CN103642894B - 一种金黄色葡萄球菌特异性显色培养基 - Google Patents
一种金黄色葡萄球菌特异性显色培养基 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种金黄色葡萄球菌特异性显色培养基，含有碳源、氮源、酵母粉、琼脂、杂菌生长抑制剂、NaCl、金黄色葡萄球菌生长促进剂，特异性酶混合显色底物，以及可选的助显色剂。金黄色葡萄球菌在本发明培养基上显色效果更好，显色快，目标菌呈现粉红色-紫红色，可清晰地与其它细菌呈现的蓝绿色、无色、黄色或奶油色等颜色区分，可以更容易、可靠地检测金黄色葡萄球菌。与现有的显色培养基相比，可以缩短检测时间6～18h。解决了现有培养基不能很好地区分金黄色葡萄球菌和其它葡萄球菌缺陷，大大降低了假阳性和假阴性结果的出现，不仅可以作为金黄色葡萄球菌确认培养基，还可以作为从样品中特异性分离金黄色葡萄球菌的培养基，应用前景广泛。
Description
技术领域
本发明涉及一种微生物鉴定用培养基，特别涉及一种金黄色葡萄球菌特异性显色培养基。
背景技术
金黄色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)是人类的一种重要的致病菌，属于葡萄球菌属(Staphyloccocusspp)，可引起多种组织器官的化脓性炎症，产毒株金黄色葡萄球菌可引起食物中毒，其危害仅次于副溶血弧菌和沙门氏菌。因此，如何快速、准确、特异地从含有大量其它细菌的食品等样品中分离且鉴别出金黄色葡萄球菌具有重要的现实意义。
目前对金黄色葡萄球菌的检测以选择性培养基为主。GB、SN、FDA及ISO等标准中关于金黄色葡萄球菌检验中，选择性培养基为Baird-Parker琼脂，在该培养基上金黄色葡萄球菌呈现黑色菌落，周围有透明圈。事实上一些非金黄色葡萄球菌如：腐生葡萄球菌、缓慢葡萄球菌及赛氏葡萄球菌等也能表现出金黄色葡萄球菌的性状，造成假阳性现象。虽然近年来已有一些基于分子生物学和免疫学的快速检测方法出现，可以区分金黄色葡萄球菌和其它葡萄球菌，但在应用方面存在一定局限性，一方面，这些方法不能直接用于目标菌的检测，另一方面，这些方法需要专业的技术人员或者昂贵的仪器，使其应用受到了很大的限制。相比较，利用酶活性检测鉴别细菌是一种有效的方法，这种技术可以定量并初步鉴定目标菌，且操作简便，大幅度提高了工作效率。
近年来，随着特异性酶显色技术的发展，通过显色培养基技术来快速鉴定微生物，已经成为新的发展方向，通过往分离培养基中添加细菌特异性酶显色底物，可以直接通过菌落颜色对菌株进行分离及初步鉴定，减少大量可疑菌株后续的生化鉴定步骤，节省时间，大大提高检测效率。目前关于金黄色葡萄球菌鉴定的显色培养基存在一定的缺陷，不能较好的区分金黄色葡萄球菌和其它葡萄球菌。例如，WO2000053799A1描述了一种金黄色葡萄球菌显色培养基，该培养基利用金黄色葡萄球菌能产生碱性磷酸酶，不能产生β-葡萄糖苷酶的特性，在培养基中添加两种相应的底物，以特异性选择金黄色葡萄球菌，但是这种培养基不能区分金黄色葡萄球菌和其它葡萄球菌，从而导致假阳性。CN102177249A和CN1518602A中描述的利用金黄色葡萄球菌特异性酶α﹣葡糖苷酶底物的显色培养基，但是这种培养基仍不能很好的区分金黄色葡萄球菌和其它葡萄球菌，从而导致假阳性。
目前用于金黄色葡萄球菌分离和检测的培养基技术瓶颈在于，特异性较差，不能较好的区分金黄色葡萄球菌和其它葡萄球菌，金黄色葡萄球菌检测容易造成假阳性。
发明内容
针对上述的现有技术所面临的问题，本发明的目的在于提供一种显色培养基，一方面解决现有显色培养基不能很好区分金黄色葡萄球菌和其它葡萄球菌的缺陷；另一方面可以使金黄色葡萄球菌显色快，显色效果好，更容易对金黄色葡萄球菌进行检测。
本发明所采取的技术方案是：
一种金黄色葡萄球菌特异性显色培养基，含有碳源、氮源、酵母粉、琼脂、杂菌生长抑制剂、NaCl、金黄色葡萄球菌生长促进剂，培养基中还添加有碱性磷酸酶、α-D-半乳糖苷酶和β-D-葡萄糖醛酸苷酶的特异性酶显色底物，以及可选的助显色剂。
作为本发明的进一步改进，每1000mL培养基含有蛋白胨6～11g、大豆蛋白胨4～7g、酵母粉4～7g、丙酮酸钠7～12g、氯化钠15～30g、琼脂粉10～20g、适量杂菌生长抑制剂。
