CN107743519A

CN107743519A - 用于分离包括传统培养基中无法培养的如支原体的物种的临床样本的培养基

Info

Publication number: CN107743519A
Application number: CN201680020698.0A
Authority: CN
Inventors: I·特玛戈马丁内斯
Original assignee: Cpm Di Claudio Pierre Marty Co Ltd
Current assignee: C.P.M.迪克劳迪奥皮尔玛蒂有限公司; Cpm Di Claudio Pierre Marty Co Ltd
Priority date: 2015-04-01
Filing date: 2016-03-31
Publication date: 2018-02-27
Also published as: US10920188B2; WO2016157109A1; US20180080005A1; EP3277794A1

Abstract

本发明涉及特异性的用于支原体属微生物的培养基，具体地，用于难以培养的支原体物种(生殖支原体、肺炎支原体、透支原体、发酵支原体、梨支原体和/或猪鼻支原体)。本发明还提供一种用于属于支原体属的物种生长和/或分离和/或鉴定的体外方法以及使用该培养基的生长支持物。

Description

用于分离包括传统培养基中无法培养的如支原体的物种的临床样本的培养基

详述

本发明涉及用于支原体属微生物的特异性的培养基，并且，具体地，涉及难培养的支原体(生殖支原体、肺炎支原体、透支原体、发酵支原体、梨支原体(Mycoplasma pirium)、猪鼻支原体)。本发明还提供了用于属于支原体属物种的生长和/或分离和/或鉴定的体外方法以及使用这种培养基的生长支持物。

在先技术的状态

支原体是能够自由生活的最小的微生物，它们与病毒不同，可在无细胞的培养基中生长，它们通过二分裂繁殖，因缺乏细胞壁而与细菌不同；然而，它们有三层构成的细胞膜，包括细菌或病毒中均不存在的为结构提供支撑的固醇类物质(1-9)。

如果将它们保持在包括其繁殖所需的全部蛋白质络合物的渗透稳定的培养基中，它们没有细胞壁即可存活。可以在动物有机体中或在细胞培养基或具有高度复杂配方的培养基中发现这种情况。

支原体属(支原体科、支原体目)的细菌属于柔膜细菌(“光滑的皮肤”)类，它们代表一组复杂而精细的微生物，在原核生物中具有独特性，对于微生物学家来说，目前是一谜团。

它们在大自然中普遍存在，目前已知物种的数量正在增加，约为200种，其中许多表现为共生，而其他物种对于人类和动物和植物而言都是致病性的(7-14)。

在人类中分离出14个物种，其中12个属于支原体属和2个物种(变型微小脲原体(Ureaplasma biovar parvum)和解脲脲原体)属于脲原体属。14个物种中的6个主要位于泌尿生殖道(14-21)。

支原体具有3个主要的生物学特征，使得它们不同于其它的细菌，并且表征了其与宿主有机体相关的行为特征。这些特征是：

1-无细胞壁，且已知在自由生活的微生物中尺寸最小，如其细胞大小(0.2-0.8μm)和其基因(genoma)大小。这种生殖支原体具有包含在能够自动复制的细胞中的最小的基因(580kb，且仅381个基因)，其基因含量决定了用于DNA复制和修复以及遗传转录和翻译所必需的基因的最小数量；

2-代谢途径的有限预知。肺炎支原体和生殖支原体的基因组的完整表征证明不存在涉及氨基酸合成的基因并且缺乏用于维生素，核酸、脂肪酸和胆固醇前体生物合成的基因，因此它们完全依赖于他们自己的外源供应，来自宿主生物体的细胞或来自复杂和丰富的培养基，尽管其复杂的组成仅能使得最严苛的支原体物种在2周或更长时间内生长；

3-微生物－宿主相互作用，其表现为与上皮细胞和免疫系统的细胞的表面寄生，并且作为一些物种的兼性形式(保持体外细胞外和细胞内活力的能力)的细胞内定位。

基因组大小及其碱基组成构成支原体的主要性质。与他们自己的大小相比，支原体物种的基因组为从600到2300kb的范围。例如，肺炎支原体具有816kb的基因组，而生殖支原体的基因组甚至更小，因为其为580kb，并且目前在最先进的研究中，倾向于将其用作研究最小基因组的参考，以具有自主活力为目的。

