CN112557381A - 一种用于α-半乳糖苷酶的检测测试条及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于α‑半乳糖苷酶的检测测试条及其检测方法，可有效解决α‑半乳糖苷酶的快速有效检测的问题，其解决的技术方案是，该检测测试条由基材PVC板、硝酸纤维膜、引水玻璃纤维、吸水棉浆板、末端覆膜和加样点构成，基材PVC板1上端部设置有加样点6，加样点6后面的基材PVC板1上依次设置有引水玻璃纤维3、硝酸纤维膜2、吸水棉浆板4，引水玻璃纤维3、硝酸纤维膜2、吸水棉浆板4上部均覆盖有末端覆膜5，所述的硝酸纤维膜2上包被有X‑a‑gal溶液的反应条带，本发明特异性强，灵敏度高，检测结果准确率高，是用于α‑半乳糖苷酶的检测测试条及其检测方法上的创新。

Description

一种用于α-半乳糖苷酶的检测测试条及其检测方法
技术领域
本发明涉及生物检测领域，特别是一种用于α-半乳糖苷酶的检测测试条及其检测方法。
背景技术
半乳糖苷酶是水解含半乳糖苷键的物质，根据糖残基的性质(包括糖苷键的性质)来进行命名和分类的(如α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶)，α-半乳糖苷酶属于外切糖苷酶类，是能专一水解α-半乳糖苷的酶，该酶在食品、饲料、医药工业等领域得到广泛的应用，受到业内的高度重视，被认为是最有应用潜力的酶制剂之一。α-半乳糖苷酶催化α-半乳糖苷键的水解，可将豆制食品及饲料中的抗营养因子α-半乳糖苷类转化分解，改善营养成分使其易于消化吸收。豆类作为一种传统作物，在世界范围内被广泛种植，是食品与饲料工业的重要原料。但由于豆类中含有无法被人类及其他单胃动物消化的半乳糖苷类低聚糖如蜜二糖、棉子糖、水苏糖等，所以摄食后会在小肠内部经厌氧发酵形成胃肠胀气，导致豆类制品的吸收利用率无法达到最大。而通过添加α-半乳糖苷酶进行酶解， 则可显著改善营养吸收，提高产能。
α-半乳糖苷酶作为一种新型饲用酶制剂，在饲料工业中得到了广泛的应用。α-半乳糖苷是由1个蔗糖与1个或多个半乳糖以α-1,6-糖苷键连接而成的不溶于水的低聚糖，是豆粕、棉粕、菜籽粕等饲料原料中主要的抗营养因子之一。这种抗营养因子会降低饲料中糖类和蛋白质的利用率。α-半乳糖苷的抗营养作用主要表现在：（1）局部反应：即α-半乳糖苷增加了小肠内容物的渗透作用和持水力，因而降低了营养物质的水解作用；（2）全身作用：由于营养物质水解作用减弱，增加了小肠内容物量，较大的食糜刺激小肠加强蠕动，加快了肠道内食糜的运转速度，影响了营养物质的充分吸收。饲用α-半乳糖苷酶作用机理在于能够有效降解饲料中存在的半乳糖苷等抗营养因子，降低食糜粘度，减少腹泻的发生；摧毁植物细胞壁结构，促进细胞内营养物质释放，提高饲料中营养物质的利用效率；消除抗营养因子对类胰岛素样生长因子IGF-I分泌的抑制，促进蛋白质的合成，提高瘦肉率；降解豆类饲料中的胀气因子，大大降低豆类原料引发的幼龄动物腹泻现象；增强动物的免疫功能和抗病能力，减少饲料中抗生素的用量；减轻或避免消化器官代偿性增生和肥大，降低动物维持需要量，提高饲料能量效价；扩大饲料配方中原料使用种类，充分利用副产品等非常规饲料资源，降低配方成本。
α–半乳糖苷酶作为一种新型饲料添加剂在饲料中添加越来越广泛，酶制剂活性的测定是酶制剂应用效果评价的重要组成部分，也是评价酶制剂最直接、经济有效的方式，然而作为衡量酶制剂质量的重要指标酶活力的检测，目前国内至今还没有统一标准，还没有国家标准或行业标准测定方法，使得α-半乳糖苷酶酶活性的检测比较混乱，使其在饲料等领域的应用中受到极大的限制。