JP4338889B2 - 大腸菌群及び／又は大腸菌の迅速検出法並びにこの方法に使用する迅速検出キット - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、臨床材料、食品、医薬品、化粧品、飲料水等の中の大腸菌群及び／又は大腸菌の迅速検出法並びにこの方法に使用する迅速検出キットに関するものである。
【０００２】
詳しくは、本発明は、グラム陽性細菌生育阻害培地に生育した細菌集落に発色合成酵素基質を直接滴下することを特徴とする大腸菌群及び／又は大腸菌の迅速で、簡易かつ高感度の検出法、並びにこの方法に使用する迅速検出キットに関するものである。
尚、本明細書において、百分率（％）の表示は、特に断りのない限り重量による値である。
【０００３】
【従来の技術】
従来、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド０．０５〜５ｍｇ／ｍｌを含有する培地及びこれを使用したグルクロニダーゼ活性の検出に基づく大腸菌の迅速検出法が知られている（特開平６−６２８９３号公報。以下、従来技術１と記載する。）。
【０００４】
また、インドリル誘導体として６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド０．０３〜０．２ｍｇ／ｍｌ及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド０．０１〜０．２ｍｇ／ｍｌを含有するβ−ガラクトシダーゼ活性及びβ−グルクロニダーゼ活性の検出に基づく大腸菌群及び／又は大腸菌の同時検出のための栄養培地が開示されている（特表平９−５０１３１４号公報。以下、従来技術２と記載する。）。
【０００５】
更に、培養試薬を含有するブイヨン培地に反応基質として５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド０．０１〜０．５ｍｇ／ｍｌを添加した検出液をシート状の基体に含浸させてなることを特徴とする大腸菌群検出用試験シートが開示されている（特開２０００−１００号公報。以下、従来技術３と記載する。）。
しかしながら、これらの従来技術には、次に記載するとおりの不都合があった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
従来の６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド等の発色合成酵素基質を含有する培地は、大腸菌群及び／又は大腸菌を検出するために、２４時間程度培養することが必要であることから、迅速な方法とはいえないという問題点があった。
【０００７】
また、従来技術３の発色合成酵素基質として５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシドを使用した大腸菌群検出用試験シートは、簡易ではあるが、前記培地と同様に大腸菌群を検出するために、２４時間程度培養することが必要であることから、迅速な方法とはいえないという問題点があった。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記従来技術に鑑みて、グラム陽性細菌生育阻害培地に生育した細菌集落に発色合成酵素基質を直接滴下することを特徴とする大腸菌群及び／又は大腸菌の迅速検出法が、８乃至１４時間という短時間で、いわゆる迅速に、簡易かつ高感度で大腸菌群及び／又は大腸菌を検出できることを見い出し、本発明を完成した。
【０００９】
本発明の目的は、迅速で、簡易かつ高感度で大腸菌群及び／又は大腸菌を検出することが可能な大腸菌群及び／又は大腸菌の迅速検出法並びにこの方法に使用する迅速検出キットを提供することである。
【００１０】
前記課題を解決する本発明の第一の発明は、可視光で観察可能に発色する発色合成酵素基質を含有しないグラム陽性細菌生育阻害培地に生育した細菌集落に、前記発色合成酵素基質を直接滴下し、発色反応させた後、その発色度合を肉眼により観察することを特徴とする大腸菌群及び／又は大腸菌の迅速検出法であり、発色合成酵素基質が５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド、又はこれらの塩類であること（以下、態様１と記載する。）を望ましい態様としてもいる。
【００１１】
前記課題を解決する本発明の第二の発明は、６〜８０ｍｇ／ｍｌの濃度の発色合成酵素基質及びこれを収容する滴下用容器からなる前記第一の発明の大腸菌群及び／又は大腸菌の迅速検出法に使用する迅速検出キットであり、発色合成酵素基質が５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド、又はこれらの塩類であること（以下、態様２と記載する。）を望ましい態様としてもいる。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明の第一の発明のグラム陽性細菌生育阻害培地としては、選択的にグラム陽性細菌（グラム染色性が陽性の細菌）の生育を阻害し、グラム陰性細菌（グラム染色性が陰性の細菌）が生育し、細菌集落を形成しうるものであれば如何なるものであってもよいが、具体的には、市販の赤色色素を含有するデオキシコール酸寒天培地（メルク・ジャパン社製等）、ＶＢＲ寒天培地（バイオレッド−レッド−胆汁酸寒天培地。メルク・ジャパン社製等）、市販の色素を含有しない硫酸ラウリルブロス（日本ベクトン・ディッキンソン社製等）に１．５％濃度で寒天を加えて調製した寒天培地等を例示できる。
【００１３】
本発明の発色合成酵素基質は、グラム陰性細菌の細菌集落に直接滴下することにより、大腸菌群及び／又は大腸菌を直接検出できるものであれば如何なるものであってもよいが、培地中への拡散性、培地色調との色調コントラスト、及び可視光で観察可能であるか否かを考慮して、本発明の態様１及び２に示すとおり、大腸菌群かつ大腸菌の集落を青色に発色する５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、大腸菌群かつ大腸菌の集落を紫色に発色する５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、大腸菌群かつ大腸菌の集落を赤紫色に発色する６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、大腸菌の集落のみを特異的に青色に発色する５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド、又はこれらの塩類であることが望ましい。
【００１４】
