JP2002360296A - 大腸菌群の検出法並びに検出キット - Google Patents
大腸菌群の検出法並びに検出キットInfo
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- JP2002360296A JP2002360296A JP2001178648A JP2001178648A JP2002360296A JP 2002360296 A JP2002360296 A JP 2002360296A JP 2001178648 A JP2001178648 A JP 2001178648A JP 2001178648 A JP2001178648 A JP 2001178648A JP 2002360296 A JP2002360296 A JP 2002360296A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 β−ガラクトシダーゼを含む検体であって
も、大腸菌群の迅速、簡易、正確な検出を可能にする方
法及びこの方法に使用する検出キットを提供する。 【解決手段】 検体をグラム陽性細菌生育阻害平板培地
にて培養した後、酸化還元色素を変色させる細菌集落に
ついて、β‐ガラクトシダーゼにより発色する発色合成
酵素基質の発色性を指標として大腸菌群を検出すること
を特徴とする大腸菌群の検出法と、酸化還元色素液及び
これを収容する酸化還元色素液滴下用容器と、β−ガラ
クトシダーゼの存在により発色する発色合成酵素基質液
及びこれを収容する発色合成酵素基質液滴下用容器とを
備えた大腸菌群の検出キット。
も、大腸菌群の迅速、簡易、正確な検出を可能にする方
法及びこの方法に使用する検出キットを提供する。 【解決手段】 検体をグラム陽性細菌生育阻害平板培地
にて培養した後、酸化還元色素を変色させる細菌集落に
ついて、β‐ガラクトシダーゼにより発色する発色合成
酵素基質の発色性を指標として大腸菌群を検出すること
を特徴とする大腸菌群の検出法と、酸化還元色素液及び
これを収容する酸化還元色素液滴下用容器と、β−ガラ
クトシダーゼの存在により発色する発色合成酵素基質液
及びこれを収容する発色合成酵素基質液滴下用容器とを
備えた大腸菌群の検出キット。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、検体の大腸菌群の
検出法及びこの方法に使用する検出キットに関するもの
である。特に本発明は、β−ガラクトシダーゼを含む食
品、医薬品、化粧品等の大腸菌群の迅速、簡易、高感度
の検出法及びこの方法に使用する検出キットに関するも
のである。尚、本明細書において、百分率（％）の表示
は、特に断らない限り重量による値である。
検出法及びこの方法に使用する検出キットに関するもの
である。特に本発明は、β−ガラクトシダーゼを含む食
品、医薬品、化粧品等の大腸菌群の迅速、簡易、高感度
の検出法及びこの方法に使用する検出キットに関するも
のである。尚、本明細書において、百分率（％）の表示
は、特に断らない限り重量による値である。
【０００２】
【従来の技術】検体中の大腸菌群の検出法としては、イ
ンドリル誘導体として、６−クロロ−３−インドリル−
β−Ｄ−ガラクトピラノシド０．０３〜０．２ｍｇ／ｍ
ｌ及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−
Ｄ−グルクロニド０．０１〜０．２ｍｇ／ｍｌを含有す
るβ−ガラクトシダーゼ活性及びβ−グルクロニダーゼ
活性の検出に基づく大腸菌群及び／又は大腸菌の同時検
出のための栄養培地が開示されている（特表平9-501314
号公報。以下従来技術１と記載する）。更に、培養試薬
を含有するブイヨン培地に反応基質として５−ブロモ−
４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノ
シド０．０１〜０．５ｍｇ／ｍｌを添加した検出液をシ
ート状の基体に含浸させてなることを特徴とする大腸菌
群検出用シートが開示されている（特開2000-100号公
報。以下従来技術２と記載する）。
ンドリル誘導体として、６−クロロ−３−インドリル−
β−Ｄ−ガラクトピラノシド０．０３〜０．２ｍｇ／ｍ
ｌ及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−
Ｄ−グルクロニド０．０１〜０．２ｍｇ／ｍｌを含有す
るβ−ガラクトシダーゼ活性及びβ−グルクロニダーゼ
活性の検出に基づく大腸菌群及び／又は大腸菌の同時検
出のための栄養培地が開示されている（特表平9-501314
号公報。以下従来技術１と記載する）。更に、培養試薬
を含有するブイヨン培地に反応基質として５−ブロモ−
４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノ
シド０．０１〜０．５ｍｇ／ｍｌを添加した検出液をシ
ート状の基体に含浸させてなることを特徴とする大腸菌
群検出用シートが開示されている（特開2000-100号公
報。以下従来技術２と記載する）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】従来技術１の６−クロ
ロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド等の
発色合成酵素基質を含有する培地は、大腸菌群を検出す
るために、24時間程度培養する必要があることから、迅
速な方法とはいえない問題があった。従来技術２の発色
合成酵素基質として５−ブロモ−４−クロロ−３−イン
ドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを使用した大腸菌
群検出用試験シートは、簡易ではあるが、前記培地と同
様に大腸菌群を検出するために、24時間程度培養する必
要があることから、迅速な方法とはいえない問題があっ
た。本発明は、迅速で、簡易かつ正確に、大腸菌群の検
出法及びこの方法に使用する検出キットを提供するもの
である。特に、本発明は、β−ガラクトシダーゼを含む
検体であっても、大腸菌群の迅速、簡易、正確な検出を
可能にする方法及びこの方法に使用する検出キットを提
供することを目的とする。
ロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド等の
発色合成酵素基質を含有する培地は、大腸菌群を検出す
るために、24時間程度培養する必要があることから、迅
速な方法とはいえない問題があった。従来技術２の発色
合成酵素基質として５−ブロモ−４−クロロ−３−イン
ドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを使用した大腸菌
群検出用試験シートは、簡易ではあるが、前記培地と同
様に大腸菌群を検出するために、24時間程度培養する必
要があることから、迅速な方法とはいえない問題があっ
た。本発明は、迅速で、簡易かつ正確に、大腸菌群の検
出法及びこの方法に使用する検出キットを提供するもの
である。特に、本発明は、β−ガラクトシダーゼを含む
検体であっても、大腸菌群の迅速、簡易、正確な検出を
可能にする方法及びこの方法に使用する検出キットを提
供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明の第一の発明は、
検体をグラム陽性細菌生育阻害平板培地にて培養した
後、酸化還元色素を変色させる細菌集落について、β−
ガラクトシダーゼにより発色する発色合成酵素基質の発
色性を指標として大腸菌群を検出することを特徴とする
大腸菌群の検出法である。本発明の大腸菌群の検出法の
第一の態様は、検体をグラム陽性細菌生育阻害平板培地
にて培養し、生育した細菌集落と酸化還元色素とを接触
した後、該色素を変色させた細菌集落にβ−ガラクトシ
ダーゼの存在によって発色する発色合成酵素基質を滴下
することを特徴とした大腸菌群の検出法である。本発明
の大腸菌群の検出法の第二の態様は、酸化還元色素を含
むグラム陽性細菌生育阻害平板培地にて検体を培養し、
該色素を変色させた細菌集落にβ−ガラクトシダーゼの
存在によって発色する発色合成酵素基質を滴下すること
を特徴とした大腸菌群の検出法である。発色合成酵素基
質が、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−
Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−６−クロロ−３
−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、６−クロ
ロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、又
はこれらの塩類であることを望ましい態様としてもい
る。本発明の第二の発明は、大腸菌群の検出キットであ
って、その第一の態様は、酸化還元色素液及びこれを収
容する酸化還元色素液滴下用容器と、β−ガラクトシダ
ーゼの存在によって発色する発色合成酵素基質液及びこ
れを収容する発色合成酵素基質液滴下用容器とを備えた
大腸菌群の検出キットである。さらに、任意に前記酸化
