CN102286606A - 克罗诺杆菌肉汤培养基及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于食品中克罗诺杆菌的检测培养基及检测方法。本发明的检测方法在液体培养基中利用克罗诺杆菌产生的α-葡萄糖苷酶的活性检测克罗诺杆菌，在对克罗诺杆菌进行选择性增菌的同时使其得到鉴别。本发明的克罗诺杆菌肉汤培养基可包含混合胨18-20重量份；乳糖3-5重量份；K2HPO4 2-3重量份；KH2PO4 2-3重量份；氯化钠20-34重量份；月桂基硫酸钠0.08-0.15重量份；万古霉素0.009-0.011重量份；4-甲基伞形酮-α-D-吡喃葡萄糖苷0.07-0.10重量份；pH6.8±0.2，最佳培养温度，36℃。本发明还公开了用于上述检测方法的试剂盒。本发明的优点在于缩短了检测时间，免除了后续繁琐的鉴定操作步骤，从而提高了克罗诺杆菌的检测效率。
Description
技术领域
本发明涉及一种克罗诺杆菌肉汤培养基及检测方法，属于食品卫生微生物安全检验与监测领域。
背景技术
克罗诺杆菌(Cronobacter spp.)，过去称作阪崎肠杆菌(Enterobactersakazakii)，广泛存在于自然界中，可通过配方奶粉等食品引起新生儿脑膜炎、败血症、坏死性结肠炎，婴幼儿感染后病死率高达20～50％，由此得到了世界卫生组织和各国政府及食品工业领域专家的高度重视。此类细菌在1980年被定义和分类为肠杆菌属的一个种，即阪崎肠杆菌，2008年被重新分类划分为一个新属，即克罗诺杆菌属，其包括5个新种、1个克罗诺杆菌基因种(genomospeciese)和3个新亚种(赵贵明等，阪崎肠杆菌的分类变化及新种属生物学特性，卫生研究，2010年，第39卷，第2期)。目前用于克罗诺杆菌的检测方法有传统分离计数方法、分子生物学和免疫学等快速方法，但使用最普遍的方法和仲裁方法仍是传统方法(GB/T 4789.40-2008，食品卫生微生物学检验--阪崎肠杆菌检验)。
传统方法中，检测克罗诺杆菌的实验步骤分为增菌、分离和鉴定三个部分，增菌步骤包括前增菌和选择性增菌，前增菌使奶粉中包括目标菌在内的各种菌均获得增殖，选择性增菌则是为目标菌提供适宜的生长环境，同时尽可能抑制非目标菌的生长，以保证获得足够数量的目标菌。整个增菌过程需要约48小时，接下来是分离和鉴定。阳性样品的检测流程为6天，阴性样品需要3天。快速方法也需要经过前增菌和选择性增菌，阴性样品也需要3天，如果结果为阳性，则需要用传统方法进行验证，也为6天(SN/T 1632.3-2005，奶粉中阪崎肠杆菌的检验-荧光PCR检测方法)。
同时，目前的克罗诺杆菌鉴定培养基是平板培养基。而前增菌后的培养物所包含的非目标菌远多于目标菌。在这种情况下，使用平板培养基不易于分离鉴定出目标菌。因此，现有方法中必须要使用单独的选择性增菌步骤以提高目标菌相对数量。
可见，现有检测方法和检测培养基要求使用单独的增菌和测试步骤，因此非常耗时。因此，本领域需要效率更高、操作简便的培养基用于克罗诺杆菌的检测。
针对上述问题，本发明提供了用于检测克罗诺杆菌的克罗诺杆菌肉汤培养基。所述克罗诺杆菌肉汤培养基是基于传统细菌培养理论，将人工合成的酶底物与支持细菌生长的多种营养物质组合使用，在细菌生长的同时，通过观察是否产生荧光对目标菌进行判断。本发明所述的克罗诺杆菌肉汤培养基，在选择性增菌培养基中添加了4-甲基伞形酮-α-D-吡喃葡萄糖苷(4-Methylumbelliferyl-α-D-glucopyranoside，α-MUG)，在选择性增菌的同时，通过观察是否产生荧光。利用本发明的克罗诺杆菌肉汤培养基和检测方法，在48小时内即可得出初步实验结果，比目前的标准方法和快速方法早1天获得实验结果，具有高效、快速、低廉、操作简便的优点。