据研究报道所知，一种酶的活性只能是在一个特定条件下的反应结果，α-半乳糖苷酶活性的测定，可以按照作用底物能力划分，根据α-半乳糖苷酶作用的底物不同，如可用作α-半乳糖苷酶测定的底物有蜜二糖、棉籽糖、水苏糖及对硝基苯酚-α-D-半乳糖吡喃糖苷等，工业上常用的有三种检测方法测定α-半乳糖苷酶的活性，一是葡萄糖氧化酶法，通常以蜜二糖为底物，用葡萄糖氧化酶酶解蜜二糖为葡萄糖，再用warburg压力计测定其含量法；二是Nelson/Somogyi比色法，通常以棉子糖或水苏糖为底物，棉子糖或水苏糖经酶解后用Nelson/Somogyi还原糖分析法测定还原糖含量而计算出α-半乳糖苷酶酶活力；三是以对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖苷（ρNPG）为底物ρNPG法，以ρNPG为底物，经酶解后测定对硝基酚的含量计算出α-半乳糖苷酶酶活力。三种测定方法用于测定饲用α-半乳糖苷酶酶活力的测定比较分析，葡萄糖氧化酶法测定步骤较繁琐复杂；Nelson/Somogyi还原糖分析法，由于饲料中成分复杂，含有豆粕、棉粕等半乳糖苷类成分等影响测定干扰因素多，另外饲用酶制剂的载体含量较多，还原糖含量较高，导致测定结果不准确；对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖苷（ρNPG）为底物的ρNPG法，饲料中与ρNPG结构类似物少，具有抗干扰能力强，操作方便等特点，较适宜用于饲用α-半乳糖苷酶酶活力的测定，α-半乳糖苷酶的优选底物是对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖苷(ρNPG)，优选方法为对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖苷（ρNPG）为底物ρNPG法。
考虑道饲用酶制剂的作用环境，饲用酶制剂的作用位点是动物的消化道，其反应的pH和温度与工业酶制剂最高酶活条件差异，另外饲用酶制剂的载体含量较多，还原糖含量较高，建议反应温度37℃，反应体系pH5.0，若找到一种方便、快捷的α-半乳糖苷酶检测方法对α-半乳糖苷酶推广应用，服务于生产具有重要意义。
发明内容
针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种用于α-半乳糖苷酶的检测测试条及其检测方法，可有效解决α-半乳糖苷酶的快速有效检测的问题。
本发明解决的技术方案是，该检测测试条由基材PVC板、硝酸纤维膜、引水玻璃纤维、吸水棉浆板、末端覆膜和加样点构成，基材PVC板1上端部设置有加样点6，加样点6后面的基材PVC板1上依次设置有引水玻璃纤维3、硝酸纤维膜2、吸水棉浆板4，引水玻璃纤维3、硝酸纤维膜2、吸水棉浆板4上部均覆盖有末端覆膜5，所述的硝酸纤维膜2上包被有X-a-gal溶液的反应条带，通过α-半乳糖苷酶与X-α-Gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-半乳糖苷）溶液的反应产生颜色的变化，从测试条检测观察到的颜色变化而判断结果。
所述的X-a-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-半乳糖苷）溶液浓度为100mg/mL，用量为10μL。
所述的引水玻璃纤维3、硝酸纤维膜2、吸水棉浆板4固定粘贴于基材PVC板1上，其上覆盖有末端覆膜5，切割成长条即可。
所述的5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-半乳糖苷 (X-α-Gal)的配制为：把X-α-Gal溶解于二甲基甲酰胺中，制成质量浓度为100mg/mL的X-α-Gal溶液，0.22µm滤膜过滤除菌，得过滤除菌后的X-α-Gal溶液。
所述的α-半乳糖苷酶的检测，通过α-半乳糖苷酶与X-α-Gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-半乳糖苷）的反应产生颜色的变化，从测试条检测观察到的颜色变化而判断结果，加样点加样2µLα-半乳糖苷酶20倍稀释液后37℃条件下，2小时内观察结果，在2小时内呈现蓝色条带即表示被检测液体中含有α-半乳糖苷酶，且被检测液体中α-半乳糖苷酶含量不小于50U/mL。