本発明の態様１及び２に示す５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニドは、いずれも市販品（和光純薬工業社製、ナカライテスク社製等）が使用できる。
【００１５】
本発明の発色合成酵素基質は、溶液状、粉末状等各種の実施形態が可能であるが、直接滴下して使用されることから、溶液状であることが望ましい。
【００１６】
本発明の細菌集落への直接滴下は、発色合成酵素基質を滴状で滴下することに限定されず、霧状で滴下することもできる。発色合成酵素基質の滴下量は、細菌集落の大きさ、発色合成酵素基質の濃度等により適宜選択されるが、目標細菌集落全体を覆うのに十分な量滴下することが望ましい。
【００１７】
本発明の大腸菌群は、好気性又は通性嫌気性の無芽胞桿菌で、乳糖を分解してガスを形成するグラム陰性菌であるエシェリキア属、エンテロバクター属等の各菌を示し、本発明の大腸菌は、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）を示す。
【００１８】
尚、赤色色素を含有するグラム陽性細菌生育阻害培地（デオキシコール酸寒天培地、ＶＢＲ寒天培地等）に生育した細菌集落に対しては、青色に発色する発色合成酵素基質（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド等）を使用することが、培地色調との色調コントラストに優れ、観察しやすいことから、望ましい。また、色素を含有しないグラム陽性細菌生育阻害培地（硫酸ラウリル寒天培地等）に生育した細菌集落に対しては、紫又は赤紫色に発色する発色合成酵素基質（５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド等）を使用することが、培地色調との色調コントラストに優れ、観察しやすいことから、望ましい。
【００１９】
更に、発色合成酵素基質として、大腸菌群かつ大腸菌の集落を紫又は赤紫色に発色するもの（５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド等）と大腸菌の集落のみを特異的に青色に発色するもの（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド等）を組み合わせて使用することにより、エシェリキア・コリの集落のみが青色に染色され、エシェリキア・コリを除くエシェリキア属、エンテロバクター属等の大腸菌群の各菌の集落が紫又は赤紫色に染色され、大腸菌群と大腸菌を鑑別して検出できることから、一層望ましい。
【００２０】
以上のとおりの本発明の大腸菌群及び／又は大腸菌の迅速検出法は、発色合成酵素基質滴下後の培養操作が不用であり、細菌集落への滴下から短時間（１５分乃至２時間）の発色反応で強い発色が検出できることから、簡易かつ高感度で大腸菌群及び／又は大腸菌を検出できる。
【００２１】
また、本発明の大腸菌群及び／又は大腸菌の迅速検出法は、発色合成酵素基質に細菌集落が直接さらされ発色することから、発色合成酵素基質の培養による細菌集落への取り込みに長時間を必要とすることもないことから、概ね細菌集落が形成される８乃至１２時間という短い培養時間で、いわゆる迅速に大腸菌群及び／又は大腸菌を検出できる。
【００２２】
次に本発明の第二の発明について詳細に説明する。
本発明の第二の発明の発色合成酵素基質の濃度は、後記試験例から明らかなとおり、６ｍｇ／ｍｌ未満では、直接滴下により鑑別に十分な発色が得られないこと、８０ｍｇ／ｍｌを超えると、発色合成酵素基質の結晶の析出が認められることから、６〜８０ｍｇ／ｍｌである。尚、培地中に含有させる場合と異なり、発色合成酵素基質溶液の溶媒による細菌の生育阻害等の影響を考慮する必要はなく、強い発色が可能な６〜８０ｍｇ／ｍｌという比較的高濃度での実施が可能となる。
【００２３】
尚、本発明の第二の発明の態様２に示す発色合成酵素基質は、ジメチルホルムアミド（和光純薬工業社製、ナカライテスク社製等）又はジメチルホルムアミドの水溶液に前記濃度で溶解して使用でき、ジメチルホルムアミド水溶液はジメチルホルムアミド濃度として５０％以上の水溶液であることが望ましい。
【００２４】
前記濃度の発色合成酵素基質を収容する本発明の第二の発明の滴下用容器は、細菌集落に発色合成酵素基質を直接滴下することができる容器であれば、如何なるものであってもよいが、具体的には、市販の点眼ボトル、スポイト瓶、ノズルバイアル、ノズルキャップ付容器等（竹本容器社製、マルコム社製等）が例示できる。
【００２５】
以上のとおりの本発明の第二の発明の迅速検出キットは、前記本発明の第一の発明の大腸菌群及び／又は大腸菌の迅速検出法に好適に使用することができ、迅速で、簡易かつ高感度な大腸菌群及び／又は大腸菌の検出を可能とする。
【００２６】
尚、本発明の第二の発明の迅速検出キットとグラム陽性細菌生育阻害培地とを組み合わせてセットとすることが、本発明の第一の発明の大腸菌群及び／又は大腸菌の迅速検出法の実施に便利であることから望ましい。特に、発色合成酵素基質として青色に発色するもの（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド等）を使用した第二の発明の迅速検出キットと赤色色素を含有するグラム陽性細菌生育阻害培地（デオキシコール酸寒天培地、ＶＢＲ寒天培地等）を組み合わせたセットが、本発明の第一の発明の大腸菌群及び／又は大腸菌の迅速検出法において、前記のとおり培地色調との色調コントラストに優れ、観察しやすいことから望ましい。また、発色合成酵素基質として紫又は赤紫色に発色するもの（５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド等）を使用した第二の発明の迅速検出キットと色素を含有しないグラム陽性細菌生育阻害培地（硫酸ラウリル寒天培地等）を組み合わせたセットが、本発明の第一の発明の大腸菌群及び／又は大腸菌の迅速検出法において、前記のとおり培地色調との色調コントラストに優れ、観察しやすいことから望ましい。
【００２７】
更に、発色合成酵素基質として、大腸菌群及び／又は大腸菌の集落を紫又は赤紫色に発色するもの（５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド等）と大腸菌の集落のみを特異的に青色に発色するもの（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド等）を組み合わせてを使用した第二の発明の迅速検出キットと色素を含有しないグラム陽性細菌生育阻害培地（硫酸ラウリル寒天培地等）を組み合わせたセットが、本発明の第一の発明の大腸菌群及び／又は大腸菌の迅速検出法において、前記のとおり、エシェリキア・コリの集落のみが青色に染色され、エシェリキア・コリを除くエシェリキア属、エンテロバクター属等の大腸菌群の各菌の集落が紫又は赤紫色に染色され、大腸菌群と大腸菌を鑑別して検出できることから、一層望ましい。
