MX2012007557A - Un medio de cultivo para seleccion o enriquecimiento de s. aureus resistente a meticilina. - Google Patents
Un medio de cultivo para seleccion o enriquecimiento de s. aureus resistente a meticilina.Info
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Abstract
La invención se relaciona con un medio de cultivo para selección o enriquecimiento de Staphylococcus Aureus resistente a meticilina (MRSA), el medio comprende una combinación de al menos dos cefalosporinas.
Description
UN MEDIO DE CULTIVO PARA SELECCIÓN O ENRIQUECIMIENTO DE S. AÜBEUS RESISTENTE A METICILINA
CAMPO DE LA INVENCION
La invención se relaciona con la identificación rápida o enriquecimiento de Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA) .
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Staphylococcus aureus es uno de los patógenos identificados más comúnmente en la medicina humana y es una causa principal de infecciones nosocomiales e infecciones adquiridas en la comunidad. La resistencia a meticilina, reportada por primera vez en 1961, actualmente se ha propagado en los hospitales de todo el mundo. La identificación rápida y confiable de Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA) se ha tornado esencial para un cuidado adecuado del paciente, y el control de diseminación de la cepa.
Un medio especifico es óptimo cuando estimula el crecimiento de las especies esperadas e inhibe el crecimiento de las especies no esperadas. Para la detección o enriquecimiento del MRSA, es decisivo obtener el MRSA total e inhibir el MSSA total, debido a que ambos microorganismos
comparten actividades fenotipicas idénticas. Para este medio de detección o enriquecimiento, deben ser excelentes tanto la sensibilidad como la especificidad.
El procedimiento estándar para identificar el MRSA se basa en cultivos que utilizan medio selectivo de agar (Cherkaoui et al, 2007, J. ed. Microbiol., 56:500-503).
Las solicitudes de patentes internacionales WO2004/027086 y O2004/063391 describen medios cromogénicos de agar que contienen un antibiótico de ß-lactama, en particular, una cefalosporina .
Diversos medios cromogénicos para la selección de MRSA están disponibles comercialmente .
Cherkaoui et al., supra, compararon el desempeño de cuatro de los mismos: base de agar para selección de resistencia a oxacilina (ORSAB, Oxoid) , MRSA ID (BioMérieux) ; Chromogen oxacilin S. aureus (Axon Lab) , y MRSASeiect (Bio-Rad) . Stoakes et al, 2006, J. Clin. Microbiol., 44(3):637-639) compararon MRSASeiect con CHROMagar MRSA (Becton-Dickinson) , y medio de manitol-sal suplementado con oxacilina o cefoxitina (MSA-OXA y MSA-CFOX, Oxoid) .
Sin embargo, estos medios tienen desventajas.
No se garantiza su estabilidad, debido a que se sabe que las cefalosporinas son muy inestables a temperatura ambiente o a una mayor temperatura. Desde un punto de vista
comercial, es importante que los desempeños de las placas o tubos no disminuyan durante el transporte o suministro que puede tomar varios días por lo general a temperatura ambiente .
Además, la mayoría de estos medios proporcionan un resultado después de las 18-24h de incubación. Para mejorar la sensibilidad, con frecuencia es necesario que el usuario extienda el tiempo de incubación (en general 48h) , lo cual conduce a un diagnóstico retrasado y en general a una especificidad disminuida, en particular cuando el medio no es bastante estable. Con frecuencia también se recomienda al usuario realizar pruebas de confirmación tales como prueba de susceptibilidad antimicrobiana, aglutinación con látex o PCR, lo cual conduce a un costo aumentado del análisis y, una vez más, a un diagnóstico retraso.
Por lo tanto existe una necesidad continua de proporcionar un medio para detección de MRSA con mayor desempeño que los medios cromogénicos actuales en los términos de sensibilidad y/o especificidad. De preferencia, este medio debe permitir una detección rápida (en un término de 18-24h) y exhibir una buena estabilidad.
SUMftRIO DE LA INVENCIÓN
Esta invención proporciona un medio de cultivo que
cumple con estas necesidades.
Un objetivo de la invención de esta forma es un medio de cultivo para selección o enriquecimiento de Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA) , el medio comprende una combinación de al menos dos cefalosporinas .
En una modalidad preferida, el medio comprende además un agente cromogénico, el cual puede ser, por ejemplo, 6-cloro-3-indoxil-fosfato .
En una modalidad preferida, el medio de cultivo es un medio de cultivo con agar. Sin embargo, también puede ser un medio de cultivo liquido, es decir, un caldo.
En una modalidad particular, el medio comprende dos cefalosporinas .