因此可以理解，对于这些药物的复制，强加了复杂的营养需求，因为它们缺乏表征大部分细菌的几种酶学途径，并且它们完全依赖于例如氨基酸、核苷酸、脂肪酸和甾醇类的生物合成前体的外源供应(22-26)。

不同的支原体物种的鉴定和实验室的诊断基于基本的细菌学检验，比如：形态学、菌株特征、生化和生理测试。这些测试的实施需要培养菌株，这对某些物种来说是困难的、复杂的和昂贵的。

人源性支原体的生长只能通过分离具有确定的致病潜力并且在特异的和标准化的培养基(如脲原体、人支原体和肺炎支原体)中生长相当满意的物种来进行。所有的支原体物种需要复杂的培养基，由甾醇类、脂肪酸、氨基酸和满足营养需求的其他化合物构成。其处理需非常小心，并且需要检查其全部和每个组分。因此，很少有临床实验室提供用作支原体感染的诊断方法的培养基。然而，培养基仍然是临床分离(包括抗性研究)的生物学和分子表征的基础。

必须用分子技术(27-30)检测极度刺激性的物种，比如生殖支原体、发酵支原体、透支原体和梨支原体(Mycoplasma pirum)。

在开发用于微生物诊断的分子技术后，目前已经开发了分析基因组DNA、核糖体RNA等方法，尽管它们是昂贵的方法，并且其中一些方法只能在具有精密设备、配有高素质人员的实验室中应用。然而，目前有一些分子技术仅对某些支原体物种的诊断足够有效，而其它物种则由于开发复杂性和高成本还在研究中。

总而言之，已知的现有培养基主要用作支原体菌株增殖和生长的工具。

已知培养基的组成变化能够鉴定特征为生长相对较快的某些支原体物种，例如在包括氨基酸，例如，用于培养人支原体的精氨酸或用于培养微小脲原体和解脲支原体的尿素的培养基的情况下。在肺炎支原体的情况下，可以通过使用包括葡萄糖的市售的培养基进行培养，但是仅在几周后能获得生长。

在最苛刻的物种的情况下，例如，生殖支原体，目前是通过市场上可获得的分子技术鉴定。然而，这些方法不能够鉴定具有临床重要性的物种，例如发酵支原体、透支原体、梨支原体。在目前的实践中，为了分离起始于样品的这些菌株，一种方法是将这些菌株接种在细胞培养物中。然而，需要很长时间甚至是大约几个月才能获得菌落。

例如生殖支原体、肺炎支原体、透支原体、发酵支原体、梨支原体、猪鼻支原体的特定的支原体物种的培养和鉴定有一系列的缺点，其需要很长的培养时间，不是数周，就是几天(31)。因此，对于某些支原体物种，分子方法仍然是首选。然而，常规培养物对于微生物的微生物学表征是不可避免的。

不同的流行病学、遗传和分子研究表明，来自例如生殖支原体和人支原体的药物的感染过程可以有助于某些恶性过程的发展，包括高达20％的前列腺癌和子宫癌。生殖支原体、透支原体和猪鼻支原体是性传播因子，并且据观察，在感染后它们能够将正常上皮细胞转化为恶性细胞。

这些物种还与非淋菌性尿道炎有一定的相关性，并且存在于15-20％的患有不同程度的慢性过程和不育症的无症状男性中。

开发一种能够分离和鉴定难以培养的支原体物种的培养基的需要仍然是现有技术状态下的公开问题。

因此，本发明的目的在于提出一种新的和初步的用于解决现有技术状态中存在的并且与分离和鉴定支原体属物种有关的问题的方案。

发明概述

本发明来自于开发培养基的需要，该培养基能够有效且快速地同时培养、分离和鉴定属于支原体属的不同物种，特别是难以培养的物种，例如，生殖支原体、肺炎支原体、透支原体、发酵支原体，梨支原体和/或猪鼻支原体。

