WO2004063392A2 - Medio de cultivo selectivo para el aislamiento y deteccion de especies del genero streptococcus - Google Patents

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WO2004063392A2
WO2004063392A2 PCT/CU2004/000001 CU2004000001W WO2004063392A2 WO 2004063392 A2 WO2004063392 A2 WO 2004063392A2 CU 2004000001 W CU2004000001 W CU 2004000001W WO 2004063392 A2 WO2004063392 A2 WO 2004063392A2
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Anabel Duran Vila
Claudio Rodríguez Martínez
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/14—Streptococcus; Staphylococcus

Definitions

  • the present invention relates to Microbiology and specifically to clinical and veterinary diagnosis, food quality control and studies of contamination of environmental elements, in which methods for the isolation and detection of Streptococcus species are needed.
  • Previous Art Streptococci are considered a genus of fastidious microorganisms, whose identification is highly important in clinical diagnosis.
  • streptococci are not the microorganisms that most frequently cause urinary sepsis, their detection is necessary, since hemolytic ⁇ streptococci are specifically the most frequent cause of sepsis in neonates, which allows intrapartum antibiotic prophylaxis and prevention of perinatal infection. by this microorganism (Bosch, J .; Murillo, S .; Rico, M. and Salgado, M. 1998. Usefulness of a selective medium disk-broth for the detection of group B streptococcus in the vagina. Sick. Infected. Microbiol Clin. No. 16 (2)).
  • Streptococcus urinalis sp.nov. which although similar to Streptococcus pyogenes and Streptococcus canis, appear to be a new species of the genus Streptococcus, whose name is Streptococcus urinalis sp.nov., Strain type CCUG 41590T ( Collins, MD; Hutson, RA; Falsen, E .; ⁇ ikolaitchouk, ⁇ .; La Claire, L. and Facklam, RR 2000. An unusual Streptococcus from human uri ⁇ e, Streptococcus urinalis sp. Nov.
  • non-selective means do not allow differentiation between pathogenic and non-pathogenic species. These non-selective means allow the growth of other Gram positive and Gram negative bacteria that compete with streptococci for nutrients. For example: in the case of Proteus, the strains that develop "veil" prevent the isolation of the colonies of interest.
  • the CLED Medium marketed by the aforementioned firms, which is widely used in laboratories and is considered one of the best options, allows the growth of all urine pathogens, within which are Streptococcus, and other Gram microorganisms positive, which cannot be differentiated, because they have similar cultural characteristics. Streptococcus growth is slow. Enterococcus (Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium and Enterococcus avium) can be confused with Shigella species.
  • UNTPATH, Spain describes in its manual a selective medium for Streptococus that requires the addition of blood and a selective supplement, which contains colistin sulfate and oxolinic acid, but it is also essential incubation in CO2 atmosphere at 5%.
  • a selective supplement which contains colistin sulfate and oxolinic acid, but it is also essential incubation in CO2 atmosphere at 5%.
  • the use of antibiotics as a supplement hinders the preparation of the medium and does not guarantee a real inhibition of the accompanying unwanted microbiota, due to the appearance, with increasing frequency, of antibiotic resistance phenomena, mainly in Gram negative organisms.
  • a selective medium for rapid isolation of Streptococcus agalactiae and other streptococci related to bovine mastitis: Edwards Medium (Modified) is described in the 1995 OXOID Manual. Blood is added as a supplement and contains thallium sulfate and violet crystal as inhibitors. This diagnosis allows the growth of Streptococcus agalactiae and other Streptococcus, only using as a principle of identification the hydrolysis of the sculin by group D streptococci (black colonies) and the negative response (blue colonies) of the rest, so they cannot be differentiated between them.
  • the violet crystal used as a selective agent can in turn inhibit the growth of Streptococcus themselves, in addition thallium sulfate is considered a highly toxic compound, harmful to human health and extremely harmful to the environment, which at the same time It complicates and makes the process of production, preparation and waste of the environment very cumbersome.
  • the prepared medium has a durability of less than 2 months due to the instability of the components.
  • the preparation is complex, and includes different steps, such as: the preparation of the basal medium, the addition of the gel, the agitation to trap bxrrbujas, the addition of the supplements and the incubation in a water bath.
  • This formulation is complex to prepare, contains labile enzymes added as a supplement and complex chemical compounds (malto-oligosaccharides), labile and its use in the culture media industry is rare.
  • group B Streptococcus hemolytic
  • hemolytic based on the production of an orange pigment
  • the composition of the medium is: glucose, sodium pyruvate, meat peptone, MgSO4, MOPS-Phosphate, methotrexate and an antibacterial agent (inactive for group B Streptococcus).
  • Other streptococci cannot be identified with the help of this formulation.
  • JP 59159797 (Kojima, H., et al. 1984.09.10.
  • Culture medium for selective proliferation of Streptococcus hemolyticus a selective medium for the proliferation of Streptococcus hemolyticus is described, the composition of which contains lipids and fatty acids as selective agents specific to promote the growth of this species.
  • the use in this medium, of soybeans, makes it complex in its preparation, in addition, the selective agents do not inhibit the growth of other Streptococcus species of interest.
  • chromogenic or fluorogenic substrates incorporated into traditional media or in new culture media, specifically developed for some microorganisms with metabolic requirements, has increased. These chromogenic reactions have certain advantages over conventional media, such as: speed in response over time, high specificity and sensitivity as a result of the degradation of the substrate by a specific enzyme.
  • the agar was designed for the enumeration of enterococci in seawater or fresh water. It contains nalidixic acid, cycloheximide, triphenyltetrazolium and the indoxyl substrate ⁇ -D glucoside. It has the disadvantage that using antibiotics as selective agents, in addition to having only one Enzymatic marker that makes the identification of other Streptococcus impossible. Long incubation periods (24-48 hours) are required and the sensitivity of the medium is not high. "The modification of this medium by reducing the concentration of triphenyltetrazolium and increasing the concentration of indoxil ⁇ -D glycoside reduced the incubation time to 24 hours but did not expand the diagnostic possibilities of the medium.
  • Chromocult enterococci broth (CEB) (BBL) and the Readycult enterococci (MERCK) use 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl- ⁇ D glucopyranoside as substrate to identify Enterococcus and sodium azide to inhibit other microorganisms. false positives, such as: Leuconostoc, Lactococcus lactis and Aeromonas sp. No other streptococci are identified and contain toxic ingredients.
  • CHROMagar Orientation (BBL) medium (Carricajo, A .; Boiste, S .; Thore, J .; Aubert, G .; Gille, Y and Freydiere, AM. 1999. Comparative evaluation of five chromogenic media for detection, enumeration and identification of urinary tract pathogens, Eur J Clin Microbiol Infec ⁇ Dis 18 (11), p. 796-803; Samra, Z .; Heifetz, M .; Talmor, J .; Bain, E. and Bahar, J. 1998. Evaluation of use of a new chromogenic agar in detection of urinary tract pathogens. J Clin Microbiol., 36 (4), p.
  • Gram positive, Gram negative and yeast are streptococci (groups D, B and C), although groups B and C cannot be differentiated, so additional biochemical tests are required for identification.
  • streptococci groups D, B and C
  • groups B and C cannot be differentiated, so additional biochemical tests are required for identification.
  • the great diversity of colors makes the interpretation of the results extremely difficult and sometimes it is necessary to pay special attention to the morphology, size and characteristics of the colonies (brightness or opacity) which makes the interpretation of the results even more difficult.
  • the similarity of colors of some streptococci with microorganisms of the genera Klebsiella, Enterobacter and Citrobacter requires additional tests that require more hours of testing. It is also noteworthy that the medium is sensitive to light, which alters the original color, and incubation and reading must be done immediately.
  • the UTI medium (OXOID Inc.) designed for presumptive identification and differentiation of microorganisms that cause urinary tract infections, contains the x-glu chromogenic substrate for the identification of enterococci.
  • This formulation presents as disadvantages that other streptococci cannot be identified, other Gram negative microorganisms that are generally found in urinary infections in concentrations higher than Streptococcus grow and their use is restricted to urine samples.
  • Alain Rambach patented a method for the identification of microorganisms with at least two chromogenic substrates (US 5 962 251, 1999.10.05 "Method for the identification of microorganisms wifh at least two chromogens").
  • the medium provides for the use of agar, peptone, sodium chloride, yeast extract, meat extract and carbohydrates (glucose), as well as chromogenic substrates derived from indoxyl (bromo-indoxyl, chloro-indoxyl, dichloro-indoxyl, chlorine -bromo-indoxilo, among others). Its greatest utility is for the demonstration of the presence or absence of yeasts of the genus Candida, especially Candida albicans and Candida tropicalis, although microorganisms of other genera, both Gram positive and Gram negative grow with different shades of color, among which are streptococci .
  • the invention consists in the use of a nutrient, which, when metabolized by microorganisms, produces a reaction, in this case the enzyme ⁇ -D-glucosidase and pyrrolidonyl-arylamidase.
  • a nutrient which, when metabolized by microorganisms, produces a reaction, in this case the enzyme ⁇ -D-glucosidase and pyrrolidonyl-arylamidase.
  • the medium is unable to identify vancomycin-sensitive enterococci, as well as other Streptococcus species. Its preparation is cumbersome, as it required the addition of antibiotics as a supplement and vancomycin does not inhibit some Gram-negative bacteria that can grow in the environment, in addition, additional tests are required for the identification of species.
  • United States patent application 20020086278-A1. 2002.06.04 Gosnell et al.
  • Chromogenic media containing blood or hemin describe a medium containing blood or hemin and also chromogenic substrates such as: magenta, x-glucoside, x-glucuronide, Mag-Phosphate, en ⁇ re o ⁇ ros.
  • the medium allows the growth and identification of different species due to morphological characteristics, the appearance of various color tones, fluorescence and hemolytic reactions.
  • the invention can be considered as the closest proioipo.
  • the medium had the following disadvantages:
  • chromogenic substrates can be added to the fresh medium, aseptically prepared, since some of them are labile at high temperatures, which makes their preparation complex.
  • group D esrep ⁇ ococos take the same color as other microorganisms (blue), among which are: Candida albicans, Gram negatives and Staphylococcus epidermidis. • The ones, especially the mageny, obscure the color of the media with blood after the incubation, which reduces the clarity of the reading and the appearance of hemolytic reactions.
  • the aim of the present invention is to provide a selective means for the isolation and defection of species of the genus Streptococcus, enabling the differentiation of Streptococcus of clinical importance, such as: Streptococcus agalactiae, Streptococcus pyogenes and Streptococcus of group D (Enterococcus), in early cultivation periods (2- 24 hours) and with high sensitivity and analytical specificity.
  • the novelty of the proposed invention consists of a combination of nullitic bases specially selected in amounts of 15 to 58 g / 1, which guarantee a total nitrogen content, mainly derived from proteins, between 10 and 14%, a specially designed mixture of Gram negative microorganism inhibitors in amounts of 0.55 to 1.63 g / 1; a mixture of chromogenic and / or fluorogenic substrates, degradable by at least one enzyme of each species, in amounts of 0.3 to 1.5 g / 1 and indicator compounds of deaminase activity, in amounts of 1 to 3 g / 1 .