【００２８】
尚、本発明において発色合成酵素基質の発色の判定は、次の発色度合の判定方法を採用した。
【００２９】
（発色度合の判定方法）
肉眼により細菌集落の発色度合を日本工業規格（ＪＩＳ Ｚ ８７２１）に準拠した日本規格協会発行の標準色票と比較して判定した。
【００３０】
具体的には各発色合成酵素基質による発色の色彩に対応した次に示す各標準色票と比較して、明度（Ｖ）が７以下の値を示すものを鑑別に十分な発色ありと判定した。
【００３１】
発色の色彩が青色を呈する発色合成酵素基質である５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニドを使用した場合には、色相別チャート５Ｂの彩度（Ｃ）が６の列の標準色票と比較する。
【００３２】
発色の色彩が紫色を呈する発色合成酵素基質である５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを使用した場合には、色相別チャート５Ｐの彩度（Ｃ）が６の列の標準色票と比較する。
【００３３】
発色の色彩が赤紫色を呈する発色合成酵素基質である６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを使用した場合には、色相別チャート５ＲＰの彩度（Ｃ）が８の列の標準色票と比較する。
【００３４】
次に試験例を示して本発明を詳記する。
試験例１
この試験は、発色度合を指標として、発色合成酵素基質の適正な濃度を調べるために行った。
【００３５】
（１）試験培地
グラム陽性細菌生育阻害培地として、市販のデオキシコール酸寒天培地（メルク・ジャパン社製）を、常法により、調製して、無菌室内で、直径９ｃｍのプラスチック製シャーレ（栄研器材社製）に１枚当たり１５ｍｌ分注し、冷却固化したものを使用した。
【００３６】
（２）試験菌株の調製
試験菌株として、微生物保存機関である東京大学医科学研究所より分譲されたエシェリキア・コリ（Escherichia coli）ＩＩＤ ５６２Ｂ、及び発酵研究所より分譲されたエンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter cloacae）ＩＦＯ １３５３５を使用した。前記試験培地の各１平板に対して、前記試験菌株の各１菌株の滅菌生理食塩水による希釈液（１００cells／ｍｌ）０．１ｍｌを塗抹し、３５℃で１０時間培養し、検出対象である細菌集落を形成させた。
【００３７】
（３）試料の調製
発色合成酵素基質として、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（和光純薬工業社製）を、ジメチルホルムアミド（ナカライテスク社製）に、表１に示すとおり、３、６、８０、及び９０ｍｇ／ｍｌの各濃度で溶解し、試験試料とした。
【００３８】
（４）試験方法
各試料を前記細菌集落に直接滴下し、３５℃で３０分間発色反応させ、発色度合を前記発色度合の判定方法により判定した。
【００３９】
（５）試験結果
この試験の結果は、表１に示すとおりである。表１から明らかなとおり、発色合成酵素基質の濃度が６ｍｇ／ｍｌ未満では、鑑別に十分な発色が得られず、発色なしと判定された。また、８０ｍｇ／ｍｌを超えると、発色合成酵素基質の結晶の析出が認められた。
従って、発色合成酵素基質の適正な濃度は、６〜８０ｍｇ／ｍｌであることが判明した。
【００４０】
尚、大腸菌群及び／又は大腸菌に属する試験菌株の種類、グラム陽性細菌生育阻害培地の種類（具体的には、硫酸ラウリル寒天培地等）、大腸菌群及び／又は大腸菌を直接検出できる発色合成酵素基質の種類（５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド等）、１５分乃至２時間の発色反応時間の範囲で、又は８乃至１２時間の細菌培養時間の範囲で、適宜変更して試験したが、ほぼ同様の結果が得られた。
【００４１】
【表１】
【００４２】
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４３】
【実施例】
実施例１
発色合成酵素基質として、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（和光純薬工業社製）を、ジメチルホルムアミド（和光純薬工業社製）の５０％濃度の水溶液に、２０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解し、５ｍｌ容量のポリプロピレン製点眼ボトル（竹本容器社製）に分注し、大腸菌群及び／又は大腸菌の迅速検出キットを得た。
次いで、前記迅速検出キットを使用して、次に示すとおり、大腸菌群及び／又は大腸菌の迅速検出法を実施した。
【００４４】
グラム陽性細菌生育阻害培地として、市販のデオキシコール酸寒天培地（メルク・ジャパン社製）を、常法により、調製して、無菌室内で、直径９ｃｍのプラスチック製シャーレ（栄研器材社製）に１枚当たり１５ｍｌ分注し、冷却固化したものを使用した。
【００４５】
前記培地の１平板に対して、微生物保存機関である東京大学医科学研究所より分譲されたエシェリキア・コリ（Escherichia coli）ＩＩＤ ５６２Ｂ、及びアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより分譲されたシュードモナス・エルジノーサ（Pseudomonas aeruginosa）ＡＴＣＣ ５５１６のそれぞれの菌数を滅菌生理食塩水にて、１００cells／ｍｌに調製した混合菌液０．１ｍｌを塗抹し、３５℃で１２時間培養し、検出対象である細菌集落を形成させた。
【００４６】
前記平板培地上に形成された各細菌集落に対して、前記迅速検出キットを使用し、前記発色合成酵素基質液を１集落当たり１滴（約２０μｌ）直接滴下し、３５℃で１５分間発色反応させた。発色反応後、肉眼により細菌集落の発色度合を観察した。
【００４７】
その結果、周囲の培地色調とは明らかに異なる明瞭な青色の発色が認められる細菌集落と、全く発色が認められない細菌集落が観察された。
【００４８】
発色ありの細菌集落と発色なしの細菌集落について、常法（厚生省生活衛生局監修、「食品衛生検査指針 微生物編」、日本食品衛生協会発行、１９９０年１２月２５日）に基づき細菌の同定を行った結果、発色ありの細菌集落はエシェリキア・コリであり、発色なしの細菌集落はシュードモナス・エルジノーサであることが確認された。
【００４９】