首次描述了一种培养基，大多数支原体属的物种可在该培养基中生长，然后其可将微生物培养技术扩展到广谱的支原体属的物种。

具体地，经过长时间的实验和选择工作，本发明人检测出能够满足上述需要的培养基配方的主要成分。具体地，包括具有不同来源和组成的主要成分的本发明的培养基组成意外地显示出能够使得支原体属物种的充分生长。存在于本发明的培养基中的动物血液和组织的水解物尤其重要，其保证了支原体属生长所必需的物质的供应，而不妨碍鉴定。

与本发明相关的优点之一在于，可以仅基于培养特征(培养基的颜色)进行目标细菌的鉴定，而不需要深入观察菌落的形态学特征，并由不专业的人员容易地解释结果。

本发明的培养基包括营养物质，所述营养物质足以使得目标微生物快速生长，并阻碍其它并发生物的生长，使得支原体培养的更快，然后可以比利用已知培养基的培养物更短的时间分离和鉴定支原体。具体地，甚至经过1-4天的最长培养时间后可进行分离和鉴定。

本发明的培养基的额外优点在于它不包括可限制其生产和使用的有毒物质或环境污染物。

本发明的主题是：

-用于支原体属微生物的培养基，其包括作为活性成分的：

-牛血的水解产物，

-来自牛心的提取物；

-牛心的酶解产物；

-乳蛋白的酶解产物；

-大豆蛋白的酶解产物；

-动物组织的酶解产物；

-来自酿酒酵母的自溶产物或水解产物；

-用于体外培养和/或分离和/或鉴定支原体属微生物的方法，包括通过使用本发明的培养基培养微生物的步骤；

－用于属于支原体属的微生物的生长和/或分离和/或鉴定的支持物，其包括本发明的培养基。

-用于属于支原体属的微生物的生长和/或分离和/或鉴定的试剂盒，其包含至少一份的本发明的培养基和适于所述微生物的生长和/或分离和/或鉴定的方法。

从下面的详细描述可以明显地看出本发明的其它优点和特征。

本发明的描述

以下报道本发明的不同主题的详细说明。

培养基

本发明提供了支原体属微生物的培养基。具体地，本发明的培养基可以用于选自下组的支原体物种：生殖支原体、肺炎支原体、透支原体、发酵支原体、梨支原体、猪鼻支原体、人支原体和存在于人和动物的常见菌群中的支原体属的其他物种。它甚至可以用于如解脲支原体和脲原体属的微生物。

本发明的培养基包括作为活性成分的

-牛血的水解产物，来自牛心的提取物；牛心的酶解产物；乳蛋白的酶解产物；大豆蛋白的酶解产物；动物组织的酶解产物；来自酿酒酵母的自溶产物或水解产物。

本文提及的所有成分，无论是主要成分还是本发明的培养基的其它成分/组分，均可在市场上获得，因此本文不再需要对其做具体的额外的检查。但是，例如，对于其中的一些，下面给出了一个简短的额外的检查。

牛血的水解产物是通过牛血分离和脱水所获的终产物，所述牛血具有高于80％的蛋白质性质，从而使其成为蛋白的唯一来源。45％的血量为细胞、红细胞(大部分)、白细胞和血小板。剩余的血液由血浆、清澈和淡黄色的液体构成。血浆由45％的水构成，甚至包括蛋白质合成所必需的营养物质，比如，葡萄糖、脂肪、蛋白质、维生素、矿物质和氨基酸。举例来说，可以通过在0.5％NaCl中以1:2的比例稀释血液，并在约80℃下加热该混合物约半小时来制备牛血的水解产物。随后进行离心和灭菌，优选通过过滤的方法。

牛血的水解产物可以以每升培养基的约5至30克之间的量存在。

动物组织的酶解产物是氨基酸和具有低分子量的肽和细胞所具有的所有代谢物的组合。

具体地，在特定的pH和温度的物理化学条件下，这些成分获自动物组织的酶蛋白水解。从化学的观点来看，通过释放由细胞所具有的代谢物所形成的细胞内容物，包括细胞核内容物，从而得到包含在外细胞膜、核膜和细胞质基质中的蛋白质降解产物。这种水解产物也被称为具有动物来源的蛋白胨。作为实例而不具有限制性的目的，为了本发明的目的，可以使用由OXOID、牛肉提取物、Bacto^TM生产的月示蛋白胨。