  • the original mixture of nu ⁇ ri ⁇ ivas bases is composed by exlrac ⁇ os and hydrolysates of diferen ⁇ es origins, specifically selected en ⁇ re:
  • Bovine blood hydrolyzate from 5 to 10 g / 1
  • the peculiar mixture of inhibitors never described includes a combination of: Ialium acetaium from 0.55 to 1.6 g / 1 Nalidixic acid from 0.005 to 0.030g / l
  • O ⁇ ro aspec ⁇ o singular of the invention consists in the use of the mixture of chromogenic and fluorogenic substrates that reveal the phosphatase, glucosidase and glucuronidase activity. to differentiate the various species of Streptococcus, which contains: para-nitrophenyl phosphate disodium salt (PNP), from 0.2 to 0.8 g / L; x-glu (5-bromo-4-chloro-3-indolyl- ⁇ -Dgluco ⁇ iranósido,
  • PNP para-nitrophenyl phosphate disodium salt
  • Mu-glu (4-methylumbeliferyl ⁇ D-glucopyranoside), Saimon-glu (6-chloro-3-indolyl- ⁇ -D-glucopyranoside) from 0.05 to 0.4 g / L and x-gluc (5-bromo- 4-Chloro-3-indolyl- ⁇ -D-glucuronide cyclohexylammonium salt), Magenia-Gluc (5-bromo-6-chloro-3-indolyl- ⁇ -D-glucuronide cyclohexylammonium salt) and MUG (4-hydrichydride Methylumbeliferyl ⁇ -D-glucuronide) from 0.05 to 0.2 g / L.
  • chromogenic substances are combined in a very original way, to guarantee the appearance of different colors or fluorescence for each species to be identified, with the following being: a) PNP + x-glu + Magen ⁇ a-gluc or MUG b) PNP + Salmon-glu + x -gluc or MUG c) PNP + MU-glu + Magen ⁇ a gluc or x-gluc
  • Another singular aspect of the invention consists in the addition of several compounds that indicate the deaminase activity in the medium, such as: salts of irivaleni meials, preferably ferric-ammonium citrate in amounts of 0.5 to 1.0 g / 1 and aromatic amino acids, preferably phenylalanine and pyrophane, in amounts of 1.0 to 2.0 g / 1.
  • salts of irivaleni meials preferably ferric-ammonium citrate in amounts of 0.5 to 1.0 g / 1
  • aromatic amino acids preferably phenylalanine and pyrophane
  • a 10.0 to 14.0 g / L agar is incorporated into the composition described above and a medium is obtained that allows observing the culinary characteristics of the inertial organisms.
  • the formulated medium had a pH value of 7 to 7.4 and is used in concentrations of 25 to 80 g / L of water.
  • Streptococcus can be isolated and determined exclusively, mainly those that are pathogenic to man, based only on the appearance of colonies of specific colors for certain genera, and on changes in the color of the medium.
  • a selective culture medium is provided that made it possible in unison to differentiate group D streptococci (erythrococci) from the rest of the streptococci, and to the latter enirre themselves.
  • group D streptococci erythrococci
  • Streptococcus agalactiae and Streptococcus pyogenes which grow without the presence of other Gram negative bacteria and other Gram positive species inhibited.
  • the advantages of the means proposed in the following invention are that: • For the first time, the differentiation between pathogenic species was possible, and en ⁇ re es ⁇ as and most of the non-pathogens of the genus Streptococcus. •
  • the medium is highly selective for Streptococcus, it inhibits most species of Gram-negative bacteria, with the exception of Proteus mirabilis ATCC 7002 that grows in the highly inhibited medium, but at high concentrations it turns the medium to a color different from that of streptococci.
  • Proteus mirabilis ATCC 7002 that grows in the highly inhibited medium, but at high concentrations it turns the medium to a color different from that of streptococci.
  • only very few species of other Gram positive organisms develop, which are inhibited, and in the case of a low growth in the medium, there is a coloration that does not inhibit the abundant growth of microorganisms. of inferes.
  • the complex and innovative mixture of nutritive bases that the medium contains guarantees the presence of amino acids, peptides, polypeptides, proieosa and pep ⁇ onas of the most diverse origins and composition, and unexpectedly, allowed an abundant growth of the species of interest and They allow the exclusion of labile substances such as hemin and blood.
  • the shelf life of the prepared medium is considerable, as it contains inhibitors of most environmental coniaminants and does not contain labile substances (such as hemin, blood and antibiotics).
  • the formulation reported in the application makes it possible to prepare the medium at different concentrations for multiple presentations, for example: a simple concentration in an agarized medium, a double concentration to be used in membrane filtration techniques, or in the form of broth, and even at a higher concentration for miniaturized systems.
  • the proposed formulation allows its use in the search for Streptococcus in clinical or veterinary samples, water and other elements of the environment as well as food.
  • composition of the medium the components used in the preparation were preferably solid.
  • the description of the steps to follow for the preparation of these was presented below:
  • Said ingredients of prolic origin are in an amount of 15 to 58 g / 1, specifically Bovine blood hydrolyzate of 5-10 g / 1, Beef heart extract of 1- 12 g / 1, Enzymatic hydrolyzate of heart muscle of 1-5 g / 1 beef, Enzymatic hydrolyzate of 5-20 g / 1 milk proteins, Enzymatic hydrolyzate of Soybean proteins of 2-15 g / 1, Enzymatic hydrolyzate of animal tissue of 1-5 g / 1, Autolysed or hydrolyzed yeast
  • the selective agents are selected from: alium acetaium from 0.55 to 1.6 g / 1 and nalidixic acid from 0.05 to 0.030g / l. They are also screened, being ready to be mixed and homogenized with the rest of the components.
  • the chromogenic and fluorogenic compounds to determine the glucosidase, phosphatase and glucuronidase activity in amounts of 0.3 to 1.5 g / 1, are premixed, can also be milled and screened prior to homogenization in such a way that weighing the sum of the quantity of each component in the formulation, an adequate distribution of each is achieved.
  • the chromogenic and fluorogenic substrates are selected depending on the objective of the medium, from: p-niyrophenophosphaium disodium salt, from 0.2 to 0.8 g / 1, x-glu (5-bromo-4-chloro-3-indolyl - ⁇ -D-glucopyranoside), Mu-glu (4-methylumbelliferyl ⁇ -D-glucopyranoside), Salmon-glu (6-chloro-3-indolyl- ⁇ -D-glucopyranoside) from 0.05 to 0.4 g / 1 and x-gluc (5-bromo-4-chloro-3- indolyl- ⁇ -D-glucuronide cyclohexylammonium salt), Magenia-gluc (5-Bromo-6-chloro-3-indolyl- ⁇ D-glucuronide cyclohexylammonium salt ) and MUG (4-methylumbelliferyl ⁇ -D-glucuronide trihydrate)
  • the gel gel preferably agar, of hardness between 400 and 700 g / cm 2 , is used in amounts between 10.0 to 14.0 g / 1, specifically for the solid medium, dried and lamized before being added to the medium.
  • the powder is added in amounts of 30 to 80 g / 1, in this way it is restored and the suspension of the composition is obtained.
  • the composition can be prepared on a laboratory scale, weighing the components separately within a container and maintaining the aforementioned proportions.
  • the liquid is subsequently added to the powder mixture little by little, to achieve complete dissolution.
  • the suspension is stirred and allowed to stand for at least 10 minutes.
  • the agarized medium it may or may not be sterilized prior to the addition of p-nitrophenylphosphate disodium salt. Provided that precautions have been taken in the preparation, heating to boiling is sufficient, since the medium is highly inhibitory of environmental microorganisms that could contaminate it. Otherwise, the medium is sterilized at 115 ° C for 10 minutes and subsequently, after cooling to 45-50 ° C, the filtered PNP is added through a sterilizing filter. In the case of the liquid medium, it is always sterilized in an autoclave and the sterile supplement is added. Once the lysium medium is distributed in the final test package.
  • inoculation methods are used. Once inoculated, they are incubated at a temperature of 30 to 37 ° C for at least 2 to 6 hours in the case of the liquid medium and 18 to 24 hours for the solid medium.
  • the es ⁇ afilococos in general, do not develop in the middle or are very inhibited, being observed like small colorless colonies (Staphylococcus saprophyticus) or of colors different from the streptococci, that do not interfere in the identification of the organisms of interest.
  • Enterococci are observed in pink, blue or fluorescent color depending on the combination of the suriars used, while depending on the combination used the streptococci are observed yellow, greenish yellow, green, magenta, blue or fluorescent, whenever a suriary is used different than the one used to reveal the presence of enterococci. Examples of Realization
  • composition was prepared with the ingredients according to example 1, but weighed separately inside an Erlenmeyer flask.
  • the following ingredients were used as growth promoting agents and enzymatic markers:
  • Agar was not used in the formulation. 100 mL of deionized water was added to the solid ingredient mixture and the composition was prepared as set forth in the detailed description.
  • Streptococcus pyogenes ATCC 19615 collection strains Streptococcus agalactiae ATCC 12386, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Enterococcus faecalis ATCC 19433, Enterococcus faecium ATCC 6056 were inoculated. each. It was achieved at 18 hours that the medium will be taken blue-green in the case of Enterococcus faecalis ATCC 29212 and 19433.
  • the Enterococcus faecium strain showed dark blue coloration, Streptococcus agalactiae was taken green and Streptococcus pyogenes was observed greenish yellow .
  • the results show the rapidity of the response of the microorganisms over time and the possibility of differentiating the enterococci (group D) from the streptococcal disease by taking a coloration between green-blue to blue and streptococci, such as: Streptococcus pyogenes and Streptococcus agalactiae show a greenish yellow coloration.
  • group D enterococci
  • streptococcus pyogenes and Streptococcus agalactiae show a greenish yellow coloration.
  • Streptococus pyogenes and Streptococcus agalactiae both turned the olive green medium.
  • the 4 isolated strains of eneroxes turned black, as did 3 of the hemolytic ⁇ streptococci. Only one hemolytic ⁇ was observed olive green as was Streptococus pyogenes and Streptococcus agalactiae.
  • composition of the medium was prepared according to example 2, with the difference that the concentration of nutritive components and enzymatic markers was increased. The following amounts were weighed separately into an Erlenmeyer flask:
  • Collection strains were inoculated, such as: Streptococcus pyogenes ATCC 19615, Streptococcus agalactiae ATCC 12386, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Enterococcus faecalis ATCC 19433, Enterococcus faecium ATCC 6056 and some isolated strains: Enterococcus avium (isolated). These strains were inoculated directly in the wells of a set of polypropylene microtubes (Module 250 pp, NUNC, loie: 046247) adding
  • Streptococcus agalactiae showed an intense yellow color.
  • composition of the ingredients was prepared according to example 2, with the addition of a gel gel (agar) in a concentration of 6.5 g / 500 mL.
  • a gel gel agar
  • the components were weighed separately in an Erlenmeyer cornfield and 500 mL of deionized water was added to the solid ingredient mixture. Subsequently, preparation was carried out according to example 1. Collection strains were inoculated, such as: Streptococcus pyogenes ATCC 19615, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Enterococcus faecalis ATCC 19433, Enterococcus faecium ATCC 6056. They were inoculated by stretch marks on the surface until achieving isolated colonies.