即ち、前記迅速検出キットを使用した大腸菌群及び／又は大腸菌の迅速検出法は、エシェリキア・コリとシュードモナス・エルジノーサの鑑別に有効であり、いわゆる迅速に、簡易かつ高感度で大腸菌群及び／又は大腸菌を検出できることから優れている。
【００５０】
実施例２
大腸菌群及び／又は大腸菌の迅速検出法のグラム陽性細菌生育阻害培地として、市販のデオキシコール酸寒天培地（メルク・ジャパン社製）を、常法により、調製して、無菌室内で、直径９ｃｍのプラスチック製シャーレ（栄研器材社製）に１枚当たり１５ｍｌ分注し、冷却固化したものを使用した。
供試試料として生活廃水を滅菌生理食塩水で１０００倍に希釈した溶液０．１ｍｌを塗抹し、３５℃で８時間培養し、検出対象である細菌集落を形成させた。
【００５１】
発色合成酵素基質として、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（和光純薬工業社製）を、ジメチルホルムアミド（ナカライテスク社製）に、４０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解したものを使用した。
【００５２】
前記平板培地上に形成された各細菌集落に対して、マイクロピペット（ギルソン社製）を使用し、前記発色合成酵素基質液を１集落当たり３０μｌ直接滴下し、３５℃で１時間発色反応させた。発色反応後、肉眼により細菌集落の発色度合を観察した。
【００５３】
その結果、周囲の培地色調とは明らかに異なる明瞭な青色の発色が認められる細菌集落と、全く発色が認められない細菌集落が観察された。
【００５４】
発色ありの細菌集落と発色なしの細菌集落について、常法（厚生省生活衛生局監修、「食品衛生検査指針 微生物編」、日本食品衛生協会発行、１９９０年１２月２５日）に基づき細菌の同定を行った結果、発色ありの細菌集落は大腸菌群であり、発色なしの細菌集落は大腸菌群でないことが確認された。
【００５５】
即ち、前記大腸菌群及び／又は大腸菌の迅速検出法は、大腸菌群の鑑別に有効であり、いわゆる迅速に、簡易かつ高感度で大腸菌群及び／又は大腸菌を検出できることから優れている。
【００５６】
実施例３
発色合成酵素基質として、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド（ナカライテスク社製）を、ジメチルホルムアミド（和光純薬工業社製）の５０％濃度の水溶液に、１０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解し、５ｍｌ容量のポリプロピレン製点眼ボトル（竹本容器社製）に分注し、大腸菌の迅速検出キット１を得た。
【００５７】
また、発色合成酵素基質として、６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ナカライテスク社製）を、ジメチルホルムアミド（和光純薬工業社製）の５０％濃度の水溶液に、１０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解し、５ｍｌ容量のポリプロピレン製点眼ボトル（竹本容器社製）に分注し、大腸菌群及び／又は大腸菌の迅速検出キット２を得た。
次いで、前記迅速検出キット１及び２を使用して、次に示すとおり、大腸菌群及び／又は大腸菌の迅速検出法を実施した。
【００５８】
グラム陽性細菌生育阻害培地として、市販の硫酸ラウリルブロス（日本ベクトン・ディッキンソン社製）に１．５％濃度で寒天（ディフコ社製）を加えて常法により、調製し滅菌して、無菌室内で、直径９ｃｍのプラスチック製シャーレ（栄研器材社製）に１枚当たり１５ｍｌ分注し、冷却固化したものを使用した。
【００５９】
前記培地の１平板に対して、微生物保存機関である東京大学医科学研究所より分譲されたエシェリキア・コリ（Escherichia coli）ＩＩＤ ５６２Ｂ、及び発酵研究所より分譲されたエンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter cloacae）ＩＦＯ １３５３５のそれぞれの菌数を滅菌生理食塩水にて、１００cells／ｍｌに調製した混合菌液０．１ｍｌを塗抹し、３５℃で１０時間培養し、検出対象である細菌集落を形成させた。
【００６０】
前記平板培地上に形成された各細菌集落に対して、前記迅速検出キット１及び２を使用し、前記２種類の発色合成酵素基質液を１集落当たり各１滴（約２０μｌ）ずつ直接滴下し、３５℃で２時間発色反応させた。発色反応後、肉眼により細菌集落の発色度合を観察した。
【００６１】
その結果、周囲の培地色調とは明らかに異なる明瞭な赤紫色の発色が認められる細菌集落と、青色の発色が認められる細菌集落が観察された。
【００６２】
赤紫色の細菌集落と青色の細菌集落について、常法（厚生省生活衛生局監修、「食品衛生検査指針 微生物編」、日本食品衛生協会発行、１９９０年１２月２５日）に基づき細菌の同定を行った結果、赤紫色の細菌集落は大腸菌群、即ちエンテロバクター・クロアカエであり、青色の細菌集落はエシェリキア・コリであることが確認された。
【００６３】
即ち、前記迅速検出キットを使用した大腸菌群及び／又は大腸菌の迅速検出法は、エシェリキア・コリとエシェリキア・コリを除く大腸菌群との鑑別にも有効であり、いわゆる迅速に、簡易かつ高感度で大腸菌群及び／又は大腸菌を検出できることから優れている。
【００６４】
【発明の効果】
以上詳細に記載したとおり、本発明はグラム陽性細菌生育阻害培地に生育した細菌集落に発色合成酵素基質を直接滴下することを特徴とする大腸菌群及び／又は大腸菌の迅速で、簡易かつ高感度の検出法、並びにこの方法に使用する迅速検出キットに関するものであり、本発明によって奏せられる効果は次のとおりである。
（１）本発明の大腸菌群及び／又は大腸菌の迅速検出法は、８乃至１４時間という短時間で、いわゆる迅速に、大腸菌群及び／又は大腸菌を検出できる。
（２）本発明の大腸菌群及び／又は大腸菌の迅速検出法及び迅速検出キットは、細菌集落に発色合成酵素基質を直接滴下する構成よりなることから、極めて簡易である。
（３）本発明の大腸菌群及び／又は大腸菌の迅速検出法及び迅速検出キットは、培地中に含有させる場合と異なり、発色合成酵素基質溶液の溶媒による細菌の生育阻害等の影響を考慮する必要はなく、強い発色が可能な６〜８０ｍｇ／ｍｌという比較的高濃度での実施が可能で高感度である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、臨床材料、食品、医薬品、化粧品、飲料水等の中の大腸菌群及び／又は大腸菌の迅速検出法並びにこの方法に使用する迅速検出キットに関するものである。
【０００２】
詳しくは、本発明は、グラム陽性細菌生育阻害培地に生育した細菌集落に発色合成酵素基質を直接滴下することを特徴とする大腸菌群及び／又は大腸菌の迅速で、簡易かつ高感度の検出法、並びにこの方法に使用する迅速検出キットに関するものである。