动物组织的酶解产物的量可以为约2至99克/升培养基。

乳蛋白的酶解产物可以是酪蛋白水解产物，其来自含有盐酸的酪蛋白水解物，然后用碳酸氢钠中和。酪蛋白水解酸提供了培养基所需的氮。作为实例而不具有限制性的目的，用OXOID生产的可用于本发明目的的酪蛋白水解产物。

乳蛋白的酶解产物，其甚至可以是乳白蛋白水解物，是从牛奶中获得的蛋白质乳白蛋白经胰酶消化所得到的蛋白胨。高水平的主要氨基酸使其成为组织培养基中的宝贵的补充剂。作为实例而不具有限制性的目的，由BD Bacto^TM(乳白蛋白水解物，乳白蛋白的酶解液代码：259962-BD Bacto^TM；Leche Peptonizada BD)生产的可用于本发明目的的水解产物。

乳蛋白的酶解产物可以以约1至67克/升培养基的量存在。

就大豆蛋白的酶解产物而言，通过举例而不具有限制性的目的，报道了蛋白胨DISOIA BBL^TM。

大豆蛋白的酶解产物可以以约0.2至34克/升培养基的量存在。

相对于来自酿酒酵母的自溶产物或水解产物，可以通过，例如，将预先培养和离心的100克酿酒酵母溶解在100ml的蒸馏水中来进行制备。随后将其在121度下高压处理10分钟，并用过滤的方法进行灭菌。

来自酿酒酵母的自溶产物或水解产物可以以约15至56克/升培养基的量存在。

具体地，来自牛心的提取物可以以约2至56克/升培养基的量存在于培养基中。优选地，这种成分的存在量为约10-20克/升培养基。

它包括专门制备的蛋白胨，其包括通过酶消化经选择的新鲜肉而制备的肉类消化物(其可以从心脏、脑等开始加工)，旨在提高非常苛刻的微生物的培养。它包括在每个蛋白胨中可获得的具有不同体积的高谱肽，以及存在于单一蛋白胨中的矿物质、维生素、核苷酸和其他的碳酸盐化合物。

在生产蛋白胨中，仅使用水解酶，更具体地，是打开动物、植物和微生物来源的蛋白质(蛋白酶)和肽(肽酶)的肽键的那些。这些酶的用途随着组织或其他器官(比如胰腺)的直接添加而改变，旨在使用高度纯化的酶。用于水解蛋白质的酶的例子由木瓜蛋白酶组成。木瓜蛋白酶具有广泛的作用谱(具有广谱的蛋白酶)，实际上它消化了蛋白质来源的所有物质，甚至是针对氨基酸的角蛋白、多肽和合成底物。

可以通过使用两种类型的水解剂、化学(酸或碱)剂或酶，进行蛋白质水解。

酸水解用于获得少量的营养基质，通常通过使用诸如肉、心等的底物。

作为水解剂，使用无机酸，例如盐酸、硫酸等。在100-130℃的温度和1-4个大气压下，在4至45小时的时间内获得水解。这些压力和温度条件显著地提高了水解度，因此获得了高含量的游离氨基酸。

碱性水解。通过使用氢氧化钠、氢氧化钙和氢氧化铵作为水解剂进行碱水解。

酶水解可回收大量的原始材料的氨基酸、肽和多肽。其中酶水解所需的“软”条件可消除或减轻酸和碱水解产生的一些缺点，并且获得的产物通过微生物达到高水平的同化。使用几种酶制剂(胰酶、肝胰岛素等)。

