阳性对照物17β-雌二醇浓度(ng)，再对校正后的样品吸光度系列进行曲线拟合，求出50％雌激素效应的水样的量(L)，由此计算得出各水样的EEQs，结果以ng/L表示。
本专利的创新及优势在于以下几方面：
1.目前针对水体中的环境雌激素物质综合毒性的评价尚缺乏统一标准，本专利提出了一套完善的环境雌激素物质综合毒性评价方法。
2.本专利在水样中的有机物富集过程中全程监测TOC以确保吸附柱的未饱和，以保证水样中的有机物充分富集。采用三种不同极性的有机溶剂(甲醇、二氯甲烷和正己烷)对富集物质进行洗脱，确保了不同极性的有机物质能够充分洗脱。
3.本专利采用了毒理学评价指标EC25-E2和化学分析指标雌二醇当量(EEQs)相结合的评价体系。从不同的角度验证了水中环境雌激素物质的综合毒性。
4.目前，检测与评价水中有机物生物毒性多采用Amberlite XAD等大孔树脂提取水中微量有机物。本专利中的水样前处理方法采用C18柱提取水中微量有机物，操作更简便，富集效率更高，方便大批次水样的前处理；而且所使用的商品化C18柱，相比手工填充制备的大孔树脂柱重现性和精密度更佳，检测结果的比较更科学，方便适合形成新的规范与标准。
本发明提供了一种检测环境水中非挥发性有机物雌激素活性的方法，用以评价不同环境水体中多种、微量有机物(天然、人工合成)综合的雌激素活性强度。本发明是通过固相萃取的方法，提取定量水样中的有机物，将所提取的有机物与重组酵母菌共同培养后，检测并评价水样中有机物的雌激素活性。本发明所用重组酵母菌的DNA序列整合有人的雌激素受体hER基因，当具有雌激素活性的物质与雌激素受体结合，可以分泌产生一种生物酶(β-半乳糖苷酶)，它能分解底物β-D半乳糖苷氯酚红(Chlorophenol red-β-dgalactopyranoside，CPRG)，使其由黄色变为红色，通过检测波长540nm吸光度值，计算其雌激素活性的强度。同时，在水样有机物雌激素活性检测中，以17β-雌二醇作为阳性对照物，结合其与重组酵母菌的反应模型，可推算出水样有机物的雌激素活性强度。本发明与已有的检测与评价水中类雌激素污染物的方法相比，具有快速简便、成本低廉、所需样品量少、灵敏度高等优点，并能反映水中混合有机物雌激素受体的诱导效应，且通过标准曲线计算可得到水中类雌激素污染物的毒性当量值，方便不同水样中有机物雌激素活性强度的比较与评价。本发明适用于环境水样，如地表水、自来水厂的水源水及各处理工艺环节出水、污水处理厂进厂污水及各处理工艺环节出水。及各种可溶于有机溶剂的受试样品。
附图说明
图1为雌激素活性检测试验中阳性对照物(17β-雌二醇)与校准后吸光度(OD值)拟合曲线，图中横坐标为阳性对照物17β-雌二醇(E2)的浓度，作图时，横坐标对数化处理。纵坐标为校准的吸光度值，即640nm的吸光度减去540nm吸光度所得值。经过三次方曲线拟合即y＝ax3+bx2+cx+d,R2需达到0.9及以上说明具有较好的拟合，能投入计算。
图2为我国某地表水的雌激素活性检测评价结果季节性变化图，有图中可知，各水文期源水的雌激素活性强于出厂水，管网末梢水最弱。三个水文期以枯水期的雌激素活性最强，丰水期最弱，雌激素活性表现出随季节的变化趋势。
具体实施方式
实施例1
对地表水中非挥发有机物的雌激素活性评价
以我国某地的地表水为对象，按照下述的方法对某年平水期，丰水期，枯水期三个水文期的水样进行雌激素活性评价。
步骤一、通过固相萃取的方法，对水样中的微量有机物进行吸附、富集，然后进行洗脱、浓缩，得到浓缩有机物样本。
使用洁净棕色玻璃瓶收集我国某地的地表水样(湖泊、江河水及以其为水源的自来水厂出厂水和管网末梢水样)，每个水样采集量为4L。
