CN101975776A - 用于环境雌激素类污染物检测的基因工程试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

一种境检测技术领域的用于环境雌激素类污染物检测的基因工程试剂盒及其应用，该试剂盒组分含量为：2×10⁴体积份的LB培养基、1体积份的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷、20体积份的氯仿、10体积份的十二烷基硫酸钠溶液、20体积份的邻-硝基苯-β-D-半乳糖苷以及100体积份的碳酸钠溶液。本发明检测过程更加简便快捷，只需2～3小时即可获得结果；没有特殊的仪器要求，样品需要量少，检测稳定性高，检测灵敏度可达ng/L；在大大降低了分析成本的同时也提高了分析率。

Description

用于环境雌激素类污染物检测的基因工程试剂盒及其应用 

技术领域

本发明涉及一种境检测技术领域的基因工程试剂盒及其应用方法，具体是一种用于环境雌激素类污染物检测的基因工程试剂盒及其应用。 

背景技术

环境雌激素类污染物(Environmental Estrogens，EEs)是自然或人类活动中产生的在环境中持久存在的一类化学物质，可通过直接或间接的方式在动物和人类体内蓄积、富集，在机体内与激素受体结合，它的作用与动物内分泌激素的作用类似，会引起人类及多种生物的神经系统失调、内分泌紊乱、免疫能力下降以及生殖失常等，直接关系着人类社会与生物圈生存与繁衍的根本性安全。因此，必须对EEs作全方位的检测，以评估其潜在的风险与危害。 

目前，EEs的检测手段主要有化学法和生物学法。化学法中应用最广泛的一种是高效液相色谱法，它往往与其它技术相结合来检测EEs，如固相微萃取技术-高效液相色谱法(SPME-HPLC)，高效液相色谱法-飞行时间质谱法(HPLC-ToF)以及高效液相色谱-串联质谱联用法(HPLC-MS/MS)等。虽然化学法测定环境激素含量准确性较高且方法较多，但其样品前处理和测定步骤十分复杂，仪器价格昂贵，且只能局限于对目标化合物的分析方面，限制了化学法在检测EEs的推广与应用。生物检测方法可以兼顾EEs之间的加和作用和协同作用。子宫生长试验是最早建立的生物学检测EEs活性的方法，随后，细胞检测EEs的方法如人类乳腺癌细胞培养，大鼠子宫腺癌细胞培养，肝细胞卵黄素生成实验等也有一定应用。尽管动物及细胞检测方法可比较有效地研究雌激素类物质的代谢过程，但其模型建立难度大，操作复杂，筛选通量不大，且哺乳动物细胞的抗毒素能力较低，所以不太适于大量样品的EEs快速检测。相比于哺乳动物细胞，微生物具有培养操作简单，筛选通量大，抗毒素能力强等特点，更适于高通量样品的快速筛查。利用分子生物学技术建立的重组酵母系统(YES)(Takamura Enya T，Ishihara J，Tahara S，et al.Analysis of estrogenic activity of food stuffs and cigarette smoke condensates using a yeast estrogen screening method.FoodChem Toxicol，2003，41(4)：543～550)是近年来应用较广泛的EEs生物检测方法，其检测灵敏度和特异性较好，且费用低廉。但酵母生长速度较慢，检测周期较长，仍需进一步完善。随着我国经济的快速发展和EEs污染 问题的日益严重，亟需建立更为简便快捷、高效灵敏且经济的高通量生物学检测EEs的方法。 