還元色素液及び／または前記発色合成酵素基質液を吸収
させるための吸収体を備えた大腸菌群の検出キットとす
ることができる。本発明の大腸菌群の検出キットの第二
の態様は、酸化還元色素が予め添加された吸収体と、β
−ガラクトシダーゼの存在によって発色する発色合成酵
素基質液及びこれを収容する発色合成酵素基質液滴下用
容器とを備えた大腸菌群の検出キットである。本発明の
大腸菌群の検出キットの第三の態様は、酸化還元色素が
予め添加されたグラム陽性菌生育阻害平板培地と、β−
ガラクトシダーゼの存在によって発色する発色合成酵素
基質液及びこれを収容する発色合成酵素基質液滴下用容
器とを備えた大腸菌群の検出キットである。発色合成酵
素基質が、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−
β−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−６−クロロ
−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、６−
クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシ
ド、又はこれらの塩類であることを望ましい態様として
もいる。
検体をグラム陽性細菌生育阻害平板培地にて培養した
後、酸化還元色素を変色させる細菌集落について、β−
ガラクトシダーゼにより発色する発色合成酵素基質の発
色性を指標として大腸菌群を検出することを特徴とする
大腸菌群の検出法である。本発明の大腸菌群の検出法の
第一の態様は、検体をグラム陽性細菌生育阻害平板培地
にて培養し、生育した細菌集落と酸化還元色素とを接触
した後、該色素を変色させた細菌集落にβ−ガラクトシ
ダーゼの存在によって発色する発色合成酵素基質を滴下
することを特徴とした大腸菌群の検出法である。本発明
の大腸菌群の検出法の第二の態様は、酸化還元色素を含
むグラム陽性細菌生育阻害平板培地にて検体を培養し、
該色素を変色させた細菌集落にβ−ガラクトシダーゼの
存在によって発色する発色合成酵素基質を滴下すること
を特徴とした大腸菌群の検出法である。発色合成酵素基
質が、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−
Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−６−クロロ−３
−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、６−クロ
ロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、又
はこれらの塩類であることを望ましい態様としてもい
る。本発明の第二の発明は、大腸菌群の検出キットであ
って、その第一の態様は、酸化還元色素液及びこれを収
容する酸化還元色素液滴下用容器と、β−ガラクトシダ
ーゼの存在によって発色する発色合成酵素基質液及びこ
れを収容する発色合成酵素基質液滴下用容器とを備えた
大腸菌群の検出キットである。さらに、任意に前記酸化
還元色素液及び／または前記発色合成酵素基質液を吸収
させるための吸収体を備えた大腸菌群の検出キットとす
ることができる。本発明の大腸菌群の検出キットの第二
の態様は、酸化還元色素が予め添加された吸収体と、β
−ガラクトシダーゼの存在によって発色する発色合成酵
素基質液及びこれを収容する発色合成酵素基質液滴下用
容器とを備えた大腸菌群の検出キットである。本発明の
大腸菌群の検出キットの第三の態様は、酸化還元色素が
予め添加されたグラム陽性菌生育阻害平板培地と、β−
ガラクトシダーゼの存在によって発色する発色合成酵素
基質液及びこれを収容する発色合成酵素基質液滴下用容
器とを備えた大腸菌群の検出キットである。発色合成酵
素基質が、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−
β−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−６−クロロ
−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、６−
クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシ
ド、又はこれらの塩類であることを望ましい態様として
もいる。
【０００５】
【発明の実施の形態】本発明の第一の発明は、大腸菌群
の検出法であって、その原理は、検体をグラム陽性細菌
生育阻害平板培地にて培養することにより、グラム陰性
細菌の集落を形成させ、さらに検体中の固体夾雑物と細
菌集落を区別するために酸化還元色素の還元性を確認し
た後、β−ガラクトシダーゼの存在により発色する発色
合成酵素基質の発色性を調べて、グラム陰性のβ−ガラ
クトシダーゼを発現する細菌として大腸菌群を検出する
ものである。
の検出法であって、その原理は、検体をグラム陽性細菌
生育阻害平板培地にて培養することにより、グラム陰性
細菌の集落を形成させ、さらに検体中の固体夾雑物と細
菌集落を区別するために酸化還元色素の還元性を確認し
た後、β−ガラクトシダーゼの存在により発色する発色
合成酵素基質の発色性を調べて、グラム陰性のβ−ガラ
クトシダーゼを発現する細菌として大腸菌群を検出する
ものである。
【０００６】 本発明の方法の第一の態様は、検体をグ
ラム陽性細菌生育阻害平板培地にて培養し、生育した細
菌集落と酸化還元色素とを接触した後、該色素を変色さ
せた細菌集落にβ−ガラクトシダーゼの存在によって発
色する発色合成酵素基質を滴下することを特徴とした大
腸菌群の検出法である。また、本発明の大腸菌群の検出
法の第二の態様は、酸化還元色素を含むグラム陽性細菌
生育阻害平板培地にて検体を培養し、生育した細菌集落
のうち、該色素を変色させた細菌集落にβ−ガラクトシ
ダーゼの存在によって発色する発色合成酵素基質を滴下
することを特徴とした大腸菌群の検出法である。
ラム陽性細菌生育阻害平板培地にて培養し、生育した細
菌集落と酸化還元色素とを接触した後、該色素を変色さ
せた細菌集落にβ−ガラクトシダーゼの存在によって発
色する発色合成酵素基質を滴下することを特徴とした大
腸菌群の検出法である。また、本発明の大腸菌群の検出
法の第二の態様は、酸化還元色素を含むグラム陽性細菌
生育阻害平板培地にて検体を培養し、生育した細菌集落
のうち、該色素を変色させた細菌集落にβ−ガラクトシ
ダーゼの存在によって発色する発色合成酵素基質を滴下
することを特徴とした大腸菌群の検出法である。
【０００７】 本発明において、グラム陽性細菌生育阻
害平板培地としては、選択的にグラム陽性細菌（グラム
染色性が陽性の細菌）の生育を阻害し、グラム陰性細菌
（グラム染色性が陰性の細菌）が生育し、細菌集落を形
成しうるものであればいかなるものでもあってもよい
が、具体的には市販の赤色色素を含有するデオキシコー
ル酸寒天培地（メルク・ジャパン社製等）、ＶＲＢ寒天
培地（バイオレッド−レッド−胆汁酸寒天培地。メルク
・ジャパン社製等）、市販の色素を含有しないラウリル
硫酸ブロス（日本ベクトン・ディッキンソン社製等）に
１．５％濃度で寒天を加えて調製した寒天培地等を例示
できる。
害平板培地としては、選択的にグラム陽性細菌（グラム
染色性が陽性の細菌）の生育を阻害し、グラム陰性細菌
（グラム染色性が陰性の細菌）が生育し、細菌集落を形
成しうるものであればいかなるものでもあってもよい
が、具体的には市販の赤色色素を含有するデオキシコー
ル酸寒天培地（メルク・ジャパン社製等）、ＶＲＢ寒天
培地（バイオレッド−レッド−胆汁酸寒天培地。メルク
・ジャパン社製等）、市販の色素を含有しないラウリル
硫酸ブロス（日本ベクトン・ディッキンソン社製等）に
１．５％濃度で寒天を加えて調製した寒天培地等を例示
できる。
【０００８】 本発明において用いられる、酸化還元色
素は、微生物によって還元され、変色する指示薬であれ
ば、如何なるものであってもよく、レサズリンナトリウ
ム、トリフェニルテトラゾリウムクロライド（ＴＴＣと
もいう）等が例示される。レサズリンナトリウム溶液は
暗紫色〜濃青色であるが微生物により還元されて淡紅色
に変化する。また、トリフェニルテトラゾリウムクロラ
イド溶液（ＴＴＣ）は無色であるが、微生物により還元
されて赤色に変化する。
素は、微生物によって還元され、変色する指示薬であれ
ば、如何なるものであってもよく、レサズリンナトリウ
ム、トリフェニルテトラゾリウムクロライド（ＴＴＣと
もいう）等が例示される。レサズリンナトリウム溶液は
暗紫色〜濃青色であるが微生物により還元されて淡紅色
に変化する。また、トリフェニルテトラゾリウムクロラ
イド溶液（ＴＴＣ）は無色であるが、微生物により還元
されて赤色に変化する。
【０００９】 本発明の方法の第一の態様は、平板培地
上に細菌集落を形成してから酸化還元色素を接触させる
ものである。すなわち、検体をそのまま、又は必要に応
じて滅菌した生理食塩水中に分散させた後、これをグラ
ム陽性細菌生育阻害平板培地に塗抹し、８〜１２時間程
度培養する。ついで、形成された細菌集落と酸化還元色
素を接触させるが、方法としては、生育した集落が存在