牛心的酶解产物的量可以为约1至62克/升培养基。

上述组分的存在使得培养基具有高的总氮含量。具体地，这种含量在约10％至94％之间。

在本发明的一个实施方式中，所述培养基甚至还包括革兰氏阴性微生物、革兰氏阳性菌、真菌和酵母的生长抑制剂。具体地，这种抑制剂可以选自下组：萘啶酸、万古霉素、制霉菌素、乙酸铊、酚红，青霉素和两性霉素B。

优选地，在培养基内，萘啶酸的存在量为0.1至3.5克/升培养基；和/或万古霉素的存在量为0.5至1克/升培养基；和/或制霉菌素的存在量为0.2至5克/升培养基；和/或乙酸铊的存在量为0.01至1.5克/升培养基；和/或酚红的存在量为0.03至3克/升培养基；和/或青霉素的存在量为0.1至5克/升培养基；和/或两性霉素B的存在量为0.05至3克/升培养基。

具体地，在酚红的存在下，下列物种的颜色变化如下：

人支原体：红色/浊红色

解脲支原体：红色

微小脲原体：红色

肺炎支原体：浊黄色

生殖支原体：橙色/黄色

发酵支原体：亮黄色/浊黄色

梨支原体：黄色/浊黄色

透支原体：亮黄色/浊黄色

猪鼻支原体：浊黄色

培养基甚至还可以包括三价金属盐，优选柠檬酸铁铵；芳香族氨基酸；球状蛋白和血浆的混合物。

例如，可以从马、兔、牛的血液中获得可用于培养基中的血浆或球状蛋白。举例来说，该方法可以提供总血液的离心，将获得的上清液于-80度冻结48小时，用盐水溶液以1：8的比例进行冷冻和稀释。将其加入到制备的培养物中，并将获得的培养基冷冻至-20度直至其使用。

优选地，三价金属的盐的存在量为约0.5至1.0克/升培养基；芳族氨基酸的存在量为约1至72克/升培养基；球状和血浆蛋白的存在量为约0.01至70克/升培养基；纤维蛋白的混合物的存在量为约0.01至30克/升培养基。

与其他市售培养基不同，本发明的培养基不需要调节pH，并且在其不同的实施方式中具有适合于不同支原体物种的生长和/或分离和/或鉴定的pH值。优选地，本文所述的培养基的pH在7.5和7.7之间。

可以通过本领域技术人员认为合适的任何方法以实验室的规模来制备本发明的培养基。在一个示例性且非限制性的实施方式中，这种方法可以包括分别称量不同的主要成分/组分，并逐渐向粉末混合物中加入液体，直到获得其完全溶解物。将悬浮液搅拌并静置至少10分钟。培养基在约115℃下灭菌10分钟，然后在45-50℃冷却后，加入含有球状和纤维蛋白、氨基酸溶液的液体补充剂。

培养基可以是液体、半固体、固体或甚至是冻干形式。然后将培养基放入密封的小瓶中，防止光照并保持在室温。

通常，本文所述的培养基可以用于不同的目的，比如用在富集和保存临床样品的培养基的制剂中，用在保存菌株的培养基中，用在分离菌落的固体培养基中，以及包括用在常规鉴定的试管或板中进行推测鉴定的培养基。

用于分离支原体物种的体外方法

本文还描述了体外培养和/或分离和/或鉴定支原体属微生物的方法。

具体地，该方法的特征在于它包括通过使用本发明的培养基来培养微生物的步骤。

仅在本发明的情况下，包括支原体的样品将散布在包含这种培养基的生长支持物上，并在适于微生物生长的条件下培养。具体地，这些条件包括在固体或液体形式的本发明培养基中约36℃的培养温度。

在本发明的一个实施方式中，培养和/或分离和/或鉴定属于生殖支原体，肺炎支原体、透支原体、发酵支原体、梨支原体和/或猪鼻支原体物种的物种。

一般来说，本发明的方法使得在不同类型的样品(例如，兽医临床来源的样品、水样或环境一般样品以及食物)中鉴定支原体属物种成为可能。

用于分离和鉴定支原体物种的支持物

本说明书的主题还是一种支持物，用于属于支原体属的微生物的生长和/或分离和/或鉴定，其包括本发明的培养基。

作为非限制性的实例，支持物可以是由聚丙烯、pvp、聚苯乙烯或PVC制成的板，包括圆锥形、直的或半直的识别孔，底部形状如U、V、平或半平，通常用于微培养技术或用于免疫学和分子鉴定的其它方法，例如PCR或分子探针，例如包括显色、荧光或比色反应的生化方法。

