MXPA05007219A - Medio de cultivo selectivo para el aislamiento y deteccion de especies del genero streptococcus. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se relaciona con la Microbiologia en particular con un medio de cultivo selectivo para el aislamiento y deteccion de especies del genero Streptococcus. El medio propuesto permite la identificacion de especies de Streptococcus por la aparicion de 3 tonalidades diferentes en los organismos a detectar y la aparicion de emisiones fluorescentes, ademas de cambios de coloracion del medio, lo que ofrece la identificacion con un alto grado de sensibilidad y especificidad. El medio comprende relaciones especificas de mezclas de bases nutritivas ricas en compuestos de origen proteico (polipeptidos, peptidos, proteosas, aminoacidos) y vitaminas que posibilitan un crecimiento abundante de las especies de interes, ademas de la inclusion del hidrolizado enzimatico de sangre, el cual garantiza la presencia en el medio de sustancias derivadas de la sangre o de sus fracciones necesarias para el crecimiento de Streptococcus, sin entorpecer la identificacion.

Description

MEDIO DE CULTIVO SELECTIVO PARA EL AISLAMIENTO Y DETECCION DE ESPECIES DEL GENERO STREPTOCOCCUS SECTOR TÉCNICO La presente invención se relaciona con la Microbiología y específicamente con el diagnóstico clínico y veterinario, control de la calidad de alimentos y estudios de contaminación de elementos ambientales, en los que se necesitan métodos para el aislamiento y detección de especies de Streptococcus .

Los estreptococos son considerados un género de microorganismos fastidiosos, cuya identificación es altamente importante en el diagnóstico clínico. Dentro de la clasificación realizada por Lancefield se encuentran numerosas especies patógenas al hombre, tales como: Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Streptococcus angínosus, Enterococcus avium, Enterococcus faecxum, Enterococcus faecalls, agentes causales de septicemias, meningitis neonatales, endocarditis e infecciones de las vías urinarias (Giuseppe, N. y Vito Mar . , 1989. Diccionario de Bacteriología Humana, edición española Menarini) . Aunque los estreptococos no son los microorganismos que más frecuentemente provocan sepsis urinaria, sí se hace necesario su detección, pues son específicamente los estreptococos ß hemolíticos la causa más frecuente de sepsis en neonatos, lo que permite administrar profilaxis antibiótica intraparto y prevenir la infección perinatal por este microorganismo (Bosch, J.; Murillo, S.; Rico, M. y Salgado, M. 1998. Utilidad de un medio selectivo disco-caldo para la detección de estreptococo del grupo B en la vagina. Enferm. Infecc. Microbiol. Clin. Vol 16(2)). La incidencia de sepsis neonatal temprana es de 1.48-4.08/1,000 nacidos vivos con una mortalidad de 8.7-10.5 % (Montero, R. ; Barbadillo, F . ; Anso, S . ; Marrero, . ; Carpintero I.; Sastre E. y Alonso B.: Sepsis neonatal por Streptococcus agalactiae. Qué hacer ?. An-Esp-Pediatr . 1998; 48 (3), p. 288-92; Juncosa, T.; Bosch, J.; Dopico, E.; Guardia, C; Lite, J. ; Sierra, M. ; Barranco, . ; Matas, L.; Sánchez, F . ; Sanfeliu, I. y Vinas, L. 1998. Infección neonatal por Streptococcus agalactiae. Estudio multicéntrico en el área de Barcelona. Enferm-Infecc-Microbiol-Clin. ; 16(7), p. 312-5). El agente causal de esta enfermedad es Streptococcus agalactiae mayormente, residente habitual del tracto genital femenino. Además surgen nuevos patógenos urinarios no conocidos como Streptococcus urinalis sp.nov., que aunque posee similitud con Streptococcus pyogenes y Streptococcus canis, resulta ser una nueva especie del género Streptococcus, cuyo nombre es Streptococcus urinalis sp.nov., cepa tipo CCÜG 41590T (Collins, M.D.; Hutson, R.A.; Falsen, E.; Nikolaitchouk, N.; La Claire, L. and Facklam, R.R. 2000. An unusual Streptococcus from human uriñe, Streptococcus urinalis sp. nov. Int J Syst Evol Microbiol; 50 Pt 3, p. 1173-1178). En la actualidad existen en el mercado una serie de medios de cultivo que están diseñados para aislar y/o detectar las diferentes especies del género Streptococcus . Entre ellos se pueden mencionar: Agar Sangre, Agar Sangre Columbra, Agar Triptona Soya con Sangre, Agar Cerebro Corazón, entre otros (Manual de Medios de cultivo OXOID. 1995. UNIPATH, España; MERCK Microbiology Manual. 2000. Merck KgaA, Darmstadt; Manual DIFCO de Bacteriología. 1984. Décima Edición, Francisco Soria Melguizo, S.A., Madrid).

Estos medios no selectivos no permiten la diferenciación entre las especies patógenas y no patógenas. Estos medios al no ser selectivos permiten el crecimiento de otras bacterias Gram positivas y Gram negativas que compiten con los estreptococos por los nutrientes. Por ejemplo: en el caso de Proteus, las cepas que desarrollan "velo" impiden el aislamiento de las colonias de interés.

En las formulaciones no se encuentran sustancias altamente nutritivas, por lo que es necesario añadir sangre, lo cual dificulta la manipulación, aumenta el riesgo de contaminación y no permite una prolongada vida útil del medio preparado, por ser ésta un componente biológico lábil.

El Medio CLED comercializado por las firmas anteriormente mencionadas, que es utilizado ampliamente en los laboratorios y es considerado como una de las mejores opciones, permite el crecimiento de todos los patógenos de la orina, dentro de los que se encuentran Streptococcus, y otros microorganismos Gram positivos, que no pueden ser diferenciados, porque poseen características culturales similares. El crecimiento de los Streptococcus es lento. Los enterococos [Enterococcus faecallSf Enterococcus faecium y Enterococcus avium) pueden ser confundidos con especies de Shigella.

En el Manual MERCK de Medios de cultivo (MERCK Microbiology Manual, 2000. Merck KgaA, Darmstadt) se describe un medio y un caldo para el Enriquecimiento selectivo de Streptococcus, que emplea la azida sódica y el sulfito de sodio como inhibidores de organismos Gram negativos. Se pueden mencionar como desventajas del medio su alta toxicidad por la presencia de la Azida sódica (ingrediente altamente tóxico) y la imposibilidad de diferenciar las distintas especies, pues es un caldo utilizado específicamente para promover el crecimiento microbiano.

La firma OXOID (Manual de Medios de cultivo, OXOID, 1995. UNIPATH, España) describe en su manual un medio selectivo para Streptococus que precisa de la adición de sangre y de un suplemento selectivo, que contiene sulfato de colistina y ácido oxolínico, pero además es indispensable su incubación en atmósfera de C02 al 5 %. Conjuntamente con las dificultades anteriormente mencionadas que provoca la adición de sangre, el uso de antibióticos como suplemento, dificulta la preparación del medio y no garantiza una real inhibición de la microbiota acompañante indeseada, debido a la aparición, cada vez con mayor frecuencia, de fenómenos de resistencia a los antibióticos, principalmente en los organismos Gram negativos.

Por demás, la necesidad de incubar el medio en atmósfera de C02 al 5 % hace engorrosa la técnica de aislamiento, al no estar éste dirigido a la identificación o diferenciación, por lo que es preciso utilizar medios o ensayos bioquímicos y serológicos para identificar las especies de Streptococcus de interés . En el Manual antes mencionado, se describe además la composición de un medio selectivo para Streptococcus/Staphylococcus con la adición de sangre estéril y el suplemento de antibióticos ácido nalidixico y sulfato de colistina. El empleo de esta formulación presenta las mismas desventajas mencionadas en el párrafo anterior, relativas a la utilización de sangre y antibióticos. ün medio selectivo para el aislamiento rápido de Streptococcus agalactíae y otros estreptococos relacionados con la mastitis bovina: Medio Edwards (Modificado) es descrito en el Manual OXOID de 1995. A éste se le adiciona sangre como suplemento y contiene sulfato de talio y cristal violeta como inhibidores. Este diagnosticador permite el crecimiento de Streptococcus agalactíae y otros Streptococcus, sólo utilizando como principio de identificación la hidrólisis de la esculina por los estreptococos del grupo D (colonias negras) y la respuesta negativa (colonias azules) del resto, por lo que no pueden ser diferenciados entre ellos. El cristal violeta empleado como agente selectivo, puede a su vez inhibir el crecimiento de los propios Streptococcus, además el sulfato de talio es considerado un compuesto altamente tóxico, nocivo para la salud humana y extremadamente dañino para el medio ambiente, lo que al mismo tiempo complica y hace muy engorroso el proceso de producción, preparación y el desecho del medio.