  • composition of the medium was prepared by weighing the ingredients separately in an Erlenmeyer corn according to example 4, with the difference that the enzymatic markers are in a lower concentration (0.2 g / 1 of p-nitrophenyl phosphate disodium salt and 0 , 1 g / 1 of 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- ⁇ -D-glucopyranoside).
  • the preparation method was that described in example 1. Streptococcus pyogenes ATCC 19615, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Enterococcus faecium ATCC were inoculated by stretch marks on the surface of the gel.
  • composition was prepared with the ingredients according to example 2, with the difference that the chromogenic substrate x-glu (5-bromo-4-chloro-3-indolyl- ⁇ -D-glucopyranoside) was replaced by Mu-glu (4 -methylumbeliferyl ⁇ -D-glucopyranoside) in a concentration of 0.05 g / 1.
  • the preparation method was similar to example 2.
  • Enterococcus avium Enterococcus avium. These strains were inoculated directly in the wells of a set of polypropylene micro tubes (Module 250 pp, NUNC, lot: 046247) by adding 0.1 mL of a standardized solution to the McFarland 2.0 scale in 0.1 mL medium.
  • composition of the medium was prepared by weighing the ingredients separately in an Erlenrneyer flask. 2 mixtures of inhibitors in the solid medium were tested.
  • the composition of growth promoting agents, enzymatic markers and inhibitors used is described below:
  • Proteus mirabilis strains remained ir-hybrid, evidencing the inhibitory power of the medium for Gram negative organisms. Some strains of Staphylococcus developed in the middle, however they took different colors from streptococci, but in addition the rapid catalase test was performed, adding a reactive goia in the middle, achieving the complete differentiation of both genders.
  • composition of the ingredients was prepared according to example 7, the components were weighed separately in an Erlenmeyer flask with the difference that x-gluc was replaced (5- Bromo-4-chloro-3-indolyl- ⁇ -D-glucuronide cyclohexylammonium salt) by Magenta-gluc (gluc
  • the preparation method was similar to example 7.
  • ATCC 29971 Enterococcus faecium ATCC 6056, Streptococcus agalactiae ATCC 12386,
  • Example 8 The composition according to Example 8 was prepared, with the difference that X-gluc was replaced by the fluorogenic MUG, at a concentration of 0.05 g / 1. Deionized water was added to the solid ingredient mixture and the composition was prepared until gelling as described in example number 1.
  • Proteus mir ⁇ bilis collection strains of ATCC 7002, St ⁇ phylococcus ⁇ ureus ATCC 25923, St ⁇ phylococcus were inoculated by stretch marks xylosus ATCC 29971, Enterococcus f ⁇ ecium ATCC 6056, Streptococcus ⁇ g ⁇ l ⁇ cti ⁇ e ATCC 12386, Streptococcus pyogenes ATCC 19615, Streptococcus f ⁇ ec ⁇ lis ATCC 29212 and the strain isolated from: Enterococcus ⁇ vium (Costalous sphylophycology) The reading was done at 24 hours, according to table No. 5
  • the composition of the medium was prepared by weighing the ingredients separately in an Erlenmeyer flask.
  • the medium was prepared with the same ratio of nutritional bases as example 7, except that enzymatic bovine blood hydrolyzate was added in amounts of 1,911 g / 300 mL.
  • Two different enzyme markers were also tested at a concentration of 1.0 g / 1 with the addition of 0.5 g / 1 of ferric-ammonium citrate and two different concentrations of nalidixic acid 0.015 g / 1 and 0.010 g / 1.
  • the composition of enzymatic markers and inhibitors used is described below:
  • the method of inoculation used was: stretch marks on the surface of the gel and in the case of microorganisms used as positive conilols it was also inoculated by dilutions (10 " and 10 " 5 ).
  • composition of the present invention ATS: Triptona Agar Soy CFU / mL: Colony Forming Units per 10 " dilution mL In the middle is the growth of Streptocococcus agalactiae, Enterococcus faecalis,
  • Enterocccus faecium and Enterococcus avium at alias dilutions shows the differentiated growth of the different species den ⁇ ro of the genus Streptococcus.
  • Figure 2 Growth curves of Streptococcus agalactiae ATCC 12386 in the different nutrient base mixtures.
  • Figure 3 Growth curves of Streptococcus pyogenes ATCC 19615 in the different nutrient base mixtures.

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Abstract

La presente invención se relaciona con la Microbiología en particular con un medio de cultivo selectivo para el aislamiento y detección de especies del género Streptococcus. El medio propuesto permite la identificación de especies de Streptococcus por la aparición de 3 tonalidades diferentes en los organismos a detectar y la aparición de emisiones fluorescentes, además de cambios de coloración del medio, lo que ofrece la identificación con un alto grado de sensibilidad y especificidad.El medio comprende relaciones específicas de mezclas de bases nutritivas ricas en compuestos de origen protéico (polipéptidos, péptidos, proteosas, amioácidos) y vitaminas que posibilitan un crecimiento abundante de las especies de interés, además de la inclusión del hidrolizado enzimático de sangre, el cual garantiza la presencia en el medio de sustancias derivadas de la sangre o de sus fracciones necesarias para el crecimiento de Streptococcus, sin entorpecer la identificación.

Description

MEDIO DE CULTIVO SELECTIVO PARA EL AISLAMIENTO Y DETECCIÓN DE
ESPECIES DEL GENERO STREPTOCOCCUS
Sector Técnico
La presente invención se relaciona con la Microbiología y específicamente con el diagnóstico clínico y veterinario, control de la calidad de alimentos y estudios de contaminación de elementos ambientales, en los que se necesitan métodos para el aislamiento y detección de especies de Streptococcus. Arte Previo Los estreptococos son considerados un género de microorganismos fastidiosos, cuya identificación es altamente importante en el diagnóstico clínico. Dentro de la clasificación realizada por Lancefield se encuentran numerosas especies patógenas al hombre, tales como: Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Streptococcus anginosus, Enterococcus avium, Enterococcus faeciu n, Enterococcus faecalis, agentes causales de septicemias, meningitis neonatales, endocarditis e infecciones de las vías urinarias (Giuseppe, N. y Vito Mar N., 1989. Diccionario de Bacteriología Humana, edición española Menarini). Aunque los estreptococos no son los microorganismos que más f ecuentemente provocan sepsis urinaria, sí se hace necesario su detección, pues son específicamente los estreptococos β hemolíticos la causa más frecuente de sepsis en neonatos, lo que permite administrar profilaxis antibiótica intraparto y prevenir la infección perinatal por este microorganismo (Bosch, J.; Murillo, S.; Rico, M. y Salgado, M. 1998. Utilidad de un medio selectivo disco-caldo para la detección de estreptococo del grupo B en la vagina. Enferm. Infecc. Microbiol. Clin. Nol 16(2)). La incidencia de sepsis neonatal temprana es de 1.48-4.08/1,000 nacidos vivos con una mortalidad de 8.7-10.5 % (Montero, R.; Barbadillo, F.; Anso, S.; Matrero, M.; Carpintero I.; Sastre E. y Alonso B.: Sepsis neonatal por Streptococcus agalactiae. Qué hacer ?. An-Esp- Pediatr. 1998; 48 (3), p. 288-92; Juncosa, T.; Bosch, J.; Dopico, E.; Guardia, C; Lite, J.; Sierra, M.; Barranco, M.; Matas, L.; Sánchez, F.; Sanfeliu, I. y Ninas, L. 1998. Infección neonatal por Streptococcus agalactiae. Estudio multicéntrico en el área de Barcelona. Enferm-Infecc-Microbiol-Clin.; 16(7), p. 312-5). El agente causal de esta enfermedad es Streptococcus agalactiae mayormente, residente habitual del tracto genital femenino. Además surgen nuevos patógenos urinarios no conocidos como Streptococcus urinalis sp.nov., que aunque posee similitud con Streptococcus pyogenes y Streptococcus canis, resulta ser una nueva especie del género Streptococcus, cuyo nombre es Streptococcus urinalis sp.nov., cepa tipo CCUG 41590T (Collins, M.D.; Hutson, R.A.; Falsen, E.; Νikolaitchouk, Ν.; La Claire, L. and Facklam, R.R. 2000. An unusual Streptococcus from human uriñe, Streptococcus urinalis sp. nov. Int J Syst Evol Microbiol; 50 Pt 3, p. 1173-1178). En la actualidad existen en el mercado una serie de medios de cultivo que están diseñados para aislar y/o detectar las diferentes especies del género Streptococcus. Entre ellos se pueden mencionar: Agar Sangre, Agar Sangre Columbia, Agar Triptona Soya con Sangre, Agar
Cerebro Corazón, entre otros (Manual de Medios de cultivo OXOID. 1995. UNTPATH, España; MERCK Microbiology Manual. 2000. Merck KgaA, Darmstadt; Manual DIFCO de
Bacteriología. 1984. Décima Edición, Francisco Soria Melguizo, S.A., Madrid).
Estos medios no selectivos no permiten la diferenciación entre las especies patógenas y no patógenas. Estos medios al no ser selectivos permiten el crecimiento de otras bacterias Gram positivas y Gram negativas que compiten con los estreptococos por los nutrientes. Por ejemplo: en el caso de Proteus, las cepas que desarrollan "velo" impiden el aislamiento de las colonias de interés.
En las formulaciones no se encuentran sustancias altamente nutritivas, por lo que es necesario añadir sangre, lo cual dificulta la manipulación, aumenta el riesgo de contaminación y no permite una prolongada vida útil del medio preparado, por ser ésta un componente biológico lábil.
El Medio CLED comercializado por las firmas anteriormente mencionadas, que es utilizado ampliamente en los laboratorios y es considerado como una de las mejores opciones, permite el crecimiento de todos los patógenos de la orina, dentro de los que se encuentran Streptococcus, y otros microorganismos Gram positivos, que no pueden ser diferenciados, porque poseen características culturales similares. El crecimiento de los Streptococcus es lento. Los enterococos (Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium y Enterococcus avium) pueden ser confundidos con especies de Shigella.
En el Manual MERCK de Medios de cultivo (MERCK Microbiology Manual, 2000. Merck KgaA, Darmstadt) se describe un medio y un caldo para el Enriquecimiento selectivo de Streptococcus, que emplea la azida sódica y el sulfito de sodio como inhibidores de organismos Gram negativos. Se pueden mencionar como desventajas del medio su alta toxicidad por la presencia de la Azida sódica (ingrediente altamente tóxico) y la imposibilidad de diferenciar las distintas especies, pues es un caldo utilizado específicamente para promover el crecimiento microbiano. La firma OXOID (Manual de Medios de cultivo, OXOID, 1995. UNTPATH, España) describe en su manual un medio selectivo para Streptococus que precisa de la adición de sangre y de un suplemento selectivo, que contiene sulfato de colistina y ácido oxolínico, pero además es indispensable su incubación en atmósfera de CO2 al 5 %. Conjuntamente con las dificultades anteriormente mencionadas que provoca la adición de sangre, el uso de antibióticos como suplemento, dificulta la preparación del medio y no garantiza una real inhibición de la microbiota acompañante indeseada, debido a la aparición, cada vez con mayor frecuencia, de fenómenos de resistencia a los antibióticos, principalmente en los organismos Gram negativos.