作为本发明的进一步改进，每1000mL培养基含有蛋白胨6～11g、大豆蛋白胨4～7g、酵母粉4～7g、丙酮酸钠7～12g、氯化钠15～30g、琼脂粉10～20g、氯化锂8～15g、放线菌酮5～8mg、多粘菌素B5～9mg、甲磺酸去铁胺20～50mg、头孢克肟0.02～0.05mg、萘啶酮酸6～10mg、特异性酶混合显色底物和助显色剂，余量为水。
作为本发明的进一步改进，上述培养基中使用的特异性酶显色底物选自磷酸酯二钠盐、α-D-吡喃半乳糖苷、-β-D-吡喃葡萄糖醛酸苷、β-吡喃葡萄糖苷酶、β-吡喃岩藻糖苷的各种显色基团的衍生物。
作为本发明的进一步改进，上述培养基中使用的特异性酶显色底物选自5-溴-6-氯-3-吲哚基磷酸酯二钠盐、5-溴-4-氯-3--α-D-吡喃半乳糖苷和5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖醛酸苷。
作为本发明的进一步改进，上述培养基中使用的助显色剂选自麦芽糖、固红紫色LB盐、固红3GL盐、硫酸镁、氯化铁和过氧化月桂酰。
作为本发明的进一步改进，每1000mL培养基含有蛋白胨6～11g、大豆蛋白胨4～7g、酵母粉4～7g、丙酮酸钠7～12g、氯化钠15～30g、琼脂粉10～20g、氯化锂8～15g、放线菌酮5～8mg、多粘菌素B5～9mg、甲磺酸去铁胺20～50mg、头孢克肟0.02～0.05mg、萘啶酮酸5～10mg、5-溴-6-氯-3-吲哚基磷酸酯二钠盐0.05～0.1g、5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-吡喃半乳糖苷0.03～0.06g、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖醛酸苷0.05～0.1g、固红紫色LB盐0.01～0.04g、过氧化月桂酰0.04～0.07g，余量为水。
作为本发明的进一步改进，每1000mL培养基含有蛋白胨10.0g、大豆蛋白胨5.0g、酵母粉5.0g、丙酮酸钠10.0g、氯化钠25.0g、琼脂粉15.0g、氯化锂10.0g、放线菌酮7.0mg、多粘菌素B7.0mg、甲磺酸去铁胺30mg、头孢克肟0.04mg，萘啶酮酸7.0mg、5-溴-6-氯-3-吲哚基磷酸酯二钠盐0.06g、5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-吡喃半乳糖苷0.05g、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖醛酸苷0.08g、固红紫色LB盐0.03g和过氧化月桂酰0.05g，余量为水。
本发明的有益效果是：
本发明的显色培养基在检测金黄色葡萄球菌时，显色效果更好，显色快，目标菌呈现粉红色-紫红色，可清晰地与其它细菌呈现的蓝绿色、无色、黄色或奶油色等颜色区分，可以更容易更可靠地检测金黄色葡萄球菌，与常规培养基或现有的显色培养基相比，可以缩短检测时间6～18h。
本发明的显色培养基解决了现有显色培养基不能很好地区分金黄色葡萄球菌和其它葡萄球菌的缺陷，大大降低了假阳性和假阴性结果的出现，不仅本发明可以作为金黄色葡萄球菌和其它葡萄球菌确认培养基，还可以作为从样品中特异性分离金黄色葡萄球菌的培养基，应用前景广泛。
附图说明
图1是金黄色葡萄球菌ATCC6538在本发明培养基和市售培养基培养18h后显色性能测试结果。
具体实施方式
为了更好的区分金黄色葡萄球菌，在显色培养基添加促进葡萄球菌生长的因子，同时添加其他杂菌生长抑制剂，常见的杂菌生长抑制剂有氯化钠、氯化锂、放线菌酮、多粘菌素B、甲磺酸去铁胺、头孢克肟和萘啶酮酸等，可以抑制大部分革兰氏阴性菌的生长和部分革兰氏阳性菌的生长。
蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母粉、丙酮酸钠、氯化钠、琼脂粉和水为葡萄球菌生长提供丰富的营养和适宜的生长环境，有助于葡萄球菌快速生长。
