CN104388526A - 金黄色葡萄球菌选择性显色培养基及其检测试纸 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种金黄色葡萄球菌选择性显色培养基，其中每1000mL培养基含有如下重量的组分：蛋白胨8-12g、酵母粉5-8g、丙酮酸钠3-6g、氯化钠55-90g、亚碲酸钾30-45g、氯化锂7-10g、琼脂10-20g、复合特异性酶显色底物0.2-0.5g、二甲基甲酰胺30-75g、抗生素0.04-0.08g、助显色剂0.05-0.1g，余量为水。本发明使用高盐培养基等金葡菌选择性培养基，添加金葡菌天然耐性抗生素提高选择性，添加金葡菌代谢酶特异性底物显色，提高检查效率，还可制作成检测试纸条方便实际使用。

Description

金黄色葡萄球菌选择性显色培养基及其检测试纸
技术领域
本发明涉及一种适用于金黄色葡萄球菌的选择性显色培养基，以及采用该选择性显色培养基的检测试纸。
背景技术
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是引起葡萄菌属食物中毒的主要病原微生物，也是影响世界各国经济的重要食源性疾病之一。人们摄取的食物和饮料中受到金黄色葡萄球菌污染时，将会产生一种或以上的肠毒素，引起食物中毒，常见的中毒症状是呕吐和腹泻。研究发现，金黄色葡萄球菌在自然界中广泛存在，另外，金黄色葡萄球菌在人类和温血动物的皮肤和鼻腔中均能存活。食品加工者和无症状携带者是食品污染的主要来源，生产过程中缺乏卫生监督管理容易有金黄色葡萄球菌及其肠毒素的存在。食品样品中超过106-108CFU/g(mL)的金黄色葡萄球菌可引起食物中毒，而1g(mL)肠毒素，相当于105CFU/g(mL)的金黄色葡萄球菌，即可使敏感人群在1-6h后出现中毒症状。许多官方法规规定不同种类的食品允许低浓度的金黄色葡萄球菌存在中，例如鸡蛋和熟食制品不需检出，生肉及其制品中金黄色葡萄球菌最低限量为102-103CFU/g(mL)。
食品中金黄色葡萄球菌常规的检验方法是在37℃环境下，金黄色葡萄球菌用选择性肉汤浓缩富集24-48h后直接接种于选择性培养基(如Baird.parker琼脂)培养，随后挑取可疑菌落经血浆凝固酶试验进行生化鉴定。传统方法需要5-6天时间，其他相似的方法如最大可能数法(Most Probable Number，MPN)同样耗时费力，不能满足快速检测需求。寻找快速、简单、准确的金黄色葡萄球菌检测方法是研究人员十分关注的课题。国内外的研究者在食品安全快速检测方面，已经取得了很大的进展，新的快速检测技术逐渐应用于食品安全快速检测领域。目前，关于金黄色葡萄球菌及其肠毒素检测的方法很多。常用的分子生物学方法主要有聚合酶链反应(Polymerase Chain React ion，PCR)、核酸探针技术、重组DNA技术以及环介导等温扩增技术等，主要用于金黄色葡萄球菌肠毒素的检测，这类方法优点是灵敏度高、特异性强，但是检测方法复杂，需要昂贵的实验仪器设备以及专业技术人员操作，检测成本相对较高，同时PCR扩增产物容易引起实验室的污染等问题，也不利于在一般实验室的应用。免疫学方法应用较多的有乳胶凝集技术、酶联免疫技术、免疫荧光技术以及免疫磁珠技术等，可以实现对病原微生物的快速检测，本类技术具有操作简单、高通量的优点，在此基础上研究出的自动荧光酶标仪，可以极大程度地提高检测的灵敏度和特异性，但由于仪器设备过于昂贵，也不利于在基层实验室的推广应用。新型的测试片法、显色培养基法，以及生化试剂盒法都是在金黄色葡萄球菌传统平板检测方法改进而来的。测试片是将显色培养基附着在无纺布、滤纸等固体载体上，运用测试卡片的技术制成的，自问世以来，以其便于携带、简便、快速、特异性高等优点为许多国家所采用，尤其适用于现场以及突发公共卫生事件的快速检测检测。由于纸片面积小，微生物生长产生过多的粘液使相邻菌落融合，使用时间较长时，无法准确计数。
