ES2323428T3 - Procedimiento de deteccion de streptococcus agalactiae utilizando la actividad alfa-glucosidasa. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento de detección específica y de identificación de Streptococcus agalactiae, caracterizado porque utiliza un medio de reacción que comprende al menos un sustrato enzimático de {alpha}-glucosidasa.
Description
Procedimiento de detección de Streptococcus
agalactiae utilizando la actividad
\alpha-glucosidasa.
La presente invención se refiere al ámbito de la
detección y la identificación de Streptococcus agalactiae.
Más particularmente, la invención se refiere a la utilización de
sustratos enzimáticos de \alpha-glucosidasa para
la detección y la identificador de Streptococcus
agalactiae.
El género Streptococcus comprende
numerosas especies muy extendidas en la naturaleza, en la piel y las
mucosas del ser humano y de los animales y que dan origen a muchas
infecciones. Éstas son bacterias ubicuistas que se encuentran en
estado libre en el medio externo (suelo, aire, agua), en estado
saprofito o en estado de comensal en el ser humano y los animales.
Sus ubicaciones son la rinofaringe para los estreptococos de los
grupos A, C, G H y salivarius, el intestino para los
estreptococos fecales del grupo D y la cavidad vaginal para los
estreptococos del grupo B. Su papel patógeno es extremadamente
variado y depende de las especies en juego y de su ubicación en el
organismo.
Los estreptococos son cocos Gram+ de 0,5 a 1
\mum de diámetro, que presentan un agrupamiento en cadena y son
inmóviles. Catalasa negativos, con metabolismo fermentador, son
anaerobios facultativos y son sensibles a las variaciones de
temperatura (crecimiento óptimo a 37ºC) y a las variaciones de pH
(pH óptimo 7).
Streptococcus agalactiae (o estreptococo
B) es reconocido como uno de los principales agentes infecciosos
responsables de la mamitis en los bóvidos. En el ser humano, es
esencialmente un saprofito de los conductos genitales de la mujer
(vagina), pero se encuentra también en la rinofaringe y en el
intestino, particularmente el recto. En los adultos, la colonización
permanece a menudo asintomática, pero Streptococcus
agalactiae puede ser responsable de septicemia, de neumonías, de
meningitis, de artritis, de infecciones urinarias y de supuraciones
profundas. En la mujer embarazada o después del parto, la infección
puede conducir a endometritis y a esterilidad.
En el recién nacido, la contaminación se produce
en el útero, generalmente, durante el parto por inhalación del
líquido amniótico o de secreciones vaginales. Una infección precoz
aparece a menudo en el nacimiento o en las primeras horas de vida.
La infección precoz es favorecida por la premadurez, la rotura de
las membranas y una gran colonización de la vagina de la madre. La
tasa de mortalidad en este tipo de infección es muy elevada (>
50%). Las infecciones tardías se traducen generalmente en meningitis
(meningitis del lactante) y artritis.
El cribado sistemático de portadoras de
Streptococcus agalactiae se recomienda al final del embarazo,
idealmente entre 34 y 38 semanas de amenorrea (35-37
semanas de embarazo), debido particularmente a su prevalencia (10%
en Francia, es decir al menos 75000 mujeres embarazadas/año) y a sus
consecuencias durante los partos a término, lo que hace de esto un
problema de salud pública.
Medios selectivos y/o medios que permiten una
orientación del diagnóstico están disponibles en el mercado. Sin
embargo, estos medios tienen el inconveniente de que no bastan por
sí mismos para el diagnóstico de Streptococcus agalactiae y
que es necesario realizar ensayos complementarios tales como la
puesta de manifiesto del antígeno del grupo B de Lancefield
(polisacárido con presencia dominante de ramnosa) y la hidrólisis de
hipurato (caldo de hipurato).
Los medios selectivos utilizados más
habitualmente son el caldo de Todd-Hewitt, caldo de
enriquecimiento para la búsqueda de estreptococos del grupo B en la
mujer embarazada. Este caldo contiene diferentes antibióticos que
inhiben la mayor parte de los gérmenes Gram negativos de la flora de
acompañamiento, tales como ácido nalixídico y gentamicina o el ácido
nalixídico, poilimixina y cristal violeta.