本发明中的5-溴-6-氯-3-吲哚-磷酸盐可以使金黄色葡萄球菌显粉红-紫红色。本发明在培养基中添加了α-D-半乳糖苷酶和β-D-葡萄糖醛酸苷酶的显色底物。在不添加这两种酶时，其它葡萄球菌会和金黄色葡萄球菌都显示粉红-紫红色，不能区分；在添加这两种底物后，因为其它葡萄球菌能表达产生水解这两种底物中至少一种酶，游离出发色基团，通过竞争性显色，使菌落呈现出发色基团的色泽，而金黄色葡萄球菌仍然显示粉红-紫红色，从而与金黄色葡萄球菌相区分。本发明优选5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-吡喃半乳糖苷和5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖醛酸苷，可以使其它葡萄球菌呈蓝绿色。
助显色剂与特异性酶显色底物相结合，加强显色效果。特别的，当固红紫色LB盐和过氧化月桂酰联合使用时，固红紫色LB盐可与5-溴-4-氯-3-吲哚酚、5-溴-6-氯-3-吲哚酚结合后加深显色效果，而且过氧化月桂酰也可促使显色基团两两氧化耦合，进一步加深显色效果，具有极好地协同作用。
细菌在本发明培养基中呈现的特征有：
1）能产生碱性磷酸酶，形成第一种菌落颜色（粉红色-紫红色），金黄色葡萄球菌呈现第一种颜色菌落；
2）能产α-D-半乳糖苷酶酶和β-D-葡萄糖醛酸苷酶的显色底物中至少一种的微生物，形成第二种颜色菌落（蓝绿色），部分其它葡萄球菌呈现第二种颜色菌落；
3）碱性磷酸酶、α-D-半乳糖苷酶酶和β-D-葡萄糖醛酸苷酶三种酶均不能产生的其它葡萄球菌，形成第三种颜色菌落（菌落本身颜色）；以上几种颜色容易区分。
本发明的显色培养基可用于区分金黄色葡萄球菌和其它葡萄球菌或样品中金黄色葡萄球菌的检测，包括如下步骤：
1)显色平板的制备：将上述显色培养基的各组分，加入到去离子水中，搅拌，加热煮沸至完全溶解，调节pH至6.9±0.2，待冷却至45～55℃，倒平板，备用；
2)葡萄球菌确认：将可疑葡萄球菌制备成107～108CFU/mL的菌悬液，分别取一环四区划线接种于显色平板上，置于37±1℃培养箱培养18-24h，观察结果；
3)样品检测：依据各领域规范规定的样本处理方法处理，将样品或含样品的增菌液划线或涂布接种到平板上，37℃培养18～24h；
4)结果分析：若显色平板上呈现粉红色-紫红色菌落，则说明此菌落为可疑金黄色葡萄球菌菌落；其它葡萄球菌呈现绿色、蓝绿色、无色、黄色或奶油色；非葡萄球菌不生长。
下面结合实施例，进一步说明本发明。
实施例1
每1000mL培养基含有蛋白胨10.0g、大豆蛋白胨5.0g、酵母粉5.0g、丙酮酸钠10.0g、氯化钠25.0g、琼脂粉15.0g、氯化锂10.0g、放线菌酮7.0mg、多粘菌素B7.0mg、甲磺酸去铁胺30mg、头孢克肟0.04mg，萘啶酮酸7.0mg、5-溴-6-氯-3-吲哚基磷酸酯二钠盐0.06g、5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-吡喃半乳糖苷0.05g、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖醛酸苷0.08g、固红紫色LB盐0.03g和过氧化月桂酰0.05g，余量为水，pH为6.9±0.2。
实施例2
一种新型特异性的金黄色葡萄球菌显色培养基，每1000mL培养基含有蛋白胨6.0g、大豆蛋白胨4.0g、酵母粉4.0g、丙酮酸钠7g、氯化钠15.0g、琼脂粉20.0g、氯化锂10.0g、放线菌酮7.0mg、多粘菌素B5.0mg、甲磺酸去铁胺50mg、头孢克肟0.04mg，萘啶酮酸7.0mg、5-溴-6-氯-3-吲哚基磷酸酯二钠盐0.10g、5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-吡喃半乳糖苷0.05g、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖醛酸苷0.08g、固红紫色LB盐0.04g和过氧化月桂酰0.04g，余量为水，pH为6.9±0.2。
实施例3