发明内容
本发明提供了一种克罗诺杆菌肉汤培养基和用于检测克罗诺杆菌的方法，从而在增菌过程的同时实现对克罗诺杆菌的鉴别，显著缩短了检测克罗诺杆菌所需的时间。
根据本发明的第一方面，本发明提供了使用包含α-MUG的克罗诺杆菌肉汤培养基检测食品中克罗诺杆菌的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)前增菌步骤：将所述食品置于无菌蒸馏水或缓冲蛋白胨水中，混合均匀后，在35～44℃培养18～24小时；和
(2)克罗诺杆菌的选择性培养和鉴定：以300-3000cfu/mL的接种量将前增菌培养液转种至包含α-MUG的克罗诺杆菌肉汤培养基中，在36±1℃培养18～22小时，并观察是否产生荧光，
其中所述步骤(2)中产生荧光则表明所述食品为克罗诺杆菌阳性。
所述步骤(2)的最佳培养温度为36℃。
在所述步骤(2)中使用的包含α-MUG的克罗诺杆菌肉汤培养基为包含氮源、碳源、无机盐、水和4-甲基伞形酮-α-D-吡喃葡萄糖苷的克罗诺杆菌肉汤培养基。任选地，所述克罗诺杆菌肉汤培养基还包含一种或多种抑菌剂。
具体地，所述氮源选自蛋白胨、牛肉浸粉、混合胨、明胶胨和胰酪胨中的一种或多种。本发明中使用的氮源是本领域通常使用的氮源，例如可购自北京奥博星等生产商。所述碳源选自蔗糖、乳糖和葡萄糖中的一种或多种。所述无机盐选自氯化钠、K2HPO4、KH2PO4、Na2HPO4中的一种或多种。所述抑菌剂为万古霉素、月桂基硫酸钠、胆盐、亮绿中的一种或多种。这些抑菌剂用于抑制革兰氏阳性菌生长。
4-甲基伞形酮-α-D-吡喃葡萄糖苷(α-MUG)是克罗诺杆菌特有的α-D-葡萄糖苷酶的底物。在克罗诺杆菌α-葡萄糖酶的作用下，α-MUG被分解，其分解产物在366nm的长波UV下产生荧光。
因此，克罗诺杆菌可以在本发明的克罗诺杆菌肉汤培养基中生长，而革兰氏阳性细菌则不能生长。克罗诺杆菌在本发明的克罗诺杆菌肉汤培养基中的生长过程中，α-MUG不断被克罗诺杆菌产生的α-D-葡萄糖苷酶分解，培养18-24小时后，于366nm的长波UV下观察是否有荧光产生，从而使克罗诺杆菌得到鉴别。
本发明中所述的食品是指各种供人食用或者饮用的成品和原料。所述食品可以是乳制品或乳制品的原料，例如奶酪、黄油、牛奶、稀奶油、生奶油、乳脂、乳饮料、酸牛奶和奶粉等。根据一个实施方式，所述食品为奶粉。
根据一种实施方式，本发明克罗诺杆菌肉汤培养基的配方可以是：蛋白胨8-12重量份；牛肉浸粉2-4重量份；氯化钠4-6重量份；蔗糖9-11重量份；万古霉素0.009-0.011重量份；α-MUG 0.07-0.10重量份；其pH值为7.4±0.1。
根据另一种实施方式，本发明克罗诺杆菌肉汤培养基的配方可以是：蛋白胨8-12重量份；牛肉浸粉2-4重量份；氯化钠4-6重量份；蔗糖9-11重量份；万古霉素0.009-0.011重量份；月桂基硫酸钠0.08-0.15重量份；α-MUG0.07-0.10重量份；其pH值为7.4±0.1。
根据另一种实施方式，本发明克罗诺杆菌肉汤培养基的配方可以是：混合胨18-20重量份；乳糖3-5重量份；K2HPO4 2-3重量份；KH2PO4 2-3重量份；氯化钠20-34重量份；月桂基硫酸钠0.08-0.15重量份；万古霉素0.009-0.011重量份；α-MUG 0.07-0.10重量份；其pH值为6.8±0.2。
根据另一种实施方式，本发明克罗诺杆菌肉汤培养基的配方可以是：明胶胨9-11重量份；葡萄糖4-6重量份；Na2HPO4 7.5-8.5重量份；KH2PO4 1.8-2.1重量份；牛胆盐18-22重量份；亮绿0.010-0.015重量份；α-MUG 0.07-0.10重量份；其pH值为7.2±0.2。