与其它微生物相比，大肠杆菌具有生长周期短，遗传背景清楚，操作步骤简单，改造技术成熟，培养成本低廉等优势，是进行环境EEs生物学检测的极佳个体，结合近年来分子生物学研究的热点之一——蛋白质内含肽(Intein)，可实现高效灵敏、快捷经济的高通量检测。蛋白质内含肽是存在于前体蛋白质中的一段氨基酸序列，在蛋白成熟过程中可发生自我剪切，从前体蛋白中释放出来，同时连接两端的肽链，形成有活性的成熟蛋白。目前，蛋白内含肽已应用到蛋白质工程领域的各个方面，如蛋白快速纯化，蛋白互作检测，蛋白体内外连接及环化，及蛋白质结构与活性关系研究；在医学、制药、传染病学、农学等多个领域都有应用。由于蛋白质内含肽最早是在微生物中发现，且具有微生物易培养、易于操作、理化性质明确等性质，因此内含肽在微生物分子生物学方面的应用最为广泛。最近，有关条件性蛋白内含肽的研究备受研究者关注，一些条件性蛋白内含肽被陆续构建成功。这些内含肽仅在特定条件下，如温度和药物诱导时(Rubing Liang et al.A novel strategy to create temperature-sensitive mutants with T7-expression system in Escherichia coli，J Microbiol Meth，2007，68(3)：497～506)，才能发生剪切，产生有活性的目标蛋白。利用条件性蛋白内含肽来调控蛋白活性的方法与其它方法相比，其本底表达更低，不同条件下蛋白的表达水平与活性差异更明显，使用范围更广泛。若利用雌激素敏感的蛋白内含肽，将该内含肽与颜色蛋白融合，即可实现受雌激素诱导的颜色蛋白表达，从而在分光光度计下进行快速检测。 

经对现有文献资料检索发现，公开号为CN 1624483A的中国发明专利申请说明书披露了一种检测环境雌激素效应的试剂盒及其制备方法，该方法利用抗原抗体反应来检测环境雌激素效应的试剂盒。它利用了包被在酶标板杀伤的鲫卵黄蛋白原多克隆抗体和酶标记鲫卵黄蛋白原单克隆抗体来反应。步骤包括：制备鲫卵黄蛋白原多克隆抗体，包被于酶标板上，用BSA封闭；制备鲫卵黄蛋白原单克隆抗体，并用酶标记，将标记的抗体与等量甘油混合；将鲫卵黄蛋白原多克隆抗体与鲫卵黄蛋白原单克隆抗体共同包装，得到为其检测试剂盒。该试剂盒检测方法复杂，需多步操作，时间较长；价格昂贵，成本高；抗原抗体反应假阳性较高；检测阈值较高，一般为500～1400ng/mL；且该试剂盒的应用范围有限，只能检测鲫鱼和相关种类的鱼类的血清或血浆中含有的卵黄蛋白原。 

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种用于环境雌激素类污染物检测的基因工程试剂盒及其应用，检测过程更加简便快捷，只需2～3小时即可获得结果；没有特殊的仪器要 求，样品需要量少，检测稳定性高，检测灵敏度可达ng/L；在大大降低了分析成本的同时也提高了分析率。 

本发明是通过以下技术方案实现的： 

本发明涉及一种检测环境雌激素类污染物的基因工程试剂盒，其组分为：2×10⁴体积份的LB培养基、1体积份的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、20体积份的氯仿、10体积份的十二烷基硫酸钠溶液(SDS)、20体积份的邻-硝基苯-β-D-半乳糖苷(ONPG)以及100体积份的碳酸钠溶液。 

所述的十二烷基硫酸钠溶液是指质量百分数浓度为1％的SDS的水溶液。 

所述的碳酸钠溶液是指浓度为1M的Na₂CO₃的水溶液。 

本发明涉及上述试剂盒的检测方法，包括如下步骤： 

步骤一，培养大肠埃希氏菌(Escherichia coli)DE3(pLacZMER)； 

所述的培养是指：在37℃环境下采用振荡摇床以以180rpm的转速培养，培养至OD₆₀₀为0.6。 

所述的大肠埃希氏菌DE3(pLacZMER)为包含质粒pLacZMER的大肠杆菌，具有卡那霉素抗性，生长培养基为LB培养基，生长与培养温度为37度；显著特征为：雌激素加入后会产生颜色反应，且强度与雌激素浓度呈正相关。 