一种新型特异性的金黄色葡萄球菌显色培养基，每1000mL培养基含有蛋白胨10.0g、大豆蛋白胨5.0g、酵母粉7.0g、丙酮酸钠10.0g、氯化钠25.0g、琼脂粉15.0g、氯化锂8.0g、放线菌酮8.0mg、多粘菌素B9.0mg、萘啶酮酸10.0mg、甲磺酸去铁胺30mg、头孢克肟0.05mg、5-溴-6-氯-3-吲哚基磷酸酯二钠盐0.07g、5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-吡喃半乳糖苷0.03g、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖醛酸苷0.10g、固红紫色LB盐0.03g和过氧化月桂酰0.05g，余量为水，pH为6.9±0.2。
实施例4
一种新型特异性的金黄色葡萄球菌显色培养基，每1000mL培养基含有蛋白胨11.0g、大豆蛋白胨4.0g、酵母粉5.0g、丙酮酸钠10.0g、氯化钠25.0g、琼脂粉15.0g、氯化锂10.0g、放线菌酮7.0mg、多粘菌素B7.0mg、甲磺酸去铁胺30mg、头孢克肟0.04mg，萘啶酮酸7.0mg、5-溴-6-氯-3-吲哚基磷酸酯二钠盐0.06g、5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-吡喃半乳糖苷0.05g、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖醛酸苷0.08g、固红紫色LB盐0.03g和过氧化月桂酰0.05g，余量为水，pH为6.9±0.2。
实施例5
一种新型特异性的金黄色葡萄球菌显色培养基，每1000mL培养基含有蛋白胨10.0g、大豆蛋白胨7.0g、酵母粉7.0g、丙酮酸钠12.0g、氯化钠30.0g、氯化锂15.0g、琼脂粉10.0g、放线菌酮5.0mg、多粘菌素B9.0mg、甲磺酸去铁胺20mg、头孢克肟0.02mg，萘啶酮酸5.0mg、5-溴-6-氯-3-吲哚基磷酸酯二钠盐0.05g、5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-吡喃半乳糖苷0.06g、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖醛酸苷0.05g、固红紫色LB盐0.01g和过氧化月桂酰0.07g，余量为水，pH为6.9±0.2。
特异性实验
将表1中所列的17株葡萄球菌制备成107～108CFU/mL的菌悬液，分别取一环划线按四区划线法接种于实施案例1中所描述培养基制成的平板（简称HKM）和对照平板上，37℃培养24h，观察菌落的显色情况，实验结果如表1所示。
注：对照培养基有：国内厂家的金黄色葡萄球菌显色培养基和OXOID公司的Baird-Parker琼脂（简称B-P琼脂）。金黄色葡萄球菌在上述对照培养基中特征分别为，国内厂家金黄色葡萄球菌显色培养基，金黄色葡萄球菌呈蓝绿色；B-P培养基金黄色葡萄球菌呈黑色，周围有透明圈。表1中菌落生长情况用生长几区来表示，4区表示生长良好，菌落大小正常，1～3区表示生长受抑制，菌落偏小或生长少于4区。
表1不同培养基的葡萄球菌特异性实验结果
由表1可知，6株金黄色葡萄球菌在本发明的培养基上均形成粉红色-紫红色菌落，均显示阳性结果，菌落大小适宜，生长良好。其它葡萄球菌与金黄色葡萄球菌不同颜色的菌落，可较好地与金黄色葡萄球菌区分。除金黄色葡萄球菌ATCC6538在国内厂家②上完全受抑制外，金黄色葡萄球菌在上述5种培养基中均显示阳性结果。对于其它非葡萄球菌，在国内厂家金黄色葡萄球菌显色培养基和B-P平板上其它葡萄球菌与金黄色葡萄球菌不能很好地相区分。试验表明本发明所述的显色培养基能很好区分金黄色葡萄球菌和其它葡萄球菌，在特异性方面明显优于B-P及国内厂家的同类产品。
显色强度及速度效果试验
将金黄色葡萄球菌ATCC6538和ATCC25923分别制成102～103CFU/mL菌悬液，取100μL用螺旋接种法分别接种到实施案例1中所描述培养基、科玛嘉公司金黄色葡萄球菌显色培养基（简称CHROMagar）和OXOID公司的Baird-Parker琼脂（简称B-P）等3种培养基制成的平板上，显色培养基37℃培养18-24h，Baird-Parker琼脂37℃培养24-48h。分别对3种平板显色强度及速度效果定期观察，结果见图1、表2和表3。
注：科玛嘉（CHROMagar）金黄色葡萄球菌显色培养基，金黄色葡萄球菌呈粉红-紫红色菌落；B-P培养基金黄色葡萄球菌呈黑色，周围有透明圈。显色强度用“+”表示：—：不显色，+：浅谈显色，++：清晰显色，+++：中等强度显色，++++：强显色