De manera similar el Medio Todd-Hewitt con gentamicina y ácido nalidixico, Agar Sangre con colistina y ácido nalidixico, Caldo Mueller-Hinton con 5 % de suero y amikacina (Bosch, J.; Murillo, S.; Rico, M. y Salgado, M. 1998. Utilidad de un medio selectivo disco-caldo para la detección de estreptococo del grupo B en la vagina. Enferm. Infecc. Microbiol. Clin. 16(2)) y el Medio Azida-Esculina-Acido oxolinico también se han empleado para la detección e identificación de especies especificas de Streptococcus con las desventajas ya mencionadas con anterioridad (Figueras, M.J; Inza, I.; Polo, F. and Guarro, J. 1998. Evaluation of the oxolinic acid-esculin-azide médium for the isolation and enumeration of faecal streptococci in a routine monitoring programme for bathing waters . Can. J. Microbiol. 44, p. 998-1002) .

Se han solicitado o patentado un grupo de invenciones dirigidas al cultivo de especies especificas de Streptococcus. Algunas de ellas se relacionan a continuación.

En la solicitud de patente EP 1 098 002 Al del 2001.05.09 (Dehydrated immediate reconstruction culture médium to identify group B Streptococci (Streptococcus agalactiae) by detection of their pigment) , De la Rosa Fraile, describe un medio deshidratado de reconstitución inmediata para identificar Streptococcus del grupo B, por la producción de su pigmento, cuya esencia consiste en añadir Sephadex 200 como agente gelificante al Medio Granada.

Las limitaciones de la citada invención se pueden resumir como sigue: ??? Sólo permite la identificación de Streptococcus agalactiae. *X* Se necesita adicionar suero de caballo. *Z* El medio preparado tiene una durabilidad de menos de 2 meses debido a la inestabilidad de los componentes, ?í* Se necesitan antibióticos como el metronidazol y la colistina añadidos como suplemento, lo que presenta deficiencias comunes a las ya descritas para las anteriores formulaciones. ?J* Al ser un medio semisólido, no se pueden observar las características culturales del microorganismo. La preparación es compleja, e incluye diferentes pasos, tales como: la preparación del medio basal, la adición del gel, la agitación para atrapar burbujas, la adición de los suplementos y la incubación en baño María.

Este mismo autor, años antes, desarrolló una formulación (De La Rosa Fraile, Manuel; Patente: ES 2088827, 1996.09.16. Culture médium for Streptococcus agalactiae which actives the formation of pigment by amylases and/or (G(&alpha 1-4) G) (n>2) glucooligosaccharides added as chemical compounds, as polysaccharide hydrolysates or generated in the same médium using enzymes and polysaccharides ) para la detección de Streptococcus agalactiae que contenía antibióticos en forma de suplemento, amílasas, malto-oligosacáridos, almidón para la producción del pigmento característico de este microorganismo. Dicha formulación es compleja de preparar, contiene enzimas lábiles adicionadas como suplemento y compuestos químicos complejos (malto-oligosacáridos ) , lábiles y su empleo en la industria de medios de cultivo es poco común .

Otro medio destinado a la identificación de Streptococcus del grupo B (hemolíticos ) , basado en la producción de un pigmento de color naranja, fue desarrollado por Tanaka Yoshihiro y Takahashi Hisayoshi (JP 9313171A2, 1997.12.09. Culture médium for group B hemolytic Streptococcus) . La composición del medio es: glucosa, piruvato de sodio, Peptona de carne, MgS04, MOPS-Fosfato, metotrexato y un agente antibacteriano (inactivo para Streptococcus del grupo B) . Con ayuda de esta formulación no pueden ser identificados otros estreptococos.

En la patente JP 59159797 (Kojima, H., et al. 1984.09.10.

Culture médium for selective proliferation of Streptococcus hemolyticus) , se describe un medio selectivo para la proliferación de Streptococcus hemolyticus, cuya composición contiene lípidos y ácidos grasos como agentes selectivos específicos para promover el crecimiento de esta especie. El empleo en este medio, del frijol de soya, lo hace complejo en su preparación, además, los agentes selectivos no inhiben el crecimiento de otras especies de Streptococcus de interés.

Deyloff John protegió un medio de cultivo para la diferenciación de Streptococcus mutans (US 4468456, 1984.08.28. Médium for differentiating Streptococcus mutans) compuesto por sales de fosfato, agar, Extracto de levadura, sacarosa y un indicador de pH. La preparación de producto es compleja ya que el mismo se compone de 2 capas agarizadas, a una de las cuales hay que añadirle una suspensión de Fosfato de calcio, de difícil disolución. El medio no es suficientemente inhibidor para otras especies de Gram positivos .

Otros medios y métodos han sido desarrollados para el cultivo de especies especificas de Streptococcus para obtener determinados metabolitos, o incluso, para el diagnóstico. Dichos productos en ningún caso brindan la posibilidad de diferenciación o detección de un número significativo de Streptococcus dentro del género. Entre de ellos se encuentran: Park et al. (US 5496726, 1996. Streptococcus zooepidemicus médium and process for preparing hyaluronic acid) e Inoue et al. (US 4 306 024, 1981.12.15. Process for cultivation of hemolytic Streptococcus pyogenes) .

Blareau Jean Pierre y colaboradores (Patente: FR 2723960-A1, 1994.08.31. Cultures de Streptococcus thermophilus a activite beta-galactosidase elevee, leur procede d'obtention, et leurs utilisations ) patentaron un medio de cultivo para Streptococcus thermophilus que contenía hidrolizados de proteínas lácteas, lactosa y extracto de levadura como únicos componentes. El medio no está dirigido al diagnóstico clínico, ni al control de la calidad de alimentos y además no es selectivo para la detección de Streptococcus .

Otro grupo de invenciones, por el contrario está dirigido al cultivo de varios géneros o especies de Streptococcus, y no permiten una diferenciación o identificación adecuada entre ellos, varios ejemplos se citan a continuación: En los últimos años, ha aumentado el empleo de sustratos cromogénicos o fluorogénicos incorporados a los medios tradicionales o en nuevos medios de cultivo, desarrollados específicamente para algunos microorganismos con exigencias metabólicas. Estas reacciones cromogénicas poseen ciertas ventajas sobre los medios convencionales, tales como: rapidez en la respuesta en el tiempo, elevada especificidad y sensibilidad como resultado de la degradación del sustrato por una enzima específica.

Manafi en numerosos artículos, menciona y abarca una revisión extensa de los sustratos cromogénicos y fluorogénicos más frecuentemente empleados como componentes de los medios de cultivo, además, explica sus posibles usos en la identificación de algunas especies de Streptococcus, por ejemplo en el artículo "New developments in chromogenic and fluorogenic culture media" (Manafi, M. 2000. International Journal of Food Microbiology 60, p. 205-218) se hace referencia a algunos de estos medios, los cuales presentan determinadas limitaciones o desventajas: ¦ Enterolert (IDEXX Laboratories Inc., Westbrook, Maine) y el Microtiter píate MUST (Sanofi, France) gue contienen un sustrato fluorogénico específico para la ß-D glucosidasa, diseñados para la detección de enterococos en agua, aunque no permite la diferenciación e identificación de otros estreptococos, además contienen un solo marcador de enzima específica fluorogénico.

¦ El agar fue diseñado para la enumeración de enterococos en agua de mar o agua fresca. Contiene ácido nalidixico, cicloheximida, trifeniltetrazolio y el sustrato indoxil la ß-D glucósido. Posee la desventaja que utilizar antibióticos como agentes selectivos, además de poseer un solo marcador enzimático que imposibilita la identificación de otros Streptococcus . Se precisan de largos periodos de incubación (24-48 horas) y la sensibilidad del medio no es elevada. ¦ La modificación de este medio reduciendo la concentración de trifeniltetrazolio y aumentando la concentración de indoxil ß-D glucósido redujo el tiempo de incubación a 24 horas pero no amplió las posibilidades diagnósticas del medio . ¦ Chromocult enterococci broth (CEB) (BBL) y el Readycult enterococci (MERCK) emplean como sustrato el 5-Bromo-4- cloro-3-indolil- D glucopiranósido para identificar Enterococcus y azida sódica para inhibir otros microorganismos. En el medio aparecen falsos positivos, tales como: Leuconostoc, Lactococcus lactis y Aeromonas sp. No se identifican otros estreptococos y contiene ingredientes tóxicos.