步骤二，向基因工程菌株的培养物中加入IPTG并进行诱导处理； 

所述的诱导处理是指：在37℃环境下采用振荡摇床以以180rpm的转速培养1小时。 

步骤三，向基因工程菌株的培养物中依次加入氯仿、SDS和ONPG并进行孵育处理后加入碳酸钠溶液，再置于紫外分光光度计中检测得到环境雌激素类污染物的含量。 

所述的孵育处理是指：在28℃的环境下温育至培养物的颜色为黄色。 

所述的置于紫外分光光度计中检测是指：采用紫外分光光度计测定OD₄₂₀和OD₅₅₀后根据标准曲线定量计算β-半乳糖苷酶活性＝[1000×(OD₄₂₀-OD₅₅₀)×1.75]/[OD₆₀₀×(T2-T1)×V]，并得到环境雌激素类污染物的含量，其中：T2和T1分别为反应终止时间和反应起始时间，单位为分钟；V为所取菌液体积，单位为mL，OD₄₂₀和OD₅₅₀OD₆₀₀为光密度，OD＝log(1/trans)，trans为检测物的透光值。 

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：本发明利用含有雌激素敏感的蛋白内含肽的基因工程菌株并结合分光光度技术，建立了一种高通量快速检测环境雌激素效应的基因工程试剂盒与方法。利用本发明的试剂盒进行检测，检测过程更加简便快捷，只需2～3小时即可获得结果；没有特殊的仪器要求，样品需要量少，检测稳定性高，检测灵敏度可达ng/L；在大大 降低了分析成本的同时也提高了分析率。 

本发明所述的大肠埃希氏菌Escherichia coli DE3(pLacZMER)于2010年06月04号提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏编号为：CGMCCNO：3913；该单位的地址为：北京市朝阳区北辰西路，中国科学院微生物研究所，邮编，100101。 

附图说明

图1为质粒pLacZMER酶切鉴定结果图； 

图2为菌体蛋白SDS-PAGE检验结果图； 

图3体外纯化的工程菌株表达蛋白在17β-雌二醇诱导后的SDS-PAGE结果图； 

图4DE3(pLacZMER)工程菌在加入不同浓度的17β-雌二醇后β-半乳糖苷酶活性变化图； 

图5DE3(pLacZMER)工程菌在加入不同浓度的双酚A后β-半乳糖苷酶活性变化图； 

图6DE3(pLacZMER)工程菌在加入不同浓度的多环芳烃屈后β-半乳糖苷酶活性变化图； 

图7DE3(pLacZMER)工程菌在加入不同浓度的多环芳烃6OH-屈后β-半乳糖苷酶活性变化图。 

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。 

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。 

实施例1 

基因工程试剂盒的制备 

步骤一，将人源雌激素受体α蛋白的Ser301-Thr553肽段与蛋白质内含肽(Mycobacterium tuberculosis recA intein)融合，构建雌激素敏感的蛋白质内含肽嵌合体； 

(1)PCR扩增蛋白质内含肽(Mycobacterium tuberculosis recA intein)片段，引物为5’-GGATCCtgtttcgactacagcacccg-3’，5’-AAGCTTgttgtgcaccatgacaccgt-3’，纯化回收；将该片段和质粒pET28a分别用Bam HI/Hind III双酶切后，回收酶切片段；之后用T4DNA连接酶连接两个酶切片段，化学转化大肠杆菌DH5α(F-endA1gln V44thi-1recA1relA1gyrA96deoRnupGΦ80dlacZΔM15Δ(lacZYA-argF)U169，hsdR17(rK-mK+)，λ-)，铺LBK平板，37℃过夜培养；挑取克隆并提取质粒，测序鉴定，阳性质粒命名为pMRecA，纯化回收，-20℃保存备用。 

(2)PCR扩增人雌激素受体蛋白的Ser301至Thr553区域，模板为Gal4-ER-VP16(Randall Morse，Wadsworth Center索取)。将人雌激素受体和pMRecA质粒用Bss HII酶切后连接，即为雌激素敏感的蛋白质内含肽嵌合体质粒pMER。 