表2金黄色葡萄球菌ATCC6538显色性能测试结果
表3金黄色葡萄球菌ATCC25923显色性能测试结果
由表2和表3可知，本发明所述的显色培养基(HKM)，目标菌株具有显色速度快、生长好的优点，与CHROMagar显色培养基相比可以使检测时间缩短6h左右，与Baird-Parker琼脂相比可使检测时间缩短18h左右。
综上所述，本发明所描述的一种新型特异性的金黄色葡萄球菌显色培养基具有显色效果好、特异性高、结果判断简单等优点，一方面，本发明所描述的显色培养基解决了现有技术不能很好地区分金黄色葡萄球菌和其它葡萄球菌缺陷，大大降低了假阳性和假阴性结果的出现，另一方面，目标菌株在本发明所描述的显色培养基具有显色速度快、生长好的优点，国外同类产品相比可以使检测时间缩短6h左右，与传统培养基Baird-Parker琼脂相比可使检测时间缩短18h左右，金黄色葡萄球菌与其它葡萄球菌方面，明显优于国内厂家同类培养基和传统培养基Baird-Parker琼脂，大大降低了假阳性和假阴性结果的出现，有很广泛的应用前景。
虽然本发明已经对具体实施案例进行了描述，但是本发明并不局限于此，本行业技术人员应该意识到，在本发明所述原理下可以对本发明做多种修饰和改变。因此，本发明意欲涵盖在权利要求书及其同等物范围内的所有这些修饰和改变。
Claims (4)
1.一种金黄色葡萄球菌特异性显色培养基，含有碳源、氮源、酵母粉、琼脂、杂菌生长抑制剂、NaCl、金黄色葡萄球菌生长促进剂，其特征在于：每1000mL培养基含有蛋白胨6～11g、大豆蛋白胨4～7g、酵母粉4～7g、丙酮酸钠7～12g、氯化钠15～30g、琼脂粉10～20g、氯化锂8～15g、放线菌酮5～8mg、多粘菌素B5～9mg、甲磺酸去铁胺20～50mg、头孢克肟0.02～0.05mg、萘啶酮酸6～10mg、特异性酶混合显色底物和助显色剂，余量为水，其中特异性酶混合显色底物为5-溴-6-氯-3-吲哚基磷酸酯二钠盐、5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-吡喃半乳糖苷和5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖醛酸苷。
2.根据权利要求1所述的金黄色葡萄球菌特异性显色培养基，其特征在于：助显色剂选自麦芽糖、固红紫色LB盐、固红3GL盐、硫酸镁、氯化铁和过氧化月桂酰。
3.一种金黄色葡萄球菌特异性显色培养基，其特征在于：每1000mL培养基含有蛋白胨6～11g、大豆蛋白胨4～7g、酵母粉4～7g、丙酮酸钠7～12g、氯化钠15～30g、琼脂粉10～20g、氯化锂8～15g、放线菌酮5～8mg、多粘菌素B5～9mg、甲磺酸去铁胺20～50mg、头孢克肟0.02～0.05mg、萘啶酮酸5～10mg、5-溴-6-氯-3-吲哚基磷酸酯二钠盐0.05～0.1g、5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-吡喃半乳糖苷0.03～0.06g、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖醛酸苷0.05～0.1g、固红紫色LB盐0.01～0.04g、过氧化月桂酰0.04～0.07g，余量为水。
4.根据权利要求3所述的金黄色葡萄球菌特异性显色培养基，其特征在于：每1000mL培养基含有蛋白胨10.0g、大豆蛋白胨5.0g、酵母粉5.0g、丙酮酸钠10.0g、氯化钠25.0g、琼脂粉15.0g、氯化锂10.0g、放线菌酮7.0mg、多粘菌素B7.0mg、甲磺酸去铁胺30mg、头孢克肟0.04mg，萘啶酮酸7.0mg、5-溴-6-氯-3-吲哚基磷酸酯二钠盐0.06g、5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-吡喃半乳糖苷0.05g、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖醛酸苷0.08g、固红紫色LB盐0.03g和过氧化月桂酰0.05g，余量为水。
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