BRPI0406610B1 - meio de cultura seletivo para o isolamento e/ou detecção prematura de espécies do gênero streptococcus - Google Patents

Abstract

"meio de cultura seletivo para o isolamento e/ou detecção prematura de espécies do gênero streptococcus". a presente invenção se relaciona com microbiologia em particular com um meio de cultura seletivo para o isolamento e/ou detecção prematura de espécies do gênero streptococcus. o meio proposto permite a identificação de espécies streptococcus pelo aparecimento de 3 tonalidades diferentes nos organismos a detectar e o aparecimento de emissões fluorescentes além de mudanças de coloração do meio, o que oferece a identificação com um alto grau de sensibilidade e especificidade. o meio compreende relações específicas de misturas de bases nutrientes ricas em compostos de origem protéica (polipeptídeos, peptídeos, proteoses, aminoácidos) e vitaminas que possibilitam um crescimento abundante das espécies de interesse, além da inclusão do hidrolisado enzimático de sangue, o qual garante a presença no meio de substâncias derivadas do sangue ou de uma de suas frações necessárias para o crescimento de streptococcus, sem prejudicar a identificação.

Description

“MEIO DE CULTURA SELETIVO PARA O ISOLAMENTO E/OU DETECÇÃO PREMATURA DE ESPÉCIES DO GÊNERO STREPTOCOCCUS’ Setor Técnico A presente invenção se relaciona com a microbiologia e especificamente com o diagnóstico clínico e veterinário, controle da qualidade de alimentos e estudos de contaminação de elementos ambientais, nos quais se necessitam métodos para o isolamento e detecção de espécies de Streptococcus.

Arte Anterior Os estreptococos são considerados um gênero de microorganismos fastidiosos, cuja identificação é altamente importante não diagnóstico clínico. Dentro da classificação realizada por Lancefield encontram-se numerosas espécies patogênicas ao homem, tais como: Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Streptococcus anginosus, Enterococcus avium, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, agentes causais de septicemias, meningites neonatais, endocardites e infecções das vias urinárias (Giuseppe, N. e Vito Mar N., 1989. Diccionario de Bacteriologia Humana, edição espanhola Menariní). Ainda que os estreptococos não sejam os microorganismos que mais frequentemente provocam sépsis urinária, faz-se necessária sua detecção, pois são especificamente os estreptococos β hemolíticos a causa mais ffeqüente de sépsis em neonatos, o que permite administrar profilaxia antibiótica intraparto e prevenir a infecção perinatal por este microorganismo (Bosch, J.; Murillo, S.; Rico, M. e Salgado, M. 1998. Utilidad de um medio selectivo disco-caldo para la detección de estreptococo do grupo B en la vagina. Enferm. Infecc. Microbiol. Clin. Vol 16(2)). a incidência de sépsis neonatal prematura é de 1,48-4,08/1000 nascidos vivos com uma mortalidade de 8,7-10,5% (Montero, R; Barbadillo, F.; Anso, S.; Marrero, M.; Carpintero I.; Sastre E. e Alonso B.: Sepsis neonatal por Streptococcus agalactiae. Qué hacer ?. An-Esp-Pediatr. 1998; 48 (3), p. 288-92; Juncosa, T.; Bosch, J.; Dopico, E.; Guardia, C.; Lite, J.; Sierra, M.; Barranco, M.; Matas, L.; Sanchez, F.; Sanfeliu, I. e Vinas, L. 1998. Infección neonatal por Streptococcus agalactiae. Estúdio multicéntrico em el área de Barcelona. Enferm-Infecc-Microbiol-Clin.; 16(7), p. 312-5). O agente causai desta enfermidade é Streptococcus agalactiae principalmente, residente habitual do trato genital feminino. Ademais surgem novos patógenos urinários não conhecidos como Streptococcus urinalis sp.nov., que embora possua similitude com Streptococcus pyogenes e Streptococcus canis, resulta ser uma nova espécie do gênero Streptococcus, cujo nome é Streptococcus urinalis sp.nov., cepa tipo CCUG 41590T (Collins, M.D.; Hutson, R.A.; Falsen, E.; Nikolaitchouk, N.; La Claire, L. and Facklam, R.R. 2000. An unusual Streptococcus fforn human urine, Streptococcus urinalis sp. nov. Int J Syst Evol Microbiol; 50 Pt 3, p. 1173-1178).

Na atualidade existe no mercado uma série de meios de cultura que estão projetados para isolar e/ou detectar as diferentes espécies do gênero Streptococcus. Entre eles pode-se mencionar: Agar Sangue, Agar Sangue Columbia, Agar Triptona Soja com Sangue, Agar Cérebro Coração, entre outros (Manual de meios de cultura OXOID. 1995. UNIPATH, Espanha; MERCK Microbiology Manual. 2000. Merck KgaA, Darmstadt; Manual DIFCO de Bacteriologia. 1984. Décima Edição, Francisco Soria Melguizo, S.A., Madrid).

Estes meios não seletivos não permitem a diferenciação entre as espécies patogênicas e não patogênicas. Estes meios ao não serem seletivos permitem o crescimento de outras bactérias Gram positivas e Gram negativas que competem com os estreptococos pelos nutrientes. Por exemplo: no caso de Proteus, as cepas que desenvolvem "véu" impedem o isolamento das colônias de interesse.

Nas formulações não se encontram substâncias altamente nutritivas, pelo que é necessário adicionar sangue, o que dificulta a manipulação, aumenta o risco de contaminação e não permite uma prolongada vida útil do meio preparado, por ser este um componente biológico lábil. O meio CLED comercializado pelas empresas anteriormente mencionadas, que é utilizado amplamente nos laboratórios e é considerado como uma das melhores opções, permite o crescimento de todos os patógenos da urina, dentre os quais se encontram Streptococcus, e outros microorganismos Gram positivos, que não podem ser diferenciados, porque possuem características culturais similares. O crescimento dos Streptococcus é lento. Os enterococos (Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium e Enterococcus avium) podem ser confundidos com espécies de Shigella.

No Manual MERCK de meios de cultura (MERCK Microbiology Manual, 2000. Merck KgaA, Darmstadt) descreve-se um meio e um caldo para o enriquecimento seletivo de Streptococcus, que emprega a azida sódica e o sulfito de sódio como inibidores de organismos Gram negativos. Pode-se mencionar como desvantagens do meio sua alta toxicidade pela presença da azida sódica (ingrediente altamente tóxico) e a impossibilidade de diferenciar as distintas espécies, pois é um caldo utilizado especificamente para promover o crescimento microbiano. A empresa OXOID (Manual de meios de cultura, OXOID, 1995. UNIPATH, Espanha) descreve em seu manual um meio seletivo para Streptococcus que precisa da adição de sangue e de um suplemento seletivo, que contém sulfato de colistina e ácido oxolínico, porém além disso é indispensável sua incubação em atmosfera de C02 a 5 %. Conjuntamente com as dificuldades anteriormente mencionadas que provoca a adição de sangue, o uso de antibióticos como suplemento, dificulta a preparação do meio e não garante uma real inibição da microbiota acompanhante indesejada, devido ao aparecimento, cada vez com maior frequência, de fenômenos de resistência aos antibióticos, principalmente nos organismos Gram negativos.

Ademais, a necessidade de incubar o meio em atmosfera de CO2 a 5% toma incômoda a técnica de isolamento, ao não estar este dirigido à identificação ou diferenciação, pelo que é preciso utilizar meios ou ensaios bioquímicos e sorológicos para identificar as espécies de Streptococcus de interesse.

No Manual acima mencionado, descreve-se ademais a composição de um meio seletivo para Streptococcus/Staphylococcus com a adição de sangue estéril e 0 suplemento de antibióticos ácido nalidíxico e sulfato de colistina. 0 emprego desta formulação apresenta as mesmas desvantagens mencionadas no parágrafo anterior, relativas à utilização de sangue e antibióticos.