Después de la etapa de enriquecimiento, el caldo
de Todd-Hewitt complementado con antibióticos debe
trasladarse a medios para la búsqueda de estreptococos (véase las
recomendaciones del CDC (Centre for Disease Control), MMWR
(Morbidity and Mortalitu Weekly Report), 16 de agosto de 2002, Vol.
51, Nº RR-11).
El medio de Lim es una variante del caldo de
Todd-Hewitt y contienen el 1% de extracto de
levadura, ácido nalixídico y colistina.
Una gelosa Columbia que contiene el 5% de sangre
también se utiliza y permite particularmente la puesta de manifiesto
del carácter \beta-hemolítico de Streptococcus
agalactiae. Sin embargo, este carácter no siempre aparece: el
halo de hemólisis alrededor de las colonias puede ser estrecho,
dando más bien el aspecto \alpha- e incluso
\gamma-hemolítico. Por el contrario, este carácter
se vuelve claro si en las proximidades de las colonias de
Streptococcus agalactiae, se encuentran colonias de
Staphylococcus aureus (Factor CAMP).
Estos medios selectivos tienen como
inconveniente que deben completarse mediante ensayos bioquímicos y/o
inmunológicos.
Actualmente, el único medio selectivo listo para
el empleo disponible en el mercado, que permite el aislamiento y la
identificación directa de Streptococcus agalactiae a partir
de extracciones recto-vaginales es el medio Granada
(Biolys SA). Este medio tiene la característica de que favorece la
producción de un pigmento carotenoide por las cepas de
Streptococcus agalactiae debido a la presencia en el medio de
almidón soluble, proteosa peptona Nº 3, glucosa, piruvato de sodio,
sulfato de magnesio, metotrexato, colistina, cristal violeta, agar,
suero de caballo, Na_{2}HPO_{4} anhidro, metronidazol, MOPS
(ácido morfolinopropanosulfónico) hemisódico, agua destilada e
incubación en anaerobiosis. Este medio tiene por lo tanto el
inconveniente de que la detección directa de Streptococcus
agalactiae se realiza en condiciones anaerobias, lo que no es
fácil de realizar. Por otro lado, no está disponible ningún medio de
detección que contiene uno o más sustratos enzimáticos.
El documento WO0130794 muestra solamente en
términos generales que se podría detectar los microbios como
Escherichia coli, Shigella, Salmonella, Proteeae, Pseudomonas
aeruginosa, Neisseria meningitidis, Enterococcus, Staphylococcus
aureus, Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Streptoccocus
pyogenes, Streptococcus agalactiae, Candida albicans, Candida
glabrata, Candida tropicales, Cryptococcus neoformans y
Aspergillus fumigatus mediante la detección de enzimas como
\beta-glucuronidasa,
\beta-galactosidasa,
6-fosfatogalactohidrolasa,
a-galactosidasa, \alpha-amilasa,
\alpha-glucosidasa,
\beta-glucosidasa, hexosaminidasas como
N-acetil-\beta-glucosaminidasa
o
N-acetil-\beta-galactosaminidasa,
de la familia de las esterasas, de las lipasas, de las fosfatasas,
de las sulfatasas, de las ADNasas, de las peptidasas y de las
proteasas.
La Solicitante ha demostrado contra todo lo
esperado, que era posible utilizar sustratos enzimáticos, en
particular sustratos enzimáticos de
\alpha-glucosidasa, para la detección específica y
la identificación de Streptococcus agalactiae.
En efecto, de forma sorprendente, no solamente
los sustratos enzimáticos son utilizados por los Streptococcus
agalactiae permitiendo su revelado, por ejemplo produciendo una
modificación de la coloración de las colonias en el medio cuando se
utiliza un sustrato enzimático cromógeno, sin que la coloración se
difunda en el medio de reacción, y por lo tanto se concentre a nivel
de las colonias, sino que estas moléculas no tienen ningún efecto
perjudicial sobre el crecimiento de estas bacterias.