En otra modalidad particular, el medio comprende tres cefalosporinas .
La invención proporciona además un método para selección o enriquecimiento de Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA) en un medio de cultivo o caldo, el método comprende (i) inocular el medio de cultivo definido en la presente, con bacterias para prueba, (ii) cultivar las bacterias en el medio de cultivo, y (iii) identificar opcionalmente la presencia de las cepas de MRSA, que aparecen como colonias con color sobre el medio cuando el
medio comprende un agente cromogénico.
En una modalidad particular, las bacterias para prueba están en forma de una muestra clínica, tal como una torunda nasal.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION
Los inventores suponen que a la larga la estabilidad de un medio de cultivo con MRSA que comprende una cefalosporina se podría mejorar al agregar una segunda cefalosporina en el medio. De manera bastante sorprendentemente, encontraron que agregar otra cefalosporina hace posible no sólo de hecho mejorar la estabilidad del medio de cultivo, sino que también aumenta su especificidad a la larga.
Desde un punto de vista comercial, es importante que los desempeños de las placas o tubos no disminuyan durante la vida en anaquel del producto debido a las condiciones de transporte/suministro que pueden tomar varios días. La mezcla de cefalosporinas inesperadamente aumenta la fuerza o estabilidad del medio según se observa por los desempeños obtenidos después de estrés térmico (cuando las placas se colocan sobre una incubadora durante 3 días a 37°C) .
La mezcla de cefalosporinas limita adicionalmente
el crecimiento de colonias falso-positivas que conservan una sensibilidad óptima.
Un objetivo de la invención es un medio de cultivo para selección o enriquecimiento de Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA) , el medio comprende una combinación de al menos dos cefalosporinas .
Los ejemplos de cefalosporinas incluyen, de manera enunciativa, cualquier cefalosporina de primera, segunda, tercera y cuarta generación.
La expresión "cefalosporina de segunda o tercera generación" se debe entender para denotar los antibióticos de la familia de cefalosporinas que tienen una fórmula derivada de la siguiente fórmula (I):
en la cual R2 es un grupo H, un grupo acetoximetilo, un. grupo metitiotetrazol , un grupo dimetilaminoetiltio-tetrazol, un grupo triazina, un grupo acetaminopiridina (piridinio) , o un grupo piridinio sustituido con un grupo carbamoilo, un grupo ciclopentopiridinio o un grupo tiometilacetoxitiazol , Rl es
un heterociclo amino-2-tiazol, un alfa-piperazindiona o un alfa-sulfofenilo, y R4 es un grupo H o un radical alfa-metoxi .
En particular, se pretende que se denoten los compuestos que tienen la siguiente fórmula:
en la cual R3 es un grupo H o un grupo alfa-metoxiimino . En un caso particular, el grupo R4 es hidrógeno.
Las cefamicinas son compuestos en los cuales el grupo R4 es un radical alfa-metoxi, que protege al anillo de beta-lactama contra la hidrólisis mediante beta-lactamasas , y corresponde a la siguiente fórmula:
Los oxacefemos son compuestos en los cuales el átomo de azufre del anillo de cefemo se reemplaza con un átomo de oxigeno, y se considera que son derivados de la
fórmula (I) proporcionada anteriormente.
En general, para estos compuestos, el grupo R4 es un [alfa] -metoxi .
Una definición de las cefalosporinas previstas de esta forma se puede encontrar en Binger "Mécanisme d'Action des, Béta-lactamines (de la structure bactérienne á la structure de La molecule)" 198 6 , Roussel (París) publisher, capítulo III, páginas 4 7 - 62 , y capítulo IV, páginas 63 - 68 ) , y en el trabajo de Richmond (Beta-lactam antibiotics (the background to their use as therapeutic aents) , Hoechst Aktiengesellschaft, D- 6230 Frankfurt (Main) 80 publisher, 1981 , capítulo 3 , páginas 55 - 65 ) .
Entre las cefalosporinas de segunda
generación, se puede hacer mención de: loracarbef, cefaclor, cefuroxima, cefprozil, cefoxitina (cefoxitan) , cefamandol, cefotian, cefotetano, cefmetazol, cefocinida, ceforanida, cefpodoxima, cefixima, cefotaxima, ceftizoxima, ceftriaxona, ceftazidima, cefmenoxima, cefodizima, cefoperazona , cefepima (algunas veces clasificada como una cef losporina de cuarta
generación), cefpiroma, cefsulfonida, cefetamet, ceftibuteno, moxalactam (latamoxef ) y flomoxef, en particular en la forma de sales (por ejemplo sales de sodio) .