步骤二，将颜色蛋白β-半乳糖苷酶基因克隆到质粒的T7启动子下游，构建可高水平表达颜色蛋白的质粒。测序结果证实； 

以质粒pME6522为模板，用引物(5’-CCTTGGGGATCCatgaccatgattcaaggcacg-3’；5’-CCTTGGAAGCTTttatttttgacaccagaccaactgg-3’)扩增全长的lacZ基因片段，纯化回收；将该片段和质粒pET28a分别用Bam HI/Hind III双酶切后，回收酶切片段；之后用T4DNA连接酶连接两个酶切片段，化学转化大肠杆菌DH5α(F-endA1gln V44thi-1recA1relA1gyrA96deoRnupG Φ80dlacZΔM15Δ(lacZYA-argF)U169，hsdR17(rK-mK+)，λ-)，铺LBK平板，37℃过夜培养；挑取克隆并提取质粒，测序鉴定，阳性质粒命名为pETlacZ，纯化回收，-20℃保存备用。 

步骤三，利用反向PCR和无痕定点插入重组技术，将雌激素敏感的蛋白内含肽插入到颜色蛋白β-半乳糖苷酶基因中，构建雌激素敏感的基因工程菌株。酶切检测证实基因插入无误；蛋白质电泳检测证实工程菌株在无雌激素存在时颜色蛋白不表达，雌激素加入后可诱导颜色蛋白的高水平表达，且蛋白表达水平与雌激素浓度成正比；β-半乳糖苷酶活性检测证实该菌株在无雌激素存在时没有β-半乳糖苷酶的活性，雌激素的加入可诱导出高水平的β-半乳糖苷酶活性，并与雌激素浓度成正比。 

(1)以质粒pETlacZ为模板，用引物(5’-tgttactcgctcacatttaatgttg-3’；5’-acccgtcggattctccgtg-3’)线性扩增pETlacZ，纯化回收，-20℃保存备用； 

(2)以质粒pMER为模板，PCR扩增M^ER intein片段 

(5’-GTCAATCCGCCGTTTGTTCCCACGGA GAATCCGACGGGTtgtttcgactacagcacccg-3’，5’-TAGCCAGCTTTCATCAACATTAAATGTGAGCGAGTAA CAgttgtgcaccatgacaccgt-3’)，两侧带有与lacZ插入位点两侧同源的序列。 

(3)将线性片段pETlacZ和ΔI-SMTR intein混合后电转化DY329(W3110DlacU169nadA::Tn10gal490lcI857D(cro-bioA))感受态细胞，通过同源重组构建lacZ-intein-ER嵌合物，铺LBA平板，32℃过夜培养，分别挑取克隆并提取质粒，测序鉴定，阳性克隆即为重组质粒-pLacZMER，纯化回收，-20℃保存备用。 

(4)将重组质粒pLacZMER转化大肠杆菌DE3(F-，ompT，hsdSB(rB-mB-)，gal dcm(DE3))菌株，即为雌激素敏感的基因工程菌株。 

(5)pLacZMER质粒的酶切鉴定：将构建成功的质粒pLacZMER用Bam HI/Hind III双酶切，琼脂糖电泳鉴定。如图所示(图1)，质粒pLacZMER长度大约为10kb左右，质粒pET28a的长度大约为5.3kb。质粒pLacZMER用Bam HI/Hind III酶切之后产生两条条带，一条带大小与pET28a相同，大约为5.3kb；另一条带大小大约为4.7kb，与LacZ-intein-ER嵌合物的大小相当(LacZ为3.5kb，ER-intein为1.2k)。根据基因测序结果可知，质粒pLacZMER构建成功，即已将LacZ-intein-ER嵌合物装入pET28a质粒。 

图1为质粒pLacZMER酶切鉴定。图中，M：DNA Marker；1：pLacZMER质粒；2：质粒pET28a；3：pLacZMER质粒用Bam HI/Hind III酶切后电泳；4：LacZ片段；5：ER-intein片段。 