尚、本明細書において、百分率（％）の表示は、特に断りのない限り重量による値である。
【０００３】
【従来の技術】
従来、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド０．０５〜５ｍｇ／ｍｌを含有する培地及びこれを使用したグルクロニダーゼ活性の検出に基づく大腸菌の迅速検出法が知られている（特開平６−６２８９３号公報。以下、従来技術１と記載する。）。
【０００４】
また、インドリル誘導体として６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド０．０３〜０．２ｍｇ／ｍｌ及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド０．０１〜０．２ｍｇ／ｍｌを含有するβ−ガラクトシダーゼ活性及びβ−グルクロニダーゼ活性の検出に基づく大腸菌群及び／又は大腸菌の同時検出のための栄養培地が開示されている（特表平９−５０１３１４号公報。以下、従来技術２と記載する。）。
【０００５】
更に、培養試薬を含有するブイヨン培地に反応基質として５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド０．０１〜０．５ｍｇ／ｍｌを添加した検出液をシート状の基体に含浸させてなることを特徴とする大腸菌群検出用試験シートが開示されている（特開２０００−１００号公報。以下、従来技術３と記載する。）。
しかしながら、これらの従来技術には、次に記載するとおりの不都合があった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
従来の６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド等の発色合成酵素基質を含有する培地は、大腸菌群及び／又は大腸菌を検出するために、２４時間程度培養することが必要であることから、迅速な方法とはいえないという問題点があった。
【０００７】
また、従来技術３の発色合成酵素基質として５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシドを使用した大腸菌群検出用試験シートは、簡易ではあるが、前記培地と同様に大腸菌群を検出するために、２４時間程度培養することが必要であることから、迅速な方法とはいえないという問題点があった。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記従来技術に鑑みて、グラム陽性細菌生育阻害培地に生育した細菌集落に発色合成酵素基質を直接滴下することを特徴とする大腸菌群及び／又は大腸菌の迅速検出法が、８乃至１４時間という短時間で、いわゆる迅速に、簡易かつ高感度で大腸菌群及び／又は大腸菌を検出できることを見い出し、本発明を完成した。
【０００９】
本発明の目的は、迅速で、簡易かつ高感度で大腸菌群及び／又は大腸菌を検出することが可能な大腸菌群及び／又は大腸菌の迅速検出法並びにこの方法に使用する迅速検出キットを提供することである。
【００１０】
前記課題を解決する本発明の第一の発明は、可視光で観察可能に発色する発色合成酵素基質を含有しないグラム陽性細菌生育阻害培地に生育した細菌集落に、前記発色合成酵素基質を直接滴下し、発色反応させた後、その発色度合を肉眼により観察することを特徴とする大腸菌群及び／又は大腸菌の迅速検出法であり、発色合成酵素基質が５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド、又はこれらの塩類であること（以下、態様１と記載する。）を望ましい態様としてもいる。
【００１１】
前記課題を解決する本発明の第二の発明は、６〜８０ｍｇ／ｍｌの濃度の発色合成酵素基質及びこれを収容する滴下用容器からなる前記第一の発明の大腸菌群及び／又は大腸菌の迅速検出法に使用する迅速検出キットであり、発色合成酵素基質が５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド、又はこれらの塩類であること（以下、態様２と記載する。）を望ましい態様としてもいる。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明の第一の発明のグラム陽性細菌生育阻害培地としては、選択的にグラム陽性細菌（グラム染色性が陽性の細菌）の生育を阻害し、グラム陰性細菌（グラム染色性が陰性の細菌）が生育し、細菌集落を形成しうるものであれば如何なるものであってもよいが、具体的には、市販の赤色色素を含有するデオキシコール酸寒天培地（メルク・ジャパン社製等）、ＶＢＲ寒天培地（バイオレッド−レッド−胆汁酸寒天培地。メルク・ジャパン社製等）、市販の色素を含有しない硫酸ラウリルブロス（日本ベクトン・ディッキンソン社製等）に１．５％濃度で寒天を加えて調製した寒天培地等を例示できる。
【００１３】
本発明の発色合成酵素基質は、グラム陰性細菌の細菌集落に直接滴下することにより、大腸菌群及び／又は大腸菌を直接検出できるものであれば如何なるものであってもよいが、培地中への拡散性、培地色調との色調コントラスト、及び可視光で観察可能であるか否かを考慮して、本発明の態様１及び２に示すとおり、大腸菌群かつ大腸菌の集落を青色に発色する５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、大腸菌群かつ大腸菌の集落を紫色に発色する５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、大腸菌群かつ大腸菌の集落を赤紫色に発色する６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、大腸菌の集落のみを特異的に青色に発色する５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド、又はこれらの塩類であることが望ましい。
【００１４】
本発明の態様１及び２に示す５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニドは、いずれも市販品（和光純薬工業社製、ナカライテスク社製等）が使用できる。
【００１５】
本発明の発色合成酵素基質は、溶液状、粉末状等各種の実施形態が可能であるが、直接滴下して使用されることから、溶液状であることが望ましい。
【００１６】
本発明の細菌集落への直接滴下は、発色合成酵素基質を滴状で滴下することに限定されず、霧状で滴下することもできる。発色合成酵素基質の滴下量は、細菌集落の大きさ、発色合成酵素基質の濃度等により適宜選択されるが、目標細菌集落全体を覆うのに十分な量滴下することが望ましい。