本发明的克罗诺杆菌肉汤培养基可以按照常规方法配制。因此，本发明的克罗诺杆菌还可以任选地包括以下步骤：
按照上述配方称取各组分，将万古霉素之外的其他成分与水混合溶解。将所得溶液在121℃高压灭菌15分钟，备用。对于配方中含有万古霉素的培养基，其在过滤除菌后将万古霉素加入经高压灭菌的培养基中。
在实际工作中，也可能需要分离出克罗诺杆菌阳性食品中的克罗诺杆菌菌株。因此，对于在所述步骤(2)中鉴定为克罗诺杆菌阳性的食品，所述方法还可以包括：
(3)分离单菌落：将所述克罗诺杆菌阳性食品的选择性培养液划线接种到包含5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖苷(X-α-GlcA)的显色培养基琼脂平板，在36±1℃培养18～22小时，以得到单个菌落；和
(4)生化验证：从步骤(3)的平板挑取蓝绿色菌落，进行革兰氏染色和氧化酶试验，并进行生化鉴定。
根据本发明的第二方面，本发明还提供了用于本发明的第一方面所述方法的试剂盒，其包含：
(1)作为前增菌液的无菌蒸馏水或缓冲蛋白胨水；和
(2)用于选择性培养并鉴定克罗诺杆菌的克罗诺杆菌肉汤培养基，所述克罗诺杆菌肉汤培养基包含4-甲基伞形酮-α-D-吡喃葡萄糖苷；
和任选的(3)和(4)：
(3)用于分离克罗诺杆菌单菌落的显色培养基琼脂平板，所述显色培养基琼脂平板包含5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖苷；和
(4)用于对分离的单菌落进行生化验证的试剂。
本发明中的生化验证试剂是本领域通常用于检验克罗诺杆菌单菌落的生化验证试剂，例如可购自生物梅里埃公司等生产商。
本发明的克罗诺杆菌检测方法的特点在于克罗诺杆菌的选择性培养和鉴定在同一步骤中进行，并利用酶解后产生荧光的α-MUG，通过荧光反应检测样品中的克罗诺杆菌，从而大大缩减了检测时间，同时避免了非目标菌的干扰，提高了检测的特异性和准确性。本发明的克罗诺杆菌肉汤培养基操作简便，价格低廉，具有很好的应用推广前景。
具体实施方式
实施例1：本发明所述的克罗诺杆菌肉汤培养基选择性评价
1.培养基配制
按表1中的配方称取各组分，配制成三种培养基，分别为培养基1、培养基2和培养基3，调整培养基1和培养基2的pH为7.4±0.1；调整培养基3的pH为pH6.8±0.2，121℃高压灭菌15后冷却室温，分装到试管中，每管10mL备用。
按厂家说明配制TSB肉汤培养基(美国BD公司产品，货号：211825)，备用。
表1：培养基组分
**10mg万古霉素溶解于10mL蒸馏水中，过滤除菌，加入高压灭菌后的培养基中。
2.接种
将克罗诺杆菌参考菌株及相关参考菌株接种于TSB肉汤培养基(美国BD公司产品，货号：211825)中，35℃培养18-24小时，轻微摇动使菌液混匀，无菌生理盐水进行10倍稀释，以确定接种量数量。
吸取0.1ml所得的菌悬液(选择300-3000cfu/mL浓度)，转接于培养基1、培养基2和培养基3中，36℃培养24h，观察生长状况。
3.结果
克罗诺杆菌属在培养基1、2、3中均能很好生长，同时革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌受到抑制。
表2：参考菌株的生长状况
实施例2：本发明所述的克罗诺杆菌肉汤培养基特异性测试
为进一步验证本发明克罗诺杆菌肉汤培养基的特异性和选择性，选取了克罗诺杆菌属下全部6个种的参考菌株，以及5株分离菌株，还选择了与克罗诺杆菌最相近的产气肠杆菌、阴沟肠杆菌和较为常见但微生物学特性较远的其他菌株(参见表2)进行以下试验。