Por demás, la necesidad de incubar el medio en atmósfera de CO2 al 5 % hace engorrosa la técnica de aislamiento, al no estar éste dirigido a la identificación o diferenciación, por lo que es preciso utilizar medios o ensayos bioquímicos y serológicos para identificar las especies de
Streptococcus de interés.
En el Manual antes mencionado, se describe además la composición de un medio selectivo para StreptococcusIStaphylococcus con la adición de sangre estéril y el suplemento de antibióticos ácido nalidíxico y sulfato de colistina. El empleo de esta formulación presenta las mismas desventajas mencionadas en el párrafo anterior, relativas a la utilización de sangre y antibióticos.
Un medio selectivo para el aislamiento rápido de Streptococcus agalactiae y otros estreptococos relacionados con la mastitis bovina: Medio Edwards (Modificado) es descrito en el Manual OXOID de 1995. A éste se le adiciona sangre como suplemento y contiene sulfato de talio y cristal violeta como inhibidores. Este diagnosticador permite el crecimiento de Streptococcus agalactiae y otros Streptococcus, sólo utilizando como principio de identificación la hidrólisis de la esculina por los estreptococos del grupo D (colonias negras) y la respuesta negativa (colonias azules) del resto, por lo que no pueden ser diferenciados entre ellos.
El cristal violeta empleado como agente selectivo, puede a su vez inhibir el crecimiento de los propios Streptococcus, además el sulfato de talio es considerado un compuesto altamente tóxico, nocivo para la salud humana y extremadamente dañino para el medio ambiente, lo que al mismo tiempo complica y hace muy engorroso el proceso de producción, preparación y el desecho del medio.
De manera similar el Medio Todd-Hewitt con gentamicina y ácido nalidíxico, Agar Sangre con colistina y ácido nalidíxico, Caldo Mueller-Hinton con 5 % de suero y amikacina (Bosch, J.; Murillo, S.; Rico, M. y Salgado, M. 1998. Utilidad de un medio selectivo disco-caldo para la detección de estreptococo del grupo B en la vagina. Enferm. Infecc. Microbiol. Clin. 16(2)) y el Medio Azida-Esculina-Acido oxolínico también se han empleado para la detección e identificación de especies específicas de Streptococcus con las desventajas ya mencionadas con anterioridad (Figueras, M.J; Inza, L; Polo, F. and Guarro, J. 1998. Evaluation of the oxolinic acid-esculin-azide médium for the isolation and enumeration of faecal streptococci in a routine monitoring programme for bathing waters. Can. J. Microbiol. 44, p. 998-1002). Se han solicitado o patentado un grupo de invenciones dirigidas al cultivo de especies específicas de Streptococcus. Algunas de ellas se relacionan a continuación.
En la solicitud de patente EP 1 098 002 Al del 2001.05.09 (Dehydrated immediate reconstruction culture médium to identify group B Streptococci (Streptococcus agalactiae) by detection of their pigment), De la Rosa Fraile, describe un medio deshidratado de reconstitución inmediata para identificar Streptococcus del grupo B, por la producción de su pigmento, cuya esencia consiste en añadir Sephadex 200 como agente gelificante al Medio
Granada.
Las limitaciones de la citada invención se pueden resumir como sigue: *** Sólo permite la identificación de Streptococcus agalactiae.
*t* Se necesita adicionar suero de caballo.
*** El medio preparado tiene una durabilidad de menos de 2 meses debido a la inestabilidad de los componentes.
*t* Se necesitan antibióticos como el metronidazol y la colistina añadidos como suplemento, lo que presenta deficiencias comunes a las ya descritas para las anteriores formulaciones.
*t* Al ser un medio semisólido, no se pueden observar las características culturales del microorganismo.
La preparación es compleja, e incluye diferentes pasos, tales como: la preparación del medio basal, la adición del gel, la agitación para atrapar bxrrbujas, la adición de los suplementos y la incubación en baño María.
Este mismo autor, años antes, desarrolló una formulación (De La Rosa Fraile, Manuel; Patente: ES 2088827, 1996.09.16. Culture médium for Streptococcus agalactiae which actives the formation of pigment by amylases and/or (G(&alpha 1-4)G) (n>2) glucooligosaccharides added as chemical compounds, as polysaccharide hydrolysates or generated in the same médium using enzymes and polysaccharides) para la detección de Streptococcus agalactiae que contenía antibióticos en forma de suplemento, amilasas, malto- oligosacáridos, almidón para la producción del pigmento característico de este microorganismo. Dicha formulación es compleja de preparar, contiene enzimas lábiles adicionadas como suplemento y compuestos químicos complejos (malto-oligosacáridos), lábiles y su empleo en la industria de medios de cultivo es poco común. Otro medio destinado a la identificación de Streptococcus del grupo B (hemolíticos), basado en la producción de un pigmento de color naranja, fue desarrollado por Tanaka Yoshihiro y Takahashi Hisayoshi (JP 9313171A2, 1997.12.09. Culture médium for group B hemolytic Streptococcus). La composición del medio es: glucosa, piruvato de sodio, Peptona de carne, MgSO4, MOPS-Fosfato, metotrexato y un agente antibacteriano (inactivo para Streptococcus del grupo B). Con ayuda de esta formulación no pueden ser identificados otros estreptococos.
En la patente JP 59159797 (Kojima, H., et al. 1984.09.10. Culture médium for selective proliferation of Streptococcus hemolyticus), se describe un medio selectivo para la proliferación de Streptococcus hemolyticus, cuya composición contiene lípidos y ácidos grasos como agentes selectivos específicos para promover el crecimiento de esta especie. El empleo en este medio, del frijol de soya, lo hace complejo en su preparación, además, los agentes selectivos no inhiben el crecimiento de otras especies de Streptococcus de interés.
Deyloff John protegió un medio de cultivo para la diferenciación de Streptococcus mutans (US 4468456, 1984.08.28. Médium for differentiating Streptococcus mutans) compuesto por sales de fosfato, agar, Extracto de levadura, sacarosa y un indicador de pH. La preparación de producto es compleja ya que el mismo se compone de 2 capas agarizadas, a una de las cuales hay que añadirle una suspensión de Fosfato de calcio, de difícil disolución. El medio no es suficientemente inhibidor para otras especies de Gram positivos. Otros medios y métodos han sido desarrollados para el cultivo de especies específicas de Streptococcus para obtener determinados metabolitos, o incluso, para el diagnóstico. Dichos productos en ningún caso brindan la posibilidad de diferenciación o detección de un número significativo de Streptococcus dentro del género. Entre de ellos se encuentran: Park et al. (US 5496726, 1996. Streptococcus zooepidemicus médium and process for preparing hyaluronic acid) e Inoue et al. (US 4 306 024, 1981.12.15. Process for cultivation of hemolytic Streptococcus pyogenes).
Blareau Jean Pierre y colaboradores (Patente: FR 2723960-A1, 1994.08.31. Cultures de Streptococcus thermophϊlus a activite beta-galactosidase elevee, leur procede d'obtention, et leurs utilisations) patentaron un medio de cultivo para Streptococcus thermophilus que contenía hidrolizados de proteínas lácteas, lactosa y extracto de levadura como iónicos componentes. El medio no está dirigido al diagnóstico clínico, ni al control de la calidad de alimentos y además no es selectivo para la detección de Streptococcus. Otro grupo de invenciones, por el contrario está dirigido al cultivo de varios géneros o especies de Streptococcus, y no permiten una diferenciación o identificación adecuada entre ellos, varios ejemplos se citan a continuación:
En los últimos años, ha aumentado el empleo de sustratos cromogénicos o fluorogénicos incorporados a los medios tradicionales o en nuevos medios de cultivo, desarrollados específicamente para algunos microorganismos con exigencias metabólicas. Estas reacciones cromogénicas poseen ciertas ventajas sobre los medios convencionales, tales como: rapidez en la respuesta en el tiempo, elevada especificidad y sensibilidad como resultado de la degradación del sustrato por una enzima específica.
Manafi en numerosos artículos, menciona y abarca una revisión extensa de los sustratos cromogénicos y fluorogénicos más frecuentemente empleados como componentes de los medios de cultivo, además, explica sus posibles usos en la identificación de algunas especies de Streptococcus, por ejemplo en el artículo "New developments in chromogenic and fluorogenic culture media" (Manaíϊ, M. 2000. International Journal of Food Microbiology 60, p. 205-218) se hace referencia a algunos de estos medios, los cuales presentan determinadas limitaciones o desventajas:
" Enterolert (LDEXX Laboratories Inc., Westbrook, Maine) y el Microtiter píate MUST
(Sanofi, France) que contienen un sustrato fluorogénico específico para la β-D glucosidasa, diseñados para la detección de enterococos en agua, aunque no permite la diferenciación e identificación de otros estreptococos, además contienen un solo marcador de enzima específica fluorogénico.
" El agar fue diseñado para la enumeración de enterococos en agua de mar o agua fresca. Contiene ácido nalidíxico, cicloheximida, trifeniltetrazolio y el sustrato indoxil la β-D glucósido. Posee la desventaja que utilizar antibióticos como agentes selectivos, además de poseer un solo marcador enzimático que imposibilita la identificación de otros Streptococcus. Se precisan de largos períodos de incubación (24-48 horas) y la sensibilidad del medio no es elevada. " La modificación de este medio reduciendo la concentración de trifeniltetrazolio y aumentando la concentración de indoxil β-D glucósido redujo el tiempo de incubación a 24 horas pero no amplió las posibilidades diagnósticas del medio. " Chromocult enterococci broth (CEB) (BBL) y el Readycult enterococci (MERCK) emplean como sustrato el 5-Bromo-4-cloro-3-indolil-βD glucopiranósido para identificar Enterococcus y azida sódica para inhibir otros microorganismos. En el medio aparecen falsos positivos, tales como: Leuconostoc, Lactococcus lactis y Aeromonas sp. No se identifican otros estreptococos y contiene ingredientes tóxicos.