显色培养基的问世，是传统平板检测方法的一个重大突破。显色培养基是建立在细胞内生化反应的基础上，利用微生物自身代谢而产生特异性酶或其他特异性物质，在培养基中添加相应的显色底物，使菌落呈现特定的颜色进而实现分离和鉴别微生物的目的。目前，金黄色葡萄球菌显色培养基产品比较成熟的主要有法国科玛嘉公司的CHROMagar Staphaureus、法国生物梅利埃公司的Saureus ID和BD公司的BBLTM CHROMagarTM.Staph aureust引。近年来，国内一些生物科技公司也致力于金黄色葡萄球菌显色培养基的研究。市面上常用的显色培养基产品也有很高的特异性和灵敏度，但由于显色培养基价格昂贵，检测成本高及购买不方便，使其推广应用受到限制，不能满足实际需求。
发明内容
本发明提供一种适用于金黄色葡萄球菌的选择性显色培养基，以及采用该选择性显色培养基的检测试纸，以克服现有技术存在的上述缺陷。
本发明首先涉及一种金黄色葡萄球菌选择性显色培养基，其中每1000mL培养基含有如下重量的组分：蛋白胨8-12g、酵母粉5-8g、丙酮酸钠3-6g、氯化钠55-90g、亚碲酸钾30-45g、氯化锂7-10g、琼脂10-20g、复合特异性酶显色底物0.2-0.5g、二甲基甲酰胺30-75g、抗生素0.04-0.08g、助显色剂0.05-0.1g，余量为水。
所述复合特异性酶显色底物是5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯和5-溴-4-氯-3--α-D-吡喃半乳糖苷的混合物，两者的重量配比优选为0.2-1.5：1，最好是0.8-1.0：1。
所述抗生素选自链霉素、氨苄西啉、甲氧西林、阿米卡星、磺胺嘧啶的一种以上，优选氨苄西啉或磺胺嘧啶。
所述助显色剂选自麦芽糖、硫酸镁、氯化铁或过氧化月桂酰的一种以上。
本发明还涉及一种采用该金黄色葡萄球菌选择性显色培养基制作的检测试纸，其至少含有一吸附有上述金黄色葡萄球菌选择性显色培养基的吸水滤纸。
为了更好的区分金黄色葡萄球菌，在显色培养基添加杂菌生长抑制剂，包括链霉索、氨苄西啉、甲氧西林、阿米卡星、磺胺嘧啶等金黄色葡萄球菌耐性抗生素，可以抑制大部分革兰氏阴性菌的生长和部分革兰氏阳性菌的生长。
蛋白胨、酵母粉、丙酮酸钠、氯化钠为金黄色葡萄球菌生长提供丰富的营养和适宜的生长环境，有助于葡萄球菌快速生长。
助显色剂与特异性酶显色底物相结合，加强显色效果。
本发明使用高盐培养基等金葡菌选择性培养基，添加金葡菌天然耐性抗生素提高选择性，添加金葡菌代谢酶特异性底物显色，提高检查效率，还可制作成试纸条方便实际使用。本发明的显色培养基解决了现有显色培养基不能很好地区分金黄色葡萄球菌和其它葡萄球菌的缺陷，本发明不仅可以作为金黄色葡萄球菌和其它葡萄球菌确认培养基，还可以作为从样品中特异性分离金黄色葡萄球菌的培养基，应用前景广泛。
具体实施方式
下面给出本发明较佳实施例，以详细说明本发明的技术方案。
实施例1
蛋白胨8g、酵母粉5g、丙酮酸钠3g、氯化钠55g、亚碲酸钾30g、氯化锂7g、琼脂10g、5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯0.08g、5-溴-4-氯-3--α-D-吡喃半乳糖苷0.4g、二甲基甲酰胺30g、链霉素0.03g、氨苄西啉0.05g、过氧化月桂酰0.1g，余量为水。
将上述成分溶于水至1000mL，加热煮沸，调节pH至7.4±0.2，120℃灭菌15min，即可使用。
实施例2
蛋白胨12g、酵母粉8g、丙酮酸钠6g、氯化钠90g、亚碲酸钾45g、氯化锂10g、琼脂20g、5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯0.13g、5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯0.1g、二甲基甲酰胺75g、甲氧西林0.04g、氯化铁0.02g、过氧化月桂酰0.03g，余量为水。
将上述成分溶于水至1000mL，加热煮沸，120℃灭菌15min，即可使用。
实施例3