En particular, las cefalosporinas se pueden seleccionar del grupo de cefamicinas (incluyendo por ejemplo, cefoxitina, cefotetano, cefmetazol, cefbutperazona, cefminox) y de oxacefemos (incluyendo por ejemplo, moxalactam o flomoxef) .
De preferencia, las cefalosporinas se seleccionan del grupo que consiste de cefotetano (CTT) , ceftriaxona (CRO) , cefuroxima (CX ) , cefsulodina (CFS) , ceftibuteno (CTB) , cefepima (FEP) , cefoperazona (CFP) , cefpodoxima (CPD) , cefoxitina (FOX), flomoxef, cefmetazol (C T) , moxalactam (MOX) y ceftiofur (XLN) , o las sales de los mismos. En lo sucesivo, se hace referencia ya sea al nombre completo de la cefalosporina o a la abreviatura de 3 letras.
De mayor preferencia, el medio comprende una combinación de cefalosporinas seleccionadas del grupo que consiste de:
cefotetano y ceftriaxona;
cefotetano y cefoxitina;
cefotetano y cefpodoxima;
cefpodoxima y cefsulodina;
cefuroxima y cefsulodina;
cefsulodina y cefotetano;
cefsulodina y ceftriaxona;
ceftiofur y cefsulodina;
cefsulodina y cefepime;
moxalactam y cefoxitina;
moxalactam y cefpodoxima;
cefotetano y ceftiofur;
cefpodoxima y ceftriaxona;
cefoperazona y ceftiofur;
cefoperazona y cefsulodina;
ceftriaxona y cefoperazona;
cefoperazona y cefuroxima;
cefotetano y ceftibuteno;
ceftriaxona y ceftibuteno;
y
ceftriaxona y cefepime.
Un "medio de cultivo" en el sentido en el que se describe en la presente, es un medio de agar nutritivo o un medio liquido (es decir, un caldo) que contiene nutrientes que permiten que crezca Staphylococcus aureus. Comúnmente se conocen los medios de cultivo para S. aureus, y en general contienen extractos de carne y peptona, asi como también sales (véase, por ejemplo la WO2004 /027086) .
El término "selección" o "seleccionar MRSA" se refiere a la detección y/o identificación de MRSA, e implica estimular el crecimiento y distinguir el MRSA de otro S. aureus y otras bacterias.
El término "enriquecimiento" o "enriquecer el MRSA" se refiere al cultivo selectivo del MRSA e implica estimular el crecimiento del MRSA con respecto al crecimiento de otro S. aureus y otras bacterias.
El medio de cultivo se inocula con bacterias para prueba o directamente con una muestra biológica o ambiental. Las bacterias para prueba pueden provenir de fuentes clínicas humanas o de cualquier fuente, que incluya de manera enunciativa, alimentos, animales vivos o muertos o tejido de vegetal, agua, aire, otras superficies ambientales inanimadas. Si la fuente de la muestra es sólida, la muestra se puede suspender en un diluyente liquido antes de la inoculación del medio de cultivo. También, una muestra liquida o licuada se puede diluir antes de inocular el medio de cultivo. En ciertas modalidades, la muestra se puede diluir en serie y las diluciones en serie se pueden utilizar para inocular una pluralidad de medios de cultivo para obtener una enumeración más precisa de S. aureus en la muestra original. En una modalidad preferida, las bacterias para prueba están en forma de una muestra clínica, tal como
una torunda nasal, una muestra de herida o un cultivo sanguíneo .
El término "estabilidad" se refiere a la capacidad del medio de acuerdo con la invención para permitir la selección o detección selectiva de MRSA durante un período de tiempo determinado, con la misma conflabilidad a todo lo largo del período de tiempo.
El medio de cultivo inoculado se incuba bajo condiciones que permitan el crecimiento de estafilococos. En una modalidad el método de la presente invención, el medio de cultivo inoculado se incuba a 37 °C durante aproximadamente 24 horas. Sin embargo, en otras modalidades, el medio de cultivo inoculado se puede incubar entre aproximadamente 18 horas hasta aproximadamente 48 horas entre aproximadamente 30 °C hasta aproximadamente 42 °C. En particular, la temperatura de incubación es entre aproximadamente 33°C hasta 39°C. Aunque la suplementación con NaCl adicional, hasta una concentración de aproximadamente 5%, produce resultados óptimos, las concentraciones tan bajas como 2.5% de NaCl también se desempeñan bien. Las concentraciones tan bajas como 0.01% también pueden proporcionar resultados satisfactorios.