【００１７】
本発明の大腸菌群は、好気性又は通性嫌気性の無芽胞桿菌で、乳糖を分解してガスを形成するグラム陰性菌であるエシェリキア属、エンテロバクター属等の各菌を示し、本発明の大腸菌は、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）を示す。
【００１８】
尚、赤色色素を含有するグラム陽性細菌生育阻害培地（デオキシコール酸寒天培地、ＶＢＲ寒天培地等）に生育した細菌集落に対しては、青色に発色する発色合成酵素基質（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド等）を使用することが、培地色調との色調コントラストに優れ、観察しやすいことから、望ましい。また、色素を含有しないグラム陽性細菌生育阻害培地（硫酸ラウリル寒天培地等）に生育した細菌集落に対しては、紫又は赤紫色に発色する発色合成酵素基質（５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド等）を使用することが、培地色調との色調コントラストに優れ、観察しやすいことから、望ましい。
【００１９】
更に、発色合成酵素基質として、大腸菌群かつ大腸菌の集落を紫又は赤紫色に発色するもの（５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド等）と大腸菌の集落のみを特異的に青色に発色するもの（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド等）を組み合わせて使用することにより、エシェリキア・コリの集落のみが青色に染色され、エシェリキア・コリを除くエシェリキア属、エンテロバクター属等の大腸菌群の各菌の集落が紫又は赤紫色に染色され、大腸菌群と大腸菌を鑑別して検出できることから、一層望ましい。
【００２０】
以上のとおりの本発明の大腸菌群及び／又は大腸菌の迅速検出法は、発色合成酵素基質滴下後の培養操作が不用であり、細菌集落への滴下から短時間（１５分乃至２時間）の発色反応で強い発色が検出できることから、簡易かつ高感度で大腸菌群及び／又は大腸菌を検出できる。
【００２１】
また、本発明の大腸菌群及び／又は大腸菌の迅速検出法は、発色合成酵素基質に細菌集落が直接さらされ発色することから、発色合成酵素基質の培養による細菌集落への取り込みに長時間を必要とすることもないことから、概ね細菌集落が形成される８乃至１２時間という短い培養時間で、いわゆる迅速に大腸菌群及び／又は大腸菌を検出できる。
【００２２】
次に本発明の第二の発明について詳細に説明する。
本発明の第二の発明の発色合成酵素基質の濃度は、後記試験例から明らかなとおり、６ｍｇ／ｍｌ未満では、直接滴下により鑑別に十分な発色が得られないこと、８０ｍｇ／ｍｌを超えると、発色合成酵素基質の結晶の析出が認められることから、６〜８０ｍｇ／ｍｌである。尚、培地中に含有させる場合と異なり、発色合成酵素基質溶液の溶媒による細菌の生育阻害等の影響を考慮する必要はなく、強い発色が可能な６〜８０ｍｇ／ｍｌという比較的高濃度での実施が可能となる。
【００２３】
尚、本発明の第二の発明の態様２に示す発色合成酵素基質は、ジメチルホルムアミド（和光純薬工業社製、ナカライテスク社製等）又はジメチルホルムアミドの水溶液に前記濃度で溶解して使用でき、ジメチルホルムアミド水溶液はジメチルホルムアミド濃度として５０％以上の水溶液であることが望ましい。
【００２４】
前記濃度の発色合成酵素基質を収容する本発明の第二の発明の滴下用容器は、細菌集落に発色合成酵素基質を直接滴下することができる容器であれば、如何なるものであってもよいが、具体的には、市販の点眼ボトル、スポイト瓶、ノズルバイアル、ノズルキャップ付容器等（竹本容器社製、マルコム社製等）が例示できる。
【００２５】
以上のとおりの本発明の第二の発明の迅速検出キットは、前記本発明の第一の発明の大腸菌群及び／又は大腸菌の迅速検出法に好適に使用することができ、迅速で、簡易かつ高感度な大腸菌群及び／又は大腸菌の検出を可能とする。
【００２６】
尚、本発明の第二の発明の迅速検出キットとグラム陽性細菌生育阻害培地とを組み合わせてセットとすることが、本発明の第一の発明の大腸菌群及び／又は大腸菌の迅速検出法の実施に便利であることから望ましい。特に、発色合成酵素基質として青色に発色するもの（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド等）を使用した第二の発明の迅速検出キットと赤色色素を含有するグラム陽性細菌生育阻害培地（デオキシコール酸寒天培地、ＶＢＲ寒天培地等）を組み合わせたセットが、本発明の第一の発明の大腸菌群及び／又は大腸菌の迅速検出法において、前記のとおり培地色調との色調コントラストに優れ、観察しやすいことから望ましい。また、発色合成酵素基質として紫又は赤紫色に発色するもの（５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド等）を使用した第二の発明の迅速検出キットと色素を含有しないグラム陽性細菌生育阻害培地（硫酸ラウリル寒天培地等）を組み合わせたセットが、本発明の第一の発明の大腸菌群及び／又は大腸菌の迅速検出法において、前記のとおり培地色調との色調コントラストに優れ、観察しやすいことから望ましい。
【００２７】
更に、発色合成酵素基質として、大腸菌群及び／又は大腸菌の集落を紫又は赤紫色に発色するもの（５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド等）と大腸菌の集落のみを特異的に青色に発色するもの（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド等）を組み合わせてを使用した第二の発明の迅速検出キットと色素を含有しないグラム陽性細菌生育阻害培地（硫酸ラウリル寒天培地等）を組み合わせたセットが、本発明の第一の発明の大腸菌群及び／又は大腸菌の迅速検出法において、前記のとおり、エシェリキア・コリの集落のみが青色に染色され、エシェリキア・コリを除くエシェリキア属、エンテロバクター属等の大腸菌群の各菌の集落が紫又は赤紫色に染色され、大腸菌群と大腸菌を鑑別して検出できることから、一層望ましい。
【００２８】
尚、本発明において発色合成酵素基質の発色の判定は、次の発色度合の判定方法を採用した。
【００２９】
（発色度合の判定方法）
肉眼により細菌集落の発色度合を日本工業規格（ＪＩＳ Ｚ ８７２１）に準拠した日本規格協会発行の標準色票と比較して判定した。
【００３０】