(6)体内颜色蛋白活性测定：挑取DE3(pLacZMER)单克隆，接种于3mL LB中(含50μg/mL卡那霉素)，37℃培养至OD₆₀₀为0.6左右，加入终浓度为1mM的IPTG诱导1h或同时加入终浓度为1mM的IPTG和10μL 17β-雌二醇标准品母液，摇培诱导1h，用聚丙烯酰氨凝胶(SDS-PAGE)鉴定菌体蛋白。如图所示(图2)，DE3(pLacZMER)工程菌可表达大小为198KD的蛋白；而DE3(pET28a)对照组只表达LacZ基因，蛋白大小为110KD。在加入17β-雌二醇标准品母液诱导后，DE3(pLacZMER)工程菌可产生两条条带，一条大小为110KD，与LacZ基因表达的蛋白大小相当；另一条大小为90KD，与ER-intein蛋白大小相当。因此，DE3(pLacZMER)工程菌株构建成功。该菌株不仅可在IPTG的诱导下高产量的表达，并且在17β-雌二醇的诱导下，可发生intein的自我剪切，产生了完整的β-半乳糖苷酶和ER-intein两部分；在没有17β-雌二醇存在的条件下，菌株蛋白无变化。 

图2为菌体蛋白SDS-PAGE检验结果。M：Marker；1：IPTG诱导的DE3(pLacZMER)工程菌；2：IPTG诱导DE3(pET28a)3：IPTG和17β-雌二醇共同诱导的DE3(pLacZMER)工程菌。 

(7)纯化蛋白体外活性诱导鉴定：挑取DE3(pLacZMER)单克隆，接种于3mL LB中(含50μg/mL卡那霉素)，37℃过夜培养。次日取出1mL培养物接种到1LLB中(含50μg/mL卡那霉素)，当OD₆₀₀达到0.6时加入1mM IPTG，18℃过夜诱导。IPTG诱导产生的蛋白经过Ni-NTA亲和纯化(见附)后，在体外加入17β-雌二醇诱导1h，SDS-PAGE鉴定。如图所示(图3)，Ni-NTA亲和纯化产生的蛋白大小大约为198KD，与体内表达的蛋白大小一致；在17β-雌二醇的诱导下，产生了两条明显的条带，一条大小约为110KD，与LacZ基因表达的蛋白大小相当；另一条大小约为90KD，与计算所得的ER-intein表达的蛋白大小相当。证实了工程菌株在17β-雌二醇的诱导下可发生intein的自我剪切，产生了完整的β-半乳糖苷酶和ER-intein两部分。 

图3体外纯化的工程菌株表达蛋白在17β-雌二醇诱导后的SDS-PAGE结果。左侧泳道为marker，中间泳道为未加入17β-雌二醇，右侧泳道为加入17β-雌二醇的结果。 

Ni-NTA亲和纯化蛋白流程。将1L细胞培养液，室温，8,000rpm离心10min收集细胞。将所产生的菌体悬浮于30mL裂解缓冲液(20mM Tris-HCl，300mM NaCl PH 8.0，10％glycerol，5mM β-ME，20mM imidazole，1mM PMSF)。超声波破碎菌体(功率700W，超声4s，间歇6s，共超声裂解100次)。12,000rpm离心60分钟除去裂解液中所有不溶性颗粒，回收上清液。将上清加样到裂解缓冲液彻底平衡过的2.5mL Ni-NTA树脂上。用50mL洗涤液以8mL/h速度洗柱后，用5mL洗脱液以同样的速度洗脱；分管收集洗脱液；收集液即为目标蛋白。 

(8)β-半乳糖苷酶活性检测。以无水乙醇作为溶剂配制17β-雌二醇标准品母液，使其终浓度为1mg/mL。之后用无水乙醇逐级稀释成不同浓度的17β-雌二醇标准品溶液(1×10^-1，1×10^-2，1×10^-3，1×10^-4，1×10^-5，1×10^-6，1×10^-7，1×10^-8，1×10^-9，1×10^-10mg/mL)。接种DE3(pLacZMER)单菌落于50mL LBK液体培养基中，37℃摇培到OD₆₀₀约为0.6时，加入终浓度为1mM的IPTG。分别取1mL菌液，加入不同浓度的17β-雌二醇标准品溶液10μL，及溶剂空白组(1mL菌液中加入10μL乙醇)和培养基空白组(1mL菌液中加入10μL LB培养基)。摇培诱导1h。测定β-半乳糖苷酶活性，计算β-半乳糖苷酶活性倍数，每个样品至少重复五次。如图4所示，菌株在无雌激素存在时无β-半乳糖苷酶的活性，雌激素加入后可检测到高水平的β-半乳糖苷酶活性，并与雌激素浓度成正比。β-半乳糖苷酶的活性倍数随17β-雌二醇标准品浓度的降低而降低，呈S形相关；其最低检测限可达到ng级，线性范围在ng/L和100mg/L之间。 