El medio CHROMagar Orxentation (BBL) (Carricajo, A.; Boiste, S.; Thore, J.; Aubert, G.; Gille, Y and Freydiere, AM. 1999. Comparative evaluation of five chromogenic media for detection, enumeration and identification of urinary tract pathogens . Eur J Clin Microbiol Infect Dis 18(11), p. 796-803; Samra, Z . ; Heifetz, M . ; Talmor, J. ; Bain, E. and Bahar, J. 1998. Evaluation of use of a new chromogenic agar in detection of urinary tract pathogens . J Clin Microbiol . , 36(4), p. 990-994; Hengstler, KA; Hammann, R. and Fahr, A . 1998. Evaluation of BBL CH OMagar orientation médium for detection and presumptive Identification of urinary tract pathogens. J Clin Microbiol. 36(5), p. 1464; Merlino, L; Siarakas, S.; Robertson, GJ.; Funnell, GR.; Gottlieb, T and Bradbury, R. 1997. Evaluation of CHROMagar Orientation for differentiating and presumptive identification of gram-negative bacilli and Enterococcus species. J Clin Microbiol 35(8), p. 2190) permite la identificación simultánea presuntiva de Gram positivos, Gram negativos y levaduras. Dentro de los microorganismos que se pueden identificar se incluyen los estreptococos (grupos D,B y C) , aunque los grupos B y C no pueden ser diferenciados, por lo que se requieren pruebas bioquímicas adicionales para su identificación. La gran diversidad de colores hace en extremo difícil la interpretación de los resultados y en ocasiones se requiere prestar una atención especial a la morfología, tamaño y características de las colonias (brillo u opacidad) lo que dificulta aún más la interpretación de los resultados. La similitud de colores de algunos estreptococos con microorganismos de los géneros Klebsiella, Enterobacter y Citrobacter, obliga a realizar ensayos adicionales que requieren más horas de ensayo. También es de destacar que el medio es sensible a la luz, lo que altera el color original, además la incubación y lectura debe realizarse de inmediato.

El medio UTI (OXOID Inc.) diseñado para la identificación presuntiva y diferenciación de microorganismos causantes de infecciones del tracto urinario, contiene el sustrato cromogénico x-glu para la identificación de enterococos. Esta formulación presenta como desventajas que otros estreptococos no pueden ser identificados, crecen otros microorganismos Gram negativos que generalmente se encuentran en infecciones urinarias en concentraciones superiores a Streptococcus y su uso esta restringido a muestras de orina.

En 1999, Alain Rambac patentó un método para la identificación de microorganismos con al menos dos sustratos cromogénicos (US 5 962 251, 1999.10.05 "Method for the identification of microorganisms with at least two chromogens") . El medio prevé el empleo de agar, peptona, cloruro de sodio, extracto de levadura, extracto de carne y carbohidratos (glucosa) , asi como sustratos cromogénicos derivados del indoxilo (bromo-indoxilo, cloro-indoxilo, di-cloro-indoxilo, cloro-bromo-indoxilo, entre otros) . Su mayor utilidad es para la demostración de presencia o ausencia de levaduras del género Candida, especialmente Candida albicans y Candida tropicalis, aunque microorganismos de otros géneros, tanto Gram positivos como Gram negativos crecen con diferentes tonalidades de color, entre los que se encuentran los estreptococos. Sin embargo la diversidad de organismo que se desarrollan, al igual que en el caso anterior, impide una adecuada interpretación de los resultados; hay una gran competencia por los sustratos, por lo que los estreptococos pueden encontrarse inhibidos y la diferenciación entre otras especies de Streptococcus (no-grupo D) es imposible.

Otra serie de medios cromogénicos desarrollados para la detección, enumeración e identificación de patógenos urinarios permiten la identificación específicamente de Streptococcus del grupo D tales como: CPS ID2 (bioMerieux, France) , Uriselect 3 (Sanofi Diagnostic) y Rainbo UTI (Biolog, USA) (Carricajo et al., 1999. Comparative evaluation of five chromogenic media for detection, enumeration and identification of urinary tract pathogens. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 18(11), p. 796-803; Navarro et al., 1996. Evaluation of chromogenic médium CPS ID2 (bioMerieux) in uriñe cultures. Enferm Infecc Microbiol Clin Apr; 14(4), p. 215-9; Reisner and Austin, 1997. Evaluation of CPS ID2 chromogenic agar as a single médium for uriñe culture. Diagn Microbiol Infect Dis Jul; 28(3), p. 113-7; Willinger and Manafi, 1995. Evaluation of a new chromogenic agar médium for the identification of urinary tract pathogens. Lett Appl Microbiol May 20(5), p. 300-2) y otros (Bochner B. US 5 464 755. 1995.10.07. Microbiological médium and method of assay; Yagupsky et al., 2000. Clinical evaluation of a novel chromogenic agar dipslide for diagnosis of urinary tract infections. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 19, p. 694-698).

Chen, Chun-Ming y colaboradores solicitaron una patente de un método y medio para la detección de enterococos vancomicina-resistentes (Chen, Chun-Ming; et al. Patent Application 20020132285-A1. 2002.09.19. Method and médium for detecting vancomycin-resistant enterococcus ) . La invención consiste en la utilización de un nutriente, que al ser metabolizado por los microorganismos produce una reacción, en este caso la enzima ß-D-glucosidasa y la pirrolidonil-arilamidasa. Se debe señalar que el medio es incapaz de identificar a los enterococos sensibles a la vancomicina, así como a otras especies de Streptococcus . Su preparación es engorrosa, pues necesita la adición de antibióticos como suplemento y la vancomicina no inhibe a algunas bacterias Gram negativas que pueden crecer en el medio, además, se requieren pruebas adicionales para la identificación hasta especie .

En la solicitud de patente de Estados Unidos 20020086278-A1. 2002.06.04, Gosnell y colaboradores (Chromogenic media containing blood or hemin) describen un medio que contiene sangre o hemina y además sustratos cromogénicos tales como: magenta, x-glucósido, x-glucurónido, Mag-Fosfato, entre otros . El medio permite el crecimiento y la identificación de diferentes especies por las características morfológicas, la aparición de las diversas tonalidades de colores, fluorescencia y las reacciones hemolíticas . La invención puede ser considerada como el prototipo más cercano. El medio presenta las siguientes desventajas: • La presencia de sangre o hemina entorpece la correcta interpretación de las reacciones cromogénicas, en una composición que no inhibe a las bacterias Gram negativas, dentro de los cuales se encuentra una gran biodiversidad de microorganismos con actividad enzimática común con la del género Streptococcus. · El tiempo de vida útil del medio es limitado, por la presencia de componentes biológicos (sangre o hemina) , y su preparación es engorrosa. • Al no ser un medio selectivo, pueden desarrollarse otros géneros Gram positivos y Gram negativos que compiten por los nutrientes, lo que conlleva a que los microorganismos de interés (Streptococcus) no crezcan adecuadamente. • La utilización de sangre y hemina como suplemento hace compleja la preparación de este diagnosticador y aumenta el riesgo de contaminación del medio. • Se precisa de pruebas bioquímicas adicionales para la ulterior diferenciación de Streptococcus, lo que conlleva a un período adicional de tiempo para lograr una adecuada identificación de los gérmenes de interés. Específicamente se necesita realizar una prueba de PYR adicional para diferenciar Streptococcus pyogenes de los Streptococcus del grupo D (Enterococcus) . • Para la identificación de algunos microorganismos, es preciso tener en cuenta la morfología, el tamaño y otras características de las colonias, que son muy variables porque dependen del tipo de muestra, concentración inicial del microorganismo y microbiota acompañante, entre otros factores . • La posibilidad de que crezcan microorganismos de otros géneros tales como: Proteus, cuya característica fundamental es la formación de un velo en el medio, hace imposible la identificación de las colonias. • Otros microorganismos con capacidad hidrolítica sobre las proteínas pueden hidrolizar la albúmina e interferir en la identificación. • Para la preparación del medio, se plantea que los sustratos cromogénicos pueden ser adicionados al medio fresco, preparado asépticamente, ya que algunos de ellos son lábiles a altas temperaturas, lo que hace compleja su preparación.