する平板培地面上に、直接酸化還元色素を滴下する方
法、ろ紙等の酸化還元色素の吸収体を平板培地表面に載
せた後、酸化還元色素を滴下して吸収させる方法、また
は、予め酸化還元色素を吸収したろ紙等の吸収体を平板
培地表面に載せる方法のいずれでもよい。この後、酸化
還元色素と反応させるために、２５〜４０℃、好ましく
は約３５℃で、１０分間〜２時間程度、好ましくは１０
分間〜１時間程度培養する。こうして培養すると、平板
培地表面または酸化還元色素吸収体表面では、グラム陽
性細菌生育阻害平板培地で発育する細菌は酸化還元色素
を還元し、変色する。この場合、滴下又は吸収させる酸
化還元色素溶液の濃度は、レサズリンナトリウム及びＴ
ＴＣの場合で、０．１〜１０ｍｇ/ｍｌ、好ましくは
０．５〜５ｍｇ／ｍｌ程度である。
上に細菌集落を形成してから酸化還元色素を接触させる
ものである。すなわち、検体をそのまま、又は必要に応
じて滅菌した生理食塩水中に分散させた後、これをグラ
ム陽性細菌生育阻害平板培地に塗抹し、８〜１２時間程
度培養する。ついで、形成された細菌集落と酸化還元色
素を接触させるが、方法としては、生育した集落が存在
する平板培地面上に、直接酸化還元色素を滴下する方
法、ろ紙等の酸化還元色素の吸収体を平板培地表面に載
せた後、酸化還元色素を滴下して吸収させる方法、また
は、予め酸化還元色素を吸収したろ紙等の吸収体を平板
培地表面に載せる方法のいずれでもよい。この後、酸化
還元色素と反応させるために、２５〜４０℃、好ましく
は約３５℃で、１０分間〜２時間程度、好ましくは１０
分間〜１時間程度培養する。こうして培養すると、平板
培地表面または酸化還元色素吸収体表面では、グラム陽
性細菌生育阻害平板培地で発育する細菌は酸化還元色素
を還元し、変色する。この場合、滴下又は吸収させる酸
化還元色素溶液の濃度は、レサズリンナトリウム及びＴ
ＴＣの場合で、０．１〜１０ｍｇ/ｍｌ、好ましくは
０．５〜５ｍｇ／ｍｌ程度である。
【００１０】また、本発明においては、本発明の検出法
の第二の態様に示すように、予め酸化還元色素を含むグ
ラム陽性細菌生育阻害平板培地に、同様に検体を塗抹
し、２５〜４０℃、好ましくは約３５℃で、８〜２４時
間、好ましくは８〜１４時間程度培養することもでき
る。この場合も、平板培地表面では、グラム陽性細菌生
育阻害平板培地で発育する細菌は酸化還元色素を還元
し、変色する。この場合、酸化還元色素の添加量は、レ
サズリンナトリウム及びＴＴＣの場合で、培地１０００
ｍｌ当たり０．０１〜１ｇ、好ましくは０．０５〜０．
５ｇ程度である。
の第二の態様に示すように、予め酸化還元色素を含むグ
ラム陽性細菌生育阻害平板培地に、同様に検体を塗抹
し、２５〜４０℃、好ましくは約３５℃で、８〜２４時
間、好ましくは８〜１４時間程度培養することもでき
る。この場合も、平板培地表面では、グラム陽性細菌生
育阻害平板培地で発育する細菌は酸化還元色素を還元
し、変色する。この場合、酸化還元色素の添加量は、レ
サズリンナトリウム及びＴＴＣの場合で、培地１０００
ｍｌ当たり０．０１〜１ｇ、好ましくは０．０５〜０．
５ｇ程度である。
【００１１】本発明の方法では、こうして発色させた
後、更に、上記酸化還元色素を変色させた細菌集落にβ
−ガラクトシダーゼの存在によって発色する発色合成酵
素基質を滴下し、１０分間〜２時間程度、好ましくは１
０分間〜１時間程度、２５〜４０℃程度、好ましくは約
３５℃程度で培養し、発色を観察する。
後、更に、上記酸化還元色素を変色させた細菌集落にβ
−ガラクトシダーゼの存在によって発色する発色合成酵
素基質を滴下し、１０分間〜２時間程度、好ましくは１
０分間〜１時間程度、２５〜４０℃程度、好ましくは約
３５℃程度で培養し、発色を観察する。
【００１２】β−ガラクトシダーゼの存在によって発色
する発色合成酵素基質は、特に限定されないが、培地中
への拡散性、培地色調との色調コントラスト、及び可視
光で観察可能であるか否かを考慮して、大腸菌群かつ大
腸菌の集落を青色に発色する５−ブロモ−４−クロロ−
３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、大腸菌
群かつ大腸菌の集落を紫色に発色する５−ブロモ−６−
クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシ
ド、大腸菌群かつ大腸菌の集落を赤紫色に発色する６−
クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシ
ド、又はこれらの塩類であることが望ましい。
する発色合成酵素基質は、特に限定されないが、培地中
への拡散性、培地色調との色調コントラスト、及び可視
光で観察可能であるか否かを考慮して、大腸菌群かつ大
腸菌の集落を青色に発色する５−ブロモ−４−クロロ−
３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、大腸菌
群かつ大腸菌の集落を紫色に発色する５−ブロモ−６−
クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシ
ド、大腸菌群かつ大腸菌の集落を赤紫色に発色する６−
クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシ
ド、又はこれらの塩類であることが望ましい。
【００１３】また、紫色又は赤紫色に発色する発色合成
酵素基質（５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−
β−Ｄ−ガラクトピラノシド、６−クロロ−３−インド
リル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を使用する場合
は、赤色及び／または紫色素を含有する培地（デスオキ
シコレイト培地、ＶＲＢ寒天培地等）では、観察しづら
いことから、色素を含有しないグラム陽性細菌生育阻害
培地（ラウリル硫酸寒天培地等）を使用することが望ま
しい。
酵素基質（５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−
β−Ｄ−ガラクトピラノシド、６−クロロ−３−インド
リル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を使用する場合
は、赤色及び／または紫色素を含有する培地（デスオキ
シコレイト培地、ＶＲＢ寒天培地等）では、観察しづら
いことから、色素を含有しないグラム陽性細菌生育阻害
培地（ラウリル硫酸寒天培地等）を使用することが望ま
しい。
【００１４】本発明において好ましく用いられる、５−
ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラク
トピラノシド、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリ
ル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、６−クロロ−３−イ
ンドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、レサズリンナ
トリウム、トリフェニルテトラゾリウムクロライド（Ｔ
ＴＣ）等は、いずれも市販品（和光純薬工業社製、ナカ
ライテスク社製等）が使用できる。
ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラク
トピラノシド、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリ
ル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、６−クロロ−３−イ
ンドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、レサズリンナ
トリウム、トリフェニルテトラゾリウムクロライド（Ｔ
ＴＣ）等は、いずれも市販品（和光純薬工業社製、ナカ
ライテスク社製等）が使用できる。
【００１５】本発明の大腸菌群の検出法によれば、５−
ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラク
トピラノシド（Ｘ−ＧＡＬ）等β−ガラクトシダーゼの
存在によって発色する発色合成酵素基質を直接滴下し、
滴下後短時間で（１０分間〜２時間で）、大腸菌群を検
出出来ることを特徴とするβ−ガラクトシダーゼを含む
検体の大腸菌群の検出法が、検体の接種（塗抹）から８
〜１６時間という短時間で、迅速に、簡便かつ高感度で
β−ガラクトシダーゼを含む検体の検査における大腸菌
群を検出できるものである。特に、本発明の検出法は、
検体がβ‐ガラクトシダーゼを含む場合も、検体に存在
するβ−ガラクトシダーゼを大腸菌群の集落と誤判定す
ることがない。
ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラク
トピラノシド（Ｘ−ＧＡＬ）等β−ガラクトシダーゼの
存在によって発色する発色合成酵素基質を直接滴下し、
滴下後短時間で（１０分間〜２時間で）、大腸菌群を検
出出来ることを特徴とするβ−ガラクトシダーゼを含む