水样中非挥发性有机物提取方法
C18柱的活化：使用Waters C181000mg 6cc，用5mL甲醇(色谱纯)浸润
10min后，以5mL/min的速率抽滤，重复两次；再使用5mL超纯水浸润10min
后，以5mL/min的速率抽滤，重复两次。
上样过柱：各水样以约2mL/min的流速通过活化完毕的C18柱富集水样中的有机物。
有机物提取：有机物的提取按照以下步骤依次进行。
①淋洗：使用5mL超纯水以5mL/min的速率抽滤
②冷冻干燥:将淋洗之后的C18柱放置于真空冷冻干燥机中冻干3h
③洗脱：使用2mL甲醇(色谱纯)浸润10min后，以1mL/min的速率抽滤，重复一次；再使用2mL二氯甲烷(色谱纯)浸润10min后，以1mL/min的速率抽滤；最后使用2mL正己烷(色谱纯)浸润10min后，以1mL/min的速率抽滤。
④将所得的洗脱液置于氮吹仪中，40℃，氮吹至干品
⑤溶剂定容，使用无水乙醇或者丙酮定容，定容后使得0.1mL溶液中含250mL水样的有机物
⑥把定容后的样品放置于4℃冰箱中避光保存
步骤二、酵母菌增殖培养基、酵母菌液和测试培养基的制备。
①配制1L酵母菌增殖培养基，在1L超纯水中依次加入以下物质：
KH2PO412g；(NH4)2SO41.8g；KOH 4.0g；MgSO40.17g；Fe2(SO4)30.70mg；L-白氨酸40mg；L-组氨酸50mg；腺嘌呤40mg；L-精氨酸-HCl 18mg；L-甲硫氨酸18mg；L-酪氨酸28mg；L-异亮氨酸28mg；L-赖氨酸-HCl 28mg L-苯丙氨酸22mg；L-谷氨酸90mg；L-缬氨酸140mg；L-丝氨酸330mg；L-天门冬氨酸100mg；维生素B10.4mg；维生素B60.4mg；维生素B30.4mg；内消旋肌醇Myo-inositol 2.5mg；Biotin维生素H 0.4mg；L-苏氨酸2.3g；硫酸铜7mg；葡萄糖20g。震荡混匀之后加入显色底物β-D半乳糖苷氯酚红(CPRG)100mg。增殖培养基配置完毕后过滤灭菌。
②酵母菌液的制备：
取50mL酵母菌增殖培养基加至无菌三角瓶中，从－80℃冰箱取含酵母菌液的EP管一支，将其解冻后取0.2mL加入到酵母菌增殖培养基中，30℃摇床中培养24h。
③测试培养基的配制：
在新配制的1L酵母菌增殖培养基中加入20mL培养了24h的酵母菌液(菌液浓度为4×107个/mL)形成测试培养基。
步骤三、雌激素活性检测试验。
试验组设阳性对照(17β-雌二醇)，阴性对照(即溶剂对照，丙酮或无水乙醇)，受试水样组。每个受试水样至少设置三平行对照。阳性对照组，阴性对照组，受试水样组均由设置溶度梯度倍比稀释系列。
取洁净无菌的96孔板一块，阳性对照物(17β-雌二醇)以3000ng依次二倍稀释固定于A排；受试水样一浓缩物以依次二倍稀释固定于B、C、D排；受试水样二浓缩物以依次二倍稀释固定于E、F、G排；阴性对照无水乙醇以依次二倍稀释固定固定于96孔板H排。每孔100μL的液体量。样品置于无菌环境中待溶剂挥发干燥后每孔各加入200μL测试培养基。置于30℃培养72h后测量540nm和640nm吸光度值。
结果计算：
1.EC25-E2：将540nm下的吸光度与640nm下的吸光度相除以消除菌液浓度的影响，取校正后的吸光度与水样量进行曲线拟合，从所得的方程中求出产生与阳性对照物(17β-雌二醇)最大效应相当的25％活性的水样量，即EC25-E2，以mL表示。