具体的には各発色合成酵素基質による発色の色彩に対応した次に示す各標準色票と比較して、明度（Ｖ）が７以下の値を示すものを鑑別に十分な発色ありと判定した。
【００３１】
発色の色彩が青色を呈する発色合成酵素基質である５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニドを使用した場合には、色相別チャート５Ｂの彩度（Ｃ）が６の列の標準色票と比較する。
【００３２】
発色の色彩が紫色を呈する発色合成酵素基質である５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを使用した場合には、色相別チャート５Ｐの彩度（Ｃ）が６の列の標準色票と比較する。
【００３３】
発色の色彩が赤紫色を呈する発色合成酵素基質である６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを使用した場合には、色相別チャート５ＲＰの彩度（Ｃ）が８の列の標準色票と比較する。
【００３４】
次に試験例を示して本発明を詳記する。
試験例１
この試験は、発色度合を指標として、発色合成酵素基質の適正な濃度を調べるために行った。
【００３５】
（１）試験培地
グラム陽性細菌生育阻害培地として、市販のデオキシコール酸寒天培地（メルク・ジャパン社製）を、常法により、調製して、無菌室内で、直径９ｃｍのプラスチック製シャーレ（栄研器材社製）に１枚当たり１５ｍｌ分注し、冷却固化したものを使用した。
【００３６】
（２）試験菌株の調製
試験菌株として、微生物保存機関である東京大学医科学研究所より分譲されたエシェリキア・コリ（Escherichia coli）ＩＩＤ ５６２Ｂ、及び発酵研究所より分譲されたエンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter cloacae）ＩＦＯ １３５３５を使用した。前記試験培地の各１平板に対して、前記試験菌株の各１菌株の滅菌生理食塩水による希釈液（１００cells／ｍｌ）０．１ｍｌを塗抹し、３５℃で１０時間培養し、検出対象である細菌集落を形成させた。
【００３７】
（３）試料の調製
発色合成酵素基質として、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（和光純薬工業社製）を、ジメチルホルムアミド（ナカライテスク社製）に、表１に示すとおり、３、６、８０、及び９０ｍｇ／ｍｌの各濃度で溶解し、試験試料とした。
【００３８】
（４）試験方法
各試料を前記細菌集落に直接滴下し、３５℃で３０分間発色反応させ、発色度合を前記発色度合の判定方法により判定した。
【００３９】
（５）試験結果
この試験の結果は、表１に示すとおりである。表１から明らかなとおり、発色合成酵素基質の濃度が６ｍｇ／ｍｌ未満では、鑑別に十分な発色が得られず、発色なしと判定された。また、８０ｍｇ／ｍｌを超えると、発色合成酵素基質の結晶の析出が認められた。
従って、発色合成酵素基質の適正な濃度は、６〜８０ｍｇ／ｍｌであることが判明した。
【００４０】
尚、大腸菌群及び／又は大腸菌に属する試験菌株の種類、グラム陽性細菌生育阻害培地の種類（具体的には、硫酸ラウリル寒天培地等）、大腸菌群及び／又は大腸菌を直接検出できる発色合成酵素基質の種類（５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド等）、１５分乃至２時間の発色反応時間の範囲で、又は８乃至１２時間の細菌培養時間の範囲で、適宜変更して試験したが、ほぼ同様の結果が得られた。
【００４１】
【表１】
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４３】
【実施例】
実施例１
発色合成酵素基質として、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（和光純薬工業社製）を、ジメチルホルムアミド（和光純薬工業社製）の５０％濃度の水溶液に、２０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解し、５ｍｌ容量のポリプロピレン製点眼ボトル（竹本容器社製）に分注し、大腸菌群及び／又は大腸菌の迅速検出キットを得た。
次いで、前記迅速検出キットを使用して、次に示すとおり、大腸菌群及び／又は大腸菌の迅速検出法を実施した。
【００４４】
グラム陽性細菌生育阻害培地として、市販のデオキシコール酸寒天培地（メルク・ジャパン社製）を、常法により、調製して、無菌室内で、直径９ｃｍのプラスチック製シャーレ（栄研器材社製）に１枚当たり１５ｍｌ分注し、冷却固化したものを使用した。
【００４５】
前記培地の１平板に対して、微生物保存機関である東京大学医科学研究所より分譲されたエシェリキア・コリ（Escherichia coli）ＩＩＤ ５６２Ｂ、及びアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより分譲されたシュードモナス・エルジノーサ（Pseudomonas aeruginosa）ＡＴＣＣ ５５１６のそれぞれの菌数を滅菌生理食塩水にて、１００cells／ｍｌに調製した混合菌液０．１ｍｌを塗抹し、３５℃で１２時間培養し、検出対象である細菌集落を形成させた。
【００４６】
前記平板培地上に形成された各細菌集落に対して、前記迅速検出キットを使用し、前記発色合成酵素基質液を１集落当たり１滴（約２０μｌ）直接滴下し、３５℃で１５分間発色反応させた。発色反応後、肉眼により細菌集落の発色度合を観察した。
【００４７】
その結果、周囲の培地色調とは明らかに異なる明瞭な青色の発色が認められる細菌集落と、全く発色が認められない細菌集落が観察された。
【００４８】
発色ありの細菌集落と発色なしの細菌集落について、常法（厚生省生活衛生局監修、「食品衛生検査指針 微生物編」、日本食品衛生協会発行、１９９０年１２月２５日）に基づき細菌の同定を行った結果、発色ありの細菌集落はエシェリキア・コリであり、発色なしの細菌集落はシュードモナス・エルジノーサであることが確認された。
【００４９】
即ち、前記迅速検出キットを使用した大腸菌群及び／又は大腸菌の迅速検出法は、エシェリキア・コリとシュードモナス・エルジノーサの鑑別に有効であり、いわゆる迅速に、簡易かつ高感度で大腸菌群及び／又は大腸菌を検出できることから優れている。
【００５０】
実施例２
大腸菌群及び／又は大腸菌の迅速検出法のグラム陽性細菌生育阻害培地として、市販のデオキシコール酸寒天培地（メルク・ジャパン社製）を、常法により、調製して、無菌室内で、直径９ｃｍのプラスチック製シャーレ（栄研器材社製）に１枚当たり１５ｍｌ分注し、冷却固化したものを使用した。