検体の大腸菌群の検出法が、検体の接種（塗抹）から８
〜１６時間という短時間で、迅速に、簡便かつ高感度で
β−ガラクトシダーゼを含む検体の検査における大腸菌
群を検出できるものである。特に、本発明の検出法は、
検体がβ‐ガラクトシダーゼを含む場合も、検体に存在
するβ−ガラクトシダーゼを大腸菌群の集落と誤判定す
ることがない。
【００１６】本発明の酸化還元色素及び発色合成酵素基
質は、溶液状、粉末状等各種の実施形態が可能である
が、直接滴下して使用されることから、溶液状であるこ
とが望ましい。本発明の細菌集落への直接滴下は、発色
合成酵素基質を滴状で滴下することに限定されず、霧状
で滴下することもできる。発色合成酵素基質の滴下量
は、細菌集落の大きさ、発色合成酵素基質の濃度等によ
り適宜選択されるが、目標細菌集落を覆うのに十分な量
滴下することが望ましい。本発明の大腸菌群には、好気
性又は通性嫌気性の無芽胞桿菌で、乳糖を分解してガス
を形成するグラム陰性菌であるエシェリキア属、エンテ
ロバクター属などの各菌を示す。
質は、溶液状、粉末状等各種の実施形態が可能である
が、直接滴下して使用されることから、溶液状であるこ
とが望ましい。本発明の細菌集落への直接滴下は、発色
合成酵素基質を滴状で滴下することに限定されず、霧状
で滴下することもできる。発色合成酵素基質の滴下量
は、細菌集落の大きさ、発色合成酵素基質の濃度等によ
り適宜選択されるが、目標細菌集落を覆うのに十分な量
滴下することが望ましい。本発明の大腸菌群には、好気
性又は通性嫌気性の無芽胞桿菌で、乳糖を分解してガス
を形成するグラム陰性菌であるエシェリキア属、エンテ
ロバクター属などの各菌を示す。
【００１７】以上の通り、本発明のβ−ガラクトシダー
ゼを含む検体の大腸菌群の検出法は、グラム陽性細菌生
育阻害平板培地に生育する細菌集落を酸化還元色素の変
色によって、固形夾雑物と識別し、更に、その変色部の
細菌集落にβ−ガラクトシダーゼの存在により発色する
発色合成酵素基質を滴下し、細菌集落の菌のβ−ガラク
トシダーゼ活性の有無を確認する検出法であって、培養
後、短時間（１０分間〜４時間）で酸化還元色素の変色
及び発色合成酵素基質の発色反応が検出でき、また、生
鮮食品、ヨーグルト等の検体に含まれるβ−ガラクトシ
ダーゼによる誤判定がないことから、簡易かつ正確に大
腸菌群を検出できる。
ゼを含む検体の大腸菌群の検出法は、グラム陽性細菌生
育阻害平板培地に生育する細菌集落を酸化還元色素の変
色によって、固形夾雑物と識別し、更に、その変色部の
細菌集落にβ−ガラクトシダーゼの存在により発色する
発色合成酵素基質を滴下し、細菌集落の菌のβ−ガラク
トシダーゼ活性の有無を確認する検出法であって、培養
後、短時間（１０分間〜４時間）で酸化還元色素の変色
及び発色合成酵素基質の発色反応が検出でき、また、生
鮮食品、ヨーグルト等の検体に含まれるβ−ガラクトシ
ダーゼによる誤判定がないことから、簡易かつ正確に大
腸菌群を検出できる。
【００１８】また、本発明の検出法は、発色合成酵素基
質を培養後、酸化還元色素変色部の細菌集落に直接滴下
することから、比較的高濃度の発色合成酵素基質を使用
出来、概ね細菌集落が形成される８〜１６時間という短
い時間で、迅速に大腸菌群を検出できる。
質を培養後、酸化還元色素変色部の細菌集落に直接滴下
することから、比較的高濃度の発色合成酵素基質を使用
出来、概ね細菌集落が形成される８〜１６時間という短
い時間で、迅速に大腸菌群を検出できる。
【００１９】次に本発明の第二の発明について詳細に説
明する。第二の発明は、第一の発明の検査法を実施する
ためのキットに関する。本発明の検出キットの第一の態
様は、大腸菌群の検出キットであって、その第一の態様
は、酸化還元色素液及びこれを収容する酸化還元色素液
滴下用容器と、β−ガラクトシダーゼの存在によって発
色する発色合成酵素基質液及びこれを収容する発色合成
酵素基質液滴下用容器とを備えた大腸菌群の検出キット
である。このキットを用いて、大腸菌群を検出するに
は、グラム陽性細菌生育阻害平板培地に生育した細菌集
落に、酸化還元色素液滴下用容器を用いて酸化還元色素
を平板培地面に滴下し、これを培養する。ついで発色合
成酵素基質液滴下用容器を用いて発色合成酵素基質を滴
下する。
明する。第二の発明は、第一の発明の検査法を実施する
ためのキットに関する。本発明の検出キットの第一の態
様は、大腸菌群の検出キットであって、その第一の態様
は、酸化還元色素液及びこれを収容する酸化還元色素液
滴下用容器と、β−ガラクトシダーゼの存在によって発
色する発色合成酵素基質液及びこれを収容する発色合成
酵素基質液滴下用容器とを備えた大腸菌群の検出キット
である。このキットを用いて、大腸菌群を検出するに
は、グラム陽性細菌生育阻害平板培地に生育した細菌集
落に、酸化還元色素液滴下用容器を用いて酸化還元色素
を平板培地面に滴下し、これを培養する。ついで発色合
成酵素基質液滴下用容器を用いて発色合成酵素基質を滴
下する。
【００２０】このキットは、さらに、任意に前記酸化還
元色素液及び／または前記発色合成酵素基質液を吸収さ
せるための吸収体を備えた大腸菌群の検出キットとする
ことができる。この場合、吸収体を平板培地表面に載せ
た後、酸化還元色素液滴下用容器を用いて酸化還元色素
を吸収させるか、または、予め酸化還元色素液滴下用容
器を用いて吸収体に酸化還元色素を吸収させて平板培地
表面に載せ、培養することができる。ついで発色合成酵
素基質液滴下用容器を用いて発色合成酵素基質を滴下す
る。
元色素液及び／または前記発色合成酵素基質液を吸収さ
せるための吸収体を備えた大腸菌群の検出キットとする
ことができる。この場合、吸収体を平板培地表面に載せ
た後、酸化還元色素液滴下用容器を用いて酸化還元色素
を吸収させるか、または、予め酸化還元色素液滴下用容
器を用いて吸収体に酸化還元色素を吸収させて平板培地
表面に載せ、培養することができる。ついで発色合成酵
素基質液滴下用容器を用いて発色合成酵素基質を滴下す
る。
【００２１】本発明の大腸菌群の検出キットの第二の態
様は、酸化還元色素が予め添加された吸収体と、β−ガ
ラクトシダーゼの存在によって発色する発色合成酵素基
質液及びこれを収容する発色合成酵素基質液滴下用容器
とを備えた大腸菌群の検出キットである。このキットを
用いて大腸菌群を検出するには、グラム陽性細菌生育阻
害平板培地に生育した細菌集落に、酸化還元色素を吸収
したろ紙等の吸収体を平板培地表面に載せ、これを培養
する。ついで発色合成酵素基質液滴下用容器を用いて発
色合成酵素基質を滴下する。
様は、酸化還元色素が予め添加された吸収体と、β−ガ
ラクトシダーゼの存在によって発色する発色合成酵素基
質液及びこれを収容する発色合成酵素基質液滴下用容器
とを備えた大腸菌群の検出キットである。このキットを
用いて大腸菌群を検出するには、グラム陽性細菌生育阻
害平板培地に生育した細菌集落に、酸化還元色素を吸収
したろ紙等の吸収体を平板培地表面に載せ、これを培養
する。ついで発色合成酵素基質液滴下用容器を用いて発
色合成酵素基質を滴下する。
【００２２】本発明の大腸菌群の検出キットの第三の態
様は、酸化還元色素が予め添加されたグラム陽性菌生育
阻害培地と、β−ガラクトシダーゼの存在によって発色
する発色合成酵素基質液及びこれを収容する発色合成酵
素基質液滴下用容器とを備えた大腸菌群の検出キットで
ある。このキットを用いて大腸菌群を検出するには、酸
化還元色素が予め添加されたグラム陽性細菌生育阻害平
板培地にて検体を培養し、この培地の酸化還元色素を還
元し、該色素を変色させた細菌集落に、発色合成酵素基
質液滴下用容器を用いて発色合成酵素基質を滴下する。
様は、酸化還元色素が予め添加されたグラム陽性菌生育
阻害培地と、β−ガラクトシダーゼの存在によって発色
する発色合成酵素基質液及びこれを収容する発色合成酵
素基質液滴下用容器とを備えた大腸菌群の検出キットで
ある。このキットを用いて大腸菌群を検出するには、酸
化還元色素が予め添加されたグラム陽性細菌生育阻害平
板培地にて検体を培養し、この培地の酸化還元色素を還
元し、該色素を変色させた細菌集落に、発色合成酵素基
質液滴下用容器を用いて発色合成酵素基質を滴下する。
【００２３】本発明の検出キットにおいて、酸化還元色
素及び／または発色合成酵素基質を収容する滴下用容器
は、細菌集落または、以下の吸収体に直接滴下すること
が出来る容器であれば、如何なるものであってもよい
が、具体的には、市販の点眼ボトル、スポイト瓶、ノズ
ルバイアル、ノズルキャップ付き容器等（竹中容器社
製、マルコム社製等）が例示できる。
素及び／または発色合成酵素基質を収容する滴下用容器
は、細菌集落または、以下の吸収体に直接滴下すること
が出来る容器であれば、如何なるものであってもよい
が、具体的には、市販の点眼ボトル、スポイト瓶、ノズ
ルバイアル、ノズルキャップ付き容器等（竹中容器社
製、マルコム社製等）が例示できる。
【００２４】吸収体は、酸化還元色素液及び／または発
色合成酵素基質を吸収、保持させ得るものであればいず
れのものでも使用でき、市販のろ紙、メッシュ、紙シー
ト等（東洋ろ紙社製等）が例示される。酸化還元色素を
予め添加された吸収体は、細菌集落によって還元され変
色するために十分量の酸化還元色素が予め添加された吸