Um meio seletivo para 0 isolamento rápido de Streptococcus agalactiae e outros estreptococos relacionados com a mastite bovina: meio Edwards (Modificado) é descrito no Manual OXOID de 1995. A este se adiciona sangue como suplemento e ele contém sulfato de tálio e cristal violeta como inibidores. Este diagnosticador permite 0 crescimento de Streptococcus agalactiae e outros Streptococcus, só utilizando como princípio de identificação a hidrólise da esculina pelos estreptococos do grupo D (colônias negras) e a resposta negativa (colônias azuis) do resto, pelo que não podem ser diferenciados entre eles. O cristal violeta empregado como agente seletivo, pode por sua vez inibir 0 crescimento dos próprios Streptococcus, e além disso 0 sulfato de tálio é considerado um composto altamente tóxico, nocivo para a saúde humana e extremamente danoso para 0 meio ambiente, 0 que ao mesmo tempo complica e toma muito incômodo 0 processo de produção, preparação e 0 descarte do meio.

De maneira similar 0 meio Todd-Hewitt com gentamicina e ácido nalidíxico, Agar Sangue com colistina e ácido nalidíxico, Caldo Muelles-Hinton com 5% de soro e amicacina (Bosch, J.; Murillo, S.; Rico, M. e Salgado, M. 1998. Utilidad de um medio selectivo disco-caldo para a detección de estreptococo do grupo B em la vagina. Enferm. Infecc. Microbiol. Clin. 16(2)) e o meio Azida-Esculina-Ácido oxolínico também foram empregados para a detecção e identificação de espécies específicas de Streptococcus com as desvantagens já mencionadas anteriormente (Figueras, M.J; Inza, L; Polo, F. and Guarro, J. 1998. Evaluation of the oxolinic acid-esculín-azide médium for the isolation and enumeration of faecal streptococci in a routine monitoring programme for bathing waters. Can. J. Microbiol. 44, p. 998-1002).

Foi requerido ou patenteado um grupo de invenções dirigidas à cultura de espécies específicas de Streptococcus. Algumas delas são relacionadas a seguir.

No pedido de patente EP 1 098 002 Al de 2001.05.09 (Dehydrated immediate reconstruction culture médium to identify group B Streptococci (Streptococcus agalactiae) by detection of their pigment), De La Rosa Fraile, descreve um meio desidratado de reconstituição imediata para identificar Streptococcus do grupo B, pela produção de seu pigmento, cuja essência consiste em adicionar Sephadex 200 como agente gelificante ao meio Granada.

As limitações da citada invenção podem ser resumidas como se segue: ♦♦♦ Só permite a identificação de Streptococcus agalactiae. ❖ Requer adicionar soro de cavalo. ❖ O meio preparado tem uma durabilidade de menos de 2 meses devido à instabilidade dos componentes. *t* Requer-se antibióticos como o metronidazol e a colistina adicionados como suplemento, o que apresenta deficiências comuns às já descritas para as anteriores formulações. ❖ Por ser um meio semi-sólido, não se podem observar as características culturais do microorganismo. A preparação é complexa, e inclui diferentes passos, tais como: a preparação do meio basal, a adição do gel, a agitação para captar bolhas, a adição dos suplementos e a incubação em banho Maria.

Este mesmo autor, anos antes, desenvolveu uma formulação (De La Rosa Fraile, Manuel; Patente: ES 2088827, 1996.09.16. Culture médium for Streptococcus agalactiae which actives the formation of pigment by amylases and/or (G(&alpha 1-4)G) (n>2) glucooligosacarídeos added as Chemical compounds, as polysaccharide hydrolysates or generated in the same médium using enzymes and polysaccharides) para a detecção de Streptococcus agalactiae que continha antibióticos em forma de suplemento, amilases, malto-oligossacarídeos, amido para a produção do pigmento característico deste microorganismo. Dita formulação é complexa para preparar, contém enzimas lábeis adicionadas como suplemento e compostos químicos complexos (malto-oligosacarídeos), lábeis e seu emprego na indústria de meios de cultura é pouco comum.

Outro meio destinado à identificação de Streptococcus do grupo B (hemolíticos), baseado na produção de um pigmento de cor laranja, foi desenvolvido por Tanaka Yoshihiro e Takahashi Hisayoshi (JP 9313171A2, 1997.12.09. Culture médium for group B hemolytic Streptococcus). A composição do meio é: glucose, piruvato de sódio, peptona de came, MgS04, MOPS-Fosfato, metotrexato e um agente antibacteriano (inativo para Streptococcus do grupo B). Com ajuda desta formulação não podem ser identificados outros estreptococos. Na patente JP 59159797 (Kojima, H., et al. 1984.09.10. Culture médium for selective proliferation of Streptococcus hemolyticus), descreve-se um meio seletivo para a proliferação de Streptococcus hemolyticus, cuja composição contém lipídeos e ácidos graxos como agentes seletivos específicos para promover o crescimento desta espécie. O emprego neste meio, do feijão de soja, toma-o complexo em sua preparação, e além disso, os agentes seletivos não inibem o crescimento de outras espécies de Streptococcus de interesse. Deeyloff John protegeu um meio de cultura para a diferenciação de Streptococcus rnutans (US 4468456, 1984.08.28. Médium for differentiating Streptococcus mutans) composto por sais de fosfato, agar, extrato de levedura, sacarose e um indicador de pH. A preparação de produto é complexa já que o mesmo se compõe de 2 camadas agarizadas, a uma das quais é preciso adicionar uma suspensão de fosfato de cálcio, de difícil dissolução. O meio não é suficientemente inibidor para outras espécies de Gram positivos.

Outros meios e métodos foram desenvolvidos para a cultura de espécies especificas de Streptococcus para obter determinados metabólitos, ou inclusive, para o diagnóstico. Ditos produtos em nenhum caso oferecem a possibilidade de diferenciação ou detecção de um número significativo de Streptococcus dentro do gênero. Entre eles encontram-se: Park et al. (US 5496726, 1996. Streptococcus zooepidemicus médium and process for preparing hyaluronic acid) e Inoue et al. (US 4 306 024,1981.12.15. Process for cultivation of hemolytic Streptococcus pyogenes).

Blareau Jean Pierre e colaboradores (Patente: FR 2723960-A1, 1994.08.31. Cultures de Streptococcus thermophilus à activité beta-galactosidase elevée, leur procédé d'obtention, et leurs utilisations) patentearam um meio de cultura para Streptococcus thermophilus que continha hidrolisados de proteínas lácteas, lactose e extrato de levedura como únicos componentes. O meio não está dirigido ao diagnóstico clínico, nem ao controle da qualidade de alimentos e ademais não é seletivo para a detecção de Streptococcus.

Outro grupo de invenções, pelo contrário está dirigido à cultura de vários gêneros ou espécies de Streptococcus, e não permitem uma diferenciação ou identificação adequada entre eles, vários exemplos sendo citados em seguida.

Nos últimos anos, aumentou o emprego de substratos cromogênicos ou fluorogênicos incorporados aos meios tradicionais ou em novos meios de cultura, desenvolvidos especificamente para alguns microorganismos com exigências metabólicas. Estas reações cromogênicas possuem certas vantagens sobre os meios convencionais, tais como: rapidez na resposta no tempo, elevada especificidade e sensibilidade como resultado da degradação do substrato por uma enzima específica.