La concentración de cada cefalosporina en el medio, de acuerdo con la invención de preferencia está entre 0.01 y 50 mg/1, de preferencia 0.5 y 30 mg/1, en particular 0.5 y 15
mg/1, todavía de preferencia entre 0.5 mg/1 y 10 mg/1. En una modalidad particular, el medio de cultivo comprende de 1 hasta 2 o 2.5 mg/1 de cefotetano y de 1.5 hasta 2.5 mg/1 de ceftriaxona, de preferencia 1.75 mg/1, 2 mg/1 ó 2.4 mg/1 de cefotetano y 2.4 mg/1 de ceftriaxona. En otra modalidad particular, el medio de cultivo comprende 1.5 hasta 2.5 mg/1 de cefotetano y 1.5 hasta 2.5 mg/1 de cefpodoxima, de preferencia 2 mg/1 de cefotetano y 1.5 mg/1 de cefpodoxima.
El medio de cultivo de preferencia comprende un agente cromogénico, y los microorganismos cultivados que sobreviven producen una colonia de color detectable en el medio o sobre el mismo, indicando el crecimiento de microorganismos y permitiendo la detección específica de S. aureus (el crecimiento de Staphylococci epidermidis resistente a meticilina sobre el medio como colonias blancas) .
Los medios, de acuerdo con la presente invención de preferencia contienen de 0.01 hasta 0.50 g/1, en particular de 0.05 hasta 0.40 g/1 de un agente cromogénico que permite la coloración de las cepas de Staphylococcus aureus. El agente cromogénico de preferencia es 6-cloro-3-indoxil-fosfato. Otros ejemplos de agentes cromogénicos que se pueden utilizar en el medio de acuerdo con la invención, incluyen de manera enunciativa, 5-bromo-6-cloro-3-indoxil-fosfato, 5-
bromo-4 -cloro-3-indoxil-fosfato, 5-bromo-3-indoxil-fosfato,
3-indoxil-fosfato, 6-bromo-3-indoxil-a-D-glucósido, 5-bromo- 4-cloro-3-indoxil-a-D-glucósido, 5-bromo-4-cloro-3-indoxil-N-metil-a-D-glucósido, 6-cloro-3-indoxil-a-D-glucósido .
En una modalidad preferida, además del agente cromogénico mencionado anteriormente, el medio, de acuerdo con la invención comprende al menos un agente cromogénico adicional que permite la coloración de otros microorganismos que podrían estar presentes en el inoculo, tales como 5-bromo-4-cloro-3-indoxilglucurónido ( "X-glucurónido" ) y/o 5-bromo-4-cloro-3-indoxilglucósido ("X-glu"), 5-bromo-4-cloro-3-indoxilgalactósido ("X-gal"). El medio, de acuerdo con la invención también puede comprender un agente fluorogénico tal como 4-metilumbeliferi1-a-D-glucósido.
El medio de cultivo de la invención puede comprender otros antibióticos, tales como, vancomicina, teicoplanina, avoparcina. De preferencia, el medio de cultivo no comprende oxacilina y/o tampoco comprende cefoxitina.
El medio de cultivo de la invención es muy sensible. Permite la identificación de cepas de MRSA débilmente resistentes y proporciona una buena especificidad.
De preferencia, el medio comprende cualquiera de las siguientes combinaciones de cefalosporinas (se debe
entender que cada concentración se puede aplicar a +/- 10s
CTT 2 mg/1 + CRO 2 mg/1
CTT 2.4 mg/1 + CRO 2.4 mg/1
FOX 4.5 mg/1 + CTT 2 mg/1
CTT 2 mg/1 +CPD 1.5 mg/1
CTT 2.4 mg/1 + CPD 1.8 mg/1
CPD 1.5 mg/1 + CFS 3.5 mg/1
CXM 0.75 mg/1 + CFS 3 mg/1
CXM 0.75 mg/1 + CFS 3.5 mg/1
CFS 3.5 mg/1 +CRO 2 mg/1
XLN 0.75 mg/1 +CFS 3 mg/1
CFS 3 mg/1 + FEP 2 mg/1
MOX 6 mg/1 + FOX 4.5 mg/1
MOX 4 mg/1 + CPD 1 mg/1
CTT 2 mg/1 + XLN 0.75 mg/1
CTT 1.75 mg/1 + CXM 0.75 mg/1
CPD 2.5 mg/1 + CRO 3.5 mg/1
CPD 2 mg/1 +CRO 4 mg/1
CFP 1.75 mg/1 + XLN 2 mg/1
CFP 2.25 mg/1 + XLN 1.25 mg/1
CFP 1.5 mg/1 + CFS 3 mg/1
Los medios de la invención muestran un excelente desempeño en los términos de sensibilidad y especificidad. Se mostró que los medios óptimos, serán tanto sensibles como específicos cuando se prueban en un término de 24h. Algunos otros se desempeñan mejor cuando se prueban en un término de 48h. Sin embargo, el retraso en el diagnóstico se equilibró mediante una estabilidad excelente.