2.雌二醇当量(EEQs)：将540nm下的吸光度减去640nm下的吸光度以消除菌液浓度的影响，取校正后的阳性对照组17β-雌二醇吸光度最大值作为100％雌激素效应，对校正后的17β-雌二醇吸光度系列进行曲线拟合，从所得的方程中求出50％雌激素效应的对应的17β-雌二醇浓度(ng)，再对校正后的样品吸光度系列进行曲线拟合，求出50％雌激素效应的水样的量(L)，由此计算得出各水样的EEQs，结果以ng/L表示。
得到的结果如下：枯水期雌激素活性最强表现为EC25-E2值最小且EEQ值最大，丰水期雌激素效应最弱表现为EC25-E2值最大且EEQ值最小，呈现负相关，其毒理学意义一致，说明这两个评价指标能够从不同角度相互印证。随着水文期的季节性变化，地表水源水的雌激素效应明显强于其出厂水和管网末梢水(见表1、图1、图2)。此次应用的评价指标EC25-E2和EEQ值与国内该水体的其他评价研究结果相当，与目前按照国家标准检测水中单一环境雌激素物质的方法相比，不仅经济、简便，而且能反映多种、微量环境雌激素物质的综合效应。
表1 我国某地表水的雌激素检测评价结果
表1为我国某地表水的雌激素检测评价结果，由表1可知：枯水期雌激素活性效应最强表现为EC25-E2值最小且EEQ值最大，丰水期雌激素效应最弱表现为EC25-E2值最大且EEQ值最小。表现出随着水文期的季节性变化规律。地表水源水的雌激素效应明显强于其出厂水和管网末梢水。
实施例2
对自来水厂水处理工艺单元出水中有机物雌激素活性的检测与评价
以我国某地自来水厂各种不同净水工艺出水为对象，按照下述的方法对水样进行雌激素活性的检测与评价。
步骤一、通过固相萃取的方法，对水样中的微量有机物进行吸附、富集，然后进行洗脱、浓缩，得到浓缩有机物样本。
使用洁净棕色玻璃瓶收集了同一水源水经我国某地水厂不同净水处理工艺(工艺A、B、C、D、E)处理后的水样。每个水样采集量为4L。
水样中非挥发性有机物提取方法
C18柱的活化：使用Waters C181000mg 6cc，用5mL甲醇(色谱纯)浸润10min后，以5mL/min的速率抽滤，重复两次；再使用5mL超纯水浸润10min后，以5mL/min的速率抽滤，重复两次。
上样过柱：各水样以约2mL/min的流速通过活化完毕的C18柱富集水样中的有机物。
有机物提取：有机物的提取按照以下步骤依次进行：
①淋洗：使用5mL超纯水以5mL/min的速率抽滤；
②冷冻干燥:将淋洗之后的C18柱放置于真空冷冻干燥机中冻干3h；
冷冻干燥确保C18小柱吸附的有机物在处理过程中的损失最大程度的减少(如温度过高的挥发分解)；
③洗脱：
使用2mL甲醇(色谱纯)浸润10min后，以1mL/min的速率抽滤，重复一次；再使用2mL二氯甲烷(色谱纯)浸润10min后，以1mL/min的速率抽滤；最后使用2mL正己烷(色谱纯)浸润10min后，以1mL/min的速率抽滤；
④将所得的洗脱液置于氮吹仪中，40℃，氮吹至干品；
⑤溶剂定容，使用无水乙醇或者丙酮定容，定容后使得0.1mL溶液中含250mL水样的有机物；
⑥把定容后的样品放置于4℃冰箱中避光保存；
步骤二、酵母菌增殖培养基、酵母菌液和测试培养基的制备：
①配制1L酵母菌增殖培养基，在1L超纯水中依次加入以下物质：
KH2PO413.5g；(NH4)2SO42.0g；KOH 4.2g；MgSO40.22g；Fe2(SO4)30.80mg；L-白氨酸45mg；L-组氨酸55mg；腺嘌呤41mg；L-精氨酸-HCl 19mg；L-甲硫氨酸20mg；L-酪氨酸35mg；L-异亮氨酸35mg；L-赖氨酸-HCl35mg L-苯丙氨酸25mg；L-谷氨酸92mg；L-缬氨酸156mg；L-丝氨酸350mg；L-天门冬氨酸110mg；维生素B10.5mg；维生素B60.5mg；维生素B30.5mg；内消旋肌醇Myo-inositol3.0mg；Biotin维生素H 0.5mg；L-苏氨酸2.8g；硫酸铜8mg；葡萄糖21g。震荡混匀之后加入显色底物β-D半乳糖苷氯酚红(CPRG)100mg。增殖培养基配置完毕后过滤灭菌。