El medio CHROMagar Orientation (BBL) (Carricajo, A.; Boiste, S.; Thore, J.; Aubert, G.; Gille, Y and Freydiere, AM. 1999. Comparative evaluation of five chromogenic media for detection, enumeration and identification of urinary tract pathogens. Eur J Clin Microbiol Infecí Dis 18(11), p. 796-803; Samra, Z.; Heifetz, M.; Talmor, J.; Bain, E. and Bahar, J. 1998. Evaluation of use of a new chromogenic agar in detection of urinary tract pathogens. J Clin Microbiol., 36(4), p. 990-994; Hengstler, KA; Hammann, R. and Fahr, AM. 1998. Evaluation of BBL CHROMagar orientation médium for detection and presumptive identification of urinary tract pathogens. J Clin Microbiol. 36(5), p. 1464; Merlino, L; Siarakas, S.; Robertson,
GJ.; Funnell, GR.; Gottlieb, T and Bradbury, R. 1997. Evaluation of CHROMagar Orientation for differentiating and presumptive identification of gram-negative bacilli and Enterococcus species. J Clin Microbiol 35(8), p. 2190) permite la identificación simultánea presuntiva de
Gram positivos, Gram negativos y levaduras. Dentro de los microorganismos que se pueden identificar se incluyen los estreptococos (grupos D,B y C), aunque los grupos B y C no pueden ser diferenciados, por lo que se requieren pruebas bioquímicas adicionales para su identificación. La gran diversidad de colores hace en extremo difícil la interpretación de los resultados y en ocasiones se requiere prestar una atención especial a la morfología, tamaño y características de las colonias (brillo u opacidad) lo que dificulta aún más la interpretación de los resultados. La similitud de colores de algunos estreptococos con microorganismos de los géneros Klebsiella, Enterobacter y Citrobacter, obliga a realizar ensayos adicionales que requieren más horas de ensayo. También es de destacar que el medio es sensible a la luz, lo que altera el color original, además la incubación y lectura debe realizarse de inmediato. El medio UTI (OXOID Inc.) diseñado para la identificación presuntiva y diferenciación de microorganismos causantes de infecciones del tracto urinario, contiene el sustrato cromogénico x-glu para la identificación de enterococos. Esta formulación presenta como desventajas que otros estreptococos no pueden ser identificados, crecen otros microorganismos Gram negativos que generalmente se encuentran en infecciones urinarias en concentraciones superiores a Streptococcus y su uso esta restringido a muestras de orina. En 1999, Alain Rambach patentó un método para la identificación de microorganismos con al menos dos sustratos cromogénicos (US 5 962 251, 1999.10.05 "Method for the identification of microorganisms wifh at least two chromogens"). El medio prevé el empleo de agar, peptona, cloruro de sodio, extracto de levadura, extracto de carne y carbohidratos (glucosa), así como sustratos cromogénicos derivados del indoxilo (bromo-indoxilo, cloro-indoxilo, di- cloro-indoxilo, cloro-bromo-indoxilo, entre otros). Su mayor utilidad es para la demostración de presencia o ausencia de levaduras del género Candida, especialmente Candida albicans y Candida tropicalis, aunque microorganismos de otros géneros, tanto Gram positivos como Gram negativos crecen con diferentes tonalidades de color, entre los que se encuentran los estreptococos. Sin embargo la diversidad de organismo que se desarrollan, al igual que en el caso anterior, impide una adecuada interpretación de los resultados; hay una gran competencia por los sustratos, por lo que los estreptococos pueden encontrarse inhibidos y la diferenciación entre otras especies de Streptococcus (no-grupo D) es imposible. Otra serie de medios cromogénicos desarrollados para la detección, enumeración e identificación de patógenos urinarios permiten la identificación específicamente de Streptococcus del grupo D tales como: CPS 3D2 (bioMerieux, France), Uriselect 3 (Sanofi Diagnostic) y Rainbow UTI (Biolog, USA) (Carricajo et al., 1999. Comparative evaluation of five chromogenic media for detection, enumeration and identification of urinary tract pathogens. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 18(11), p. 796-803; Navarro et al., 1996. Evaluation of chromogenic médium CPS ID2 (bioMerieux) in uriñe cultures. Enfeπn Infecc Microbiol Clin Apr; 14(4), p. 215-9; Reisner and Austin, 1997. Evaluation of CPS ID2 chromogenic agar as a single médium for uriñe culture. Diagn Microbiol Infecí Dis Jul; 28(3), p. 113-7; Willinger and Manafi, 1995. Evaluation of a new chromogenic agar médium for the identification of urinary trací paíhogens. Le í Appl Microbiol May 20(5), p. 300-2) y otros (Bochner B. US 5 464 755. 1995.10.07. Microbiological médium and method of assay; Yagupsky eí al., 2000. Clinical evaluaíion of a novel chromogenic agar dipslide for diagnosis of urinary tract infections. Eur J Clin Microbiol Infecí Dis 19, p. 694-698). Chen, Chun-Ming y colaboradores solicitaron una pateníe de un método y medio para la defección de eníerococos vancomicina-resisleníes (Chen, Chun-Ming; et al. Patení Application 20020132285-A1. 2002.09.19. Meíhod and médium for deíecting vancomycin- resisíaní eníerococcus). La invención consisíe en la utilización de un nutriente, que al ser metabolizado por los microorganismos produce una reacción, en esíe caso la enzima β-D- glucosidasa y la pirrolidonil- arilamidasa. Se debe señalar que el medio es incapaz de identificar a los enterococos sensibles a la vancomicina, así como a otras especies de Streptococcus. Su preparación es engorrosa, pues necesiía la adición de antibióticos como suplemento y la vancomicina no inhibe a algunas bacterias Gram negativas que pueden crecer en el medio, además, se requieren pruebas adicionales para la identificación hasía especie. En la soliciíud de patente de Esíados Unidos 20020086278-A1. 2002.06.04, Gosnell y colaboradores (Chromogenic media containing blood or hemin) describen un medio que contiene sangre o hemina y además sustratos cromogénicos tales como: magenta, x- glucósido, x-glucurónido, Mag-Fosfato, eníre oíros. El medio permite el crecimiento y la identificación de difereníes especies por las características morfológicas, la aparición de las diversas tonalidades de colores, fluorescencia y las reacciones hemolííicas. La invención puede ser considerada como el proíoíipo más cercano. El medio presenía las siguientes desventajas:
• La presencia de sangre o hemina entorpece la correcía iníerpreíación de las reacciones cromogénicas, en una composición que no inhibe a las bacterias Gram negativas, deníro de los cuales se encueníra una gran biodiversidad de microorganismos con actividad enzimálica común con la del género Streptococcus.
• El tiempo de vida útil del medio es limitado, por la presencia de componentes biológicos (sangre o hemina), y su preparación es engorrosa. • Al no ser un medio selectivo, pueden desarrollarse oíros géneros Gram positivos y Gram negaíivos que compiíen por los nuírieníes, lo que conlleva a que los microorganismos de interés (Streptococcus) no crezcan adecuadamente.
• La utilización de sangre y hemina como suplemento hace compleja la preparación de este diagnos icador y aumenta el riesgo de coníaminación del medio. • Se precisa de pruebas bioquímicas adicionales para la ulterior diferenciación de Strepíococcus, lo que conlleva a un período adicional de tiempo para lograr una adecuada identificación de los gérmenes de inferes. Específicamente se necesiía realizar una prueba de PYR adicional para diferenciar Streptococcus pyogenes de los Streptococcus del grupo D (Enterococcus). • Para la identificación de algunos microorganismos, es preciso íener en cuenía la morfología, el íamaño y oirás características de las colonias, que son muy variables porque dependen del íipo de mueslra, conceníración inicial del microorganismo y microbioía acompañante, entre oíros factores.
• La posibilidad de que crezcan microorganismos de oíros géneros íales como: Proteus, cuya característica fundamental es la formación de un velo en el medio, hace imposible la identificación de las colonias.
• Oíros microorganismos con capacidad hidrolííica sobre las proíeínas pueden hidrolizar la albúmina e interferir en la identificación.
• Para la preparación del medio, se plantea que los sustratos cromogénicos pueden ser adicionados al medio fresco, preparado asépticamente, ya que algunos de ellos son lábiles a altas temperaturas, lo que hace compleja su preparación.
• Las soluciones de los cromogénicos, en algunos casos, forman precipitados insolubles, siendo más inestables después de una semana, lo que limita la vida útil del diagnosíicador.
• Cuando se utiliza como base el Agar Chocolate, el medio se incuba en aímósfera de CO2 al 5%.
• Algunos sustratos cromogénicos necesitan ser disueltos en dimetil sulfóxido lo que hace engorrosa la preparación del medio.
• En algunos casos (Ejemplo 3) los esírepíococos del grupo D toman igual color que oíros microorganismos (azul), entre los que se encuentran: Candida albicans, Gram negativos y Staphylococcus epidermidis. • Los susíra os especialmente el magenía, oscurecen el color de los medios con sangre después de la incubación, lo que reduce la claridad de la lectura y la apariencia de las reacciones hemolííicas.
• Los susíraíos cromogémcos que dan coloración a las colonias de púrpura, rojo y magenía no contraían adecuadamente con el fondo rojo del medio.
Divulgación de la invención
El objetivo de la preseníe invención consisíe en proveer un medio selectivo para el aislamiento y defección de especies del género Streptococcus, posibilitando la diferenciación de Streptococcus de importancia clínica, iales como: Streptococcus agalactiae, Streptococcus pyogenes y Streptococcus del grupo D (Enterococcus), en períodos tempranos de cultivo (2- 24 horas) y con una elevada sensibilidad y especificidad analítica.
La novedad de la invención propuesta consiste en una combinación de bases nulritivas especialmente seleccionadas en cantidades de 15 a 58 g/1, que garantizan un contenido de nitrógeno toíal, fundamentalmente derivado de las proteínas, entre 10 y 14 %, una mezcla especialmente diseñada de inhibidores de microorganismos Gram negativos en cantidades de 0,55 a 1,63 g/1; una mezcla de sustratos cromogénicos y/o fluorogénicos, degradables por al menos una enzima de cada especie, en cantidades de 0,3 a 1,5 g/1 y compuestos indicadores de la acíividad desaminasa, en cantidades de 1 a 3 g/1. La mezcla original de bases nuíriíivas esíá compuesía por exlracíos e hidrolizados de difereníes orígenes, específicamente seleccionados eníre:
• Hidrolizado de sangre bovina de 5 a 10 g/1
• Exlracto de corazón de res de la 12 g/1
• Hidrolizado enzimático de músculo de corazón de res de 1 a 5 g/1 • Hidrolizado enzimático de proteínas lácíeas de 5 a 20 g/1
• Hidrolizado enzimáíico de proteínas del frijol de Soya de 2 a 15 g/1
• Hidrolizado enzimático de tejido animal de 1-5 g/L
• Auíolizado o hidrolizado de levadura Sacharomyces cerevisiae de 2 a 15 g/1
La peculiar mezcla de inhibidores nunca descrita incluye una combinación de: Acetaío de íalio de 0,55 a 1,6 g/1 Acido nalidíxico de 0,005 a 0,030g/l
Oíro aspecío singular de la invención consiste en el empleo de la mezcla de susíraíos cromogénicos y fluorogénicos que revelan la acíividad fosfatasa, glucosidasa y glucuronidasa para diferenciar las diversas especies de Streptococcus, la cual contiene: para-nitrofenilfosfato sal disódica (PNP), de 0,2 a 0,8 g/L; x-glu (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-Dglucoρiranósido,
Mu-glu (4-meíilumbeliferil βD-glucopiranósido), Saimon-glu (6-cloro-3-indolil- β-D- glucopiranósido) de 0,05 a 0,4 g/L y x-gluc (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-glucurónido sal de ciclohexilamonio), Magenía-Gluc (5-bromo-6-cloro-3-indolil-β-D-glucurónido sal de ciclohexilamonio) y MUG (írihidraío de 4-meíilumbeliferil β-D-glucurónido) de 0,05 a 0,2 g/L.