优选地，支持物是多孔板的形式，其中至少一个孔包括所述培养基。

在本发明的一个实施方式中，所述板包括至少一个孔，优选全部孔具有截锥形。

试剂盒

本文还描述了用于属于支原体属的微生物的生长和/或分离和/或鉴定的试剂盒，其包括至少一份本发明的培养基和适于所述微生物生长和/或分离和/或鉴定的工具。例如，该工具可以包括一个或多个多孔板，优选具有截锥形的孔，以及用于执行该方法的说明书。

实施例

通过说明的方式示出以下实施例，并不旨在限制本发明，如本说明书另有说明。

实施例1：

将一系列营养基的混合物作为制剂的营养成分进行了测试。在实验中，设计了3个变体，其组成如表1所示。将成分重构于100mL水中并根据本发明的详细描述进行制备。

相对于参照培养基(培养基2611：螺旋体培养基)，使用收集菌株进行促进生长能力的评估。在每个试管中，接种每个微生物的0.1mL标准溶液。

促进不同支原体物种生长的结果非常令人满意。在肺炎支原体的情况下，观察到相对于超过7天的对照培养基，本发明的3种组合物在开始的49-72小时内以较高的强度促进生长。

在实验变体中检查，在透支原体的情况下，在初始的三天内观察到更快的生长加速，以及在生殖支原体的情况下从3-5天开始观察到更快的生长加速。

表1不同实验变体(VS)的营养基的组成

组分	VS₁(g/L)	VS₂(g/L)	VS₃(g/L)
				酿酒酵母的自溶物质	15	30	45
来自牛心的提取物	1	10	20
				牛血的水解产物	5	29	10
乳蛋白的酶解产物	5	34	10
				大豆蛋白的酶解产物	1	2.5	4.9
动物组织的酶解产物	1	25	43.5
				葡萄糖	1	10	20

实施例2

用实施例1的成分制备组合物，但分别在锥形瓶内称量。作为生长促进剂和酶标记物，使用以下成分：

150毫升的灭活马血清

胞苷单磷酸：

氨基酸混合物1％

L-胱氨酸·2HCl 0.06克

水溶性和脂溶性维生素的混合物1％

HEPES 2克

抗菌剂的混合物：0.5g/L万古霉素、0.2g/L制霉菌素、0.03g/L酚红、0.1g/L青霉素

pH＝7.5(+0.2)