本发明基本原理是X-α-Gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-半乳糖苷）是α-半乳糖苷酶的显色底物，在α-半乳糖苷酶的催化下无色的X-α-Gal水解后呈蓝色，因此作为α-半乳糖苷酶活性的指示剂，特异性强，灵敏度高，检测结果准确率高，是用于α-半乳糖苷酶的检测测试条及其检测方法上的创新。
附图说明
图1为本发明检测测试条结构示意图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
实施例1
本发明可用于高产α-半乳糖苷酶菌种筛选，特异性强，灵敏度高，可以快速鉴别筛选。
将高产α-半乳糖苷酶菌种接种于菌种发酵产酶培养基100mL/250mL三角瓶中，30℃、180r/min摇床震荡培养72h，发酵培养酶液离心机于4℃、8000r/min离心15min，收集上清液用于α-半乳糖苷酶酶活性分析，分析用α-半乳糖苷酶的检测测试条，在加样点加样2µL上清液,于37℃条件下，2小时内观察结果，在2小时内呈现蓝色条带被检测中上清液中含有α-半乳糖苷酶, 说明该菌种产α-半乳糖苷酶，且发酵离心上清液中α-半乳糖苷酶含量不小于50U/mL。
所述的发酵产酶培养基为：乳糖15.0 g，牛肉膏10.0 g，MgSO4•7H2O 1.0g，Na2HPO4 0.5g，MnCl2 1.0g，水苏糖0.8g，水1000mL，pH7.5。
实施例2
本发明可用于α-半乳糖苷酶酶活力检测，为更好的规范生产，河南省科学院生物研究所有限责任公司提出起草备案了企业标准Q/HKS018-2020 饲料添加剂 α-半乳糖苷酶，理化指标规定了α-半乳糖苷酶不低于1000 U/g，α-半乳糖苷酶检测方法对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖苷（ρNPG）为底物ρNPG法，酶活力定义一致定义为：α-半乳糖苷酶的活力单位：在37℃，pH 5.0条件下，1min分解底物对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖苷（ρNPG）生成1µmol对硝基苯酚所需的酶量为1个酶活力单位（U）。
若将河南省科学院生物研究所有限责任公司生产的α-半乳糖苷酶成品稀释20倍，分析用α-半乳糖苷酶的检测测试条，在加样点加样2µL稀释液后，于37℃条件下，2小时内观察结果，在2小时内呈现蓝色条带被检测液体中含有α-半乳糖苷酶，且α-半乳糖苷酶酶活力不小于50U/g，换算成成品α-半乳糖苷酶不小于1000U/g，即符合河南省科学院生物研究所有限责任公司备案的企业标准Q/HKS018-2020。这大大降低了化验人员劳动强度，节省了人力物力。
所述的α-半乳糖苷酶酶活力的检测方法是：1.0mL底物ρNPG于37℃水浴预热2min，加入稀释酶液1.0mL，37℃水浴恒温震荡10min，加入8.0mL0.2mol/L碳酸钠溶液终止反应，以蒸馏水调零，在405nm下测量OD值；标准空白用稀释酶液1.0mL，先加入8.0mL0.2mol/L碳酸钠溶液震荡混匀，再1.0mL底物ρNPG于37℃水浴恒温震荡10min，以蒸馏水调零，在405nm下测量OD值：
计算公式：α-半乳糖苷酶酶活力
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE002
式中：Ax样品酶液吸光度OD值；A0空白吸光度OD值；K对硝基酚标准曲线的斜率；C0对硝基酚标准曲线的截距；Df稀释倍数；v吸取样品酶液体积/mL；t反应时间/min
标准曲线绘制：准确称取0.13910g 对硝基酚，用0.2mol/L碳酸钠溶液定容至100mL，再稀释配制成浓度分别为：0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 mmol/L的标准对硝基酚溶液。分别吸取1.0mL 上述稀释标准的对硝基酚溶液(做3 个重复) 于试管中，分别加入1.0 mL0.05mol/L醋酸钠缓冲液（pH 5.0），加入8.0mL0.2mol/L碳酸钠溶液，振荡，以蒸馏水调零，在405 nm 处测定吸光度OD值。以对硝基酚浓度为Y轴，吸光度OD值为X轴，绘制标准曲线。