Esías susíancias cromogénicas se combinan de manera muy original, para garantizar la aparición de colores o fluorescencias diferentes para cada especie a deíecíar, siendo esías: a) PNP + x-glu + Magenía-gluc ó MUG b) PNP + Salmon-glu + x-gluc ó MUG c) PNP + MU-glu + Magenía gluc ó x-gluc
Oíro aspecto singular de la invención, consiste, en que se adicionan varios compuestos que indican la actividad desaminasa en el medio, como son: sales de meíales írivaleníes, preferiblemente citrato férrico-amónico en cantidades de 0,5 a 1,0 g/1 y aminoácidos aromáticos, preferiblemente la fenilalanina y el íripíófano, en cantidades de 1,0 a 2,0 g/1. A la composición antes descrita se incorpora agar de 10,0 a 14,0 g/L y se obtiene un medio que permite observar los caracteres culíurales de los organismos de iníerés. El medio formulado presenía un valor del pH de 7 a 7,4 y se emplea en concenlraciones de 25 a 80 g/L de agua.
Con ayuda del medio, por primera vez, se pueden aislar y deíecíar de manera exclusiva las diferentes especies de Streptococcus, fundamentalmente las patógenas al hombre, basándose solamente en la aparición de colonias de colores específicos para determinados géneros, y en cambios en el color del medio.
Es de resallar que por primera vez se provee un medio de cultivo selectivo que posibiliía al unísono, diferenciar a los estreptococos del grupo D (eníerococos) del resto de los estreptococos, y a estos últimos eníre sí. Como ejemplo se pueden señalar: Streptococcus agalactiae y Streptococcus pyogenes, que crecen sin la presencia de otras especies de bacterias Gram negativas y de otras especies de Gram positivas inhibidas.
Las ventajas del medio propuesto en la siguiente invención consisten en que: • Por primera vez se posibiliía la diferenciación entre las especies patógenas, y eníre esías y la mayoría de las no paíógenas del género Streptococcus. • El medio es altamente selectivo para Streptococcus, inhibe la mayoría las especies de bacterias Gram negativas, con excepción de Proteus mirabilis ATCC 7002 que crece en el medio muy inhibido, pero a altas concentraciones torna el medio a un color diferente al de los estreptococos. Además, en él, sólo se desarrollan muy pocas especies de otros organismos Gram positivos, que se encuentran inhibidos, y en el caso de existir un crecimiento de ellos escaso en el medio, íoman una coloración que no iníerfiere con el crecimiento abundante de los microorganismos de inferes.
• La compleja y novedosa mezcla de bases nutritivas que contiene el medio, garantiza la presencia de aminoácidos, pépíidos, polipépíidos, proíeosas y pepíonas de los más disímiles orígenes y composición, y de manera inesperada, posibiliían un crecimienío abundante de las especies de interés y permiten la exclusión de suslancias lábiles como la hemina y la sangre.
• De especial relevancia y novedad resulía la inclusión del hidrolizado enzimáíico de sangre en la mezcla antes mencionada, que garantiza la presencia en el medio de suslancias derivadas de la sangre o de sus fracciones necesarias para el crecimienío de Streptococcus, sin entorpecer la identificación. Por otra parle las proteínas de la sangre ya digeridas no le restan estabilidad al medio.
• Los estreptococos en el medio, al contar con los nutrientes suficientes para su rápido crecimiento, y ante la ausencia de otros organismos competidores, se desarrollan más rápidamente y pueden ser aislados e identificados en un período máximo de incubación de 6 a 24 horas.
• La sensibilidad y especificidad son elevadas, no pueden ser confundidos con bacterias Gram negativas tales como: Shigella y Escherichia coli, pues estos no crecen en el medio, y las pocas especies de Gram positivos que logran desarrollarse en el medio (Staphylococcus xylosus y Staphylococcus saprophyticus), se encuentran casi totalmente inhibidas y además no pueden confundirse con el resto porque toman una coloración diferente. De alguna cepa presenta crecimiento similar a Streptococcus, puede diferenciarse realizando directamente en la placa la prueba de catalasa.
• En la preseníe invención no se añaden suslancias altamente tóxicas ni contaminantes del medio ambiente, por lo que el medio se puede producir a escala industrial y preparar en el laboratorio, bajo condiciones adecuadas y propias de la actividad.
• La efectividad de los inhibidores coníemplados en la formulación evita el uso de antibióticos lábiles, lo que ayuda a que la preparación del medio sea sencilla y además no existan errores en la identificación por fenómenos de resistencia a los antimicrobianos. • La combinación de inhibidores, la concentración a la que se encuentran en el medio y su relación con los nutrientes no inhibe a ninguna especie de Streptococcus, lo que amplia el espectro diagnóstico del medio como nunca antes, pero específicamente para este género.
• Al detectarse y diferenciarse adecuadamente, los estreptococos de interés, con alta sensibilidad y especificidad no es necesario recurrir a la realización de pruebas bioquímicas adicionales, lo que posibilita tener un diagnóstico temprano.
• La preparación de este diagnosticador es en extremo sencilla pues en algunos casos, puede no esterilizarse en autoclave el medio, y en otros, sólo se adiciona un suplemento.
• La vida útil del medio preparado es considerable, ya que contiene inhibidores de la mayoría de los coníaminantes ambientales y no contiene sustancias lábiles (como la hemina, sangre y antibióticos).
• La identificación de las bacterias de interés, al realizarse sólo por las características culturales (color de las colonias y del medio), excluye la necesidad de observar a profundidad características morfológicas de las colonias, facilitando la interpretación de los resultados por un personal entrenado pero no especializado.
• El uso de más de un marcador enzimático para la diferenciación de las diversas especies del género Streptococcus aumenta la especificidad y la sensibilidad del diagnosticador.
• La formulación reportada en la solicitud posibilita preparar el medio a diferentes concentraciones para múltiples presentaciones, por ejemplo: a conceníración simple en medio agarizado, a doble conceníración para ser empleado en las técnicas de filtración por membrana, o en forma de caldo, e incluso a una concentración mayor para sistemas miniaturizados.
• Con este medio se logra sustituir el empleo de diferentes medios tradicionales o cromogénicos utilizados en la identificación de difereníes especies dentro del género Streptococcus.
• La formulación propuesía posibilita su empleo en la búsqueda de Streptococcus en muestras clínicas o veterinarias, de aguas y otros elementos del ambiente así como en alimentos.
• Se logra el aislamiento e identificación simultánea en un solo paso, con el consecuente ahorro de tiempo, de recursos y personal.
Para la definición de la composición del medio, los componeníes utilizados en la preparación fueron preferiblemente sólidos. La descripción de los pasos a seguir para la preparación de los mismos se presenía a continuación: La mezcla de bases nutritivas, cuyo contenido de niírógeno íoíal se encuentra eníre 10 y 14 %, se lamiza para lograr uniformidad en el íamaño de las partículas.
Dichos ingredientes de origen proléico esíán en una cantidad de 15 a 58 g/1, específicamente de Hidrolizado de sangre bovina de 5-10 g/1, Extracto de corazón de res de 1- 12 g/1, Hidrolizado enzimático de músculo de corazón de res de 1-5 g/1, Hidrolizado enzimático de proteínas lácíeas de 5-20 g/1, Hidrolizado enzimático de proteínas del frijol de Soya de 2-15 g/1, Hidrolizado enzimático de tejido animal de 1-5 g/1, Autolizado o hidrolizado de levadura
Sacharomyces cerevisiae de 2- 15 g/1.
Los agentes selectivos se seleccionan entre: acetaío de íalio de 0,55 a 1,6 g/1 y ácido nalidíxico de 0,05 a 0,030g/l. De igual forma son tamizados, quedando listos para ser mezclados y homogenizados con el resto de los componentes.
Los compuestos cromogénicos y fluorogénicos para deíecíar la acíividad glucosidasa, fosfatasa y glucuronidasa en cantidades de 0,3 a 1,5 g/1, son premezclados, además se pueden molinar y tamizar previo a su homogenización de manera tal que pesando la suma de la cantidad de cada componeníe en la formulación, se logre una distribución adecuada de cada uno.
Los sustratos cromogénicos y fluorogénicos son seleccionados en dependencia del objetivo del medio, entre: el p-niírofenüfosfaío sal disódica, de 0,2 a 0,8 g/1, x-glu (5-bromo-4-cloro-3- indolil-β-D-glucopiranósido), Mu-glu (4-metilumbeliferil β-D-glucopiranósido), Salmon-glu (6-cloro-3-indolil- β-D-glucopiranósido) de 0,05 a 0,4 g/1 y x-gluc (5-bromo-4-cloro-3- indolil-β-D-glucurónido sal de ciclohexilamonio), Magenía-gluc (5-Bromo-6-cloro-3-indolil- βD-glucurónido sal de ciclohexilamonio) y MUG (trihidraío de 4-metilumbeliferil β-D- glucurónido) de 0,05 a 0,2 g/1. La conformación de la mezcla de susíancias cromogénicas y fluorogénicas degradables por al menos una enzima de cada especie fue realizada, en combinaciones tales, que garantizan la aparición de colores o fluorescencia diferentes para cada especie como se describe a continuación: a) PNP + x-glu + Magenta-gluc ó MUG b) PNP + Salmon-glu + x-gluc ó MUG c) PNP + Mu-glu + Magenla-gluc ó x-gluc
El ageníe gelificanle, preferiblemente agar, de dureza entre 400 y 700 g/cm2, se utiliza en cantidades entre 10,0 a 14,0 g/1, específicamente para el medio sólido, se seca y lamiza antes de agregarse al medio.
Todos los componentes antes mencionados, así como la premezcla, se unen y homogenizan hasta lograr un contenido uniforme con un pH entre 7,0 y 7,4. Dicha mezcla se envasa en frascos herméticamente cerrados, protegidos de la luz, manteniéndolos a íemperaíura ambiente.
El polvo se adiciona en cantidades de 30 a 80 g/1, de esta manera se restituye y se obtiene la suspensión de la composición.
La composición puede prepararse a escala de laboratorio, pesando los componentes por separado dentro de un recipiente y manteniendo las proporciones antes mencionadas. Se adiciona posteriormente el líquido sobre la mezcla de polvos poco a poco, hasía lograr la compleía disolución. La suspensión se agita y se deja reposar al menos 10 minutos. Si se prepara el medio agarizado, éste puede o no esterilizarse previo a la adición del p- nitrofenilfosfaío sal disódica. Siempre que se hayan tomado precauciones en la preparación, es suficiente el calentamiento hasta ebullición, pues el medio es altamente inhibidor de los microorganismos ambientales que pudieran contaminarlo. De lo contrario, el medio se esteriliza a 115 °C durante 10 minutos y con posterioridad, después de enfriarlo hasta 45-50 °C se le adiciona el PNP filtrado a través de un filtro esterilizante. Para el caso del medio líquido, siempre se esteriliza en autoclave y se añade el suplemento estéril. Una vez el medio lisio se distribuye en el envase final de ensayo.
En dependencia de la consistencia del medio (sólido o líquido) se emplean diferentes métodos de inoculación. Una vez inoculados, se incuban a temperalura de 30 a 37 °C por al menos 2 a 6 horas en caso del medio líquido y de 18 a 24 horas para el medio sólido.
La lecíura de los resultados se realiza en el caso del medio sólido, observando el color de las colonias aisladas en la superficie y del medio. Para el medio líquido sólo se observa el cambio de coloración del medio y la fluorescencia. De manera que se puede diferenciar los estreptococos del grupo D del resto de las especies de este género.