接种以下的收集菌株：

人支原体ATCC 23114

透支原体ATCC 55252

解脲支原体ATCC 27618

解脲支原体ATCC 33175

微小脲原体ATCC 27815

生殖支原体ATCC 33175

发酵支原体ATCC 19989

猪鼻支原体ATCC 29052

梨支原体ATCC 25960

用10UCC标准化的溶液将这些菌株直接接种在试管中。

灰色方块指从那一刻开始，培养基不再被读取，因为它们已经达到了正值，没有必要继续实验。

实施例3

根据实施例2制备培养基的组合物，不同之处在于增加营养成分和酶标记物(VS2)的浓度。在锥形瓶内各自称量以下量：

150毫升的灭活马血清

10毫升的胎牛血清

来自大豆提取物(25％)、胆固醇(2％)、白蛋白(5％)的组分。

氨基酸混合物：5％

L-胱氨酸·2HCl：1克

水溶性和脂溶性维生素的混合物17％

HEPES 2克

抗菌剂的混合物：萘啶酸、0.5-1g/L万古霉素、0.2-5g/L制霉菌素、0.05g/L酚红、0.1g/L青霉素、0.05g/L两性霉素B。

实施例4

根据实施例2制备培养基的组合物，不同之处在于增加了营养成分和酶标记物(VS3)的浓度。在锥形瓶内各自称量以下量：

100毫升的灭活马血清

50毫升的灭活猪血清

50毫升的胎牛血清

球蛋白：0.7克

纤维蛋白：1克

由变性血浆蛋白(2％)、脂质(8％)、氨基酸/氨基核苷酸(4％)、胆固醇(2％)、白蛋白(0.1％)组成的悬浮液中的生长因子。

胞苷单磷酸：0.005克

氨基酸的混合物3％

L-胱氨酸·2HCl 0.1克

水溶性和脂溶性维生素的混合物3％

HEPES 0.05克

抗菌剂的混合物：萘啶酸、0.5-1g/L万古霉素、0.2-5g/L制霉菌素、0.01-0.5g/L乙酸铊、0.03-3g/L酚红、0.1－5g/L青霉素、0.05-3g/L两性霉素B、0.55,1.61g/L乙酸铊。

pH＝7.5(+0.2)

实施例5

通过称量分别放置在锥形瓶(VS3)内的成分来制备培养基的组合物。对固体培养基中的两种抑制剂的混合物进行实验。下文描述了使用的生长促进剂、酶标记物和抑制剂的组成：

无菌添加：

100毫升的灭活马血清

100毫升的灭活猪血清

100毫升的胎牛血清

球蛋白：70克

纤维蛋白：30克

由变性血浆蛋白质(15％)、脂质(10％)、氨基酸/氨基核苷酸(22％)、胆固醇(10％)、白蛋白(5％)组成的悬浮液中的生长因子。

胞苷单磷酸盐：0.1克

氨基酸的混合物30％

L-胱氨酸·2HCl 0.5克

水溶性和脂溶性维生素的混合物15％

HEPES 0.02克

抗菌剂的混合物：0.4g/L萘啶酸，0.5g/L万古霉素，0.5g/L制霉菌素，0.05g/L乙酸铊，0.03g/L酚红，0.5g/L青霉素，0.03g/L两性霉素B

pH＝7.5(+0.2)

使用以下菌株进行评估：奇异变形杆菌ATCC 7002，奇异变形杆菌ATCC 12433，表皮葡萄球菌ATCC12228，金黄色酿脓葡萄球菌ATCC 25923，木糖葡萄球菌ATCC 29971，腐生葡萄球菌ATCC 43867，屎肠球菌ATCC 6056，无乳链球菌ATCC 12386，粪链球菌ATCC 29212。

这种物种都不会在所述的制剂中生长。

实施例6

通过称量分别放置在锥形瓶内的成分来制备培养基的组合物。以与实施例5相同的营养基来制备培养基，除了以下述量加入动物组织的酶解产物：45g/500mL。此外，对两种不同的酶标记物进行测试，浓度等于1.0g/L，加入0.5g/L柠檬酸铁铵和以两种不同浓度：0.015g/L和0.010g/L的萘啶酸。

无菌添加：

100毫升的灭活马血清

100毫升的灭活猪血清

100毫升的胎牛血清

球蛋白：50克

纤维蛋白：50克

由变性血浆蛋白(20％)，脂质(10％)，氨基酸/氨基核苷酸(30％)，大豆提取物组分(2％)，胆固醇(30％)，白蛋白(0.5％)组成悬浮液中的生长因子。

胞苷单磷酸：0.02克

氨基酸混合物45％

L-胱氨酸·2HCl 0.1克

水溶性和脂溶性维生素的混合物20％

HEPES 0.5克

抗菌剂的混合物：0.4g/L萘啶酸，1g/L万古霉素，0.5g/L制霉菌素，0.05g/L乙酸铊，0.05g/L苯酚红，0.5g/L青霉素，0.2g/L两性霉素B。

pH＝7.5(+0.2)

使用以下菌株进行评估：奇异变形杆菌ATCC 7002，奇异变形杆菌ATCC 12433，表皮葡萄球菌ATCC 12228，金黄色酿脓葡萄球菌ATCC 25923，木糖葡萄球菌ATCC 29971，腐生葡萄球菌ATCC 43867，屎肠球菌ATCC 6056，无乳链球菌ATCC 12386，粪链球菌ATCC 29212。