Los medios de la invención mostraron una buena selectividad. De hecho, el crecimiento de otros estafilococos (es decir, no aureus) , principalmente S. epidermis resistente a meticilina, puede ser un problema, debido a que algunos de los mismos probablemente proporcionen una reacción falsa-positiva y luego se clasificarán como MRSA. La mezcla de cefalosporinas, de acuerdo con la invención hace posible inhibir estas especies no deseadas o limitar su coloración.
En una modalidad preferida, el medio de cultivo, de acuerdo con la invención, comprende un compuesto que inhibe el crecimiento de Staphylococcus epidermidis sin inhibir Staphylococcus aureus. De preferencia, el compuesto es deferoxamina, que de preferencia se utiliza a una concentración de 0.01 hasta 0.10 g/1. De preferencia, el compuesto es cefoperazona .
De hecho, los inventores han mostrado que la
adición de cefoperazona en un medio que ya contiene al menos otra cefalosporina (para seleccionar el RSA e inhibir el MSSA) reduce ventajosamente la coloración o inhibe el crecimiento de S. epidermidis, resistente a meticilina, reduciendo el riesgo de resultados falso positivos. De preferencia, se utiliza cefoperazona a una concentración de 0.1 hasta 3 mg/1.
Todavía en una modalidad preferida, el medio de cultivo comprende tres cefalosporinas, incluyendo cefoperazona.
En una modalidad más preferida, el medio de cultivo comprende cefotetano, ceftriaxona y cefoperazona.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención sin limitar su alcance.
EJEMPLOS
Ejemplo 1 : Comparación del desempeño de un medio de cultivo utilizando un cefalosporina contra cefalosporinas en combinación
Materiales y Métodos
El medio basal comprende peptona, sales, agentes antihongos y antibacterianos para inhibir el crecimiento de bacterias Gram negativas y hongos. El medio basal se selecciona para estimular el crecimiento de estafilococos, en
particular, Staphylococcus aureus.
Diversas cepas de MRSA (S. aureus resistente a meticilina) y MSSA (S. aureus susceptible a raeticilina) se han seleccionado de una colección de' cepas. Las cepas se cultivaron primero sobre un medio no selectivo. Las colonias se utilizan para realizar un "inoculo pesado o HI", correspondiente a aproximadamente 108 bacterias/ml inoculadas como una mácula sobre una pequeña porción de la placa, y un "inoculo ligero o LI", correspondiente a aproximadamente 105 bacterias/ml sembradas sobre una gran porción de la placa. Las placas se incubaron durante 48h a 35-37 °C. La lectura se realizó a las 24 y 48h del tiempo de incubación.
Abreviaturas y leyendas de las Tablas:
cefotetano (CTT)
ceftriaxona (CRO)
cefuroxima (CX )
cefsulodina (CFS) ,
Cefepima (FEP)
Cefoperazona (CFP)
cefpodoxima (CPD)
moxalactam (MOX)
cefoxitina (FOX)
cefmetazol (CMT)
ceftiofur (XLN)
G: crecimiento (si no se escribe nada más, "G
significa crecimiento con HI y LI a las 24h) ; Imp G
crecimiento pesado, AG: ausencia de crecimiento; ufe unidades formadoras de colonias; µ???: colonias puntiformes
SENS: sensibilidad (%), SPE: especificidad (%); MRSA Staphylococcus aureus resistente a meticilina; MS'SA
Staphylococcus aureus sensible a meticilina; MRSE Staphylococcus epidermidis resistente a meticilina; SSE Staphylococcus epidermidis sensible a meticilina;
Resultados
Las siguientes tablas muestran el desempeño de diversas fórmulas, que contienen una sola cefalosporina o una
mezcla de cefalosporinas . Los mejores medios proporcionan el crecimiento y coloración de MRSA sin crecimiento de MSSA.
Tabla 1 : Desempeño de un medio con una sola cefalosporina
(concentración de antibióticos en mg/L)
CTT, 17 mg/L, se seleccionó como la mejor concentración para obtener el balance más satisfactorio, aunque no ideal, en sensibilidad y especificidad. Para cada molécula utiliza sola, se ha seleccionado el mejor equilibrio entre sensibilidad y especificidad.