1.培养基配制
按表1中的培养基2配方称取各组分配制培养基，灭菌处理后冷却至50℃，分装到试管中，每管10mL备用。
2.接种
同实施例1，选择表2中的代表性菌株接种于TSB肉汤培养基(美国BD公司产品，货号：211825)中，36℃培养18-24h，各取一环划线接种于本发明的克罗诺杆菌肉汤培养基(培养基2)，放置在36±1℃培养箱中培养18-24h，于366nm的长波长UV灯下观察是否有荧光产生并进行记录。
3结果及分析
表2实验结果表明，本发明的克罗诺杆菌肉汤培养基具有较好的选择性和高度特异性。
表2克罗诺杆菌肉汤培养基特异性实验结果
| 参考菌株 | 编号 | 荧光信号 | 菌落特征 |
| 阪崎克罗诺杆菌 | ATCC 29544 | ++++ | 绿色 |
| 阪崎克罗诺杆菌 | ATCC 12868 | ++++ | 绿色 |
| 阪崎克罗诺杆菌 | ATCC 29004 | ++++ | 绿色 |
| 丙二酸盐阳性克罗诺杆菌 | CDC-1058-77 | +++ | 绿色 |
| 苏黎世克罗诺杆菌 | Z3032 | +++ | 绿色 |
| 克罗诺杆菌基因种 | NCTC 9529 | +++ | 绿色 |
| 穆汀斯克罗诺杆菌 | ATCC 51329 | ++++ | 绿色 |
| 都柏林克罗诺杆菌 | DES187 | +++ | 绿色 |
| 都柏林克罗诺杆菌洛桑亚种 | DSM 18706 | +++ | 绿色 |
| 都柏林克罗诺杆菌乳粉亚种 | DSM 18707 | +++ | 绿色 |
| 克罗诺杆菌属 | IQCC 10403.0* | ++++ | 绿色 |
| 克罗诺杆菌属 | IQCC 10403.1 | ++++ | 绿色 |
| 克罗诺杆菌属 | IQCC 10403.2 | ++++ | 绿色 |
| 克罗诺杆菌属 | IQCC 10403.3 | ++++ | 绿色 |
| 克罗诺杆菌属 | IQCC 10403.4 | ++++ | 绿色 |
| 产气肠杆菌 | ATCC 13048 | - | 无色 |
| 阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae) | ATCC 35030 | - | 无色 |
| 金黄色葡萄球菌 | ATCC 25923 | - | 不生长 |
IQCC为检验检疫菌种保藏中心，IQCC 10403.0-10403.4是从奶粉样品中分离出的菌株。
实施例3：本发明培养基的最适宜培养温度
1.本发明克罗诺杆菌肉汤培养基的制备
按表3中培养基3和4的配方进行制备。具体制备方法如实施例1所述。
表3：供最适宜培养温度测试用培养基组分
| 成分 | 材料来源 | 培养基3 | 培养基4 |
| 混合胨(g) | 北京奥博星 | 20 | × |
| 明胶胨(g) | 北京奥博星 | × | 10 |
| 氯化钠(g) | Sigma | 34 | × |
| 乳糖(g) | Sigma | 5 | × |
| 葡萄糖(g) | Sigma | × | 5 |
| α-MUG(g) | Sigma(货号：M9766，CAS：17833-43-1) | 0.08 | 0.09 |
| 月桂基硫酸钠(g) | Sigma | 0.1 | × |
| 牛胆盐(g) | Sigma | × | 20 |
| 亮绿(mg) | Sigma | × | 10mg |
| K2HPO4(g) | Sigma | 2.75 | × |
| Na2HPO4(g) | Sigma | × | 8.0 |