②酵母菌液的制备：
取50mL酵母菌增殖培养基加至无菌三角瓶中，从－80℃冰箱取含酵母菌液的EP管一支，将其解冻后取0.2mL加入到酵母菌增殖培养基中，30℃摇床中培养24h。
③测试培养基的配制：
在新配制的1L增殖培养基中加入16mL培养了28h酵母菌液形成测试培养基。该菌液浓度为5×107个/mL
步骤三、雌激素活性检测试验：
试验组设阳性对照(17β-雌二醇)，阴性对照(即溶剂对照，丙酮或无水乙醇)，受试水样组。每个受试水样至少设置三平行对照。阳性对照组，阴性对照组，受试水样组均由设置溶度梯度倍比稀释系列；
取洁净无菌的96孔板一块，阳性对照物(17β-雌二醇)以3000ng依次二倍稀释固定于A排；受试水样一浓缩物以依次二倍稀释固定于B、C、D排；受试水样二浓缩物以依次二倍稀释固定于E、F、G排；阴性对照无水乙醇以依次二倍稀释固定于96孔板H排。每孔100μL的液体量。样品置于无菌环境中待溶剂挥发干燥后每孔各加入200μL测试培养基。置于30℃培养72h后测量540nm和640nm吸光度值。
结果计算：
1.EC25-E2：将540nm下的吸光度与640nm下的吸光度相除以消除菌液浓度的影响，取校正后的吸光度与水样量进行曲线拟合，从所得的方程中求出产生与阳性对照物17β-雌二醇最大效应相当的25％活性的水样量，即EC25-E2，以mL表示。
2.雌二醇当量(EEQs)：将540nm下的吸光度减去640nm下的吸光度以消除菌液浓度的影响，取校正后的阳性对照组17β-雌二醇吸光度最大值作为100％雌激素效应，对校正后的阳性对照吸光度系列进行曲线拟合，从所得的方程中求出50％雌激素效应的对应17β-雌二醇浓度(ng)，再对校正后的样品吸光度系列进行曲线拟合，求出50％雌激素效应的水样的量(L)，由此计算得出各水样的EEQs，结果以ng/L表示。
以EC25-E2作为评价指标，得到如下结果：某地自来水厂不同净水工艺出水中有机物雌激素活性强度依次为：水源水>B工艺>E工艺>C工艺>D工艺>A工艺(未检出)。根据上述检测结果可知，A工艺清除源水中的类雌激素物质最为彻底，可以视为去除该类物质的最优工艺，这为选择净水工艺提供了指导性意见。
Claims (3)
1.一种环境水中非挥发性有机物雌激素活性检测方法，包括以下步骤：
步骤一、通过固相萃取的方法，对待测水样中的微量有机物进行吸附、富集，然后进行洗脱、浓缩，得到浓缩有机物样本；
步骤二、酵母菌增殖培养基、酵母菌液和测试培养基的制备：
①酵母菌增殖培养基为液体培养基，每升包括以下成分：
KH2PO4 11.5～13.5g；
(NH4)2SO4 1.5～2.0g；
KOH 3.5～4.2g；
MgSO4 0.12～0.22g；
Fe2(SO4)3 0.65～0.80mg；
L-白氨酸 31～50mg；
L-组氨酸 40～60mg；
腺嘌呤 33～50mg；
L-精氨酸-HCl 15～22mg；
L-甲硫氨酸 15～22mg；
L-酪氨酸 22～35mg；
L-异亮氨酸 22～35mg；
L-赖氨酸-HCl 22～35mg；
L-苯丙氨酸 19～25mg；
L-谷氨酸 85～92mg；
L-缬氨酸 130～156mg；
L-丝氨酸 310～350mg；
L-天门冬氨酸 90～110mg；
维生素B1 0.3～0.5mg；
维生素B6 0.3～0.5mg；
维生素B3 0.3～0.5mg；