収体であり、酸化還元色素液を添加後、乾燥処理をほど
こすことが保管上望ましい。
色合成酵素基質を吸収、保持させ得るものであればいず
れのものでも使用でき、市販のろ紙、メッシュ、紙シー
ト等（東洋ろ紙社製等）が例示される。酸化還元色素を
予め添加された吸収体は、細菌集落によって還元され変
色するために十分量の酸化還元色素が予め添加された吸
収体であり、酸化還元色素液を添加後、乾燥処理をほど
こすことが保管上望ましい。
【００２５】酸化還元色素を予め添加された培地は、細
菌集落によって還元され変色するために十分量の酸化還
元色素が予め添加された培地であり、生培地であること
が、利便性上望ましい。
菌集落によって還元され変色するために十分量の酸化還
元色素が予め添加された培地であり、生培地であること
が、利便性上望ましい。
【００２６】発色合成酵素基質の濃度は、後記試験例か
ら明らかなとおり、６ｍｇ／ｍｌ未満では、直接滴下に
より鑑別に十分な発色が得られないこと、８０ｍｇ／ｍ
ｌを超えると、発色合成酵素基質の結晶の析出が認めら
れることから、６〜８０ｍｇ／ｍｌであることが好まし
い。なお、培地中に含有させる場合と異なり、発色合成
酵素基質溶液の溶媒による細菌の生育などの影響を考慮
する必要はなく、強い発色が可能な６〜８０ｍｇ／ｍｌ
という比較的高濃度での実施が可能となる。なお、本発
明において、発色合成酵素基質は、ジメチルホルムアミ
ド（和光純薬工業社製等）又はジメチルホルムアミドの
水溶液に前記濃度で溶解して使用でき、ジメチルホルム
アミド水溶液は５０％濃度以上の溶液であることが望ま
しい。
ら明らかなとおり、６ｍｇ／ｍｌ未満では、直接滴下に
より鑑別に十分な発色が得られないこと、８０ｍｇ／ｍ
ｌを超えると、発色合成酵素基質の結晶の析出が認めら
れることから、６〜８０ｍｇ／ｍｌであることが好まし
い。なお、培地中に含有させる場合と異なり、発色合成
酵素基質溶液の溶媒による細菌の生育などの影響を考慮
する必要はなく、強い発色が可能な６〜８０ｍｇ／ｍｌ
という比較的高濃度での実施が可能となる。なお、本発
明において、発色合成酵素基質は、ジメチルホルムアミ
ド（和光純薬工業社製等）又はジメチルホルムアミドの
水溶液に前記濃度で溶解して使用でき、ジメチルホルム
アミド水溶液は５０％濃度以上の溶液であることが望ま
しい。
【００２７】以上の通り、本発明の第二の発明の迅速キ
ットは、前期本発明の第一の発明の大腸菌群の迅速判定
法に好適に使用することが出来、迅速で、簡易かつ高精
度な大腸菌群の検出を可能とする。
ットは、前期本発明の第一の発明の大腸菌群の迅速判定
法に好適に使用することが出来、迅速で、簡易かつ高精
度な大腸菌群の検出を可能とする。
【００２８】なお、本発明において発色合成酵素基質の
発色の判定は、以下の発色度合の判定方法を採用する。 （発色度合の判定方法）肉眼により細菌集落の発色度合
を日本工業規格（ＪＩＳ Ｚ ８７２１）に準拠した日
本規格協会発行の標準色票と比較して判定する。具体的
には、各発色合成酵素基質による発色の色彩に対応した
次に示す各標準色票と比較して、明度（Ｖ）が７以下の
値を示すものを鑑別に十分な発色有りと判定する。
発色の判定は、以下の発色度合の判定方法を採用する。 （発色度合の判定方法）肉眼により細菌集落の発色度合
を日本工業規格（ＪＩＳ Ｚ ８７２１）に準拠した日
本規格協会発行の標準色票と比較して判定する。具体的
には、各発色合成酵素基質による発色の色彩に対応した
次に示す各標準色票と比較して、明度（Ｖ）が７以下の
値を示すものを鑑別に十分な発色有りと判定する。
【００２９】発色の色彩が青色を呈する発色合成酵素基
質である５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β
−Ｄ−ガラクトピラノシドを使用した場合には、色相別
チャート５Ｂの彩度（Ｃ）が６の列の標準色票と比較す
る。発色の色彩が紫色を呈する発色合成酵素基質である
５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガ
ラクトピラノシドを使用した場合には、色相別チャート
５Ｐの彩度（Ｃ）が６の列の標準色票と比較する。発色
の色彩が赤紫色を呈する発色合成酵素基質である６−ク
ロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを
使用した場合には、色相別チャート５ＲＰの彩度（Ｃ）
が８の列の標準色票と比較する。次に試験例を示して本
発明を詳記する。
質である５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β
−Ｄ−ガラクトピラノシドを使用した場合には、色相別
チャート５Ｂの彩度（Ｃ）が６の列の標準色票と比較す
る。発色の色彩が紫色を呈する発色合成酵素基質である
５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガ
ラクトピラノシドを使用した場合には、色相別チャート
５Ｐの彩度（Ｃ）が６の列の標準色票と比較する。発色
の色彩が赤紫色を呈する発色合成酵素基質である６−ク
ロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを
使用した場合には、色相別チャート５ＲＰの彩度（Ｃ）
が８の列の標準色票と比較する。次に試験例を示して本
発明を詳記する。
【００３０】
【実施例】試験例１ この試験は、本発明の方法が、β−ガラクトシダーゼを
含む食品の大腸菌群の検出においても有効であることを
調べるために行った。
含む食品の大腸菌群の検出においても有効であることを
調べるために行った。
【００３１】（１）試験培地 グラム陽性細菌生育阻害平板培地として、市販のデオキ
シコール酸寒天培地（メルク・ジャパン社製）を常法に
より、調製して、無菌室内で、直径９ｃｍのプラスチッ
ク製滅菌シャーレ（栄研器材社製）に１枚当り２０ｍｌ
分注し、冷却し、水平に固めた後、試験菌液の吸収を高
めるため、クリーンブース内で、培地表面をよく乾燥し
たものを使用した。
シコール酸寒天培地（メルク・ジャパン社製）を常法に
より、調製して、無菌室内で、直径９ｃｍのプラスチッ
ク製滅菌シャーレ（栄研器材社製）に１枚当り２０ｍｌ
分注し、冷却し、水平に固めた後、試験菌液の吸収を高
めるため、クリーンブース内で、培地表面をよく乾燥し
たものを使用した。
【００３２】（２）試験菌液の調製 試験菌株として、微生物保存機関である東京大学医科学
研究所より分譲されたエシェリキア・コリ（Escherichi
a coli）ＩＩＤ ５６２Ｂ、及び発酵研究所より分譲さ
れたエンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter clo
acae）ＩＦＯ１３５３５を使用した。前記試験菌株の各
１菌株の滅菌生理食塩水による希釈液（１００ CFU（co
lonyforming unit）／ml）９ｍｌとプレーンヨーグルト
（森永乳業社製）１ｇとを混合して作製した試験菌液
を、前記試験培地の各1平板に対して、０．４ｇを塗抹
し、３５℃で１４時間培養し、検出対象である細菌集落
を形成させた（計算上菌数：３６ CFU／平板）。
研究所より分譲されたエシェリキア・コリ（Escherichi
a coli）ＩＩＤ ５６２Ｂ、及び発酵研究所より分譲さ
れたエンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter clo
acae）ＩＦＯ１３５３５を使用した。前記試験菌株の各
１菌株の滅菌生理食塩水による希釈液（１００ CFU（co
lonyforming unit）／ml）９ｍｌとプレーンヨーグルト
（森永乳業社製）１ｇとを混合して作製した試験菌液
を、前記試験培地の各1平板に対して、０．４ｇを塗抹
し、３５℃で１４時間培養し、検出対象である細菌集落
を形成させた（計算上菌数：３６ CFU／平板）。
【００３３】（３）試薬の調製 酸化還元色素としてトリフェニルテトラゾリウムクロラ
イド（和光純薬工業社製）を精製水に５ｍｇ／ｍｌの濃
度で溶解し、ＴＴＣ試薬とした。発色合成酵素基質とし
て、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ
−ガラクトピラノシド（和光純薬社製）をジメチルホル
ムアミド（和光純薬社製）に、３０ｍｇ／ｍｌの濃度で
溶解し、X−GAL試薬とした。
イド（和光純薬工業社製）を精製水に５ｍｇ／ｍｌの濃
度で溶解し、ＴＴＣ試薬とした。発色合成酵素基質とし
て、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ
−ガラクトピラノシド（和光純薬社製）をジメチルホル
ムアミド（和光純薬社製）に、３０ｍｇ／ｍｌの濃度で
溶解し、X−GAL試薬とした。
【００３４】（４）試験方法 ヨーグルトカードと細菌集落が混在したシャーレ表面に
TTC試薬を滴下、３５℃２０分間反応させ、赤く変色し
た細菌集落に、X−GAL試薬を滴下、３５℃３０分間反応
させ、青く変色した数を計測した。一方、比較実験とし
て、酸化還元色素を滴下していない培地の入ったシャー
レ表面にX−GAL試薬を滴下、３５℃３０分間発色反応さ