| KH2PO4(g) | Sigma | 2.75 | 1.9 |
| 蒸馏水 | 1000mL | 1000mL | |
| 万古霉素** | Sigma | 10mg | × |
**10mg万古霉素溶解于10mL蒸馏水中，过滤除菌，加入高压灭菌后的培养基中。
2.其他培养基的配制
按厂家说明配制TSB肉汤培养基(BD公司产品，货号：211825)，备用。
3.操作
将克罗诺杆菌菌株ATCC 29544和ATCC51329、普通变形杆菌(Proteusvulgaris)ATCC33420、金黄色葡萄球菌ATCC 25923分别接种于TSB肉汤培养基，36℃培养24小时，各取1.0mL菌悬液加到9.0mL灭菌培养基3中，成为10-1稀释度，从10-1稀释度的管中再取1.0mL转入9.0mL灭菌培养基中，成为10-2稀释度，依次稀释到10-8。培养基4的实验操作程序相同。然后再将各管分成两等份(每管5mL)，分别于36℃、42℃培养24小时。
4.结果及分析
将培养24h后的试管置于366nm波长的UV等下观察荧光强度。
荧光强度分级记录如下：
空白对照记录为“-”；与空白对照比较，肉眼能够观察到荧光的试验管，记录为“+”；通过强弱比较，由弱到强，分别记录为“++”、“+++”和“++++”。
通过表4实验结果分析，选择36℃作为适宜培养温度。
表4最适宜培养温度测试结果
实施例4：不同前增菌液和培养温度对克罗诺杆菌检测结果的影响
本试验考察将克罗诺杆菌参考菌株单独或与其他肠杆菌科的参考菌株混合后，以不同的浓度加到奶粉样品中，分别以无菌蒸馏水(简称DW)和缓冲蛋白胨水(简称BP)为前增菌液，在36℃和44℃进行前增菌，比较不同前增菌液、不同温度对结果的影响。
1.本发明克罗诺杆菌肉汤培养基的制备
按照培养基1：蛋白胨8-12重量份；牛肉浸粉2-4重量份；氯化钠4-6重量份；蔗糖9-11重量份；万古霉素0.009-0.011重量份(过滤除菌后加入高压灭菌后的培养基中)；α-MUG 0.07-0.10重量份；pH7.4±0.1，121℃高压灭菌15min后备用。
2.其他培养基和试剂的配制
缓冲蛋白胨水(北京奥博星产品)按说明书使用蒸馏水配制，121℃高压灭菌15min后备用。
3.实验方法
由于将菌液直接加到奶粉样品中均一性较难控制，因此在进行加菌试验时的操作方法是：称取100g奶粉样品，用900ml蒸馏水溶解后，再将菌液加入混匀。按照标准方法取3个100ml，3个10ml，3个1ml进行试验，奶粉的实际接种量为10g×3，1g×3，0.1g×3，培养18-22h后分别取0.1ml对应接种于培养基3中，36℃培养18-24h后于366nm波长紫外光下观察是否有荧光产生，记录阳性结果，通过查MPN表(GB/T 4789.40-2008)获得最终结果。
4.结果与分析
结果表明，前增菌液和培养温度对最终结果影响不大。结果见表5。
表5不同前增菌液和培养温度加菌试验结果
*为参考菌株45301，45005，48021，45103，46114的混合菌液
**奶粉样品由市场随机购得。
实施例5：本发明的克罗诺杆菌肉汤培养基在奶粉样品检测中应用
1.克罗诺杆菌肉汤培养基的配制
按培养基3提供的组份配制。具体制备方法如实施例1所述。
2.检测方法
(1)无菌称取奶粉样品100g，10g和1g各三份分别加入2L，250mL和125mL的样品稀释瓶中，加入9倍预热到45℃的灭菌蒸馏水(1∶10稀释)，振摇使样品充分混匀，36±1℃培养18～22h。
(2)分别移取培养18～22h的悬液1mL转种于10mL本发明克罗诺杆菌肉汤培养基(培养基3)，36±1℃培养18～22h后于366nm波长紫外光下观察荧光是否产生并进行记录。