Manafi em numerosos artigos, menciona e abarca uma revisão extensa dos substratos cromogênicos e fluorogênicos mais frequentemente empregados como componentes dos meios de cultura, ademais, explica seus possíveis usos na identificação de algumas espécies de Síreptococcus, por exemplo no artigo "New developments in chromogenic and fluorogenic culture media" (Manafi, M. 2000. International Journal of Food Microbiology 60, p. 205-218) faz-se referência a alguns destes meios, os quais apresentam determinadas limitações ou desvantagens: ■ Enterolert (IDEXX Laboratories Inc., Westbrook, Maine) e o Microtiter plate MUST (Sanofi, França) que contêm um substrato fluorogênico específico para a β-D glucosidase, projetados para a detecção de enterococos em água, embora não permita a diferenciação e identificação de outros estreptococos, contêm ademais um único marcador de enzima específica fluorogênico. ■ O agar foi projetado para a enumeração de enterococos em água do mar ou água fresca. Ele contém ácido nalidíxico, ciclo-heximida, trifeniltetrazólio e o substrato indoxil la β-D glucosídeo. Possui a desvantagem que utiliza antibióticos como agentes seletivos, além de possuir um único marcador enzimático que impossibilita a identificação de outros Síreptococcus. Precisa-se de longos períodos de incubação (24-48 horas) e a sensibilidade do meio não é elevada. . A modificação deste meio reduzindo a concentração de trifeniltetrazólio e aumentando a concentração de indoxil β-D glucosídeo reduziu o tempo de incubação a 24 horas porém não ampliou as possibilidades diagnosticas do meio. ■ Chromocult enterococci broth (CEB) (BBL) e o Readycult enterococci (MERCK) empregam substrato o 5-bromo-4-cloro-3-mdolü-(PD glucopiranosídeo para identificar Enterococos e azida sódica para inibir outros microorganismos. No meio aparecem falsos positivos, tais como: Leuconostoc, Laetococcus lactis e Aeromanas sp. Não se identificam outros estreptococos e contém ingredientes tóxicos. O meio CHROMagar Orientation (BBL) (Carricajo, A.; Boiste, S.; Thore, J.; Aubert, G.; Orille, Y. and Freydicre, AM. 1999. Comparative evaluation of five chromogenic media for detection, enumeration and Identification of urinary tract pathogens. Eur 7 Clin Microbiol Infect Dis 18(11), p. 796-803; Samra, Z.; Heifetz, M.; Talmor, J.; Bain, E. and Bahar, J. 1998. Evaluation of use of a new chromogenic agar in detection of urinary tract pathogens. J Clin Mcmbiol., 36(4), p. 990-994; Hengstler, KA; Hammann, R. and Fahr, AM. 1998. Evaluation of BBL CHROMagar orientation médium for detection and presumptive identificação of urinary tract pathogens. J Clin Microbiol. 36(5), p. 1464; Merlino, L; Siarakas, S.; Robertson, GJ.; Funnell, GR.; Gottlieb, T and Bradbury, R 1997. Evaluation of CHROMagar Orientation for differentiating and presumptive identification of gram-negative bacilli and Enterococcus species. J Clin Microbiol 35(8), p. 2190) permite a identificação simultânea presuntiva de Gram positivos, Gram negativos e leveduras. Dentro dos microorganismos que se podem identificar incluem-se os estreptococos (grupos D, B e C), ainda que os grupos B e C não possam ser diferenciados, pelo que se requer provas bioquímicas adicionais para sua identificação. A grande diversidade de cores toma difícil ao extremo a interpretação de os resultados e em algumas ocasiões é necessário prestar uma atenção especial à morfologia, ao tamanho e às características das colônias (brilho ou opacidade) o que dificulta ainda mais a interpretação dos resultados. A similitude de cores de alguns estreptococos com microorganismos dos gêneros Klebsiella, Enterobacter e Citrobacter, obriga a realizar ensaios adicionais que requerem mais horas de ensaio. Também é de se destacar que o meio é sensível à luz, o que altera a cor original, e ainda mais a incubação e a leitura devem ser realizadas de imediato. O meio UTI (OXOID Inc.) projetado para a identificação presuntiva e a diferenciação de microorganismos causadores de infecções do tracto urinário, contém o substrato cromogênico x-glu para a identificação de enterococos. Esta formulação apresenta como desvantagens que outros estreptococos não podem ser identificados, crescem outros microorganismos Gram negativos que geralmente se encontram em infecções urinárias em concentrações superiores a Streptococcus e seu uso esta restrito a amostras de urina.

Em 1999, Alain Rambach patenteou um método para a identificação de microorganismos com pelo menos dois substratos cromogênicos (US 5 962 251, 1999.10.05 "Method for the identification of microorganisms with at least two chromogens"). O meio prevê o emprego de agar, peptona, cloreto de sódio, extrato de levedura, extrato de carne e carboidratos (glucose), assim como substratos cromogênicos derivados da indoxila (bromo-indoxila, cloro-indoxila, di-cloro-indoxila, cloro-bromo-indoxila, entre outros ). Sua maior utilidade é para a demonstração de presença ou ausência de leveduras do gênero Candida, especialmente Candida albicans e Candida tropicalis, ainda que microorganismos de outros gêneros, tanto Gram positivos quanto Gram negativos crescem com diferentes tonalidades de cor, entre os quais se encontram os estreptococos. No entanto, a diversidade de organismos que se desenvolvem, igualmente ao caso anterior, impede uma adequada interpretação dos resultados; tem uma grande competição pelos substratos, pelo que os estreptococos podem encontrar-se inibidos e a diferenciação entre outras espécies de Streptococcus (no-grupo D) é impossível.

Outra série de meios cromogênicos desenvolvidos para a detecção, enumeração e identificação de patógenos urinários permite a identificação especificamente de Streptococcus do grupo D tais como: CPS ID2 (bioMerieux, França), Uriselect 3 (Sanofi Diagnostic) e Rainbow UTI (Biolog, USA) (Carricajo et al., 1999. Comparativo evaluation of five chromogenic media for deteccion, enumeration and identification of urinary tract pathogens. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 18(11), p. 796-803; Navarro et al., 1996. Evaluation of chromogenic médium CPS ID2 (bioMerieux) in urine cultures. Enferm Infecc Microbiol Clin Apr; 14(4), p. 215-9; Reisner and Austin, 1997. Evaluation of CPS ID2 chromogenic agar as a single médium for urine culture. Diagn Mierobiol Infect Dis Jul; 28(3), p. 113-7; Willinger and Manaff, 1995. Evaluation of a new chromogenie agar médium for the identification of urinary tract pathogens. Lett Appl Microbiol May 20(5), p. 300-2) e outros (Boclmer B. US 5 464 755. 1995.10.07. Microbiological médium and method of assay; Yagupsky et al., 2000. Clinicai evaluation of a novel chromogenic agar dipslide for diagnosis of urinary tract infections. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 19, p. 694-698).

Chen, Chun-Ming e colaboradores solicitaram uma patente de um método e meio para a detecção de enterococos vancomicina-resistentes (Chen, Chun-Ming; et al. Patent Application 20020132285-A1. 2002.09.19. Method and médium for deteccing vancomycin-resistant enterococcus). A invenção consiste na utilização de um nutriente, que ao ser metabolizado pelos microorganismos produz uma reação, neste caso a enzima β-D-glucosidase e a pirrolidonil-arilamidase. Deve-se assinalar que o meio é incapaz de identificar os enterococos sensíveis à vancomicina, assim como outras espécies de Streptococcus. Sua preparação é incômoda, pois necessita a adição de antibióticos como suplemento e a vancomicina não inibe algumas bactérias Gram negativas que podem crescer não meio, e ademais, requer-se provas adicionais para a identificação da espécie.

No pedido de patente US 20020086278-A1. 2002.06.04, Gosnell e colaboradores (Chromogenic media containing blood or hemin) descrevem um meio que contém sangue ou hemina e ainda substratos cromogênicos tais como: magenta, x-glucosídeo, x-glucuronídeo, Mag-Fosfato, entre outros. O meio permite o crescimento e a identificação de diferentes espécies pelas características morfológicas, o aparecimento das diversas tonalidades de cores, fluorescência e as reações hemolíticas. A invenção pode ser considerada como o protótipo mais próximo. O meio apresenta as seguintes desvantagens: • A presença de sangue ou hemina dificulta a correta interpretação das reações cromogênicas, em uma composição que não inibe a as bactérias Gram negativas, dentro das quais se encontra uma grande biodiversidade de microorganismos com atividade enzimática comum com a do gênero Streptococcus. • O tempo de vida útil do meio é limitado pela presença de componentes biológicos (sangue ou hemina), e sua preparação é incômoda. • Ao não ser um meio seletivo, podem se desenvolver outros gêneros Gram positivos e Gram negativos que competem pelos nutrientes, o que leva a que os microorganismos de interesse (Streptococcus) não cresçam adequadamente. • A utilização de sangue e hemina como suplemento toma complexa a preparação deste diagnosticador e aumenta o risco de contaminação do meio. • São necessários provas bioquímicas adicionais para a ulterior diferenciação de Streptococcus, o que leva a um período adicional de tempo para obter uma adequada identificação dos germes de interesse.