せ、青く変色した数を計測した。また、ブランクとし
て、上記試験菌を含まないプレーンヨーグルトの滅菌生
理食塩水による１０倍希釈液を用いて、本発明による方
法と酸化還元色素を滴下していない培地を用いた方法と
を同様に試験し、青変色の数を計測した。
TTC試薬を滴下、３５℃２０分間反応させ、赤く変色し
た細菌集落に、X−GAL試薬を滴下、３５℃３０分間反応
させ、青く変色した数を計測した。一方、比較実験とし
て、酸化還元色素を滴下していない培地の入ったシャー
レ表面にX−GAL試薬を滴下、３５℃３０分間発色反応さ
せ、青く変色した数を計測した。また、ブランクとし
て、上記試験菌を含まないプレーンヨーグルトの滅菌生
理食塩水による１０倍希釈液を用いて、本発明による方
法と酸化還元色素を滴下していない培地を用いた方法と
を同様に試験し、青変色の数を計測した。
【００３５】（５）試験結果 結果を表１に示す。
【００３６】
【表１】
【００３７】上記結果から、本発明の方法によって、正
確にかつ迅速に大腸菌群を計測可能であった。一方、酸
化還元色素を用いずに、そのままX-GAL試薬を滴下する
方法では、培地表面で細かく分散したヨーグルトカード
が青く変色し、大腸菌群の集落と誤判定してしまう欠点
があった。
確にかつ迅速に大腸菌群を計測可能であった。一方、酸
化還元色素を用いずに、そのままX-GAL試薬を滴下する
方法では、培地表面で細かく分散したヨーグルトカード
が青く変色し、大腸菌群の集落と誤判定してしまう欠点
があった。
【００３８】試験例２ この試験は、発色度合を指標として、発色合成酵素基質
の適正な濃度を調べるために行った。なお、以下の試薬
の調製、試験方法以外については、試験例１と同じ方法
にて実施した。
の適正な濃度を調べるために行った。なお、以下の試薬
の調製、試験方法以外については、試験例１と同じ方法
にて実施した。
【００３９】（１）試薬の調製 酸化還元色素として、レサズリンナトリウム（Resazuri
n sodium salt、和光純薬工業社製）を精製水に５ｍｇ
／ｍｌの濃度で溶解し、レサズリン試薬とした。発色合
成酵素基質として、５−ブロモ−４−クロロ−３−イン
ドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（和光純薬工業社
製）をジメチルホルムアミド（ナカライテスク社製）
に、表２に示す通りに３，６，８０、及び９０ｍｇ／ｍ
ｌの各濃度で溶解し、X−GAL試薬とした。
n sodium salt、和光純薬工業社製）を精製水に５ｍｇ
／ｍｌの濃度で溶解し、レサズリン試薬とした。発色合
成酵素基質として、５−ブロモ−４−クロロ−３−イン
ドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（和光純薬工業社
製）をジメチルホルムアミド（ナカライテスク社製）
に、表２に示す通りに３，６，８０、及び９０ｍｇ／ｍ
ｌの各濃度で溶解し、X−GAL試薬とした。
【００４０】（２）試験方法 培地表面全体にろ紙を載せ密着させた後、濃い青色のレ
サズリン試薬をろ紙全体に滴下し、３５℃３０分間変色
反応させ、このろ紙がうすいピンク色または無色に変色
した部分に、X−GAL試薬を滴下、３５℃３０分間発色反
応させ、発色度合を前記発色度合いの判定方法により判
定した。
サズリン試薬をろ紙全体に滴下し、３５℃３０分間変色
反応させ、このろ紙がうすいピンク色または無色に変色
した部分に、X−GAL試薬を滴下、３５℃３０分間発色反
応させ、発色度合を前記発色度合いの判定方法により判
定した。
【００４１】（３）試験結果 この試験の結果は表２に示すとおりである。表２から明
らかな通り、発色合成酵素基質の濃度が６ｍｇ／ｍｌ未
満では、鑑別に十分な発色が得られなかった。また８０
ｍｇ／ｍｌを超えると、発色合成酵素基質の結晶の析出
が認められた。従って、発色合成酵素基質の適正な濃度
は、６〜８０ｍｇ／ｍｌであることが判明した。なお、
大腸菌群に属する試験菌株の種類、グラム陽性細菌生育
阻害培地の種類（具体的には、硫酸ラウリル寒天培地
等）、大腸菌群を直接検出できる発色合成酵素基質の種
類（５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ
−ガラクトピラノシド、６−クロロ−３−インドリル−
β−Ｄ−ガラクトピラノシド等）、１０〜６０分間の発
色時間の範囲で、又は８〜１４時間の細菌培養時間の範
囲で、適宜変更して試験したがほぼ同様の結果が得られ
た。
らかな通り、発色合成酵素基質の濃度が６ｍｇ／ｍｌ未
満では、鑑別に十分な発色が得られなかった。また８０
ｍｇ／ｍｌを超えると、発色合成酵素基質の結晶の析出
が認められた。従って、発色合成酵素基質の適正な濃度
は、６〜８０ｍｇ／ｍｌであることが判明した。なお、
大腸菌群に属する試験菌株の種類、グラム陽性細菌生育
阻害培地の種類（具体的には、硫酸ラウリル寒天培地
等）、大腸菌群を直接検出できる発色合成酵素基質の種
類（５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ
−ガラクトピラノシド、６−クロロ−３−インドリル−
β−Ｄ−ガラクトピラノシド等）、１０〜６０分間の発
色時間の範囲で、又は８〜１４時間の細菌培養時間の範
囲で、適宜変更して試験したがほぼ同様の結果が得られ
た。
【００４２】
【表２】
【００４３】次に実施例を示してさらに本発明を詳細に
説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるもので
はない。 実施例１ 酸化還元色素として、トリフェニルテトラゾリウムクロ
ライド（和光純薬工業社製）を精製水に１％（Ｗ／Ｗ）
の濃度で溶解し、TTC試薬として使用した。発色合成酵
素基質として、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリ
ル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（MAGENTA−ＧＡＬ 和
光純薬工業社製）をジメチルホルムアミド（和光純薬工
業社製）の５０％濃度の水溶液に４０ｍｇ／ｍｌの濃度
で溶解し、MAGENTA−ＧＡＬ 試薬として使用した。これ
ら試薬を使用して、次に示すとおり、β−ガラクトシダ
ーゼを含む検体の大腸菌群の検出法を実施した。
説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるもので
はない。 実施例１ 酸化還元色素として、トリフェニルテトラゾリウムクロ
ライド（和光純薬工業社製）を精製水に１％（Ｗ／Ｗ）
の濃度で溶解し、TTC試薬として使用した。発色合成酵
素基質として、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリ
ル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（MAGENTA−ＧＡＬ 和
光純薬工業社製）をジメチルホルムアミド（和光純薬工
業社製）の５０％濃度の水溶液に４０ｍｇ／ｍｌの濃度
で溶解し、MAGENTA−ＧＡＬ 試薬として使用した。これ
ら試薬を使用して、次に示すとおり、β−ガラクトシダ
ーゼを含む検体の大腸菌群の検出法を実施した。
【００４４】グラム陽性細菌生育阻害培地として、市販
のラウリル硫酸ブロス調製用粉末培地（日本ベクトン・
デッキンソン社製）に１．５％濃度で寒天（ディフコ社
製）、を加えて常法により、調製して、上記ＴＴＣ試薬
（１％）を５ｍｌ／培地１Ｌとなるように、無菌的に添
加、攪拌後、無菌室内で、直径９ｃｍのプラスチック製
滅菌シャーレ（栄研器材社製）に1枚あたり２０ｍｌ分
注し、冷却固化、室温に1週間放置し、十分に乾操した
ものを使用した。
のラウリル硫酸ブロス調製用粉末培地（日本ベクトン・
デッキンソン社製）に１．５％濃度で寒天（ディフコ社
製）、を加えて常法により、調製して、上記ＴＴＣ試薬
（１％）を５ｍｌ／培地１Ｌとなるように、無菌的に添
加、攪拌後、無菌室内で、直径９ｃｍのプラスチック製
滅菌シャーレ（栄研器材社製）に1枚あたり２０ｍｌ分
注し、冷却固化、室温に1週間放置し、十分に乾操した
ものを使用した。
【００４５】検体は市販のパイン果肉（生）を用いた。
なお、パイン果肉（生）はβ−ガラクトシダーゼ活性が
あることが知られている。上記パイン果肉を細かく磨砕
した後、滅菌生理食塩水で５倍に希釈した分散液０．５
ｍｌに、発酵研究所より分譲されたエンテロバクター・
クロアカエ（Enterobacter cloacae）ＩＦＯ１３５３５
及びアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションよ
り分譲されたシュードモナス・エルジノーザ（Pseudomo
nas aeruginosa）ＡＴＣＣ５５１６のそれぞれの菌数を
滅菌生理食塩水にて、１，０００CFU／ｍｌに調製した
菌液を各々０．０１ｍｌ添加した試験検体０．５２ｍｌ
を、上記培地に塗抹し、３５℃で１２時間培養した。そ
の結果、培地表面全体に、赤く変色した１８の細菌集落
が観察され、その細菌集落に、MAGENTA−ＧＡＬ試薬を