(3)轻轻混匀步骤(2)获得的增菌液，每份增菌液用3mm接种环(10μL)接种2个显色培养基琼脂(含5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖苷，X-α-GlcA，购自Sigma，货号73837，CAS：108789-36-2)平板，四区法划线，以得到单个菌落。将平板在36±1℃培养18～22h。
(4)观察平板上菌落形态：如果在X-α-GlcA平板上出现蓝绿色菌落，从平板上挑取5个可疑菌落，革兰氏染色，做氧化酶试验。再应用API 20E生化鉴定试剂盒(生物梅里埃公司)进行生化鉴定，鉴定为阳性的样品查MPN表(GB/T 4789.40-2008)。
3.对照方法
采用国标方法GB/T 4789.40-2008食品卫生微生物学检验-阪崎肠杆菌检验。
4.结果及分析
表6样品中克罗诺杆菌的检测结果
*奶粉样品由市场随机购得。
经国标方法验证，产生荧光的克罗诺杆菌肉汤培养基中分离出的细菌为克罗诺杆菌，说明克罗诺杆菌肉汤培养基具有较好的特异性和较好支持克罗诺杆菌生长的能力，检测结果与国标方法一致，但早于国标方法1d获得检测结果。
虽然已经对本发明的具体实施方案进行了描述，但是本领域技术人员应认识到，在不偏离本发明的范围或精神的前提下可以对本发明进行多种改变与修饰。因而，本发明意欲涵盖落在权利要求书及其同等物范围内的所有这些改变与修饰。
Claims (13)
1.一种用于检测食品中克罗诺杆菌的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)前增菌步骤：将所述食品置于无菌蒸馏水或缓冲蛋白胨水中，混合均匀后，在35～44℃培养18～24小时；和
(2)克罗诺杆菌的选择性培养和鉴定：以300-3000cfu/mL的接种量将前增菌液转种至包含4-甲基伞形酮-α-D-吡喃葡萄糖苷的克罗诺杆菌肉汤培养基中，在36±1℃培养18～22小时，并于366nm波长紫外光下观察是否产生荧光，
其中所述步骤(2)中产生荧光则表明所述食品为克罗诺杆菌阳性。
2.如权利要求1所述的方法，其中对于在所述步骤(2)中鉴定为克罗诺杆菌阳性的食品，所述方法还包括：
(3)分离单菌落：将所述克罗诺杆菌阳性样品的选择性培养液划线接种到包含5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖苷的显色培养基琼脂平板，在36±1℃培养18～22小时，以得到单个菌落；和
(4)生化验证：从步骤(3)的平板挑取蓝绿色菌落，进行革兰氏染色和氧化酶试验，并进行生化鉴定。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述食品为乳制品或乳制品的原料。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述克罗诺杆菌肉汤培养基包含：
蛋白胨8-12重量份；
牛肉浸粉2-4重量份；
氯化钠4-6重量份；
蔗糖9-11重量份；
万古霉素0.009-0.011重量份；
4-甲基伞形酮-α-D-吡喃葡萄糖苷0.07-0.10重量份；
且所述克罗诺杆菌肉汤培养基的pH值为7.4±0.1。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述克罗诺杆菌肉汤培养基包含：
蛋白胨10重量份；
牛肉浸粉3重量份；
氯化钠5重量份；
蔗糖10重量份；
万古霉素0.010重量份；
4-甲基伞形酮-α-D-吡喃葡萄糖苷0.08重量份。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述克罗诺杆菌肉汤培养基包含：