• Las soluciones de los cromogénicos, en algunos casos, forman precipitados insoluoles,- siendo más inestables después de una semana, lo que limita la vida útil del diagnosticador . · Cuando se utiliza como base el Agar Chocolate, el medio se incuba en atmósfera de CO2 al 5%. • Algunos sustratos cromogénicos necesitan ser disueltos en dimetil sulfóxido lo que hace engorrosa la preparación del medio . · En algunos casos (Ejemplo 3) los estreptococos del grupo D toman igual color que otros microorganismos (azul) , entre los que se encuentran: Candida albicans, Gram negativos y Staphylococcus epidermidis. • Los sustratos especialmente el magenta, oscurecen el color de los medios con sangre después de la incubación, lo que reduce la claridad de la lectura y la apariencia de las reacciones hemoliticas' . • Los sustratos cromogénicos que dan coloración a las colonias de púrpura, rojo y magenta no contratan adecuadamente con el fondo rojo del medio.

Divulgación de la invención El objetivo de la presente invención consiste en proveer un medio selectivo para el aislamiento y detección de especies del género Streptococcus, posibilitando la diferenciación de Streptococcus de importancia clínica, tales como: Streptococcus agalactiae, Streptococcus pyogenes y Streptococcus del grupo D [Enterococcus) , en períodos tempranos de cultivo (2-24 horas) y con una elevada sensibilidad y especificidad analítica.

La novedad de la invención propuesta consiste en una combinación de bases nutritivas especialmente seleccionadas en cantidades de 15 a 58 g/1, que garantizan un contenido de nitrógeno total, fundamentalmente derivado de las proteínas, entre 10 y 14 %, una mezcla especialmente diseñada de inhibidores de microorganismos Gram negativos en cantidades de 0,55 a 1,63 g/1; una mezcla de sustratos cromogénicos y/o fluorogénicos, degradables por al menos una enzima de cada especie, en cantidades de 0,3 a 1,5 g/1 y compuestos indicadores de la actividad desaminasa, en cantidades de 1 a 3 g/1.

La mezcla original de bases nutritivas está compuesta por extractos e hidrolizados de diferentes orígenes, específicamente seleccionados entre: • Hidrolizado de sangre bovina de 5 a 10 g/1 • Extracto de corazón de res de la 12 g/1 • Hidrolizado enzimático de músculo de corazón de res de 1 a 5 g/1 • Hidrolizado enzimático de proteínas lácteas de 5 a 20 g/1 • Hidrolizado enzimático de proteínas del frijol de Soya de 2 a 15 g/1 • Hidrolizado enzimático de tejido animal de 1-5 g/L · Autolizado o hidrolizado de levadura Sacharomyces cerevisiae de 2 a 15 g/1 La peculiar mezcla de inhibidores nunca descrita incluye una combinación de : Acetato de talio de 0,55 a 1,6 g/1 Acido nalidixico de 0,005 a 0,030g/l Otro aspecto singular de la invención consiste en el empleo de la mezcla de sustratos cromogénicos y fluorogénicos que revelan la actividad fosfatasa, glucosidasa y glucuronidasa para diferenciar las diversas especies de Streptococcusr la cual contiene: para-nitrofenilfosfato sal disódica (PNP), de 0,2 a 0,8 g/L; x-glu (5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-Dglucopiranósido, Mu-glu ( -metilumbeliferil ß?-glucopiranósido) , Salmon-glu (6-cloro-3~indolil- ß-D-glucopiranósido) de 0,05 a 0,4 g/L y x-gluc (5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-D-glucurónido sal de ciclohexilamonio) , Magenta-Gluc (5-bromo-6-cloro-3-indolil- -D-glucurónido sal de ciclohexilamonio) y MUG (trihidrato de 4-metilumbeliferil ß-D-glucurónido) de 0,05 a 0,2 g/L.

Estas sustancias cromogénicas se combinan de manera muy original, para garantizar la aparición de colores o fluorescencias diferentes para cada especie a detectar, siendo estas: a) PNP + x-glu + Magenta-gluc ó MUG b) PNP + Salmon-glu + x-gluc ó MUG c) PNP + MU-glu + Magenta gluc ó x-gluc Otro aspecto singular de la invención, consiste, en que se adicionan varios compuestos que indican la actividad desaminasa en el medio, como son: sales de metales trivalentes, preferiblemente citrato férrico-amónico en cantidades de 0,5 a 1,0 g/1 y aminoácidos aromáticos, preferiblemente la fenilalanina y el triptófano, en cantidades de 1,0 a 2,0 g/1.

A la composición antes descrita se incorpora agar de 10,0 a 14,0 g/L y se obtiene un medio que permite observar los caracteres culturales de los organismos de interés.

El medio formulado presenta un valor del pH de 7 a 7,4 y se emplea en concentraciones de 25 a 80 g/L de agua.

Con ayuda del medio, por primera vez, se pueden aislar y detectar de manera exclusiva las diferentes especies de Streptococcus, fundamentalmente las patógenas al hombre, basándose solamente en la aparición de colonias de colores específicos para determinados géneros, y en cambios en el color del medio. Es de resaltar que por primera vez se provee un medio de cultivo selectivo que posibilita al unísono, diferenciar a los estreptococos del grupo D (enterococos ) del resto de los estreptococos, y a estos últimos entre sí. Como ejemplo se pueden señalar: Streptococcus agalactlae y Streptococcus pyogenes, que crecen sin la presencia de otras especies de bacterias Gram negativas y de otras especies de Gram positivas inhibidas .

Las ventajas del medio propuesto en la siguiente invención consisten en que: • Por primera vez se posibilita la diferenciación entre las especies patógenas, y entre estas y la mayoría de las no patógenas del género Streptococcus.

El medio es altamente selectivo para Streptococcus, inhibe la mayoría las especies de bacterias Gram negativas, con excepción de Proteus mirabilis ATCC 7002 que crece en el medio muy inhibido, pero a altas concentraciones torna el medio a un color diferente al de los estreptococos. Además, en él, sólo se desarrollan muy pocas especies de otros organismos Gram positivos, que se encuentran inhibidos, y en el caso de existir un crecimiento de ellos escaso en el medio, toman una coloración que no interfiere con el crecimiento abundante de los microorganismos de interés . La compleja y novedosa mezcla de bases nutritivas que contiene el medio, garantiza la presencia de aminoácidos, péptidos, polipéptidos , proteosas y peptonas de los más disímiles orígenes y composición, y de manera inesperada, posibilitan un crecimiento abundante de las especies de interés y permiten la exclusión de sustancias lábiles como la hemina y la sangre . De especial relevancia y novedad resulta la inclusión del hidrolizado enzimático de sangre en la mezcla antes mencionada, que garantiza la presencia en el medio de sustancias derivadas de la sangre o de sus fracciones necesarias para el crecimiento de Streptococcus, sin entorpecer la identificación. Por otra parte las proteínas de la sangre ya digeridas no le restan estabilidad al medio . Los estreptococos en el medio, al contar con los nutrientes suficientes para su rápido crecimiento, y ante la ausencia de otros organismos competidores, se desarrollan más rápidamente y pueden ser aislados e identificados en un periodo máximo de incubación de 6 a 24 horas . La sensibilidad y especi icidad son elevadas, no pueden ser confundidos con bacterias Gram negativas tales como: Shigella y Escherichia col!, pues estos no crecen en el medio, y las pocas especies de Gram positivos que logran desarrollarse en el medio (Staphylococcus xylosus y Staphylococcus saprophyticus) , se encuentran casi totalmente inhibidas y además no pueden confundirse con el resto porque toman una coloración diferente. De alguna cepa presenta crecimiento similar a Streptococcus, puede diferenciarse realizando directamente en la placa la prueba de catalasa. En la presente invención no se añaden sustancias altamente tóxicas ni contaminantes del medio ambiente, por lo que el medio se puede producir a escala industrial y preparar en el laboratorio, bajo condiciones adecuadas y propias de la actividad. La efectividad de los inhibidores contemplados en la formulación evita el uso de antibióticos lábiles, lo que ayuda a que la preparación del medio sea sencilla y además no existan errores en 1 a identif cación por fenómenos de resistencia a los antimicrobianos. La combinación de inhibidores, la concentración a la que se encuentran en el medio y su relación con los nutrientes no inhibe a ninguna especie de Streptococcus, lo que amplia el espectro diagnóstico del medio como nunca antes, pero específicamente para este género. Al detectarse y diferenciarse adecuadamente, los estreptococos de interés, con alta sensibilidad y especificidad no es necesario recurrir a la realización de pruebas bioquímicas adicionales, lo que posibilita tener un diagnóstico temprano. La preparación de este diagnosticador es en extremo sencilla pues en algunos casos, puede no esterilizarse en autoclave el medio, y en otros, sólo se adiciona un suplemento . La vida útil del medio preparado es considerable, ya que contiene inhibidores de la mayoría de los contaminantes ambientales y no contiene sustancias lábiles (como la hemina, sangre y antibióticos) . La identificación de las bacterias de interés, al realizarse sólo por las características culturales (color de las colonias y del medio) , excluye la necesidad de observar a profundidad características morfológicas de las colonias, facilitando la interpretación de los resultados por un personal entrenado pero no especializado. El uso de más de un marcador enzimático para la diferenciación de las diversas especies del género Streptococcus aumenta la especificidad y la sensibilidad del diagnosticador. La formulación reportada en la solicitud posibilita preparar el medio a diferentes concentraciones para múltiples presentaciones, por ejemplo: a concentración simple en medio agarizado, a doble concentración para ser empleado en las técnicas de filtración por membrana, o en forma de caldo, e incluso a una concentración mayor para sistemas miniaturizados . Con este medio se logra sustituir el empleo de diferentes medios tradicionales o cromogénicos utilizados en la identificación de diferentes especies dentro del género Streptococcus . • La formulación propuesta posibilita su empleo en la búsqueda de Streptococcus en muestras clínicas o veterinarias, de aguas y otros elementos del ambiente así como en alimentos . • Se logra el aislamiento e identificación simultánea en un solo paso, con el consecuente ahorro de tiempo, de recursos y personal.