ピペットを用いて滴下、３５℃３０分後の発色を観察し
た。
なお、パイン果肉（生）はβ−ガラクトシダーゼ活性が
あることが知られている。上記パイン果肉を細かく磨砕
した後、滅菌生理食塩水で５倍に希釈した分散液０．５
ｍｌに、発酵研究所より分譲されたエンテロバクター・
クロアカエ（Enterobacter cloacae）ＩＦＯ１３５３５
及びアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションよ
り分譲されたシュードモナス・エルジノーザ（Pseudomo
nas aeruginosa）ＡＴＣＣ５５１６のそれぞれの菌数を
滅菌生理食塩水にて、１，０００CFU／ｍｌに調製した
菌液を各々０．０１ｍｌ添加した試験検体０．５２ｍｌ
を、上記培地に塗抹し、３５℃で１２時間培養した。そ
の結果、培地表面全体に、赤く変色した１８の細菌集落
が観察され、その細菌集落に、MAGENTA−ＧＡＬ試薬を
ピペットを用いて滴下、３５℃３０分後の発色を観察し
た。
【００４６】その結果、赤から紫に発色した１０の細菌
集落と、赤いままの８の細菌集落が観察された。紫に発
色した細菌集落と、赤色の細菌集落について、常法（厚
生省生活衛生局監修、「食品衛生検査指針 微生物
編」、日本食品衛生協会発行、1990年12月25日）に基づ
き細菌の同定を行った結果、紫に発色した細菌集落はエ
ンテロバクター・クロアカエ、赤色の細菌集落はシュー
ドモナス・エルジノーザであることが確認された。即
ち、前記検出試薬キットを使用したβ−ガラクトシダー
ゼ活性のある生フルーツを含む大腸菌群の検出法は、生
フルーツの細かい小片を大腸菌群と誤判定することな
く、大腸菌群であるエンテロバクター・クロアカエと大
腸菌群ではないグラム陰性菌のシュードモナス・エルジ
ノーザとの鑑別に有効であり、迅速に、簡易に高感度で
大腸菌群を検出できることから優れている。
集落と、赤いままの８の細菌集落が観察された。紫に発
色した細菌集落と、赤色の細菌集落について、常法（厚
生省生活衛生局監修、「食品衛生検査指針 微生物
編」、日本食品衛生協会発行、1990年12月25日）に基づ
き細菌の同定を行った結果、紫に発色した細菌集落はエ
ンテロバクター・クロアカエ、赤色の細菌集落はシュー
ドモナス・エルジノーザであることが確認された。即
ち、前記検出試薬キットを使用したβ−ガラクトシダー
ゼ活性のある生フルーツを含む大腸菌群の検出法は、生
フルーツの細かい小片を大腸菌群と誤判定することな
く、大腸菌群であるエンテロバクター・クロアカエと大
腸菌群ではないグラム陰性菌のシュードモナス・エルジ
ノーザとの鑑別に有効であり、迅速に、簡易に高感度で
大腸菌群を検出できることから優れている。
【００４７】実施例２ 酸化還元色素として、レサズリンナトリウム（Resazuri
n sodium salt、和光純薬工業社製）をエタノール（和
光純薬工業社製）の５０％濃度の水溶液に１ｍｇ／ｍｌ
の濃度で溶解し、５ｍｌ容量のポリプロピレン製点眼ボ
トル（竹本容器社製）に分注した。発色合成酵素基質と
して、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−
Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ＧＡＬ 和光純薬工業社
製）をジメチルホルムアミド（和光純薬工業社製）の50
%濃度の水溶液に２０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解し、５ｍ
ｌ容量のポリプロピレン製点眼ボトル（竹本容器社製）
に分注した。これらボトル入りキット及び酸化還元色素
の吸収体としてのろ紙（東洋ろ紙社製）を使用して、次
に示すとおり、β−ガラクトシダーゼを含む検体の大腸
菌群の検出法を実施した。グラム陽性細菌生育阻害培地
として、市販のデオキシコール酸寒天培地（栄研化学社
製）を常法により調製して、無菌室内で、直径９ｃｍの
プラスチック製滅菌シャーレ（栄研器材社製）に1枚あ
たり２０ｍｌ分注し、冷却固化、室温に1週間放置し、
十分に乾操したものを使用した。
n sodium salt、和光純薬工業社製）をエタノール（和
光純薬工業社製）の５０％濃度の水溶液に１ｍｇ／ｍｌ
の濃度で溶解し、５ｍｌ容量のポリプロピレン製点眼ボ
トル（竹本容器社製）に分注した。発色合成酵素基質と
して、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−
Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ＧＡＬ 和光純薬工業社
製）をジメチルホルムアミド（和光純薬工業社製）の50
%濃度の水溶液に２０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解し、５ｍ
ｌ容量のポリプロピレン製点眼ボトル（竹本容器社製）
に分注した。これらボトル入りキット及び酸化還元色素
の吸収体としてのろ紙（東洋ろ紙社製）を使用して、次
に示すとおり、β−ガラクトシダーゼを含む検体の大腸
菌群の検出法を実施した。グラム陽性細菌生育阻害培地
として、市販のデオキシコール酸寒天培地（栄研化学社
製）を常法により調製して、無菌室内で、直径９ｃｍの
プラスチック製滅菌シャーレ（栄研器材社製）に1枚あ
たり２０ｍｌ分注し、冷却固化、室温に1週間放置し、
十分に乾操したものを使用した。
【００４８】検体は、市販の挽き肉（生）、玉ねぎ等の
生野菜等を使用した手作りハンバーグ（未加熱品）を用
いた。なお、この生肉、玉ねぎはβ−ガラクトシダーゼ
活性があることが知られている。上記ハンバーグを更に
細かく挽いた後、滅菌生理食塩水で５倍に希釈した分散
液０．５ｍｌを、上記培地に塗抹し、３５℃で１０時間
培養した。培地表面に市販のろ紙（東洋ろ紙社製）を載
せ、上記レサズリン溶液をろ紙全体に滴下、３５℃３０
分間後、ろ紙が淡紅色から無色となった２５区域に、Ｘ
−ＧＡＬ溶液を滴下、３５℃３０分間後の発色を観察し
た。
生野菜等を使用した手作りハンバーグ（未加熱品）を用
いた。なお、この生肉、玉ねぎはβ−ガラクトシダーゼ
活性があることが知られている。上記ハンバーグを更に
細かく挽いた後、滅菌生理食塩水で５倍に希釈した分散
液０．５ｍｌを、上記培地に塗抹し、３５℃で１０時間
培養した。培地表面に市販のろ紙（東洋ろ紙社製）を載
せ、上記レサズリン溶液をろ紙全体に滴下、３５℃３０
分間後、ろ紙が淡紅色から無色となった２５区域に、Ｘ
−ＧＡＬ溶液を滴下、３５℃３０分間後の発色を観察し
た。
【００４９】その結果、明確に青く発色した１８区域と
全く発色が認められない７区域が観察された。培地表面
より、ろ紙を取り除き、青く発色した区域の細菌集落
と、発色の認められない区域の細菌集落について、常法
（厚生省生活衛生局監修、「食品衛生検査指針 微生物
編」、日本食品衛生協会発行、1990年12月25日）に基づ
き細菌の同定を行った結果、青色発色ありの細菌集落は
大腸菌群であり、青色発色なしの細菌集落は大腸菌群で
ないことが確認された。即ち、前記検出キットを使用す
ることにより、β−ガラクトシダーゼ活性のある生肉、
玉ねぎ等を含むハンバーグについて、生肉、玉ねぎの細
かく挽かれた小片を大腸菌群と誤判定することなく、迅
速に、簡易に高感度で大腸菌群を検出できることから優
れている。
全く発色が認められない７区域が観察された。培地表面
より、ろ紙を取り除き、青く発色した区域の細菌集落
と、発色の認められない区域の細菌集落について、常法
（厚生省生活衛生局監修、「食品衛生検査指針 微生物
編」、日本食品衛生協会発行、1990年12月25日）に基づ
き細菌の同定を行った結果、青色発色ありの細菌集落は
大腸菌群であり、青色発色なしの細菌集落は大腸菌群で
ないことが確認された。即ち、前記検出キットを使用す
ることにより、β−ガラクトシダーゼ活性のある生肉、
玉ねぎ等を含むハンバーグについて、生肉、玉ねぎの細
かく挽かれた小片を大腸菌群と誤判定することなく、迅
速に、簡易に高感度で大腸菌群を検出できることから優
れている。
【００５０】
【発明の効果】以上詳細に記載した通り、本発明は、検
体をグラム陽性細菌生育阻害平板培地にて培養した後、
酸化還元色素を変色させる細菌集落について、β‐ガラ
クトシダーゼにより発色する発色合成酵素基質の発色性
を指標として大腸菌群を検出することを特徴とする大腸
菌群の迅速、簡易かつ高感度の検出法、並びにこの方法
に使用する検出キットに関するものであり、本発明によ
って奏せられる効果は以下の通りである。 （１）本発明の大腸菌群の検出法は、８〜１６時間とい
う短時間で、迅速に、大腸菌群を検出できる。 （２）本発明の大腸菌群の検出法及び検出キットは、グ
ラム陽性細菌生育阻害培地に生育した細菌集落と酸化還
元色素とを接触した後、変色部にβ−ガラクトシダーゼ
の存在によって発色する発色合成酵素基質を滴下する構
成よりなることから、極めて簡易である。 （３）本発明の大腸菌群の検出法及び検出キットは、グ
ラム陽性細菌生育阻害培地に生育した細菌集落と酸化還
元色素とを接触した後、変色部にβ−ガラクトシダーゼ
の存在によって発色する発色合成酵素基質を滴下するこ
とを特徴とし、検体に含まれるβ−ガラクトシダーゼの