这种物种都不会在所述的制剂中生长。

已经参照实施方式说明了本发明。由于本领域技术人员可以从具体实施方式获得显而易见的结果，属于同一发明核心的另外的具体实施方式也可以被提供，然后，这些实施方式将包括在由本申请的权利要求限定的保护范围内。

参考文献

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Claims

1.一种用于支原体属微生物的培养基，其特征在于，包括作为活性成分的：

－牛血的水解产物，

－来自牛心的提取物；

-牛心的酶解产物；

-乳蛋白的酶解产物；

-大豆蛋白的酶解产物；

-动物组织的酶解产物；

-来自酿酒酵母的自溶产物或水解产物。

2.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，还包括革兰氏阴性微生物、革兰氏阳性菌、真菌和酵母的生长抑制剂。

3.如权利要求1或2所述的培养基，其特征在于，

－所述来自牛心的提取物的存在量为约2至56g/L培养基；和/或

－所述牛血的水解产物的存在量为约5至30g/L培养基；和/或

－所述牛心的酶解产物的存在量为约1至62g/L培养基；和/或

－所述乳蛋白的酶解产物的存在量为约1至67g/L培养基；和/或

－所述大豆蛋白的酶解产物的存在量为约0.2至34g/L培养基；和/或

－所述动物组织的酶解产物的存在量为约2至99g/L培养基；和/或

－所述来自酿酒酵母的自溶产物或水解产物的存在量为约15至56g/L培养基。

4.如权利要求2或3所述的培养基，其特征在于，所述抑制剂选自下组：萘啶酸、万古霉素、制霉菌素、乙酸铊、酚红，青霉素和两性霉素B。

5.如权利要求4所述的培养基，其特征在于，

－所述萘啶酸的存在量为0.1至3.5克/升培养基；和/或

－所述万古霉素的存在量为0.5至1克/升培养基；和/或

－所述制霉菌素的存在量为0.2至5克/升培养基；和或

－所述乙酸铊的存在量为0.01至1.5克/升培养基；和/或

－所述酚红的存在量为0.03至3克/升培养基；和/或

－所述青霉素的存在量为0.1至5克/升培养基；和/或

－所述两性霉素B的存在量为0.05至3克/升培养基。

6.如权利要求1-5中任一所述的培养基，其特征在于，还包括：

－三价金属盐，优选柠檬酸铁铵；和/或

－芳香族氨基酸；和/或

－球蛋白和血浆的混合物。

7.如权利要求6所述的培养基，其特征在于，

－所述三价金属的盐的存在量为约0.5至1.0克/升培养基；和/或

－所述芳族氨基酸的存在量为约1至72克/升培养基；和/或

－所述球蛋白和血浆的混合物的存在量为约0.01至70克/升培养基。

8.如权利要求1-7任一所述的培养基，其特征在于，所述培养基具有7.5-7.7的pH值。

9.如权利要求1-8任一所述的培养基，其特征在于，所述培养基为液体、半固体、固体、冻干形式。

10.一种体外培养和/或分离和/或鉴定支原体属微生物的方法，其特征在于，包括使用权利要求1-9任一所述的培养基培养微生物的步骤。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述微生物属于生殖支原体、肺炎支原体、透支原体、发酵支原体、梨支原体和/或猪鼻支原体物种。

12.一种用于属于支原体属的微生物生长和/或分离和/或鉴定的支持物，其特征在于，包括权利要求1-9任一所述的培养基。

13.如权利要求12所述的支持物，其特征在于，所述支持物为多孔板的形式，其中至少一个孔包括权利要求1-8任一所述的培养基。

14.如权利要求13所述的支持物，其特征在于，所述板包括至少一个孔，优选全部孔具有截锥形。

15.一种用于属于支原体属的微生物生长和/或分离和/或鉴定的试剂盒，其特征在于，包括至少一份的权利要求1-8任一所述的培养基，和适于所述微生物生长和/或分离和/或鉴定的工具。

16.如权利要求15所述的试剂盒，其特征在于，所述工具包括具有截锥形的孔的板。