Tabla 2 : Desempeño de CRO + CTT
Con CRO utilizada sola, las colonias de MRSA fueron incoloras, y MSSA tuvieron la capacidad de crecer. Con CTT utilizado solo, las cepas de MSSA crecieron, mientras que algunos MRSA no crecieron óptimamente. Con la mezcla de CRO y CTT, todos los MRSA tuvieron la capacidad de crecer, y no se observó crecimiento de MSSA (100% de sensibilidad y 100% de especificidad a las 24h y 48h) .
Tabla 3: Desempeño de CTT + CPD
Con CTT utilizado solo, las cepas de MSSA crecieron, mientras que algunos MRSA no crecieron bien.
Con CPD utilizada sola, las cepas de MSSA crecieron, mientras que algunos MRSA no crecieron óptimamente. No se podría encontrar ninguna concentración óptima .
Con la mezcla de CTT y CPD, todos los MRSA tuvieron la capacidad de crecer a las 48h, y no se observó crecimiento de MSSA (100% de sensibilidad y 100% de especificidad a las 48h) .
Tabla 4 : Desempeño de CXM + CFS
Con CXM o CFS utilizadas solas, las cepas de MSSA crecieron, mientras que algunos MRSA no crecieron óptimamente. No se podría encontrar una concentración óptima.
Con la mezcla de CXM y CFS, todos los MRSA menos uno tuvieron la capacidad de crecer, y sólo se observó una ufe de MSSA.
Tabla 5 : Desempeño de CRO + CFS
Con CRO utiliza sola, MSSA tuvieron la capacidad de crecer .
Con CFS utilizada sola, las cepas de MSSA
crecieron, mientras que algunos MRSA no crecieron óptimamente. No se podría encontrar una concentración óptima.
Con la mezcla de CRO y CFS, todos los MRSA tuvieron la capacidad de crecer, y no se observó crecimiento de MSSA.
Tabla 6: Desempeño de FEP + CFS
Con FEP utilizada sola, algunos MRSA no crecieron bien, mientras que las cepas de MSSA crecieron. No se podría encontrar una concentración óptima.
Con CFS utilizada sola, las cepas de MSSA crecieron, mientras que algunos MRSA mostraron dificultad para crecer. No se podría encontrar ninguna concentración óptima .
Con la mezcla de FEP y CFS, todos los MRSA tuvieron la capacidad de crecer a las 48h, y no se observó ningún crecimiento de MSSA.
Tabla 7 : Desempeño de CTT + XLN
Con CTT utilizado solo, las cepas de MSSA crecieron, mientras que algunos MRSA no crecieron bastante para ser detectados.
Con XLN utilizado solo, las cepas de MSSA crecieron, mientras que algunos MRSA no crecieron. No se podría encontrar ninguna concentración óptima.
Con la mezcla de CTT y XLN, todos los MRSA tuvieron la capacidad de crecer a las 48h, y no se observó ningún crecimiento de MSSA (100% de sensibilidad y 100% de especificidad) .
Tabla 8 : Desempeño de CXM + CTT
Con CTT utilizado solo, las cepas de MSSA crecieron, mientras que algunos MRSA no crecieron bien.
Con CXM utilizada sola, las cepas de MSSA crecieron, mientras que algunos MRSA no crecieron. No se podría encontrar ninguna concentración óptima.
Con la mezcla de CTT y CXM, todos los MRSA menos uno tuvieron la capacidad de crecer a las 48h, y no se observó ningún crecimiento de MSSA.
Ejemplo 2: Estudios de estabilidad
Cuando se agregan dos cefalosporinas , se aumentó la estabilidad de la fórmula. Debido al hecho de que las moléculas son inestables, con frecuencia aparece después del estrés el crecimiento de MSSA. Los inventores han imitado el estrés debido al transporte de los discos de Petri hasta el laboratorio del consumidor, en verano, al colocar las placas durante 3 días a 37 °C antes de la inoculación y la incubación 24 ó 48h. La composición del medio basal fue la misma como se describió en el Ejemplo 1. Las abreviaturas tienen el mismo significado .
Se seleccionó la concentración óptima para Fox y Mox. Luego se observó la inhibición de MSSA (Tabla 9A) .
Tabla 9A: Estabilidad de FOX + MOX (24h de incubación)
Con una concentración óptima de FOX, la molécula se utilizará sola, 4 cepas de MSSA crecieron a las 24h después del estrés.
Con una concentración óptima de MOX utilizada sola, 4 cepas de MSSA crecieron a las 24h después del estrés. Con
FOX + OX combinadas, sólo creció un MSSA a las 24h después del estrés.