影響を考慮することなく、発色合成酵素基質による発色
を計測可能で、正確な検出が可能である。 （４）本発明の大腸菌群の検出法及び検出キットは、培
地中の発色合成酵素基質を含有させる場合と異なり、発
色合成酵素基質の溶媒による細菌の生育阻害等の影響を
考慮することなく、強い発色が可能な６〜８０ｍｇ／ｍ
ｌという比較的高濃度での実施が可能で高感度である。
体をグラム陽性細菌生育阻害平板培地にて培養した後、
酸化還元色素を変色させる細菌集落について、β‐ガラ
クトシダーゼにより発色する発色合成酵素基質の発色性
を指標として大腸菌群を検出することを特徴とする大腸
菌群の迅速、簡易かつ高感度の検出法、並びにこの方法
に使用する検出キットに関するものであり、本発明によ
って奏せられる効果は以下の通りである。 （１）本発明の大腸菌群の検出法は、８〜１６時間とい
う短時間で、迅速に、大腸菌群を検出できる。 （２）本発明の大腸菌群の検出法及び検出キットは、グ
ラム陽性細菌生育阻害培地に生育した細菌集落と酸化還
元色素とを接触した後、変色部にβ−ガラクトシダーゼ
の存在によって発色する発色合成酵素基質を滴下する構
成よりなることから、極めて簡易である。 （３）本発明の大腸菌群の検出法及び検出キットは、グ
ラム陽性細菌生育阻害培地に生育した細菌集落と酸化還
元色素とを接触した後、変色部にβ−ガラクトシダーゼ
の存在によって発色する発色合成酵素基質を滴下するこ
とを特徴とし、検体に含まれるβ−ガラクトシダーゼの
影響を考慮することなく、発色合成酵素基質による発色
を計測可能で、正確な検出が可能である。 （４）本発明の大腸菌群の検出法及び検出キットは、培
地中の発色合成酵素基質を含有させる場合と異なり、発
色合成酵素基質の溶媒による細菌の生育阻害等の影響を
考慮することなく、強い発色が可能な６〜８０ｍｇ／ｍ
ｌという比較的高濃度での実施が可能で高感度である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 矢野 陽一郎 神奈川県座間市東原五丁目１番83号 森永 乳業株式会社分析センター内 (72)発明者 清瀧 兼司 神奈川県座間市東原五丁目１番83号 森永 乳業株式会社食品総合研究所内 (72)発明者 中川 稔 神奈川県座間市東原五丁目１番83号 森永 乳業株式会社分析センター内 (72)発明者 狩野 健一郎 神奈川県座間市東原五丁目１番83号 森永 乳業株式会社食品総合研究所内 (72)発明者 佐々木 一枝 神奈川県座間市東原五丁目１番83号 森永 乳業株式会社食品総合研究所内 Ｆターム(参考） 2G054 AA04 AA10 AB03 BB13 CA28 CE02 EA06 GB04 GE07 JA02 JA06 4B063 QA18 QQ06 QR15 QR64 QR66 QS28 QX01
Claims (9)
- 【請求項１】 検体をグラム陽性細菌生育阻害平板培地
にて培養した後、酸化還元色素を変色させる細菌集落に
ついて、β‐ガラクトシダーゼにより発色する発色合成
酵素基質の発色性を指標として大腸菌群を検出すること
を特徴とする大腸菌群の検出法。 - 【請求項２】 検体をグラム陽性細菌生育阻害平板培地
にて培養し、生育した細菌集落と酸化還元色素とを接触
した後、該色素を変色させた細菌集落にβ−ガラクトシ
ダーゼの存在により発色する発色合成酵素基質を滴下す
ることを特徴とした請求項１記載の大腸菌群の検出法。 - 【請求項３】 検体を、酸化還元色素を含むグラム陽性
細菌生育阻害平板培地にて培養し、該色素を変色させた
細菌集落にβ−ガラクトシダーゼの存在により発色する
発色合成酵素基質を滴下することを特徴とした請求項１
記載の大腸菌群の検出法。 - 【請求項４】 前記発色合成酵素基質が、５−ブロモ−
４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノ
シド、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−
Ｄ−ガラクトピラノシド、６−クロロ−３−インドリル
−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、又はこれらの塩類であ
ることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項記載
の大腸菌群の検出法。 - 【請求項５】 酸化還元色素液及びこれを収容する酸化
還元色素液滴下用容器と、β−ガラクトシダーゼの存在
により発色する発色合成酵素基質液及びこれを収容する
発色合成酵素基質液滴下用容器とを備えた大腸菌群の検
出キット。 - 【請求項６】 前記酸化還元色素液及び／または前記発
色合成酵素基質液を吸収させるための吸収体を備えた請
求項５記載の大腸菌群の検出キット。 - 【請求項７】 酸化還元色素が予め添加された吸収体
と、β−ガラクトシダーゼの存在により発色する発色合
成酵素基質液及びこれを収容する発色合成酵素基質液滴
下用容器とを備えた大腸菌群の検出キット。 - 【請求項８】 酸化還元色素が予め添加されたグラム陽
性菌生育阻害平板培地と、β−ガラクトシダーゼの存在
により発色する発色合成酵素基質液及びこれを収容する
発色合成酵素基質液滴下用容器とを備えた大腸菌群の検
出キット。 - 【請求項９】 前記発色合成酵素基質が、５−ブロモ−
４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノ
シド、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−
Ｄ−ガラクトピラノシド、６−クロロ−３−インドリル
−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、又はこれらの塩類であ
ることを特徴とする請求項５乃至８のいずれか１項記載
の大腸菌群の検出キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001178648A JP4338909B2 (ja) | 2001-06-13 | 2001-06-13 | 大腸菌群の検出法並びに検出キット |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001178648A JP4338909B2 (ja) | 2001-06-13 | 2001-06-13 | 大腸菌群の検出法並びに検出キット |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002360296A true JP2002360296A (ja) | 2002-12-17 |
| JP4338909B2 JP4338909B2 (ja) | 2009-10-07 |
Family
ID=19019314
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001178648A Expired - Lifetime JP4338909B2 (ja) | 2001-06-13 | 2001-06-13 | 大腸菌群の検出法並びに検出キット |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4338909B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104007111A (zh) * | 2014-06-18 | 2014-08-27 | 南京麦思德餐饮管理有限公司 | 一种用于食品中硼砂检测的试剂盒 |
| CN106811403A (zh) * | 2017-01-22 | 2017-06-09 | 贵州勤邦食品安全科学技术有限公司 | 一种快速检测蜡样芽孢杆菌的测试片及其制备方法、检测方法 |
| CN112557381A (zh) * | 2021-01-25 | 2021-03-26 | 河南省科学院生物研究所有限责任公司 | 一种用于α-半乳糖苷酶的检测测试条及其检测方法 |
-
2001
- 2001-06-13 JP JP2001178648A patent/JP4338909B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104007111A (zh) * | 2014-06-18 | 2014-08-27 | 南京麦思德餐饮管理有限公司 | 一种用于食品中硼砂检测的试剂盒 |
| CN106811403A (zh) * | 2017-01-22 | 2017-06-09 | 贵州勤邦食品安全科学技术有限公司 | 一种快速检测蜡样芽孢杆菌的测试片及其制备方法、检测方法 |
| CN112557381A (zh) * | 2021-01-25 | 2021-03-26 | 河南省科学院生物研究所有限责任公司 | 一种用于α-半乳糖苷酶的检测测试条及其检测方法 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP4338909B2 (ja) | 2009-10-07 |
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