图4DE3(pLacZMER)工程菌在加入不同浓度的17β-雌二醇后β-半乳糖苷酶活性变化。横坐标为17β-雌二醇的浓度，纵坐标为β-半乳糖苷酶活性变化倍数。β-半乳糖苷酶的活性倍数随17β-雌二醇标准品浓度的降低而降低，呈S形相关，最低检测限为1ng/L。 

β-半乳糖苷酶活性测定方法：1mL培养物在室温6,000rpm离心2min收集细胞，1mL灭菌蒸馏水重悬，重复洗涤1次(将培养基彻底洗去，避免其干扰)，用1mL预冷的灭菌蒸馏水重悬。取500μL菌液补加灭菌蒸馏水到1mL，测定OD₆₀₀。另取500μL菌液补加灭菌蒸馏水到1mL，再加入100μL氯仿、50μL 0.1％SDS，28℃水浴振荡5s，加入0.2mL 4mg/mL的ONPG，准确计时(T₁)。28℃温育直到黄色出现，加入0.5mL 1M的Na₂CO₃终止反应，准确记录终止反应时间(T₂)。测定OD₄₂₀和OD₅₅₀。计算β-半乳糖苷酶活性。 

β-半乳糖苷酶活性计量单位： 

Miller Units＝[1000×(OD₄₂₀-OD₅₅₀)×1.75]/[OD₆₀₀×(T2-T1)×V]，其中：V为所取菌液体积(mL)，T1、T2以min记。 

β-半乳糖苷酶活性倍数： 

(样品Miller Units-溶剂空白组Miller Units)/培养基空白组Miller Units。 

步骤六，将雌激素敏感的基因工程菌株、培养基、诱导剂、裂解剂1、裂解剂2、显色剂和终止剂包装即得到试剂盒，试剂盒包括雌激素敏感的基因工程菌株，培养基，诱导剂，裂解剂1，裂解剂2，显色剂和终止剂。 

实施例2 

基因工程试剂盒对多种环境雌激素效应水平的检测 

利用实施例1中得到的试剂盒，对不同环境雌激素样品和从污水处理厂获得的污水样品进行测定，分析样品的雌激素效应水平。 

配制17β-雌二醇、双酚A、屈和6-OH-屈的不同浓度(1×10^-1，1×10^-2，1×10^-3，1×10^-4，1×10^-5，1×10^-6，1×10^-7，1×10^-8，1×10^-9，1×10^-10mg/mL)的样品，低温保存。将从污水处理厂获得污水污泥样品用滤纸过滤，以固相萃取方法获得待测样品。测定样品时，将雌激素敏感的基因工程菌株接种到1mL液体培养基中，37℃摇培到OD₆₀₀约为0.6时，加入诱导剂1μL(1∶1000稀释)及不同浓度的样品溶液10μL。37℃摇培诱导1小时。室温6,000rpm离心2min收集细胞，1mL灭菌蒸馏水洗涤后用1mL灭菌蒸馏水重悬。取500μL菌液补加灭菌蒸馏水到1mL，紫外分光光度计上测定OD₆₀₀。另取500μL菌液补加灭菌蒸馏水到1mL，再加入100μL裂解剂1、50μL裂解剂2，28℃水浴振荡5s，加入0.2mL显色剂，准确计时(T₁)。28℃温育直到黄色出现，加入0.5mL终止剂终止反应，准确记录终止反应时间(T₂)。紫外分光光度计测定OD₄₂₀和OD₅₅₀。根据标准曲线定量计算β-半乳糖苷酶活性＝[1000×(OD₄₂₀-OD₅₅₀)×1.75]/[OD₆₀₀×(T2-T1)×V]。结果如图5-7和表1所示。 