α-半乳糖苷酶的活力单位：在37℃，pH 5.0条件下，1min分解底物对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖苷（ρNPG）生成1µmol对硝基苯酚所需的酶量为1个酶活力单位（U）。
本发明经多次反复应用，均取得了满意的效果，与对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖苷（ρNPG）为底物ρNPG法相比，符合率99.11%。
本发明可用于高产α-半乳糖苷酶菌种筛选，特异性强，灵敏度高，可以快速鉴别筛选，是用于α-半乳糖苷酶的检测测试条及其检测方法上的创新，具有良好的经济和社会效益。

Claims (6)

1.一种用于α-半乳糖苷酶的检测测试条，其特征在于，该检测测试条由基材PVC板、硝酸纤维膜、引水玻璃纤维、吸水棉浆板、末端覆膜和加样点构成，基材PVC板1上端部设置有加样点6，加样点6后面的基材PVC板1上依次设置有引水玻璃纤维3、硝酸纤维膜2、吸水棉浆板4，引水玻璃纤维3、硝酸纤维膜2、吸水棉浆板4上部均覆盖有末端覆膜5，所述的硝酸纤维膜2上包被有X-a-gal溶液的反应条带，通过α-半乳糖苷酶与X-α-Gal溶液的反应产生颜色的变化，从测试条检测观察到的颜色变化而判断结果，加样点加样2µL待测液体后，37℃条件下，2小时内观察结果，在2小时内呈现蓝色条带即表示被检测液体中含有α-半乳糖苷酶，且被检测液体中α-半乳糖苷酶含量不小于50U/mL。
2.根据权利要求1所述的用于α-半乳糖苷酶的检测测试条，其特征在于，所述的X-a-gal溶液浓度为100mg/mL，用量为10μL。
3.根据权利要求1所述的用于α-半乳糖苷酶的检测测试条，其特征在于，所述的引水玻璃纤维3、硝酸纤维膜2、吸水棉浆板4固定粘贴于基材PVC板1上。
4.根据权利要求1所述的用于α-半乳糖苷酶的检测测试条，其特征在于，所述的X-α-Gal溶液的配制为：把X-α-Gal溶解于二甲基甲酰胺中，制成质量浓度为100mg/mL的X-α-Gal溶液，0.22µm滤膜过滤除菌，得过滤除菌后的X-α-Gal溶液。
5.根据权利要求1所述的用于α-半乳糖苷酶的检测测试条，其特征在于，所述的α-半乳糖苷酶酶活力为：在37℃，pH 5.0条件下，1min分解底物对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖苷生成1µmol对硝基苯酚所需的酶量为1个酶活力单位。
6.权利要求1-5任一项所述的α-半乳糖苷酶活力的检测方法，其特征在于，将1.0mL底物ρNPG于37℃水浴预热2min，加入稀释酶液1.0mL，37℃水浴恒温震荡10min，加入8.0mL0.2mol/L碳酸钠溶液终止反应，以蒸馏水调零，在405nm下测量OD值；标准空白用稀释酶液1.0mL，先加入8.0mL0.2mol/L碳酸钠溶液震荡混匀，再1.0mL底物ρNPG于37℃水浴恒温震荡10min，以蒸馏水调零，在405nm下测量OD值：
计算公式：α-半乳糖苷酶酶活力
Figure DEST_PATH_IMAGE002
式中：Ax样品酶液吸光度OD值；A0空白吸光度OD值；K对硝基酚标准曲线的斜率；C0对硝基酚标准曲线的截距；Df稀释倍数；v吸取样品酶液体积/mL；t反应时间/min；
标准曲线绘制：准确称取0.13910g 对硝基酚，用0.2mol/L碳酸钠溶液定容至100 mL，再稀释配制成浓度分别为：0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 mmol/L的标准对硝基酚溶液，分别吸取1.0mL 上述稀释标准的对硝基酚溶液于试管中，分别加入1.0mL0.05mol/L醋酸钠缓冲液，加入8.0mL0.2mol/L碳酸钠溶液，振荡，以蒸馏水调零，在405nm 处测定吸光度OD值，以对硝基酚浓度为Y轴，吸光度OD值为X轴，绘制标准曲线。
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