Especificamente necessita-se realizar uma prova de PYR adicional para diferenciar Streptococcus pyogenes dos Streptococcus do grupo D (Enterococcus). • Para a identificação de alguns microorganismos, é preciso ter em conta a morfologia, o tamanho e outras características das colônias, que são muito variáveis porque dependem do tipo de amostra, concentração inicial do microorganismo e microbiota acompanhante, entre outros fatores. • A possibilidade de que cresçam microorganismos de outros gêneros tais como: Proíeus, cuja característica fundamental é a formação de um véu no meio, toma impossível a identificação das colônias. • Outros microorganismos com capacidade hidrolítica sobre as proteínas podem hidrolisar a albumina e interferir na identificação. • Para a preparação do meio, prevê-se que os substratos cromogênicos podem ser adicionados ao meio fresco, preparado assepticamente, já que alguns deles são lábeis a altas temperaturas, o que toma complexa sua preparação. • As soluções dos cromogênicos, em alguns casos, formam precipitados insolúveis, sendo mais instáveis depois de uma semana, o que limita a vida útil do diagnosticador. t Quando se utiliza como base o Agar Chocolate, o meio é incubado em atmosfera de CO2 a 5%. • Alguns substratos cromogênicos necessitam ser dissolvidos em dimetil sulfóxido 0 que toma incômoda a preparação do meio. • Nalguns casos (Exemplo 3) os estreptococos do grupo D tomam uma cor igual a outros microorganismos (azul), entre os quais se encontram: Candida albicans, Gram negativos e Staphylococcus epidermidis. • Os substratos especialmente 0 magenta, obscurecem a cor dos meios com sangue depois da incubação, 0 que reduz a claridade da leitura e a aparência das reações hemolíticas. • Os substratos cromogênicos que dão coloração às colônias de púrpura, vermelho e magenta não contrastam adequadamente com o fundo vermelho do meio.

Divulgação da invenção O objetivo da presente invenção consiste em prever um meio seletivo para o isolamento e detecção de espécies do gênero Strepiococcus, possibilitando a diferenciação de Strepiococcus de importância clínica, tais como: Strepiococcus agalactiae, Strepiococcus pyogenes e Strepiococcus do grupo D (Enterococcus), em períodos prematuros de cultura (2-24 horas) e com uma elevada sensibilidade e especificidade analítica. A novidade da invenção proposta consiste em uma combinação de bases nutritivas especialmente selecionadas em quantidades de 15 a 58 g/1, que garantam um teor de nitrogênio total, fundamentalmente derivado das proteínas, entre 10 e 14%, uma mistura especialmente projetada de inibidores de microorganismos Gram negativos em quantidades de 0,55 a 1,63 g/1; uma mistura de substratos cromogênicos e/ou fluorogênicos, degradáveis por pelo menos uma enzima de cada espécie, em quantidades de 0,3 a 1,5 g/1 e compostos indicadores da atividade desaminase, em quantidades de 1 a 3 g/1. A mistura original de bases nutritivas está composta por extratos e hidrolisados de diferentes origens, especificamente selecionados entre: • Hidrolisado de sangue bovina de 5 a 10 g/1 • Extrato de coração de rês de 1 a 12 g/1 • Hidrolisado enzimático de músculo de coração de rês de 1 a 5 g/1 • Hidrolisado enzimático de proteínas lácteas de 5 a 20 g/1 • Hidrolisado enzimático de proteínas do feijão de soja de 2 a 15 g/1 • Hidrolisado enzimático de tecido animal de 1-5 g/1 • Autolisado ou hidrolisado de levedura Sacharomyces cerevisiae de 2 a 15 g/1. A peculiar mistura de inibidores nunca descrita inclui uma combinação de: Acetato de tálio de 0,55 a 1,6 g/1 Ácido nalidíxico de 0,005 a 0,030g/l Outro aspecto singular da invenção consiste no emprego da mistura de substratos cromogênicos e fluorogênicos que revelam a atividade fosfatase, glucosidase e glucuronidase para diferenciar as diversas espécies de Streptococcus, a qual contém: para-nitrofenilfosfato sal dissódico (PNP), de 0,2 a 0,8 g/1; x-glu (5-bromo-4-cloro-3-indolil-P-Dglucopiranosídeo), Mu-glu (4-metilumbeliferil PD-glucopiranosídeo), Salmon-glu (6-cloro-3-indolil-β-D-glucopiranosídeo) de 0,05 a 0,4 g/1 e x-gluc (5-bromo-4-cloro-3-indolil-P-D-glucuronídeo sal de ciclo-hexilamônio), Magenta-Gluc (5-bromo-6-cloro-3 -indolil-β-D-glucuronídeo sal de ciclo-hexilamônio) e MUG (triidrato de 4-metilumbeliferil β-D-glucuronídeo) de 0,05 a 0,2 Estas substâncias cromogênicas se combinam de maneira muito original, para garantir o aparecimento de cores ou fluorescências diferentes para cada espécie a detectar, sendo estas: a) PNP + x-glu + Magenta-gluc ou MUG

b) PNP + Salmon-glu + x-gluc ou MUG c) PNP + MU-glu + Magenta gluc ou x-gluc Outro aspecto singular da invenção, consiste em que se adicionam vários compostos que indicam a atividade desaminase no meio, como sejam: sais de metais trivalentes, preferivelmente citrato férrico-amoniacal em quantidades de 0,5 a 1,0 g/1 e aminoácidos aromáticos, preferivelmente a fenilalanina e o triptofano, em quantidades de 1,0 a 2,0 g/1. \ A composição acima descrita incorpora-se agar a 10,0 a 14,0 g/1 e obtém-se um meio que permite observar os caráteres culturais dos organismos de interesse. O meio formulado apresenta um valor de pH de 7 a 7,4 e é empregado em concentrações de 25 a 80 g/1 de água.

Com ajuda do meio, pela primeira vez, pode-se isolar e detectar de maneira exclusiva as diferentes espécies de Streptococcus, fundamentalmente as patogênicas ao homem, baseando-se somente no aparecimento de colônias de cores específicas para determinados gêneros, e em mudanças na cor do meio.

Deve-se ressaltar que pela primeira vez é previsto um meio de cultura seletivo que possibilita em uníssono, diferenciar os estreptococos do grupo D (enterococos) do resto dos estreptococos, e estes últimos entre si. Como exemplo pode-se assinalar: Streptococcus agalactiae e Streptococcus pyogenes, que crescem sem a presença de outras espécies de bactérias Gram negativas e de outras espécies de Gram positivas inibidas.