图5DE3(pLacZMER)工程菌在加入不同浓度的双酚A后β-半乳糖苷酶活性变化。横坐标为双酚A浓度，纵坐标为β-半乳糖苷酶活性变化倍数。β-半乳糖苷酶的活性倍数随双酚A标准品浓度的降低而降低，呈S形相关，最低检测限为1ng/L。 

图6DE3(pLacZMER)工程菌在加入不同浓度的多环芳烃屈后β-半乳糖苷酶活性变化。横坐标为多环芳烃屈浓度，纵坐标为β-半乳糖苷酶活性变化倍数。β-半乳糖苷酶的活性倍数增长随屈的浓度降低而逐渐减少，趋势基本呈S形，最低检测阈值为100ng/L。 

图7DE3(pLacZMER)工程菌在加入不同浓度的多环芳烃6OH-屈后β-半乳糖苷酶活性 变化。横坐标为多环芳烃6OH-屈浓度，纵坐标为β-半乳糖苷酶活性变化倍数。β-半乳糖苷酶活性倍数增长随6OH-屈浓度降低而逐渐减少，趋势基本呈S形，最低检测阈值为1μg/L。 

表1来源于污水处理厂的污水污泥样品中麝香类化合物GC/MS含量测定与菌株法测定的雌激素活性比对。两者趋势一致，即麝香类化合物含量越多，其β-半乳糖苷酶活性倍数越高。 

表1污水处理不同阶段污水与污泥样品中麝香类化合物的含量及雌激素活性 

Claims (10)

1.一种检测环境雌激素类污染物的基因工程试剂盒，其特征在于，其组分为：2×10⁴体积份的LB培养基、1体积份的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷、20体积份的氯仿、10体积份的十二烷基硫酸钠溶液、20体积份的邻-硝基苯-β-D-半乳糖苷以及100体积份的碳酸钠溶液。

2.根据权利要求1所述的检测环境雌激素类污染物的基因工程试剂盒，其特征是，所述的十二烷基硫酸钠溶液是指质量百分数浓度为1％的SDS的水溶液。

3.根据权利要求1所述的检测环境雌激素类污染物的基因工程试剂盒，其特征是，所述的碳酸钠溶液是指浓度为1M的Na₂CO₃的水溶液。

4.一种根据上述任一权利要求所述基因工程试剂盒的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一，培养大肠埃希氏菌(Escherichia coli)DE3(pLacZMER)；

步骤二，向基因工程菌株的培养物中加入IPTG并进行诱导处理；

步骤三，向基因工程菌株的培养物中依次加入氯仿、SDS和ONPG并进行孵育处理后加入碳酸钠溶液，再置于紫外分光光度计中检测得到环境雌激素类污染物的含量。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征是，所述的培养是指：在37℃环境下采用振荡摇床以以180rpm的转速培养，培养至OD₆₀₀为0.6。

6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征是，所述的大肠埃希氏菌DE3(pLacZMER)为包含质粒pLacZMER的大肠杆菌，具有卡那霉素抗性，生长培养基为LB培养基，生长与培养温度为37度；显著特征为：雌激素加入后会产生颜色反应，且强度与雌激素浓度呈正相关。

7.根据权利要求4所述的检测方法，其特征是，所述的诱导处理是指：在37℃环境下采用振荡摇床以以180rpm的转速培养1小时。

8.根据权利要求4所述的检测方法，其特征是，所述的孵育处理是指：在28℃的环境下温育至培养物的颜色为黄色。

9.根据权利要求4所述的检测方法，其特征是，所述的置于紫外分光光度计中检测是指：采用紫外分光光度计测定OD₄₂₀和OD₅₅₀后根据标准曲线定量计算β-半乳糖苷酶活性＝[1000×(OD₄₂₀-OD₅₅₀)×1.75]/[OD₆₀₀×(T2-T1)×V]，并得到环境雌激素类污染物的含量，其中：T2和T1分别为反应终止时间和反应起始时间，单位为分钟；V为所取菌液体积，单位为mL，OD₄₂₀和OD₅₅₀OD₆₀₀为光密度，OD＝log(1/trans)，trans为检测物的透光值。

10.一种大肠埃希氏菌，其特征在于，所述的大肠埃希氏菌，保藏编号为：CGMCCNO：3913。

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