Los inventores en la presente muestran que el crecimiento de MSSA todavía se inhibe después del estrés y es menos importante, con una mezcla de cefalosporinas en comparación con una cefalosporina utilizada sola.
Se realizaron experimentos adicionales con una combinación de CTT y CPD (Tabla 9B) , o una combinación de CTT y CRO (Tabla 9C) .
CTT, 22 mg/1, se seleccionó con el tiempo como una concentración óptima para obtener el equilibrio- más satisfactorio, aunque no ideal, en la sensibilidad y especificidad, cuando se utilizó solo.
CPD, 4 mg/1, se seleccionó con el tiempo como una concentración óptima para obtener el equilibrio más satisfactorio, aunque no ideal, en la sensibilidad y especificidad, cuando se utilizó solo.
CRO, 4,5 mg/1, se seleccionó como la mejor concentración para obtener el equilibrio más satisfactorio, aunque no ideal, en la sensibilidad y especificidad cuando se utilizó sola.
En las tablas 9B y 9C,
LG significa «crecimiento limitado» para MRSA, es decir, crecimiento sólo con un inoculo pesado (HI) ; sin
crecimiento con el inoculo ligero (LI) .
Tabla 9B: Estabilidad de CTT + CPD (24h de incubación)
En las placas control con CTT o CPD únicamente, no sometidas a ningún estrés, todos los MRSA crecieron, cuando
unas cuantas cepas de MSSA tuvieron la capacidad de crecer a las 24h.
En las placas que combinan CTT y CPD, pero que no se sometieron a estrés, todos los MRSA crecieron y ningún MSSA tuvo la capacidad de crecer.
Todos los MRSA crecieron, y la mayoría de las cepas de MSSA también tuvieron la capacidad de crecer a las 24h en placas con CTT sometidas a estrés (durante 3 días a 37°C antes de la inoculación) . Hubo una disminución dramática en la especificidad en comparación con las placas control (sin estrés ) .
Todos los MRSA crecieron, y dos cepas de MSSA tuvieron la capacidad de crecer a las 24h en placas con CPD sometidas a estrés (durante 3 días a 37°C antes de la inoculación) .
En las placas que combinan CTT y CPD, sometidas a estrés, todos los MMRSA crecieron y ningún MSSA tuvo la capacidad de crecer.
La mezcla de antibióticos de esta forma proporcionó el mejor desempeño y mostró la mejor estabilidad después del estrés .
Tabla 9C: Estabilidad de CTT + CRO (24h de incubación)
En las placas control con CTT o CRO únicamente, no sometidas a ningún estrés, todos los MRSA crecieron, cuando una cepa de MSSA tuvo la capacidad de crecer a las 24h.
En las placas que combinan CTT y CRO, pero que no se sometieron a estrés, todos los MRSA crecieron y ningún MSSA tuvo la capacidad de crecer.
Todos MRSA crecieron, y la mayoría de las cepas de MSSA también tuvieron la capacidad de crecer a las 24h en las placas con CTT sometidas a estrés (durante 3 días a 37 °C antes de la inoculación) . Hubo una disminución dramática en la especificidad en comparación con las placas control (sin estrés) .
Todos los MRSA crecieron, y cuatro cepas de MSSA también tuvieron la capacidad de crecer a las 24h en las placas con CRO sometidas a estrés (durante 3 días a 37 °C antes de la inoculación) . Hubo una disminución de especificidad en comparación con las placas control (sin estrés) .
En las placas que combinan CTT y CRO, sometidas a estrés, todos los MRSA crecieron y sólo un MSSA tuvo la capacidad de crecer a las 24h.
La mezcla de antibióticos de esta forma proporcionó el mejor desempeño y mostró la mejor estabilidad después del estrés .
Ejemplo 3 : Inhibición de otras especies
Se estudió la sensibilidad, especificidad, así como
la selectividad de un medio que comprende CFP + CRO + CTT.
La composición del medio basal fue la misma como se describió en el Ejemplo 1. Las abreviaturas tienen los mismos significados .
Tabla 10 : Inhibición de Staphylococcus epidermidi s
Agregar CFP en un medio que ya contiene otra cefalosporina reduce la coloración o inhibe el crecimiento de S. epidermis resistente a meticilina, reduciendo el riesgo de resultados falsos positivos.
Además, se observó una mayor sensibilidad y especificidad contra MSSA y MRSE.
Claims (15)
1. Un medio de cultivo para selección o enriquecimiento de Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA) , el medio caracterizado porque comprende una combinación de al menos dos cefalosporinas .