As vantagens do meio proposto na seguinte invenção consistem em que: • Pela primeira vez é possibilitada a diferenciação entre as espécies patogênicas, e entre estas e a maioria das não patogênicas do gênero Streptococcus. • O meio é altamente seletivo para Streptococcus, inibe a maioria das espécies de bactérias Gram negativas, com exceção de Proteus mirabilis ATCC 7002 que cresce no meio muito inibido, porém a altas concentrações toma o meio de uma cor diferente da dos estreptococos. Ademais, no mesmo, só se desenvolvem muito poucas espécies de outros organismos Gram positivos, que se encontram inibidos, e no caso de existir um crescimento deles escasso no meio, tomam uma coloração que não interfere com o crescimento abundante dos microorganismos de interesse. • A complexa e inédita mistura de bases nutritivas que contém o meio, garante a presença de aminoácidos, peptídeos, polipeptídeos, proteosas e peptonas das mais dissimilares origens e composição, e de maneira inesperada, possibilitam um crescimento abundante das espécies de interesse e permitem a exclusão de substâncias lábeis como a hemina e a sangue. • De especial relevância e novidade resulta a inclusão do hidrolisado enzimático de sangue na mistura antes mencionada, que garante a presença no meio de substâncias derivadas do sangue ou de suas frações necessárias para o crescimento de Streptococcus, sem prejudicar a identificação. Por outra parte as proteínas do sangue já digeridas não afetam a estabilidade do meio. • Os estreptococos no meio, ao contar com os nutrientes suficientes para seu rápido crescimento, e ante a ausência de outros organismos competidores, se desenvolvem mais rapidamente e podem ser isolados e identificados em um período máximo de incubação de 6 a 24 horas. • A sensibilidade e especificidade são elevadas, não podem ser confundidas com bactérias Gram negativas tais como: Shigella e Escherichia coli, pois estas não crescem no meio, e as poucas espécies de Gram positivos que conseguem se desenvolver no meio (Staphylococcus xylosus e Staphylococcus saprophyticus), encontram-se quase totalmente inibidas e ademais não podem confundir-se com o resto porque tomam uma coloração diferente. Se alguma cepa apresenta crescimento similar a Streptococcus, ela pode ser diferenciada realizando diretamente na placa a prova de catalase. • Na presente invenção não se adicionam substâncias altamente tóxicas nem contaminantes do meio ambiente, pelo que o meio pode ser produzido em escala industrial e preparado em laboratório, sob condições adequadas e próprias da atividade. • a efetividade dos inibidores contemplados na formulação evita o uso de antibióticos lábeis, o que ajuda que a preparação do meio seja simples e além disso não existam erros na identificação por fenômenos de resistência aos antimicrobianos. • A combinação de inibidores, na concentração a que se encontram no meio e sua relação com os nutrientes não inibem nenhuma espécie de Streptococcus, o que amplia o espectro diagnóstico do meio como nunca antes, porém especifícamente para este gênero. • Ao serem detectados e diferenciados adequadamente os estreptococos de interesse, com alta sensibilidade e especificidade, não é necessário recorrer à realização de provas bioquímicas adicionais, o que possibilita ter um diagnóstico prematuro. • A preparação deste diagnosticador é extremamente simples pois em alguns casos, o meio pode não ser esterilizado em autoclave, e em outros, só se adiciona um suplemento. • A vida útil do meio preparado é considerável, já que contém inibidores da maioria dos contaminantes ambientais e não contém substâncias lábeis (como a hemina, sangue e antibióticos). • A identificação das bactérias de interesse, ao ser realizada só pelas características culturais (cor das colônias e do meio), exclui a necessidade de observar em profundidade características morfológicas das colônias, facilitando a interpretação dos resultados por um pessoal treinado porém não especializado. • O uso de mais de um marcador enzimático para a diferenciação das diversas espécies do gênero Streptococcus aumenta a especificidade e a sensibilidade do diagnosticador. • A formulação reportada no pedido possibilita preparar o meio a diferentes concentrações para múltiplas apresentações, por exemplo: a concentração simples em meio agarizado, a dupla concentração para ser empregado nas técnicas de filtração por membrana, ou em forma de caldo, e inclusive a uma concentração maior para sistemas miniaturizados. • Com este meio se consegue substituir o emprego de diferentes meios tradicionais ou cromogênicos utilizados na identificação de diferentes espécies dentro do gênero Streptococcus. • A formulação proposta possibilita seu emprego na busca de Streptococcus em amostras clínicas ou veterinárias, de águas e outros elementos do ambiente assim como em alimentos. • Consegue-se o isolamento e identificação simultâneos em uma única etapa, com a consequente redução de tempo, de recursos e pessoal.

Para a definição da composição do meio, os componentes utilizados na preparação eram preferivelmente sólidos. A descrição das etapas a seguir para a preparação dos mesmos é apresenta abaixo: A mistura de bases nutritivas, cujo teor de nitrogênio total se encontra entre 10 e 14 %, é peneirada para obter uniformidade no tamanho das partículas.

Ditos ingredientes de origem protéica estão em uma quantidade de 15 a 58 g/1, especificamente de hidrolisado de sangue bovino de 5-10 g/1, Extrato de coração de rês de 1-12 g/1, hidrolisado enzimático de músculo de coração de rês de 1-5 g/1, hidrolisado enzimático de proteínas lácteas de 5-20 g/1, hidrolisado enzimático de proteínas do feijão de soja de 215 g/1, hidrolisado enzimático de tecido animal de 1-5 g/1, autolisado ou hidrolisado de levedura Sacharomyces cerevisiae de 2-15 g/1.

Os agentes seletivos são selecionados entre: acetato de tálio de 0,55 a 1,6 g/1 e ácido nalidíxico de 0,05 a 0,030g/l. Da mesma forma são peneirados, ficando prontos para ser misturados e homogeneizados com o resto dos componentes.

Os compostos cromogênicos e fluorogênicos para detectar a atividade glucosidase, fosfatase e glucuronidase em quantidades de 0,3 a 1,5 g/1, são pré-misturados, e além eles podem ser moídos e peneirados previamente à sua homogeneização de maneira tal que pesando a soma da quantidade de cada componente na formulação, consegue-se uma distribuição adequada de cada um.

Os substratos cromogênicos e fluorogênicos são selecionados em função do objetivo do meio, dentre: o p-nitrofenilfosfato sal dissódico, de 0,2 a 0,8 g/1, x-glu (5-bromo-4-cloro-3-indolil-(3-D-glucopiranosídeo), Mugiu (4-metilumbeliferil β-D-glucopiranosídeo), Salmon-glu (6-cloro-3-indolil-β-D-glucopiranosídeo) de 0,05 a 0,4 g/1 e x-gluc (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-glucuronídeo sal de ciclo-hexilamônio), Magenta-gluc (5-Bromo-6-cloro-3-indolil-(βD-glucuronídeo sal de ciclo-hexilamônio) e MUG (tri-idrato de 4-metilumbeliferil ^D-glucuronídeo) de 0,05 a 0,2 g/1. A formação da mistura de substâncias cromogênicas e fluorogênicas degradáveis por ao menos uma enzima de cada espécie foi realizada, em combinações tais, que garantem o aparecimento de cores ou fluorescência diferentes para cada espécie como se descreve a seguir: a) PNP + x-glu + Magenta-gluc ou MUG

b) b) ΡΓΤΡ + Salmon-glu + x-gluc ou MUG c) PNP + Mu-glu + Magenta-gluc ou x-gluc O agente gelificante, preferivelmente agar, de dureza entre 400 e 700 g/cm2, é utilizado em quantidades entre 10,0 a 14,0 g/1, especificamente para o meio sólido, é secado e peneirado se antes de ser agregado ao meio.

Todos os componentes acima mencionados, assim como a pré-mistura, são unidos e homogeneizados até obter um teor uniforme com um pH entre 7,0 e 7,4. A dita mistura é envasada em frascos hermeticamente fechados, protegidos da luz, mantendo-se os mesmos à temperatura ambiente. O pó é adicionados em quantidades de 30 a 80 g/1, e desta maneira se restitui e se obtém a suspensão da composição. A composição pode ser preparada em escala de laboratório, pesando os componentes separadamente dentro de um recipiente e mantendo as proporções antes mencionadas. Adiciona-se posteriormente o líquido sobre a mistura de pós pouco a pouco, até obter a completa dissolução. A suspensão é agitada e é deixada em repouso por pelo menos 10 minutos.