蛋白胨10g、酵母粉6g、丙酮酸钠5g、氯化钠70g、亚碲酸钾35g、氯化锂8g、琼脂15g、5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯0.14g、5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯0.16g、二甲基甲酰胺45g、抗生素氨苄西啉0.025g、磺胺嘧啶0.025g、硫酸镁0.05g、过氧化月桂酰0.03g，余量为水。
将上述成分溶于水至1000mL，加热煮沸，120℃灭菌15min，即可使用。
实施例4
金黄色葡萄球菌选择性显色培养基检测试纸的制备：将选定的吸水滤纸浸入金黄色葡萄球菌选择性显色培养基中浸渍10-15分钟后取出烘干，冷却至室温后裁成一定规格试纸备用。
实施例5
在实施例4得到的试纸上下两面分别盖覆一层聚丙烯保护膜。
实施例6
特异性验证。将金黄色葡萄球菌、伤寒沙门菌、甲型副伤寒沙门菌、乙型副伤寒沙门菌、大肠杆菌、阴沟肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、肺炎克雷伯菌、产气肠杆菌、福氏志贺菌、宋内志贺菌、志贺菌I型、志贺菌II型、鲍氏志贺菌和副溶血性弧菌接种在实施例1-3培养基中，37℃培养18h。结果如表1，“+”表示阳性结果，“一”表示阴性结果。
表1显色培养基特异性检验结果
由上表可以看出，金黄色葡萄球菌以外的大肠茵属、沙门菌属、志贺菌属等标准菌株食源性致病菌，在StCM培养基上培养观察，无菌落生长。可见本发明培养基对金黄色葡萄球菌检测具有较好的选择性及特异性。
实施例7
分别测试实施例1-3和采用国标法的检测敏感度，其中国标法是采用GBT4789.10-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验》的方法。
表2显色培养基检测敏感度
样品 18h敏感度(％) 24h敏感度(％) 48h敏感度(％)
实施例1 92 95 98
实施例2 94 97 98
实施例3 97 98 98
国标法 0 15 98
由表2可以看出，从18h到48h，本发明显色培养基检测敏感度没有太大的变化，而且在18h时，检测纯菌污染样品的敏感度就可以达到92-97％，而国标法在18-24h，检测敏感度很低，随着培养时间增加至48h，敏感度才能达到98％。大大缩短了检测时间、降低检测成本。

Claims (8)

1.一种金黄色葡萄球菌选择性显色培养基，其中每1000mL培养基含有如下重量的组分：
2.如权利要求1所述的金黄色葡萄球菌选择性显色培养基，其特征在于，所述复合特异性酶显色底物是5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯和5-溴-4-氯-3--α-D-吡喃半乳糖苷的混合物。
3.如权利要求2所述的金黄色葡萄球菌选择性显色培养基，其特征在于，所述5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯和5-溴-4-氯-3--α-D-吡喃半乳糖苷的重量配比为0.2-1.5：1。
4.如权利要求2所述的金黄色葡萄球菌选择性显色培养基，其特征在于，所述5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯和5-溴-4-氯-3--α-D-吡喃半乳糖苷的重量配比为0.8-1.0：1。
5.如权利要求1所述的金黄色葡萄球菌选择性显色培养基，其特征在于，所述抗生素选自链霉素、氨苄西啉、甲氧西林、阿米卡星、磺胺嘧啶的一种以上。
6.如权利要求1所述的金黄色葡萄球菌选择性显色培养基，其特征在于，所述抗生素选自优选氨苄西啉或磺胺嘧啶。
7.如权利要求1所述的金黄色葡萄球菌选择性显色培养基，其特征在于，所述助显色剂选自麦芽糖、硫酸镁、氯化铁或过氧化月桂酰的一种以上。
8.一种金黄色葡萄球菌选择性显色培养基检测试纸，其特征在于，其中至少含有一吸附有权利要求1-7任一项所述金黄色葡萄球菌选择性显色培养基的吸水滤纸。
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