内消旋肌醇Myo-inositol 1.1～3.3mg；
Biotin维生素H 0.3～0.5mg；
L-苏氨酸 1.9～2.8g；
硫酸铜 5～9mg；
葡萄糖 18～22g；
通过震荡使先加入的成分溶解后，再加入后一成分，直至最后成分溶解，混匀，再加入显色底物β-D半乳糖苷氯酚红(CPRG)100mg，即得到酵母菌增殖培养基，酵母菌增殖培养基配制完毕后应过滤除菌；
②酵母菌液的制备：将雌激素受体重组酵母菌株接种至酵母菌增殖培养基后，30℃振荡培养24h～48h得到酵母菌液，在此酵母菌液中加入甘油，酵母菌液与甘油的体积比85：15，混匀后每2mL分装于1支无菌EP管中，保存于-80℃低温冰箱；
③测试培养基的配制：取50mL酵母菌增殖培养基加至无菌三角瓶中，从－80℃冰箱取含酵母菌液的EP管一支，将其解冻后取0.2mL加入到酵母菌增殖培养基中，30℃摇床中培养12～36h；在每升新配制的酵母菌增殖培养基中加入15～25mL培养了12～36h的酵母菌液，形成测试培养基，所加酵母菌液浓度需至少满足以下一条：①显微镜下计数约4×107个/mL；②波长640nm吸光度值为0.8～1.2；
步骤三：以17β-雌二醇作为阳性对照物，将17β-雌二醇、浓缩有机物样本分别与重组酵母菌共同培养；即每次试验以17β-雌二醇为阳性对照，以丙酮或无水乙醇为阴性对照，每个受试水样至少设置三组平行对照，阳性对照、阴性对照和受试水样均由所设置的浓度梯度进行倍比稀释，然后将其置于无菌环境中，待溶剂挥发干燥后各加入200μL测试培养基，于30℃培养72h后，测量波长540nm和640nm吸光度值；
步骤四：以阳性对照物17β-雌二醇浓度为横坐标，以吸光度值为纵坐标绘制阳性对照标准曲线，得到拟合曲线及其方程，各测试水样的吸光度值则带入所得方程计算得出17β-雌二醇当量水平；
步骤五：对于具有雌激素活性的水样，采用水样量评价法或/和阳性物当量法来评价和比较水样中有机物雌激素活性的强度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的采用水样量评价法来评价和比较水样中有机物雌激素活性的强度的具体方法是：用EC25-E2表示各水样中非挥发性有机物的雌激素活性相当于阳性对照物17β-雌二醇产生效应最大值1/4(1/4E2max)时所需要的水样量，以mL表示，其值越小，表示水样中非挥发性有机化合物的雌激素活性越高，将540nm下的吸光度与640nm下的吸光度相除以消除菌液浓度的影响，取校正后的吸光度与水样量进行曲线拟合，从所得的方程中求出与阳性对照物17β-雌二醇(E2)最大效应值1/4活性强度相当的水样量，即EC25-E2，以mL表示。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的采用阳性物当量法来评价和比较水样中有机物雌激素活性的强度的具体方法是：雌二醇当量(EEQs)表示一定体积水样的雌激素活性水平所对应的相当效应的阳性对照物17β-雌二醇浓度，值越大其雌激素活性越强，将540nm下的吸光度减去640nm下的吸光度以消除菌液浓度的影响，取校正后的阳性对照组阳性对照物17β-雌二醇吸光度最大值作为100％雌激素效应，对校正后的阳性对照吸光度系列进行曲线拟合，从所得的方程中求出50％雌激素效应的对应的阳性对照物17β-雌二醇浓度，以ng表示，再对校正后的样品吸光度系列进行曲线拟合，求出50％雌激素效应的水样的量，以L表示，由此计算得出各水样的EEQs，结果以ng/L表示。
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