Los esíafilococos, por lo general, no se desarrollan en el medio o se encuentran muy inhibidos, observándose como colonias pequeñas incoloras (Staphylococcus saprophyticus) o de colores diferentes a los estreptococos, que no interfieren en la identificación de los organismos de interés. Los enterococos se observan de color rosado, azul o fluorescentes según la combinación de los suíraíos empleados, mientras que en dependencia de la combinación utilizada los estreptococos se observan amarillo, amarillo verdoso, verde, magenta, azules o fluorescentes, siempre que se utilice un suíraío diferente que el empleado para revelar la presencia de enterococos. Ejemplos de Realización
Ejemplo No. 1
Una serie de mezclas de bases nutritivas fueron ensayadas como componentes nutricionales en la formulación. En los experimentos se diseñaron 3 variantes, cuya composición aparece en la íabla 1. Los ingredientes se reconstituyeron en 100 mL de agua y se procedió a prepararlos según la descripción detallada de la presente invención.
La evaluación de la capacidad de promoción del crecimiento se realizó con cepas de colección en comparación con el medio de referencia (Caldo de Enriquecimiento selectivo de
Esírepíococos, Merck, lote: 86444327). En cada tubo se inoculó 0,1 mL de la solución estandarizada al 50 % de transmilancia de cada microorganismo.
Las curvas de crecimienío aparecen en las figuras 1, 2 y 3.
Los resulíados de la promoción del crecimienío de los estreptococos fueron altamente satisfactorios. En el caso de Streptococcus agalactiae se observó que las 3 composiciones características de la presente invención promovieron con mayor intensidad el crecimiento durante las 8 primeras horas con respecto al medio conírol e incluso la variante 1 promovió el crecimiento de manera muy superior hasta las 9 horas.
En el caso de Streptococcus faecalis se observó una mayor aceleración del crecimienío en las
4 primeras horas, en las variantes experimeníales, con respecto al conírol, y en el caso de Streptococcus pyogenes, a partir de las 6 horas el crecimienío resulíó significativamente superior en las nuevas composiciones propuestas.
Tabla 1. Composición de bases nutritivas de las diferentes variantes experimentales
Figure imgf000017_0001
Ejemplo No. 2
Se preparó la composición con los ingredientes según ejemplo 1, pero pesados por separado dentro de un matraz de Erlenmeyer. Como agentes promotores del crecimiento y marcadores enzimáticos se utilizaron los siguientes ingredientes:
Figure imgf000018_0001
En la formulación no se empleó agar. Se añadió a la mezcla de ingredientes sólidos 100 mL de agua desionizada y se procedió a la preparación de la composición según se expone en la descripción detallada.
Se inocularon cepas de colección de Streptococcus pyogenes ATCC 19615, Streptococcus agalactiae ATCC 12386, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Enterococcus faecalis ATCC 19433, Enterococcus faecium ATCC 6056. Dichas cepas se inocularon de forma directa una solución estandarizada al 50 % de transmitancia en los tubos de cada una. Se logró a las 18 horas que el medio se tomará azul-verdoso en el caso de Enterococcus faecalis ATCC 29212 y 19433. La cepa de Enterococcus faecium mostró coloración azul oscuro, Streptococcus agalactiae se tomó verde y Streptococcus pyogenes se observó de color amarillo-verdoso. Los resulíados muestran la rapidez de la respuesta de los microorganismos en el tiempo y la posibilidad de diferenciar los enterococos (grupo D) del resío de los estreptococos al tomarse de una coloración entre verde-azul a azul y los estreptococos, íales como: Streptococcus pyogenes y Streptococcus agalactiae moslrar una coloración amarillo verdoso. Para comprobar la certeza de la selección del susírato cromogénico x-glu se preparó un medio cuya composición fue similar a la descrita anteriormente, con la diferencia de que se empleó la esculina. La cantidad utilizada fue de 0,1 g/lOOmL, además se añadieron sales de hierro en una concentración de 0,05 g/lOOmL.
Estos ingredientes fueron pesados por separado en un matraz de Erlenmeyer, posteriormente se añadió 100 mL de agua desionizada y se procedió a la preparación. Se inocularon cepas de colección de Streptococcus pyogenes ATCC 19615, Streptococcus agalactiae ATCC 12386, Enterococcus faecalis ATCC 29212 y algunas cepas aisladas de muestras clínicas (4 eníerococos y 4 β hemolííicos) . Dichas cepas se inocularon de forma direcía una solución estandarizada al 50 % de transmiíancia en los tubos de cada una. La respuesta obtenida tanto para Enterococcus faecium como Enterococcus faecalis fue un cambio de coloración del medio a negro, lo que enmascara las demás reacciones enzimálicas a las cuales algunas especies pueden ser positivas.
En cuanto a Streptococus pyogenes y Streptococcus agalactiae ambas tornaron el medio de color verde olivo. Las 4 cepas aisladas de eníerococs dieron de color negro, al igual que 3 de los estrepíococos β hemolííicos. Solameníe un β hemolííico se observó de color verde olivo al igual que Streptococus pyogenes y Streptococcus agalactiae.
Los resultados obtenidos fueron apreciados de forma temprana, sin embargo la coloración negruzca como resultado de la hidrólisis de la esculina limiía la identificación, pues imposibilita la lectura del resto de las reacciones. Como conclusión el experimento permitió comprobar lo acepíado de la inclusión del x-glu como ingrediente en la formulación del medio, y no el uso de esculina.
Ejemplo No. 3
La composición del medio fue preparada según el ejemplo 2, con la diferencia de que se aumentó la concentración de los componeníes nutritivos y los marcadores enzimáíicos. Se pesaron por separado dentro de un matraz de Erlenmeyer las siguientes cantidades:
Figure imgf000019_0001
Se añadió a la mezcla de ingredientes sólidos 100 mL de agua desionizada y se procedió a la preparación.
Se inocularon cepas de colección, íales como: Streptococcus pyogenes ATCC 19615, Streptococcus agalactiae ATCC 12386, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Enterococcus faecalis ATCC 19433, Enterococcus faecium ATCC 6056 y algunas cepas aisladas: Enterococcus avium (aislado). Dichas cepas se inocularon de forma directa en los pocilios de un juego de microtubos de polipropileno (Módulo 250 pp, NUNC, loíe: 046247) añadiendo
0,1 mL de una solución estandarizada a la escala 3,0 de McFarland en 0,1 mL de medio.
A las 2 horas se observó cambios de coloración del medio a azul-verdoso para Enterococcus faecalis ATCC 29212, azul para Enterococcus faecalis ATCC 19433, Enterococcus avium se tomó amarillo-verdoso, Enterococcus faecium de color azul claro, Streptococcus pyogenes y
Streptococcus agalactiae se mostraron de color amarillo intenso.
La respuesta se mantuvo en el tiempo (hasía las 6 horas). Los resulíados demostraron la rapidez en la respuesla a las reacciones enzimálicas, y la posibilidad de desarrollar una prueba rápida para la identificación de especies del género Streptococcus.
Ejemplo No. 4
La composición de los ingredientes se preparó según el ejemplo 2, con la adición de un ageníe gelificaníe (agar) en una concentración de 6,5 g/500 mL. Se pesaron los componentes por separado en un maíraz de Erlenmeyer y se añadió a la mezcla de ingredientes sólidos 500 mL de agua desionizada. Posteriormente se procedió a la preparación según el ejemplo 1. Se inocularon cepas de colección, íales como: Streptococcus pyogenes ATCC 19615, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Enterococcus faecalis ATCC 19433, Enterococcus faecium ATCC 6056. Se inocularon por estrías en la superficie del gel, hasta lograr colonias aisladas.
Se logró a las 24 horas una coloración verde-claro de las colonias con cambio del medio a amarillo de Streptococcus pyogenes. Las cepas de Enterococcus faecalis ATCC 29212 y 19433 mostraron características culturales similares, se tornaron de una coloración azul con un pequeño halo azul alrededor. En cuanto a Enterococcus faecium, las colonias se observaron más pequeñas que el resto de los eníerococos, de color azul con un pequeño halo azul alrededor.
Ejemplo No. 5
Se preparó la composición del medio pesando los ingredientes por separado en un maíraz de Erlenmeyer según el ejemplo 4, con la diferencia de que los marcadores enzimáticos se encuentran en una concentración menor (0,2 g/1 de p-nitrofenilfosfato sal disódica y 0,1 g/1 de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-glucopiranósido).
El método de preparación fue el descrito en el ejemplo 1. Se inocularon por estrías en la superficie del gel, cepas de colección de: Streptococcus pyogenes ATCC 19615, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Enterococcus faecium ATCC
6056, Staphylococcus aureus ATCC 25923 y una cepa aislada de Enterococcus avium.
La lectura realizada a las 24 horas de la evaluación de la composición con las cepas de colección se observó según se muestra en la tabla No. 2.
Tabla No. 2 Características de crecimiento y de las colonias de los microorganismos en el medio sólido.
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Ejemplo No. 6
La composición fue preparada con los ingredientes según el ejemplo 2, con la diferencia de que el sustrato cromogénico x-glu (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-glucopiranósido) fue sustiíuído por Mu-glu (4-meíilumbeliferil β-D-glucopiranósido) en una conceníración de 0,05 g/1. El método de preparación fue similar al ejemplo 2.
En la evaluación se emplearon cepas de colección de: Enterococcus faecalis ATCC 29212,
Enterococcus faecium ATCC 6056, Streptococcus lactis ATCC 11454 y una cepa aislada de
Enterococcus avium. Dichas cepas se inocularon de forma direcía en los pocilios de un juego de microτubos de polipropileno (Módulo 250 pp, NUNC, lote: 046247) añadiendo 0,1 mL de una solución estandarizada a la escala 2,0 de McFarland en 0,1 mL de medio.
Se logró a partir de las 2 horas deíecíar el crecimienío de los microorganismos ensayados y la fluorescencia de color azul bajo luz ulíravioleía (365 nm) de Enterococcus faecalis y
Enterococcus faecium.
La lectura a las 6 horas mostró que todas las cepas inoculadas poseían acíividad glucosidasa, ya que respondieron con una fluorescencia de color azul al ser alumbradas con luz ulíravioleía. Se demostró que es posible la utilización del sustrato fluorogénico Mu-glu (4-metilumbeliferil β-D-glucopiranósido), pues la detección de los estreptococos (enterococos) fue rápida.
Ejemplo No. 7
Se preparó la composición del medio pesando los ingredientes por separado en un matraz de Erlenrneyer. Fueron ensayadas 2 mezclas de inhibidores en el medio sólido. A continuación se describe la composición de agentes promotores del crecimienío, marcadores enzimáíicos e inhibidores utilizados:
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Se procedió a la preparación según el ejemplo 1.
El método de inoculación empleado fue por estrías en la superficie del gel. En la evaluación se utilizaron cepas de colección de: Proteus mirabilis ATCC 7002, Proteus mirabilis ATCC 12433, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus xylosus ATCC 29971, Staphylococcus saprophyticus ATCC , Enterococcus faecium ATCC 6056, Streptococcus agalactiae ATCC 12386, Streptococcus faecalis ATCC 29212 y la cepa aislada de Enterococcus avium.