2. El medio de cultivo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque comprende un agente cromogénico.
3. El medio de cultivo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el agente cromogénico es 6-cloro 3-indoxil-fosfato .
4. El medio de cultivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque es un medio de cultivo con agar.
5. El medio de cultivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque es un caldo.
6. El medio de cultivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque comprende dos cefalosporinas .
7. El medio de cultivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque comprende tres cefalosporinas .
8. El medio de cultivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque las cefalosporinas se seleccionan del grupo que consiste de cefotetano (CTT) , ceftriaxona (CRO) , cefuroxima (CXM) , cefsulodina (CFS) , ceftibuteno (CTB) , cefepima ( FEP) , cefoperazona (CFP) , cefpodoxima (CPD) , cefoxitina (FOX), flomoxef, cefmetazol (CMT), moxalactam ( OX) y ceftiofur (XLN) .
9. El medio de cultivo de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque comprende una combinación de cefalosporinas seleccionadas del grupo que consiste de: cefotetano y ceftriaxona; cefotetano y cefoxitina; cefotetano y cefpodoxima; cefpodoxima y cefsulodina; cefuroxima y cefsulodina; cefsulodina y cefotetano; cefsulodina y ceftriaxona; ceftiofur y cefsulodina; cefsulodina y cefepime; moxalactam y cefoxitina; moxalactam y cefpodoxima; cefotetano y ceftiofur; cefpodoxima y ceftriaxona; cefoperazona y ceftiofur; cefoperazona y cefsulodina; ceftriaxona y cefoperazona; cefoperazona y cefuroxima; cefotetano y ceftibuteno; ceftriaxona y ceftibuteno; y ceftriaxona y cefepime.
10. El medio de cultivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque cada cefalosporina está presente a una concentración entre 0.1 a 50 mg/1, de preferencia entre 1 mg/1 y 10 mg/1.
11. El medio de cultivo de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque comprende de 1 a 2.5 mg/1 de cefotetano y de 1.5 a 2.5 mg/1 de ceftriaxona, de preferencia 1.75 mg/1 o 2.4 mg/1 de cefotetano y 2.4 mg/1 de ceftriaxona .
12. El medio de cultivo de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque comprende: 2 mg/1 de cefotetano y 2 mg/1 de ceftriaxona, 2.4 mg/1 de cefotetano y 2.4 mg/1 ceftriaxona, 4.5 mg/1 de cefoxitina-2 mg/1 de cefotetano, 2 mg/1 de cefotetano y 1.5 mg/1 de cefpodoxima, 2.5 mg/1 de cefotetano y 1.8 mg/1 de cefpodoxima, 1.5 mg/1 de cefpodoxima y 3.5 mg/1 de cefsulodina, 0.75 mg/1 de cefuroxima y 3 mg/1 cefsulodina, 0.75 mg/1 de cefuroxima y 3.5 mg/1 cefsulodina. 3.5 mg/1 de cefsulodina y 2 mg/1 de ceftriaxona, 0.75 mg/1 de ceftiofur y 3 mg/1 cefsulodina, 3 mg/1 de cefsulodina y 2 mg/1 de cefepima, 6 mg/1 de moxalactama y 4.5 mg/1 de cefoxitina, 4 mg/1 de moxalactam y 1 mg/1 de cefpodoxima, 2 mg/1 de cefotetano y 0.75 mg/1 de ceftiofur, 1.75 mg/1 de cefotetano y 0.75 mg/1 de cefuroxima, 2.5 mg/1 de cefpodoxima y 3.5 mg/1 de ceftriaxona, 2 mg/1 de cefpodoxima y 4 mg/1 de ceftriaxona, 1.75 mg/1 de cefpodoxima y 2 mg/1 de ceftiofur, 2.25 mg/1 de cefoperazona y 1.25 mg/1 de ceftiofur o 1.5 mg/1 de cefoperazona y 3 mg/1 de cefsulodina.
13. El medio de cultivo de conformidad con cualguiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque comprende cefoperazona, de preferencia a una concentración entre 0.1 mg/1 a 3 mg/1.
14. Un método para la selección o enriquecimiento de Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA) en un medio de cultivo, el método caracterizado porque comprende (i) inocular el medio de cultivo definido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, con bacterias para prueba, (ii) cultivar las bacterias en el medio de cultivo, y (iii) opcionalmente identificar la presencia de las cepas de MRSA, que aparecen como colonias con color en el medio cuando el medio comprende un agente cromogénico.
15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque las bacterias para prueba están en la forma de una muestra clínica, tal como una torunda nasal, una muestra de herida o una muestra sanguínea.
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