Descripción detallada de la nvención Para la definición de la composición del medio, los componentes utilizados en la preparación fueron preferiblemente sólidos. La descripción de los pasos a seguir para la preparación de los mismos se presenta a continuación: La mezcla de bases nutritivas, cuyo contenido de nitrógeno total se encuentra entre 10 y 14 %, se tamiza para lograr uniformidad en el tamaño de las partículas. Dichos ingredientes de origen protéico están en una cantidad de 15 a 58 g/1, específicamente de Hidrolizado de sangre bovina de 5-10 g/1, Extracto de corazón de res de 1- 12 g/1, Hidrolizado enzimático de músculo de corazón de res de 1-5 g/1, Hidrolizado enzimático de proteínas lácteas de 5-20 g/1, Hidrolizado enzimático de proteínas del frijol de Soya de 2-15 g/1, Hidrolizado enzimático de tejido animal de 1-5 g/1, Autolizado o hidrolizado de levadura Sacharomyces cerevislae de 2- 15 g/1. Los agentes selectivos se seleccionan entre: acetato de talio de 0,55 a 1, 6 g/1 y ácido nalidíxico de 0,05 a 0, 030g/l. De igual forma son tamizados, quedando listos para ser mezclados y homogenizados con el resto de los componentes. Los compuestos cromogénicos y fluorogénicos para detectar la actividad glucosidasa, fosfatasa y glucuronidasa en cantidades de 0,3 a 1,5 g/1, son premezclados, además se pueden molinar y tamizar previo a su homogenización de manera tal que pesando la suma de la cantidad de cada componente en la formulación, se logre una distribución adecuada de cada uno. Los sustratos cromogénicos y fluorogénicos son seleccionados en dependencia del objetivo del medio, entre: el p-nitrofenilfosfato sal disódica, de 0,2 a 0,8 g/1, x-glu (5-bromo-4-cloro-3-indolil~p-D-glucopiranósido) , Mu-glu (4-metilumbeliferil ß-D-glucopiranósido) , Salmon-glu (6-cloro-3-indolil- ß-D-glucopiranósido) de 0,05 a 0,4 g/1 y x-gluc (5-bromo-4-cloro-3-indolil~p-D-glucurónido sal de ciclohexilamonio) , Magenta-gluc (5~Bromo-6-cloro-3-indolil-ß?-glucurónido sal de ciclohexilamonio) y MUG (trihidrato de 4-metilumbeliferil ß-D-glucurónido) de 0,05 a 0,2 g/1.

La conformación de la mezcla de sustancias cromogénicas y fluorogénicas degradables por al menos una enzima de cada especie fue realizada, en combinaciones tales, que garantizan la aparición de colores o fluorescencia diferentes para cada especie como se describe a continuación: a) PNP + x-glu + Magenta-gluc ó MUG b) PNP + Salmon-glu + x-gluc ó MUG c) PNP + Mu-glu + Magenta-gluc ó x-gluc El agente gelificante, preferiblemente agar, de dureza entre 400 y 700 g/cm2, se utiliza en cantidades entre 10,0 a 14,0 g/1, específicamente para el medio sólido, se seca y tamiza antes de agregarse al medio.

Todos los componentes antes mencionados, así como la premezcla, se unen y homogenizan hasta lograr un contenido uniforme con un pH entre 7,0 y 7,4. Dicha mezcla se envasa en frascos herméticamente cerrados, protegidos de la luz, manteniéndolos a temperatura ambiente.

El polvo se adiciona en cantidades de 30 a 80 g/1, de esta manera se restituye y se obtiene la suspensión de la composición.

La composición puede prepararse a escala de laboratorio, pesando los componentes por separado dentro de un recipiente y manteniendo las proporciones antes mencionadas. Se adiciona posteriormente el líquido sobre la mezcla de polvos poco a poco, hasta lograr la completa disolución. La suspensión se agita y se deja reposar al menos 10 minutos. Si se prepara el medio agarizado, éste puede o no esterilizarse previo a la adición del p-nitrofenilfosfato sal disódica. Siempre que se hayan tomado precauciones en la preparación, es suficiente el calentamiento hasta ebullición, pues el medio es altamente inhibidor de los microorganismos ambientales que pudieran contaminarlo. De lo contrario, el medio se esteriliza a 115 °C durante 10 minutos y con posterioridad, después de enfriarlo hasta 45-50 °C se le adiciona el PNP filtrado a través de un filtro esterilizante. Para el caso del medio líquido, siempre se esteriliza en autoclave y se añade el suplemento estéril. Una vez el medio listo se distribuye en el envase final de ensayo.

En dependencia de la consistencia del medio (sólido o liquido) se emplean diferentes métodos de inoculación.

Una vez inoculados, se incuban a temperatura de 30 a 37 °C por al menos 2 a 6 horas en caso del medio liquido y de 18 a 24 horas para el medio sólido.

La lectura de los resultados se realiza en el caso del medio sólido, observando el color de las colonias aisladas en la superficie y del medio. Para el medio liquido sólo se observa el cambio de coloración del medio y la fluorescencia. De manera que se puede diferenciar los estreptococos del grupo D del resto de las especies de este género. Los estafilococos, por lo general, no se desarrollan en el medio o se encuentran muy inhibidos, observándose como colonias pequeñas incoloras {Staphylococcus saprophyticus) o de colores diferentes a los estreptococos, que no interfieren en la identificación de los organismos de interés.

Los enterococos se observan de color rosado, azul o fluorescentes según la combinación de los sutratos empleados, mientras que en dependencia de la combinación utilizada los estreptococos se observan amarillo, amarillo^ verdoso, verde, magenta, azules o fluorescentes, siempre que se utilice un sutrato diferente que el empleado para revelar la presencia de enterococos.

EJEMPLOS DE REALIZACION: Ejemplo No. 1 Una serie de mezclas de bases nutritivas fueron ensayadas como componentes nutricionales en la formulación. En los experimentos se diseñaron 3 variantes, cuya composición aparece en la tabla 1. Los ingredientes se reconstituyeron en 100 mL de agua y se procedió a prepararlos según la descripción detallada de la presente invención.

La evaluación de la capacidad de promoción del crecimiento se realizó con cepas de colección en comparación con el medio de referencia (Caldo de Enriquecimiento selectivo de Estreptococos, Merck, lote: 86444327) . En cada tubo se inoculó 0,1 mL de la solución estandarizada al 50 % de transmitancia de cada microorganismo.

Las curvas de crecimiento aparecen en las figuras 1, 2 y 3.