供試試料として生活廃水を滅菌生理食塩水で１０００倍に希釈した溶液０．１ｍｌを塗抹し、３５℃で８時間培養し、検出対象である細菌集落を形成させた。
【００５１】
発色合成酵素基質として、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（和光純薬工業社製）を、ジメチルホルムアミド（ナカライテスク社製）に、４０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解したものを使用した。
【００５２】
前記平板培地上に形成された各細菌集落に対して、マイクロピペット（ギルソン社製）を使用し、前記発色合成酵素基質液を１集落当たり３０μｌ直接滴下し、３５℃で１時間発色反応させた。発色反応後、肉眼により細菌集落の発色度合を観察した。
【００５３】
その結果、周囲の培地色調とは明らかに異なる明瞭な青色の発色が認められる細菌集落と、全く発色が認められない細菌集落が観察された。
【００５４】
発色ありの細菌集落と発色なしの細菌集落について、常法（厚生省生活衛生局監修、「食品衛生検査指針 微生物編」、日本食品衛生協会発行、１９９０年１２月２５日）に基づき細菌の同定を行った結果、発色ありの細菌集落は大腸菌群であり、発色なしの細菌集落は大腸菌群でないことが確認された。
【００５５】
即ち、前記大腸菌群及び／又は大腸菌の迅速検出法は、大腸菌群の鑑別に有効であり、いわゆる迅速に、簡易かつ高感度で大腸菌群及び／又は大腸菌を検出できることから優れている。
【００５６】
実施例３
発色合成酵素基質として、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド（ナカライテスク社製）を、ジメチルホルムアミド（和光純薬工業社製）の５０％濃度の水溶液に、１０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解し、５ｍｌ容量のポリプロピレン製点眼ボトル（竹本容器社製）に分注し、大腸菌の迅速検出キット１を得た。
【００５７】
また、発色合成酵素基質として、６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ナカライテスク社製）を、ジメチルホルムアミド（和光純薬工業社製）の５０％濃度の水溶液に、１０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解し、５ｍｌ容量のポリプロピレン製点眼ボトル（竹本容器社製）に分注し、大腸菌群及び／又は大腸菌の迅速検出キット２を得た。
次いで、前記迅速検出キット１及び２を使用して、次に示すとおり、大腸菌群及び／又は大腸菌の迅速検出法を実施した。
【００５８】
グラム陽性細菌生育阻害培地として、市販の硫酸ラウリルブロス（日本ベクトン・ディッキンソン社製）に１．５％濃度で寒天（ディフコ社製）を加えて常法により、調製し滅菌して、無菌室内で、直径９ｃｍのプラスチック製シャーレ（栄研器材社製）に１枚当たり１５ｍｌ分注し、冷却固化したものを使用した。
【００５９】
前記培地の１平板に対して、微生物保存機関である東京大学医科学研究所より分譲されたエシェリキア・コリ（Escherichia coli）ＩＩＤ ５６２Ｂ、及び発酵研究所より分譲されたエンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter cloacae）ＩＦＯ １３５３５のそれぞれの菌数を滅菌生理食塩水にて、１００cells／ｍｌに調製した混合菌液０．１ｍｌを塗抹し、３５℃で１０時間培養し、検出対象である細菌集落を形成させた。
【００６０】
前記平板培地上に形成された各細菌集落に対して、前記迅速検出キット１及び２を使用し、前記２種類の発色合成酵素基質液を１集落当たり各１滴（約２０μｌ）ずつ直接滴下し、３５℃で２時間発色反応させた。発色反応後、肉眼により細菌集落の発色度合を観察した。
【００６１】
その結果、周囲の培地色調とは明らかに異なる明瞭な赤紫色の発色が認められる細菌集落と、青色の発色が認められる細菌集落が観察された。
【００６２】
赤紫色の細菌集落と青色の細菌集落について、常法（厚生省生活衛生局監修、「食品衛生検査指針 微生物編」、日本食品衛生協会発行、１９９０年１２月２５日）に基づき細菌の同定を行った結果、赤紫色の細菌集落は大腸菌群、即ちエンテロバクター・クロアカエであり、青色の細菌集落はエシェリキア・コリであることが確認された。
【００６３】
即ち、前記迅速検出キットを使用した大腸菌群及び／又は大腸菌の迅速検出法は、エシェリキア・コリとエシェリキア・コリを除く大腸菌群との鑑別にも有効であり、いわゆる迅速に、簡易かつ高感度で大腸菌群及び／又は大腸菌を検出できることから優れている。
【００６４】
【発明の効果】
以上詳細に記載したとおり、本発明はグラム陽性細菌生育阻害培地に生育した細菌集落に発色合成酵素基質を直接滴下することを特徴とする大腸菌群及び／又は大腸菌の迅速で、簡易かつ高感度の検出法、並びにこの方法に使用する迅速検出キットに関するものであり、本発明によって奏せられる効果は次のとおりである。
（１）本発明の大腸菌群及び／又は大腸菌の迅速検出法は、８乃至１４時間という短時間で、いわゆる迅速に、大腸菌群及び／又は大腸菌を検出できる。
（２）本発明の大腸菌群及び／又は大腸菌の迅速検出法及び迅速検出キットは、細菌集落に発色合成酵素基質を直接滴下する構成よりなることから、極めて簡易である。
（３）本発明の大腸菌群及び／又は大腸菌の迅速検出法及び迅速検出キットは、培地中に含有させる場合と異なり、発色合成酵素基質溶液の溶媒による細菌の生育阻害等の影響を考慮する必要はなく、強い発色が可能な６〜８０ｍｇ／ｍｌという比較的高濃度での実施が可能で高感度である。
Claims (4)
- 可視光で観察可能に発色する発色合成酵素基質を含有しないグラム陽性細菌生育阻害培地に生育した細菌集落に、前記発色合成酵素基質を直接滴下し、発色反応させた後、その発色度合を肉眼により観察することを特徴とする大腸菌群及び／又は大腸菌の迅速検出法。
- 発色合成酵素基質が５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド、又はこれらの塩類である請求項１の大腸菌群及び／又は大腸菌の迅速検出法。
- ６〜８０ｍｇ／ｍｌの濃度の発色合成酵素基質及びこれを収容する滴下用容器からなる請求項１の大腸菌群及び／又は大腸菌の迅速検出法に使用する迅速検出キット。
- 発色合成酵素基質が５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド、又はこれらの塩類である請求項３の迅速検出キット。
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