Se se prepara o meio agarizado, este pode ou não ser esterilizado previamente à adição do p-nitrofenilfosfato sal dissódico. Sempre que se tenham tomado precauções na preparação, é suficiente o aquecimento até ebulição, pois o meio é altamente inibidor dos microorganismos ambientais que possam contaminá-lo. Do contrário, o meio é esterilizado a 115°C durante 10 minutos e posteriormente, depois de resffiá-lo até 45-50°C adiciona-se ao mesmo o PNP filtrado através de um filtro esterilizante. Para o caso do meio líquido, sempre se esteriliza em autoclave e se ajunta o suplemento estéril. Uma vez o meio pronto ele é distribuídos no recipiente final de ensaio.

Em função da consistência do meio (sólido ou líquido) empregam-se diferentes métodos de inoculação.

Uma vez inoculados, eles são incubados a temperatura de 30 a 37°C por pelo menos 2 a 6 horas em caso do meio liquido e de 18 a 24 horas para o meio sólido. A leitura dos resultados é realizada no caso do meio sólido, observando a cor das colônias isoladas na superfície e do meio. Para o meio liquido só se observa a mudança de coloração do meio e a fluorescência. De maneira que se pode diferenciar os estreptococos do grupo D do resto das espécies deste gênero.

Os estafilococos, no general, não se desenvolvem no meio ou se encontram muito inibidos, sendo observados como colônias pequenas incolores (Staphylococcus saprophyticus) ou de cores diferentes aos estreptococos, que não interferem na identificação dos organismos de interesse.

Os enterococos são observados como de cor rosa, azul ou fluorescentes conforme a combinação dos substratos empregados, enquanto que em função da combinação utilizada os estreptococos são observados como amarelo, amarelo esverdeado, verde, magenta, azuis ou fluorescentes, sempre que se utilize um substrato diferente do empregado para revelar a presença de enterococos.

Exemplos de Realização Exemplo No. 1 Uma série de misturas de bases nutritivas foi ensaiada como componentes nutricionais na formulação. Nos experimentos construíram-se 3 variantes, cuja composição aparece na tabela 1. Os ingredientes são reconstituídos em 100 ml de água e procedeu-se à sua preparação conforme a descrição detalhada da presente invenção. A avaliação da capacidade de promoção do crescimento foi realizada com cepas de coleção em comparação com o meio de referência (Caldo de Enriquecimento seletivo de Estreptococos, Merek, lote: 86444327).

Em cada tubo inoculou-se 0,1 ml da solução padronizada ao 50% de transmitância de cada microorganismo.

As curvas de crescimento aparecem nas figuras 1,2 e 3.

Os resultados da promoção do crescimento dos estreptococos foram altamente satisfatórios. No caso de Streptococcus agalactiae observou-se que as 3 composições características da presente invenção promoviam com maior intensidade o crescimento durante as 8 primeiras horas com respeito ao meio de controle e inclusive a variante 1 promoveu o crescimento de maneira muito superior até 9 horas.

No caso de Streptococcus faecalis observou-se uma maior aceleração do crescimento nas 4 primeiras horas, nas variantes experimentais, com respeito ao controle e no caso de Streptococcus pyogenes, a partir das 6 horas o crescimento resultou significativamente superior nas novas composições propostas.

Tabela 1. Composição de bases nutritivas das diferentes variantes experimentais___________________________________________________________ Exemplo No. 2 Preparou-se a composição com os ingredientes segundo o exemplo 1, porém pesados em separado dentro de um matraz de Erlenmeyer. Como agentes promotores do crescimento e marcadores enzimáticos utilizou-se os seguintes ingredientes: Na formulação não se empregou agar. Adicionou-se à mistura de ingredientes sólidos 100 ml de água deionizada e se procedeu à preparação da composição conforme exposto na descrição detalhada.

Inocularam-se cepas de coleção de Streptococcus pyogenes ATCC 19615, Streptococcus agalactiae ATCC 12386, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Enterococcus faecalis ATCC 19433, Enterococcus faecium ATCC 6056. Ditas cepas foram inoculadas de forma direta com uma solução padronizada a 50% de transmitância nos tubos de cada uma.

Obteve-se em 18 horas que o meio se tomou azul-esverdeado no caso de Enterococcus faecalis ATCC 29212 e 19433. A cepa de Enterococcus faecium mostrou uma coloração azul escuro, Streptococcus agalactiae se tomou verde e Streptococcus pyogenes foi observado como de cor amarelo-esverdeado.

Os resultados mostram a rapidez da resposta dos microorganismos no tempo e a possibilidade de diferenciar os enterococos (grupo D) do resto dos estreptococos ao se tomar de uma coloração entre verde-azul a azul e os estreptococos, tais como: Streptococcus pyogenes e Streptococcus agalactiae mostram uma coloração amarela esverdeada.

Para comprovar a certeza da seleção do substrato cromogênico x-glu foi preparado um meio cuja composição era similar à descrita anteriormente, com a diferença de que se empregou a esculina. A quantidade utilizada era de 0,1 g/100 ml, e além disso adicionou-se sais de ferro em uma concentração de 0,05 g/100 ml.

Estes ingredientes foram pesados em separado em um matraz de Erlenmeyer, posteriormente se adicionou 100 ml de água deionizada e se procedeu à preparação.

Foram inoculadas cepas de coleção de Streptococcus pyogenes ATCC 19615, Streptococcus agalactiae ATCC 12386, Enterococcus faecalis ATCC 29212 e algumas cepas isoladas de amostras clínicas (4 enterococos e 4 β hemolíticos). Ditas cepas foram inoculadas de forma direta com uma solução padronizada a 50% de transmitância nos tubos de cada uma. A resposta obtida tanto para Enterococcus faecium como Enterococcus faecalis foi uma mudança de coloração do meio para negro, o que mascara as demais reações enzimáticas para as quais algumas espécies podem ser positivas.

Quanto a Streptococcus pyogenes e Streptococcus agalactiae ambas tomarão o meio de cor verde oliva. As 4 cepas isoladas de enterococcus deram uma cor negra, da mesma forma que 3 dos estreptococos β hemolíticos. Somente um β hemolítico foi observado como de cor verde oliva da mesma forma que Streptococcus pyogenes e Streptococcus agalactiae.

Os resultados obtidos foram apreciados de forma prematura contudo embargo a coloração enegrecida como resultado da hidrólise da e seu li na limita a identificação, pois impossibilita a leitura do resto das reações.

Como conclusão o experimento permitiu comprovar a aceitação da inclusão do x-glu como ingrediente na formulação do meio, e uão o uso de esculína.

Exemplo No. 3 A composição do meio foi preparada conforme o exemplo 2, com a diferença de que se aumentou a concentração dos componentes nutritivos e os marcadores enzimáticos. Pesou-se em separado dentro de um matraz de Erlenmeyer as seguintes quantidades;

Adicionou-se à mistura de ingredientes sólidos 100 ml de água deionizada e procedeu-se à preparação.

Foram inoculadas cepas de coleção, tais como: Streptococcus pyogenes ATCC 19615, Streptococcus agalactiae ATCC 12386, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Enterococcus faecalis ATCC 19433, Enterococcus faecium ATCC 6056 e algumas cepas isoladas; Enterococcus avium (isolado). Ditas cepas foram inoculadas de forma direta nas cavidades de um jogo de micro tubos de polipropileno (Módulo 250 pp, NUNC, lote: 046247) adicionando 0,1 ml de uma solução padronizada à escala 3,0 de McFarland em 0.1 ml de meio, Em 2 horas observou-se mudanças de coloração do meio para azul-esverdeado para Enterococcus faecalis ATCC 29212, azul para Enterococcus faecalis ATCC 19433, Enterococcus avium se tomou amarelo-esverdeado, Enterococcus faecium de cor azul claro, Streptococcus pyogenes e Streptococcus agalactiae se mostraram de cor amarelo intenso. A resposta se manteve no tempo (até 6 horas). Os resultados demonstraram a rapidez na resposta às reações enzimáticas, e a possibilidade de desenvolver uma prova rápida para a identificação de espécies do gênero Streptococcus.