Se realizó la lectura a las 24 horas, los resultados del comportamiento de los microorganismos en el medio se muestran en la tabla No. 3. Es de destacar que los resultados obtenidos en ambas variantes (VI y V2) fueron similares. Tabla No. 3. Características del medio y de las colonias
Figure imgf000023_0001
Leyenda: +: crecimienío bueno -: crecimienío inhibido
Las cepas de Proteus mirabilis se mantuvieron ir-hibidas, evidenciando el poder inhibitorio del medio para los organismos Gram negativos. Algunas cepas de Staphylococcus se desarrollaron en el medio, sin embargo tomaron coloraciones diferentes a los estrepíococos, pero además se realizó la prueba rápida de la catalasa, añadiendo una goía del reacíivo en el medio, lográndose la compleía diferenciación de ambos géneros.
Ejemplo No. 8
La composición de los ingredientes se preparó según ejemplo 7, se pesaron los componentes por separado en un matraz de Erlenmeyer con la diferencia de que se sustituyó x-gluc (5- bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-glucurónido sal de ciclohexilamonio) por Magenta-gluc (gluc
(5-Bromo-6-cloro-3-indolü-βD-glucurónido sal de ciclohexilamonio).
El método de preparación fue similar al ejemplo 7.
Se inocularon cepas de colección de Proteus mirabilis ATCC 7002, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus xylosus
ATCC 29971, Enterococcus faecium ATCC 6056, Streptococcus agalactiae ATCC 12386,
Streptococcus pyogenes ATCC 19615, Streptococcus faecalis ATCC 29212 y las cepas aisladas de Enterococcus avium y Staphylococcus saprophyticus.
Los resultados del comportamiento de los microorganismos en el medio se muestran en la labia No. 4.
Tabla No. 4. Características del medio y de las colonias
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Leyenda:
+: crecimiento bueno -: crecimiento inhibido Se observó un crecimiento temprano y diferenciado de las especies de Streptococcus, por las diferentes coloraciones desarrolladas en el medio.
Algunas cepas de Staphylococcus se desarrollaron en el medio y tomaron coloraciones diferentes a los estreptococos, aunque Streptococcus xylosus se tomó de un color similar a Streptococcus agalactiae, pero se diferenció pues no tomó el color del medio a amarillo. No obstante se realizó la prueba rápida de la catalasa, añadiendo una gota del reactivo en el medio, y se logró la identificación del género Stαphylococcus, producto de la liberación de H2 y O2 (formación de burbujas).
Ejemplo No. 9
Se preparó la composición del según el ejemplo 8, con la diferencia de que se sustiíuyó X- gluc por el susíralo fluorogénico MUG, en una concentración de 0,05 g/1. Se añadió a la mezcla de ingredientes sólidos agua desionizada y se procedió a la preparación de la composición hasía su gelificación según se describe en el ejemplo número 1. Se inocularon por estrías cepas de colección de Proteus mirαbilis ATCC 7002, Stαphylococcus αureus ATCC 25923, Stαphylococcus xylosus ATCC 29971, Enterococcus fαecium ATCC 6056, Streptococcus αgαlαctiαe ATCC 12386, Streptococcus pyogenes ATCC 19615, Streptococcus fαecαlis ATCC 29212 y la cepa aislada de : Enterococcus αvium (Costa Rica) y Stαphylococcus sαprophyticus. Se realizó la lectura a las 24 horas, según la tabla No. 5
Tabla No. 5 Características del crecimiento y las colonias a las 24 horas de incubación
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Leyenda: +: buen crecimienío y fluorescencia positiva ±: crecimiento escaso -: crecimiento inhibido
Ejemplo No. 10
Se preparó la composición del medio pesando los ingredientes por separado en un matraz de Erlenmeyer. El medio se preparó con la misma relación de bases nutritivas que el ejemplo 7, a excepción de que se añadió hidrolizado enzimático de sangre bovina en cantidades de 1,911 g/300 mL. También se ensayaron dos marcadores enzimáíicos diferentes en concentración de 1,0 g/1 con la adición de 0,5 g/1 de citrato férrico-amónico y dos concentraciones diferentes de ácido nalidíxico 0,015 g/1 y 0,010 g/1. A continuación se describe la composición de marcadores enzimáticos e inhibidores utilizados:
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Se procedió a la preparación según el ejemplo 1.
El método de inoculación empleado fue: estrías en la superficie del gel y en el caso de los microorganismos utilizados como coníroles positivos se inoculó también por diluciones (10" y 10"5). En la evaluación se utilizaron cepas de colección de: Proteus mirabilis ATCC 7002, Proteus mirabilis ATCC 12433, Citrobacter freundii ATCC 8090, Citrobacter freundii ATCC 10625, Enterococcus faecium ATCC 6056, Streptococcus agalactiae ATCC 12386, Streptococcus faecalis ATCC 29212 y la cepa aislada de Enterococcus avium.
Los resultados del comportamiento de los microorganismos en el medio se muestran en la tabla No. 6. Tabla No. 6. Evaluación del comportamiento de los diferentes microorganismos (incubación 35 °C por 24 h).
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Experim: Composición de la presente invención ATS: Agar Triptona Soya UFC/mL: Unidades Formadoras de Colonias por cada mL de dilución 10"5 En el medio se observa el crecimienío de Streptocococcus agalactiae, Enterococcus faecalis,
Enterocccus faecium y Enterococcus avium a alias diluciones, se demuestra el crecimiento diferenciado de las diferentes especies deníro del género Streptococcus.
Se inocularon cepas de microorganismos Gram negaíivos, utilizando como referencia el medio íradicional Agar Triplona Soya. Al realizar la comparación con el medio conírol se comprobó el poder inhibitorio de la formulación de dicha invención al observar la inhibición íoíal de los géneros Citrobacter y Proteus.
Breve Descripción de las Figuras Figura 1: Curvas de crecimiento de Enterococcus faecalis ATCC 29212 en las diferenles mezclas de bases nutritivas.
Figura 2: Curvas de crecimiento de Streptococcus agalactiae ATCC 12386 en las diferentes mezclas de bases nutritivas.
Figura 3: Curvas de crecimiento de Streptococcus pyogenes ATCC 19615 en las difereníes mezclas de bases nutritivas.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Medio de cultivo selectivo para el aislamiento y/o defección temprana de especies del género Streptococcus, caracterizada por contener una mezcla de sustancias de origen proteico con un contenido de nitrógeno total de 10 a 14 % seleccionadas dentro del grupo consistente en auíolizado o hidrolizado de levadura Sacharomyces cerevisiae, extracto de corazón de res, hidrolizado de sangre bovina, hidrolizado enzimático de proteínas lácteas, hidrolizado enzimático de proteínas del frijol de Soya, hidrolizado enzimático de músculo de corazón de res e hidrolizado enzimático de íejido animal y que contiene además inhibidores de microorganismos Gram negativos, y una mezcla de sustancias orgánicas e inorgánicas.
2. Medio de cultivo según la reivindicación 1, caracterizada porque dentro de las sustancias de origen proteico el autolizado o hidrolizado de levadura Sacharomyces cerevisiae se encuentra entre 2 y 15 g/L.
3. Medio de cultivo según la reivindicación 1, caracíerizada porque deníro de las susíancias de origen proteico extracto de corazón de res se encuenlra entre 1 y 12 g/L.
4. Medio de cultivo según la reivindicación 1, caracíerizada porque deníro de las susíancias de origen proteico hidrolizado de sangre bovina se encueníra eníre 5 y 10 g/L.
5. Medio de cultivo según la reivindicación 1, caracíerizada porque deníro de las sustancias de origen proteico hidrolizado enzimático de proteínas lácteas se encuentra entre 5 y 40 g/L.
6. Medio de cultivo según la reivindicación 1, caracterizada porque dentro de las sustancias de origen proteico el hidrolizado enzimático de proteínas del frijol de soya se encuentra eníre 2 y 15 g/L.
7. Medio de cultivo según la reivindicación 1, caracíerizada porque deníro de las susíancias de origen proteico el hidrolizado enzimáíico de músculo de corazón de res se encueníra eníre 1 y 5 g/L.
8. Medio de cultivo según la reivindicación 1, caracterizada porque dentro de las sustancias de origen proteico el hidrolizado enzimálico de íejido animal se encuenira entre 1 y 5 g/L.
9. Medio de cultivo según la reivindicación 1, caracterizada porque sustancias inhibidoras del crecimiento de organismos Gram negaíivos, que son seleccionadas preferiblemente deníro de las sales de lalio y el ácido nalidíxico.
10. Medio de cultivo según la reivindicación 1, caracíerizada una mezcla de susíancias orgánicas e inorgánicas seleccionadas del grupo consistente en compuestos cromogénicos y//o fluorogénicos degradables bajo la acción de enzimas de al menos uno de los organismos a identificar, sales de meíales trivalentes y aminoácidos aromáticos.
11. Medio de culíivo según la reivindicación 10, caracíerizada porque la mezcla de compuesíos cromogémcos y//o fluorogénicos degradables bajo la acción de enzimas de al menos uno de los organismos a identificar, son seleccionados preferiblemente entre el p- niírofenilfosfaío sal disódica, x-glu (5-Bromo-4-cloro-3-indolil-βDglucopiranósido), Mu- glu (4-Meíilumbeliferil βD-glucopiranosido), Salmon-glu (6-Cloro-3-indolil- βD glucopiranósido) y x-gluc (5-Bromo-4-cloro-3-indolil-βDglucuronido sal de ciclohexilamonio), Magenta-Gluc (5-Bromo-6-cloro-3-indolil-βDglucuronido sal de ciclohexilamonio) y MUG (4-Meíilumbeliferil βD-glucuronido írihidraío) en cantidades del a 3 g/1.
12. Medio de culíivo, según la reivindicación 1, caracterizado por conlener compuesíos indicadores de la actividad desaminasa en las siguientes cantidades dentro del medio:
• sales de metales trivalentes, preferiblemente el citrato férrico-amónico en cantidades de 0,5 a 1,0 g/1.
• aminoácidos aromáticos, preferiblemente el triptófano y la fenilalanina en cantidades de 1 a 2 g/1.
13. Medio de cultivo según la reivindicación 1, caracterizada porque dentro de la mezcla de sustancias orgánicas e inorgánicas se incluyen agentes gelificantes, preferiblemente agar de dureza eníre 400 y 700 g/cm2 en cantidades de 10 y 14 g/L.
14. Medio de cultivo según la reivindicación l, caracterizada por presentar un valor del pH que oscila entre 7,0 y 7,4.
15. Medio de cultivo, según la reivindicación 1, caracterizado porque el mismo se prepara adicionando cantidades de 25 a 80 g/1 de agua destilada o desionizada.
16. Medio de cultivo, según la reivindicación 1, caracterizado por conformación de la mezcla de sustancias cromogénicas y fluorogénicas degradables por al menos una enzima de cada especie, en combinaciones tales, que garantizan la aparición de colores o fluorescencia diferentes para cada especie, como sigue a continuación: a) PNP + x-glu + Magenta-gluc ó MUG b) PNP + Salmon-glu + x-gluc ó MUG c) PNP + Mu-glu + Magenta-gluc ó x-gluc
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