Los resultados de la promoción del crecimiento de los estreptococos fueron altamente satisfactorios. En el caso de Streptococcus agalactiae se observó que las 3 composiciones características de la presente invención promovieron con mayor intensidad el crecimiento durante las 8 primeras horas con respecto al medio control e incluso la variante 1 promovió el crecimiento de manera muy superior hasta las 9 horas .

En el caso de Streptococcus faecalis se observó una mayor aceleración del crecimiento en las 4 primeras horas, en las variantes experimentales, con respecto al control, y en el caso de Streptococcus pyogenes, a partir de las 6 horas el crecimiento resultó significativamente superior en las nuevas composiciones propuestas.

Tabla 1. Composición de bases nutritivas de las diferentes variantes experimentales Ejemplo No. 2 Se preparó la composición con los ingredientes según ejemplo 1, pero pesados por separado dentro de un matraz de Erlenmeyer. Como agentes promotores del crecimiento y marcadores enzimáticos se utilizaron los siguientes ingredientes : En la formulación no se empleó agar. Se añadió a la mezcla de ingredientes sólidos 100 mL de agua desionizada y se procedió a la preparación de la composición según se expone en la descripción detallada.

Se inocularon cepas de colección de Streptococcus pyogenes ATCC 19615, Streptococcus agalactiae ATCC 12386, Enterococcus faecalls ATCC 29212, Enterococcus faecalis ATCC 19433, Enterococcus faecium ATCC 6056. Dichas cepas se inocularon de forma directa una solución estandarizada al 50 % de transmitancia en los tubos de cada una.

Se logró a las 18 horas que el medio se tornará azul-verdoso en el caso de Enterococcus faecalis ATCC 29212 y 19433. La cepa de Enterococcus faecium mostró coloración azul oscuro, Streptococcus agalactiae se tornó verde y Streptococcus pyogenes se observó de color amarillo-verdoso.

Los resultados muestran la rapidez de la respuesta de los microorganismos en el tiempo y la posibilidad de diferenciar los enterococos (grupo D) del resto de los estreptococos al tornarse de una coloración entre verde-azul a azul y los estreptococos, tales como: Streptococcus pyogenes y Streptococcus agalactiae mostrar una coloración amarillo verdoso .

Para comprobar la certeza de la selección del sustrato cromogénico x-glu se preparó un medio cuya composición fue similar a la descrita anteriormente, con la diferencia de que se empleó la esculina. La cantidad utilizada fue de 0,1 g/lOOmL, además se añadieron sales de hierro en una concentración de 0,05 g/lOOmL.

Estos ingredientes fueron pesados por separado en un matraz de Erlenmeyer, posteriormente se añadió 100 mL de agua desionizada y se procedió a la preparación.

Se inocularon cepas de colección de Streptococcus pyogenes ATCC 19615, Streptococcus agalactiae ATCC 12386, Enterococcus faecalis ATCC 29212 y algunas cepas aisladas de muestras clínicas (4 enterococos y 4 ß hemolíticos) . Dichas cepas se inocularon de forma directa una solución estandarizada al 50 % de transmitancia en los tubos de cada una.

La respuesta obtenida tanto para Enterococc s faecium como Enterococcus faecalis fue un cambio de coloración del medio a negro, lo que enmascara las demás reacciones enzimáticas a las cuales algunas especies pueden ser positivas.

En cuanto a Streptococus pyogenes y Streptococcus agalactiae ambas tornaron el medio de color verde olivo. Las 4 cepas aisladas de enterococs dieron de color negro, al igual que 3 de los estreptococos ß hemolíticos . Solamente un ß hemolítico se observó de color verde olivo al igual que Streptococus pyogenes y Streptococcus agalactiae.

Los resultados obtenidos fueron apreciados de forma temprana, sin embargo la coloración negruzca como resultado de la hidrólisis de la esculina limita la identificación, pues imposibilita la lectura del resto de las reacciones .

Como conclusión el experimento permitió comprobar lo aceptado de la inclusión del x-glu como ingrediente en la formulación del medio, y no el uso de esculina.

Ejemplo No. 3 La composición del medio fue preparada según el ejemplo 2, con la diferencia de que se aumentó la concentración de los componentes nutritivos y los marcadores enzimáticos. Se pesaron por separado dentro de un matraz de Erlenmeyer las siguientes cantidades : COMPONENTE g/lOOmL Hidrolizado enzimático de proteínas 1, 94 lácteas Autolizado o hidrolizado de levadura 0, 64 Saccharomyces cerevisiae Extracto de corazón de res 0,48 Hidrolizado enzimático de proteínas del 0, 64 frijol de soya P-nitrofenilfosfato sal disódica 0, 08 x-glu ( 5-bromo-4-cloro-3-indolil~ -D- 0, 04 glucopiranosido) Se añadió a la mezcla de ingredientes sólidos 100 mL de agua desionizada y se procedió a la preparación.

Se inocularon cepas de colección, tales como: Streptococcus pyogenes ATCC 19615, Streptococcus agalactias ATCC 12386, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Enterococcus faecalis ATCC 19433, Enterococcus faecium ATCC 6056 y algunas cepas aisladas: Enterococcus avium (aislado). Dichas cepas se inocularon de forma directa en los pocilios de un juego de microtubos de polipropileno (Módulo 250 pp, NUNC, lote: 046247) añadiendo 0,1 mL de una solución estandarizada a la escala 3,0 de McFarland en 0,1 mL de medio.

A las 2 horas se observó cambios de coloración del medio a azul-verdoso para Enterococcus faecalis ATCC 29212, azul para Enterococcus faecalis ATCC 19433, Enterococcus avium se tornó amarillo-verdoso, Enterococcus faecium de color azul claro, Streptococcus pyogenes y Streptococcus agalactiae se mostraron de color amarillo intenso.

La respuesta se mantuvo en el tiempo (hasta las 6 horas) . Los resultados demostraron la rapidez en la respuesta a las reacciones enzimáticas, y la posibilidad de desarrollar una prueba rápida para la identificación de especies del género Streptococcus .

Ejemplo No. 4 La composición de los ingredientes se preparó según el ejemplo 2, con la adición de un agente gelificante (agar) en una concentración de 6,5 g/500 mL. Se pesaron los componentes por separado en un matraz de Erlenmeyer y se añadió a la mezcla de ingredientes sólidos 500 mL de agua desionizada. Posteriormente se procedió a la preparación según el ejemplo 1. Se inocularon cepas de colección, tales como: Streptococcus pyogenes ATCC 19615, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Enterococcus faecalis ATCC 19433, Enterococcus faecium ATCC 6056. Se inocularon por estrías en la superficie del gel, hasta lograr colonias aisladas.

Se logró a las 24 horas una coloración verde-claro de las colonias con cambio del medio a amarillo de Streptococcus pyogenes. Las cepas de Enterococcus faecalis ATCC 29212 y 19433 mostraron características culturales similares, se tornaron de una coloración azul con un pequeño halo azul alrededor. En cuanto a Enterococcus faecium, las colonias se observaron más pequeñas que el resto de los enterococos, de color azul con un pequeño halo azul alrededor.

Ejemplo No. 5 Se preparó la composición del medio pesando los ingredientes por separado en un matraz de Erlenmeyer según el ejemplo 4, con la diferencia de que los marcadores enzimáticos se encuentran en una concentración menor (0,2 g/1 de p-nitrofenilfosf to sal disódica y 0,1 g/1 de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-D-glucopiranósido) . El método de preparación fue el descrito en el ejemplo 1.

Se inocularon por estrias en la superficie del gel, cepas de colección de: Streptococcus pyogenes ATCC 19615, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Enterococcus faecium ATCC 6056, Staphylococcus aureus ATCC 25923 y una cepa aislada de Enterococcus avium.

La lectura realizada a las 24 horas de la evaluación de la composición con las cepas de colección se observó según se muestra en la tabla No. 2.

Tabla No. 2 Características de crecimiento y de las colonias de los microorganismos en el medio sólido. Cepa Características de las colonias y del medio Streptococcus pyogenes ATCC Colonias verdosas con cambio 19615 de coloración del medio a amarillo Enterococcus faecalis ATCC Colonias azules 29212 Enterococcus faecium ATCC 6056 Colonias azules Staphylococcus aureus ATCC Colonias blancas con cambio de 25923 coloración del medio a amarillo Enterococcus avium (aislada) Colonias azules Ejemplo No. 6 La composición fue preparada con los ingredientes según el ejemplo 2, con la diferencia de que el sustrato cromogénico x-glu (5-bromo-4-cloro-3-indolil- -D-glucopiranósido) fue sustituido por Mu-glu ( 4-metilumbeliferil ß-D-glucopiranósido) en una concentración de 0,05 g/1. El método de preparación fue similar al ejemplo 2.