Exemplo No. 4 A composição dos ingredientes foi preparada conforme o exemplo 2, com a adição de um agente gelificante (agar) em uma concentração de 6,5 g/500 ml. Pesou-se os componentes em separado em um matraz de Erlenmeyer e adicionou-se à mistura de ingredientes sólidos 500 ml de água deionizada. Posteriormente procedeu-se à preparação conforme o exemplo 1.

Foram inoculadas cepas de coleção, tais como: Streptococcus pyogenes ATCC 19615, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Enterococcus faecalis ATCC 19433, Enterococcus faecium ATCC 6056.

Elas foram inoculadas por espalhamento na superfície do gel, até obter colônias isoladas.

Obteve-se em 24 horas uma coloração verde-claro das colônias com mudança do meio para amarelo de Streptococcus pyogenes. As cepas de Enterococcus faecalis ATCC 29212 e 19433 mostraram características culturais similares, se tomaram de uma coloração azul com um pequeno halo azul em volta. Quanto a Enterococcus faecium, as colônias foram observadas menores que o resto dos enterococos, de cor azul com um pequeno halo azul em volta. Exemplo No. 5 Foi preparada a composição do meio pesando os ingredientes em separado em um matraz de Erlenmeyer conforme o exemplo 4, com a diferença de que os marcadores enzimáticos se encontram em uma concentração menor (0,2 g/1 de p-nitrofenilfosfato sal dissódico e 0,1 g/1 de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-P-D-glucopiranosídeo). O método de preparação foi o descrito não exemplo 1.

Foram inoculadas por espalhamento na superfície do gel, cepas de coleção de: Streptococcus pyogenes ATCC 19615, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Enterococcus faecium ATCC 6056, Staphylococcus aureus ATCC 25923 e uma cepa isolada de Enterococcus avium. A leitura realizada a 24 horas da avaliação da composição com as cepas de coleção foi observada conforme se mostra na tabela No. 2.

Tabela No. 2 Características de crescimento e das colônias dos microorganismos no meio sólido.

Exemplo No. 6 A composição foi preparada com os ingredientes conforme o exemplo 2, com a diferença de que o substrato cromogênico x-glu (5-bromo-4-cloro-3-indolil^-D-glucopiranosídeo) foi substituído por Mu-glu (4-metilumbeliferil β-D-glucopiranosídeo) em uma concentração de 0,05 g/1. O método de preparação era similar ao exemplo 2.

Na avaliação foram empregadas cepas de coleção de: Enterococcus faecalis ATCC 29212, Enterococcus faecium ATCC 6056, Streptococcus lactis ATCC 11454 e uma cepa isolada de Enterococcus avium. Ditas cepas foram inoculadas de forma direta nas cavidades de um jogo de microtubos de polipropileno (Módulo 250 pp, NUNC, lote: 046247) adicionando 0,1 ml de uma solução padronizada na escala 2,0 de McFarland em 0,1 ml de meio.

Conseguiu-se a partir de 2 horas detectar o crescimento dos microorganismos ensaiados e a fluorescência de cor azul sob luz ultravioleta (365 nin) de Enterococcusjaecalis e Enterococcusfaecium. A leitura em 6 horas mostrou que todas as cepas inoculadas possuíam atividade glucosidase, já que respondiam com uma fluorescência de cor azul ao ser iluminadas com luz ultravioleta.

Demonstrou-se que é possível a utilização do substrato fluorogênico Mu-glu (4-metilumbeliferil β-D-g lucopiranosídeo), pois a detecção dos estreptococos (enterococos) foi rápida.

Exemplo No. 7 Preparou-se a composição do meio pesando os ingredientes em separado em um matraz de Erlenmeyer. Foram ensaiadas 2 misturas de inibidores no meio sólido. A seguir descreve-se a composição de agentes promotores do crescimento, marcadores enzimáticos e inibidores utilizados: Procedeu-se à preparação conforme o exemplo 1. O método de inoculação empregado foi por espalhamento na superfície do gel. Na avaliação, utilizou-se cepas de coleção de: Proteus mirabilis ATCC 7002, Proteus mimbiiis ATCC 12433, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus xylosus ATCC 29971, Staphylococcus' saprophyticus ATCC, Enterococcus faecium ATCC 6056, Streptococcus agalactiae ATCC 12386, Streptococcus faecalis ATCC 29212 e a cepa isolada de Enterococcus avium.

Realizou-se a leitura a 24 horas, os resultados do comportamento dos microorganismos no meio são mostrados na tabela No. 3. Deve-se destacar que os resultados obtidos em ambas variantes (VI e V2) foram similares.

Tabela No. 3. Características do meio e das colônias Legenda: +: crescimento bom -: crescimento inibido As cepas de Proteus mirabilis se mantiveram inibidas, evidenciando o poder inibitório do meio para os organismos Gram negativos.

Algumas cepas de Staphylococcus se desenvolveram no meio, contudo tomaram colorações diferentes aos estreptococos, porém além disso realizou-se a prova rápida da catalase, adicionando uma gota do reativo no meio, obtendo a completa diferenciação de ambos gêneros.

Exemplo No. 8 A composição dos ingredientes foi preparada conforme exemplo 7, os componentes foram pesados em separado em um matraz de Erlenmeyer com a diferença de que se substituiu x-gluc (5-bromo-4-cloro-3-indolil-(P-D-glucuronídeo sal de ciclo-hexilamônio) por Magenta-gluc (gluc (5-Bromo-6-cloro-3-indolil-pD-glucuronídeo sal de ciclo-hexilamônio). O método de preparação foi similar ao exemplo 7.

Foram inoculadas cepas de coleção de Proteus mimbilis ATCC 7002, Staphylococcus epidemúdis ATCC 12228, Staphyíococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus xyhsus ATCC 29971, Enterococcus faecium ATCC 6056, Streptococcus agalactiae ATCC 12386, Streptococcus pyogenes ATCC 19615, Streptococcus faecalis ATCC 29212 e as cepas isoladas de Enterococcus ovium e Staphylococcus saprophyticus.

Os resultados do comportamento dos microorganismos no meio são mostrados na tabela No, 4.

Tabela No. 4, Características do meio e das colônias Legenda: +: crescimento bom crescimento inibido Observou-se um. crescimento prematuro e diferenciado das espécies de Streptococcus, pelas diferentes colorações desenvolvidas no meio.

Algumas cepas de Staphylococcus se desenvolveram no meio e tomaram colorações diferentes aos estreptococos, ainda qm Streptococcus xylosus se tomou de uma cor similar a Streptococcus agalactiae f porém se diferenciou pois não tomou a cor do meio amarela. Não obstante realizou-se a prova rápida da caialase, adicionando uma gota do reativo no meio, e se obteve a identificação do gênero Staphyíococcus, produto da liberação de Hi e Ch (formação de bolhas).

Exemplo No. 9 Preparou-se a composição do conforme o exemplo 8, com a diferença de que se substituiu X-gluc pelo substrato fluorogênico MUG, em uma concentração de 0,05 g/l. Adicionou-se à mistura de ingredientes sólidos água deionizada e se procedeu à preparação da composição até sua gelificação conforme se descreveu no exemplo número 1.

Foram inoculadas por espalhamento cepas de coleção de Pmteus mimhiiis ATCC 7002, Staphyíococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus xylosus ATCC 29971, Etuerococcus faecium ATCC 6056, Strepiococcus agalactiae ATCC 12386, Streptococcm pyogenes ATCC 19615, Streptococcusfaecalis ATCC 29212 e a cepa isolada de : Entemcoccus avium (Costa Rica) e Staphyíococcus sapmphytkus. Realizou-se leitura a 24 horas, conforme a tabela No. 5.