蛋白胨8-12重量份；
牛肉浸粉2-4重量份；
氯化钠4-6重量份；
蔗糖9-11重量份；
万古霉素0.009-0.011重量份；
月桂基硫酸钠0.08-0.15重量份；
4-甲基伞形酮-α-D-吡喃葡萄糖苷0.07-0.10重量份；
且所述克罗诺杆菌肉汤培养基的pH值为7.4±0.1。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述克罗诺杆菌肉汤培养基包含：
蛋白胨10重量份；
牛肉浸粉3重量份；
氯化钠5重量份；
蔗糖10重量份；
万古霉素0.010重量份；
月桂基硫酸钠0.1重量份；
4-甲基伞形酮-α-D-吡喃葡萄糖苷0.08重量份。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述克罗诺杆菌肉汤培养基包含：
混合胨18-20重量份；
乳糖3-5重量份；
K2HPO4 2-3重量份；
KH2PO4 2-3重量份；
氯化钠20-34重量份；
月桂基硫酸钠0.08-0.15重量份；
万古霉素0.009-0.011重量份；
4-甲基伞形酮-α-D-吡喃葡萄糖苷0.07-0.10重量份；
且所述克罗诺杆菌肉汤培养基的pH值为6.8±0.2。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述克罗诺杆菌肉汤培养基包含：
混合胨20重量份；
乳糖5重量份；
K2HPO4 2.75重量份；
KH2PO4 2.75重量份；
氯化钠34重量份；
月桂基硫酸钠0.1重量份；
万古霉素0.010重量份；
4-甲基伞形酮-α-D-吡喃葡萄糖苷0.08重量份。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述克罗诺杆菌肉汤培养基包含：
明胶胨9-11重量份；
葡萄糖4-6重量份；
Na2HPO4 7.5-8.5重量份；
KH2PO4 1.8-2.1重量份；
牛胆盐18-22重量份；
亮绿0.010-0.015重量份；
4-甲基伞形酮-α-D-吡喃葡萄糖苷0.07-0.10重量份；
且所述克罗诺杆菌肉汤培养基的pH值为7.2±0.2。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述克罗诺杆菌肉汤培养基包含：
明胶胨10重量份；
葡萄糖5重量份；
Na2HPO4 8.0重量份；
KH2PO4 1.9重量份；
牛胆盐20重量份；
亮绿0.010重量份；
4-甲基伞形酮-α-D-吡喃葡萄糖苷0.09重量份。
12.如权利要求4-9所述的方法，其中所述克罗诺杆菌肉汤培养基通过以下步骤配制：
按重量称取各组分；
将万古霉素之外的其他成分与水混合溶解；
将所得溶液在121℃高压灭菌15分钟；
将万古霉素在过滤除菌后加入经高压灭菌的培养基中。
13.用于权利要求1-12任一项所述方法的试剂盒，其包含：
(1)作为前增菌液的无菌蒸馏水或缓冲蛋白胨水；和
(2)用于选择性培养并鉴定克罗诺杆菌的克罗诺杆菌肉汤培养基，所述克罗诺杆菌肉汤培养基包含4-甲基伞形酮-α-D-吡喃葡萄糖苷；
和任选的(3)和(4)：
(3)用于分离克罗诺杆菌单菌落的显色培养基琼脂平板，所述显色培养基琼脂平板包含5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖苷；和
(4)用于对分离的单菌落进行生化验证的试剂。
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