En la evaluación se emplearon cepas de colección de: Enterococcus faecalis ATCC 29212, Enterococcus faecium ATCC 6056, Streptococcus lactis ATCC 11454 y una cepa aislada de Enterococcus avium. Dichas cepas se inocularon de forma directa en los pocilios de un juego de microtuboo de polipropileno (Módulo 250 p, NUNC, lote: 046247) añadiendo 0,1 mL de una solución estandarizada a la escala 2,0 de McFarland en 0,1 mL de medio.

Se logró a partir de las 2 horas detectar el crecimiento de los microorganismos ensayados y la fluorescencia de color azul bajo luz ultravioleta (365 nm) de Enterococcus faecalis y Enterococcus faecium.

La lectura a las 6 horas mostró que todas las cepas inoculadas poseían actividad glucosidasa, ya que respondieron con una fluorescencia de color azul al ser alumbradas con luz ultravioleta .

Se demostró que es posible la utilización del sustrato fluorogénico u-glu ( 4-metilumbeliferil ß-D-glucopiranósido) , pues la detección de los estreptococos (enterococos) fue rápida .

E emplo No . 7 Se preparó la composición del medio pesando los ingredientes por separado en un matraz de Erlenmeyer. Fueron ensayadas 2 mezclas de inhibidores en el medio sólido. A continuación se describe la composición de agentes promotores del crecimiento, marcadores enzimáticos e inhibidores utilizados: COMPONENTE g/200 mL VI V2 Autolizado o hidrolizado de levadura 1,944 1, 944 Saccharomyces cexevisiae Extracto de corazón de res 0, 648 0, 648 Hidrolizado enzimático de proteínas lácteas 0,486 0,486 Hidrolizado enzimático de proteínas del 0, 648 0, 648 frijol de soya P- Nitrofenilfosfato sal disódica 0, 04 0, 04 Salmón- glu ( 6-cloro-3-indolil~ p-D- 0, 02 0, 02 glucopiranósido) x-gluc ( 5-bromo-4-cloro-3-indolil- 0, 02 0,02 Dglucurónido sal ciclohexilamonio) Acetato de talio 0, 12 0,12 Acido nalidixico 0, 003 0, 002 Agar 2,6 2, 6 Se procedió a la preparación según el ejemplo 1. El método de inoculación empleado fue por estrias en la superficie del gel. En la evaluación se utilizaron cepas de colección de: Proteus mirabilis ATCC 7002, Proteus mirabilis ATCC 12433, Staphylococcus epidermídis ATCC 12228, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus xylosus ATCC 29971, Staphylococcus saprophyticus ATCC , Enterococcus faecium ATCC 6056, Streptococcus agalactiae ATCC 12386, Streptococcus faecalis ATCC 29212 y la cepa aislada de Enterococcus avlum.

Se realizó la lectura a las 24 horas, los resultados del comportamiento de los microorganismos en el medio se muestran en la tabla No. 3. Es de destacar que los resultados obtenidos en ambas variantes (VI y V2) fueron similares.

Tabla No. 3. Características del medio y de las colonias Cepa Crecimient Color del medio y de o las colonias Streptococcus agalactias + Colonias verde-azules ATCC 12386 con cambio de coloración del medio a amarillo Enterococcus faecalis + Colonias rosadas ATCC 29212 Enterococcus faeci m ATCC + Colonias rosadas 6056 Enterococcus avium (Costa + Colonias rosadas Rica) Staphylococus escaso Colonias blancas saprophyticus ATCC Staphylococcus xylosus + Colonias azules Staphylococcus aureus + Colonias blancas ATCC 25923 Proteus mirabilis ATCC ¦— 7002 Leyenda : +: crecimiento bueno -: crecimiento inhibido Las cepas de Proteus mirabilis se mantuvieron inhibidas, evidenciando el poder inhibitorio del medio para los organismos Gram negativos .

Algunas cepas de Staphylococcus se desarrollaron en el medio, sin embargo tomaron coloraciones diferentes a los estreptococos, pero además se realizó la prueba rápida de la catalasa, añadiendo una gota del reactivo en el medio, lográndose la completa diferenciación de ambos géneros.

Ejemplo No. 8 La composición de los ingredientes se preparó según ejemplo 7, se pesaron los componentes por separado en un matraz de Erlenmeyer con la diferencia de que se sustituyó x-gluc (5- bromo-4-cloro-3-indolil-p-D-glucurónido sal de ciclohexilamonio) por Magenta-gluc (gluc (5-Bromo-6-cloro-3- indolil-^D-glucurónido sal de ciclohexilamonio) .

El método de preparación fue similar al ejemplo 7.

Se inocularon cepas de colección de Proteus mirabilis ATCC 7002, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus xylosus ATCC 29971, Enterococcus faecium ATCC 6056, Streptococcus agalactiae ATCC 12386, Streptococcus pyogenes ATCC 19615, Streptococcus faecalls ATCC 29212 y las cepas aisladas de Enterococcus avium y Staphylococcus saprophyticus .

Los resultados del comportamiento de los microorganismos en el medio se muestran en la tabla No. 4.

Tabla No. 4. Características del medio y de las colonias Cepa Crecimient Color del medio y de o las colonias Streptococcus pyogenes + Colonias blancas con ATCC 19615 cambio de coloración del medio a amarillo Streptococcus agalactiae + Colonias magentas con ATCC 12386 ligero cambio de coloración del medio a amarillo Enterococcus faecalis + Colonias rosadas ATCC 29212 Enterococcus faecium ATCC + Colonias rosadas 6056 Enterococcus avium (Costa + Colonias rosadas Rica) Staphylococus — saprophyticus ATCC Staphylococcus xylosus + Colonias magentas Staphylococcus aureus + Colonias blancas ATCC 25923 Proteus mirabilis ATCC 7002 Leyenda : +: crecimiento bueno - : crecimiento inhibido Se observó un crecimiento temprano y diferenciado de las especies de Streptococcus, por las diferentes coloraciones desarrolladas en el medio. Algunas cepas de Staphylococcus se desarrollaron en el medio y tomaron coloraciones diferentes a los estreptococos, aunque Streptococcus xylosus se tornó de un color similar a Streptococcus agalactias, pero se diferenció pues no tornó el color del medio a amarillo. No obstante se realizó la prueba rápida de la catalasa, añadiendo una gota del reactivo en el medio, y se logró la identificación del género Staphylococcus, producto de la liberación de ¾ y 02 (formación de burbujas) .

Ejemplo No. 9 Se preparó la composición del según el ejemplo 8, con la diferencia de que se sustituyó X-gluc por el sustrato fluorogénico MUG, en una concentración de 0,05 g/1. Se añadió a la mezcla de ingredientes sólidos agua desionizada y se procedió a la preparación de la composición hasta su gelificación según se describe en el ejemplo' número 1. Se inocularon por estrias cepas de colección de Proteus mirabills ATCC 7002 , Staphylococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus xylosus ATCC 29971, Enterococcus faecium ATCC 6056, Streptococcus agalactíae ATCC 12386, Streptococcus pyogenes ATCC 19615, Streptococcus faecalis ATCC 29212 y la cepa aislada de : Enterococcus avium (Costa Rica) y Staphylococcus saprophyticus . Se realizó la lectura a las 24 horas, según la tabla No. 5 Tabla No. 5 Características del crecimiento y las colonias a las 24 horas de incubación Leyenda: +: buen crecimiento y fluorescencia positiva ±: crecimiento escaso -: crecimiento inhibido Ejemplo No. 10 Se preparó la composición del medio pesando los ingredientes por separado en un matraz de Erlenmeyer. El medio se preparó con la misma relación de bases nutritivas que el ejemplo 7, a excepción de que se añadió hidrolizado enzimático . de sangre bovina en cantidades de 1,911 g/300 mL. También se ensayaron dos marcadores enziméticos diferentes en concentración de 1,0 g/l con la adición de 0,5 g/l de citrato férrico-amónico y dos concentraciones diferentes de ácido nalidixico 0,015 g/l y 0,010 g/l. A continuación se describe la composición de marcadores enzimáticos e inhibidores utilizados: COMPONENTE g/300 g/300 mL mL VI V2 P- Nitrofenilfosfato sal disódica 0,06 0, 06 Salmón- glu ( 6-Cloro~3-indolil- ß? 0, 0225 0, 0225 glucopiranósido) x-gluc { 5-Bromo-4-cloro-3-indolil- 0, 0225 0, 0225 ßDglucurónido sal ciclohexilamonio) Acetato de talio 0,18 0,18 Acido nalidixico 0,0045 0,003 Triptó ano 0,3 - Fenilalanina - 0,3 Citrato férrico-amónico 0,15 0,15 Agar 3,9 3,9 Se procedió a la preparación según el ejemplo 1.