Tabela No. 5 Características do crescimento e as colônias a as 24 horas de incubação Legenda: +: bom crescimento e 'fluorescência positiva ±: crescimento escasso -: crescimento inibido Exemplo No. 10 Preparou-se a composição do meio pesando os ingredientes em separado em um matraz de Erlenmeyer. O meio foi preparado com a mesma relação de bases nutritivas que o exemplo 7, com a exceção de que se adicionou hidrolisado enzimático de sangue bovino em quantidades de 1,911 g/300 ml. Também foram se ensaiados dois marcadores enzimáticos diferentes em concentração de 1,0 g/1 com a adição de 0,5 g/. de citrato férrico-amônico e duas concentrações diferentes de ácido nalidíxico 0,015 g/1 e 0,010 g/1. A seguir descreve-se a composição de marcadores enzimáticos e inibidores utilizados: Procedeu-se à preparação conforme o exemplo 1. O método de inoculação empregado era: espalhamento na superfície do gel e no caso dos microorganismos utilizados como controles positivos se inoculou também por diluições (104 e 10"5). Na avaliação utilizou-se cepas de coleção de: Proteus mirabilis ATCC 7002, Proteus mirabilis ATCC 12433, Citrobacter freundii ATCC 8090, Citrobacíer freundii ATCC 10625, Enterococcus faecium ATCC 6056, Streptococcus agalactiae ATCC 12386, Streptococcus faecalis ATCC 29212 e a cepa isolada de Enterococcus avium.

Os resultados do comportamento dos microorganismos no meio são mostrados na tabela No. 6.

Tabela No. 6. Avaliação do comportamento dos diferentes microorganismos (incubação 35°C por 24 h).

Experim: Composição da presente invenção ATS: Agar Triptona Soja UFC/ml: Unidades Formadoras de Colônias por cada ml de diluição 10'5 No meio se observa o crescimento de Streptococcus agalactiae, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium e Enterococcus avium a altas diluições, demonstra-se o crescimento diferenciado das diferentes espécies dentro do gênero Streptococcus.

Foram inoculadas cepas de microorganismos Gram negativos, utilizando como referência o meio tradicional Agar Triptona Soja. Ao realizar a comparação com o meio controle se comprovou o poder inibitório da formulação de dita invenção ao observar a inibição total dos gêneros Citrobacter e Proteus.

Breve Descrição das Figuras Figura 1: Curvas de crescimento de Enterococcus faecalis ATCC 29212 nas diferentes misturas de bases nutritivas.

Figura 2: Curvas de crescimento de Streptococcus agalactiae ATCC 12386 nas diferentes misturas de bases nutritivas.

Figura 3: Curvas de crescimento de Streptococcus pyogenes ATCC 19615 nas diferentes misturas de bases nutritivas.

REIVINDICAÇÕES

Claims (9)

1. Meio de cultura seletivo para o isolamento e/ou detecção prematura de espécies do gênero Sfreptococvus, caracterizado pelo fato de que contém uma mistura de bases nutrientes em qualidades de 15a 58 g/L que garante um teor de nitrogênio total, derivado fundamental mente de proteínas, de 10 a 14 % selecionado dentre o grupo que consiste em hidrolisado de sangue bovino, extraio de coração de rês, hidrolisado enzimático de músculo de coração de rês, hidrolisado enzimático de proteínas lácteas, hidrolisado enzimático de proteínas do feijão de soja, hidrolisado enzimático de tecido animal, autolisado ou hidrolisado de levedura Sacharamyces cerevisiae, e suas misturas, um grupo inibidor de micro-organisinos gram-negativos em uma quantidade total de 0,55 a 1,63 g/L composto pela mistura de acetato de tálio e ácido nalidtxico, uma mistura de substâncias fluorogênicas e cromogênieas degradáveis por pelo menos uma enzima específica de espécies diferentes de Streptococcus cm quantidades de 0,3 a 1,5 g/L selecionadas dentre o sal dissódico de p-nitrofeni 1 fosfato, 5-bromo-4-cloro-3-indolil- βΟ-gl ucopi ranosídeo, 4-metiIumbeliferi l- βθ-gl ucopi ranosídeo, 6-c loro-3-indoli 1-pD-glucopíranosídeo, sal de ciclo-hexilamônio de 5-bromo-4-cloro-3-indoli 1 -pD-glucuronídeo, sal de ciclo-hexilamônio de 5-bromo-6-cloro-3-indolil-pD-glicuronídeo e triidrato de 4-metilumbeliferil-pD- glucuronídeo, e indicadores de atividade de deaminase que consistem em sais de metais trivalentes e aminoácidos aromáticos, em quantidades de 1 a 3 g/L.

2. Meio de cultura de acordo com a reivindicação 1, caracierizado pelo fato de que contém bases nutrientes nas seguintes quantidades no meio: • Hidrolisado de sangue bovino de 5 a 10 g/L • Extrato de coração de rês de 1 a 12 g/L • Hidrolisado enzimático de músculo de coração de rês de 1 a 5 g/L • Hidrolisado enzimático de proteínas lácteas de 5 a 20 g/L • Hidrolisado enzimático de proteínas do feijão de soja de 2 a 15 g/L • Hidrolisado enzimático de tecido animal de 1-5 g/L • Autolisado ou hidrolisado de levedura Sacharomyces cerevisiae de 2 a 15 g/L.

3. Meio de cultura de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que contém um grupo inibidor de substâncias nas seguintes quantidades no meio: • acetato de tálio de 0,55 a 1,6 g/L • ácido nalidíxico de 0,005 a 0,030 g/L.

4. Meio de cultura de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que contém substâncias cromogênicas e fluorogênicas degradáveis para pelo menos um dos organismos a ser identificado, selecionado dentre as seguintes quantidades no meio: • sal dissódico de para-nitrofenilfosfato (PNP), de 0,2 a 0,8 g/L; • 5-bromo-4-cloro-3-indolil-P-Dglucopiranosídeo (x-glu), 4-metilumbeliferil pD-glucopiranosídeo (Mu-glu), 6-cloro-3-indolil-PD-glucopiranosídeo (Salmon-glu) de 0,05 a 0,4 g/L • sal de ciclo-hexilamônio de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-glucuronídeo (x-gluc), sal de ciclo-hexilamônio de 5-bromo-6-cloro-3-indolil-PD-glucuronídeo (Magenta-Gluc) e triidrato de 4-metilumbeliferil PD-glucuronídeo (MUG) de 0,05 a 0,2 g/L.

5. Meio de cultura de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que contém indicadores de atividade deaminase nas seguintes quantidades no meio: • sais de metal trivalente, preferivelmente, citrato férrico-amoniacal em quantidades de 0,5 a 1,0 g/L • aminoácidos aromáticos, preferivelmente, a fenilalanina e o triptofano, em quantidades de 1,0 a 2,0 g/L.

6. Meio de cultura de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela conformação da mistura das substâncias cromogênicas e fluorogênicas degradáveis para pelo menos uma enzina de cada espécie de Streptococcus, tal que as combinações garantam o aparecimento de cores ou fluorescências diferentes para cada espécie, como se segue: a) PNP + x-glu + Magenta-gluc ou MUG b) PNP + Salmon-glu + x-gluc ou MUG c) PNP + Mu-glu + Magenta-gluc ou x-gluc; em que PNP significa p-nitrofenilfosfato sal dissódico, x-glu significa 5-bromo-4-cloro-3-indolil-(3-D-glucopiranosídeo), Magenta-gluc siginifica 5-bromo-6-cloro-3-indolil-(PD-glucuronídeo sal de ciclo-hexilamônio), MUG siginifica tri-idrato de 4-metilumbeliferil- βϋ-glucuronídeo, Salmon-glu significa 6-cloro 3-indolil-pD-glucopiranosídeo, x-gluc significa 5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-D-glucuronídeo sal de ciclo-hexilamônio e Mu-glu significa 4-metilumbeliferil β-D-glucopiranosídeo.

7. Meio de cultura de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de conter também agar de dureza entre 400 e 700 g/cm2 em quantidades de 10 e 14 g/L para preparação na forma sólida do meio.

8. Meio de cultura de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que apresenta um valor de pH de 7,0 a 7,4.

9. Meio de cultura, de acordo com as reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que são adicionados de 25 a 80 g/L da mistura de seus componentes do meio a 1 litro de água destilada ou deionizada.