El método de inoculación empleado fue: estrias en la superficie del gel y en el caso de los microorganismos utilizados como controles positivos se inoculó también por diluciones (10-4 y 10"5) . En la evaluación se utilizaron cepas de colección de: Proteus mirabilis ATCC 7002, Proteus mirabllis ATCC 12433, Citrobacter freundíi ATCC 8090, Citrobacter freundii ATCC 10625, Enterococcus faecium ATCC 6056, Streptococcus agalactias ATCC 12386, Streptococcus faecalis ATCC 29212 y la cepa aislada de Enterococcus avium.

Los resultados del comportamiento de los microorganismos en el medio se muestran en la tabla No. 6.

Tabla No. 6. Evaluación del comportamiento de los diferentes microorganismos (incubación 35 °C por 24 h) . Cepa Medio Caracterís icas y Promoción color de las del colonias aisladas crecimient o UFC/mL Streptococcus Exper Colonias verde- 365 agalactiae ATCC 12386 im. azules con medio amarillo ATS Colonias blancas 330 Enterococcus faecalis Exper Colonias rosadas 600 ATCC 29212 im. ATS Colonias blancas 445 Enterococcus faecium Exper Colonias rosadas 310 ATCC 6056 im. ATS Colonias blancas 65 Enterococcus avium Exper Colonias rosadas 240 (aislado) im. A S Colonias blancas 110 Citrobacter freundii Exper Inhibido ATCC 8090 im. A S Colonias blancas Citrobacter freundii Exper Inhibido ATCC 10625 im. ATS Colonias blancas Proteus mirabilis Exper Inhibido ATCC 7002 im. ATS Colonias blancas Proteus mirabilis Exper Inhibido ATCC 12433 im. ATS Colonias blancas Experim: Composición cle la presente invención ATS: Agar Triptona Soya UFC/mL: Unidades Formadoras de Colonias por cada mL de dilución 10"5 En el medio se observa el crecimiento de Streptocococcus agalactiae, Enterococcus faecalis, Enterocccus faecium y Enterococcus avium a altas diluciones, se demuestra el crecimiento diferenciado de las diferentes especies dentro del género Streptococcus. Se inocularon cepas de microorganismos Gram negativos, utilizando como referencia el medio tradicional Agar Triptona Soya. Al realizar la comparación con el medio control se comprobó el poder inhibitorio de la formulación de dicha invención al observar la inhibición total de los géneros Citrobacter y Proteus.

Breve Descripción de las Figuras: Figura 1: Curvas de crecimiento de Enterococcus faecalis ATCC 29212 en las diferentes mezclas de bases nutritivas. Figura 2: Curvas de crecimiento de Streptococcus agalactias ATCC 12386 en las diferentes mezclas de bases nutritivas. Figura 3: Curvas de crecimiento de Streptococcus pyogenes ATCC 19615 en las diferentes mezclas de bases nutritivas.

Claims (9)

REIVINDICACIONES Medio de cultivo selectivo para el aislamiento y detección temprana de especies del género Streptococcus, caracterizado por contener un conjunto de bases nutritivas en cantidades de 15 a 58 g/1 que garantizan un contenido de nitrógeno total, derivado fundamentalmente de las proteínas de 10 a 14 %, seleccionadas entre el Hidrolizado de sangre bovina, Extracto de corazón de res, Hidrolizado enzimático de músculo de corazón de res, Hidrolizado enzimático de proteínas lácteas, Hidrolizado enzimático de proteínas del frijol de Soya, Hidrolizado enzimático de tejido animal, Autolizado o hidrolizado de levadura Sacharomyces cerevisiae, y sus mezclas; un conjunto de inhibidores en cantidades de 0,55 a 1, 6 g/1 compuesto por acetato de talio y ácido nalidíxico; una mezcla de sustancias cromogénicas y/o fluorogénicas, degradables por al menos una enzima de cada especie en cantidades de 0,3 a 1,5 g/1, seleccionadas entre el p-nitrofenilfosfato sal disódica, 5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-D-glucopiranósido) , 4-metilumbeliferil ß-D-glucopiranósido, 6-cloro-3-indolil-ß-D-glucopiranósido, 5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-Dglucurónido sal de ciclohexilamonio, 5-Bromo-6-cloro-3-indolil-p-D-glucurónido sal de ciclohexilamonio y trihidrato de 4-metilumbeliferil ß-D-glucurónido y compuestos indicadores de actividad desaminasa, en cantidades de 1 a 3 g/

1.

2. Medio de cultivo, según reivindicación 1, caracterizado por contener las bases nutritivas especificadas en las siguientes cantidades dentro del medio: • Hidrolizado de sangre bovina de 5-10 g/1 · Extracto de corazón de res de 1- 12 g/1 • Hidrolizado enzimático de músculo de corazón de res de 1-5 g/i • Hidrolizado enzimático de proteínas lácteas de 5-20 g/1 • Hidrolizado enzimático de proteínas del frijol de Soya de 2-15 g/1 • Hidrolizado enzimático de tejido animal de 1-5 g/1 • Autolizado o hidrolizado de levadura Sacharomyces cerevisiae de 2- 15 g/1

3. Medio de cultivo, según la reivindicación 1, caracterizado por contener los inhibidores del crecimiento de organismos Gram negativos, en las siguientes cantidades dentro del medio : • Acetato de talio de 0,55 a 1, 6 g/1 · Ácido nalidíxico de 0,005 a 0,030 g/1

4. Medio de cultivo, según la reivindicación 1, caracterizado por contener sustancias cromogénicas y fluorogénicos degradables por al menos uno de los organismos a identificar, seleccionadas en las siguientes cantidades dentro del medio: • p-nitrofenilfosfato sal disódica (PNP) de 0,2 a 0,8 g/1 • 5-Bromo-4-cloro-3-indolil-p-Dglucopiranósido (x-glu) , 4- Metilumbeliferil ß-D-glucopiranósido (Mu-glu) , 6-Cloro-3- indolil- ß-D glucopiranósido ( Salmon-glu) de 0,05 a 0,4 g/i • 5-Bromo-4-cloro-3-indolil-p-Dglucurónido sal de ciclohexilamonlo (x-gluc) , 5-Bromo-6-cloro-3-indolil-p- Dglucurónido sal de ciclohexilamonio (Magenta-Gluc) y 4- Metilumbeliferil ß-D-glucurónido trihidrato (MUG) de 0,05 a 0,2 g/1.

5. Medio de cultivo, según la reivindicación 1, caracterizado por contener compuestos indicadores de la actividad desaminasa en las siguientes cantidades dentro del medio: • sales de metales trivalentes, preferiblemente el citrato férrico-amónico en cantidades de 0,5 a 1,0 g/1. • aminoácidos aromáticos, preferiblemente el triptófano y la fenilalanina en cantidades de 1 a 2 g/1.

6. Medio de cultivo, según la reivindicación 1, caracterizado por conformación de la mezcla de sustancias cromogénicas y fluorogénicas degradables por al menos una enzima de cada especie, en combinaciones tales, que garantizan la aparición de colores o fluorescencia diferentes para cada especie, como sigue a continuación: a) PNP + x-glu + Magenta-gluc ó MUG b) PNP + Salmon-glu + x-gluc ó MUG c) PNP + Mu-glu + Magenta-gluc ó x-gluc

7. Medio de cultivo, según la reivindicación 1, caracterizado por contener además agar con una dureza entre 400 y 700 g/cm2 en cantidades de 10 y 14 g/1 para la preparación de las formas sólidas.

8. Medio de cultivo, según la reivindicación 1, caracterizado por poseer un valor de pH de 7 a 7,4.

9. Medio de cultivo, según la reivindicación 1, caracterizado porque el mismo se prepara adicionando cantidades de 25 a 80 g/1 de agua destilada o desionizada.