De este modo la presente invención se refiere a
un procedimiento de detección específica y de identificación de
Streptococcus agalactiae, caracterizado porque utiliza un
medio que comprende al menos un sustrato enzimático de
\alpha-glucosidasa.
Los sustratos enzimáticos de
\alpha-glucosidasa apropiados para los fines de la
invención son cualquier sustrato conocido por el experto en la
materia que permite poner de manifiesto dicha actividad enzimática.
Dichos sustratos pueden ser por ejemplo cromogénicos o fluorescentes
y se describen por ejemplo en el artículo de Rice P. et al.,
(2000). A rapid biochemical test to aid identification of Mycoplasma
mycoides subsp. Mycoides small colony (SC) strains. Lett. Appl.
Microbiol. 1: 70-74 en el catálogo BIOSYNTH,
Substrates and Reagents o www.biosynth.com o en el catálogo
GLYCOSYNTH, enzyme substrates catalogue o www.glycosynth.co.uk.
Como ejemplo, pueden mencionarse los sustratos a
base de derivados de indoxilo, los sustratos a base de derivados de
umbeliferona y los sustratos a base de derivados de naftol.
De acuerdo con una realización preferida de la
invención, el sustrato enzimático apropiado para los fines de la
invención es un sustrato a base de derivados de indoxilo.
Ejemplos de dichos derivados de indoxilo
comprenden derivados de
3-indolil-\alpha-D-glucopiranósido,
preferentemente derivados halogenados de estos compuestos.
Como ejemplos de derivados de
3-indolil-\alpha-D-glucopiranósido
halogenados, pueden mencionarse
6-bromo-3-indolil-\alpha-D-glucopiranósido,
6-cloro-3-indolil-\alpha-D-glucopiranósido,
5-bromo-6-cloro-3-indolil-\alpha-D-glucopiranósido,
5-bromo-4-cloro-3-indolil-\alpha-D-glucopiranósido
y
5-bromo-4-cloro-3-indolil-N-metil-\alpha-D-glucopiranósido,
prefiriéndose particularmente este último compuesto.
El medio de reacción tal como se utiliza en el
procedimiento de la invención es, por lo tanto, un medio de reacción
de detección debido a la presencia del sustrato enzimático.
Este medio de reacción puede servir únicamente
como medio de revelado o como medio de cultivo y de revelado. En el
primer caso, el cultivo de los microorganismos se realiza antes de
la siembra y, en el segundo caso, el medio de reacción constituye
también el medio de cultivo.
El medio de reacción puede ser sólido,
semi-sólido o líquido. Por medio sólido o
semi-sólido, se entiende por ejemplo un medio
gelificado.
El agar es el medio tradicional sólido en
microbiología para el cultivo de microorganismos, pero es posible
utilizar gelatina o agarosa. Cierto número de preparaciones están
disponibles en el mercado, como por ejemplo agar Columbia, gelosa
Tripcasa-soja, gelosa Mac Conkey, gelosa Sabouraud o
más generalmente las descritas en el Handbook o Microbiological
Media (CRC Press).
\newpage
La cantidad de agar en el medio de reacción es
de 2 a 40 g/l. Para los medios sólidos, la cantidad de agar es
preferentemente de 9 a 25 g/l, más preferentemente de 12 a 14 g/l.
Para los medios semi-sólidos, la cantidad de agar es
preferentemente de 2 a 6 g/l.
Los sustratos enzimáticos de la invención son
utilizables en un amplio intervalo de pH, particularmente entre pH
5,5 y 10.
La concentración del sustrato enzimático en el
medio de reacción está comprendida entre 10 y 2000 mg/l,
preferentemente entre 50 y 500 mg/l, más preferentemente entre 100 y
400 mg/l, lo que constituye una realización preferida de la
invención.
Por supuesto, el experto en la materia
determinará la concentración de sustrato enzimático en el medio de
reacción en este intervalo en función del sustrato seleccionado. De
este modo, en la medida en que el sustrato enzimático utilizado es
5-bromo-4-cloro-3-indolil-N-metil-\alpha-D-glucopiranósido,
se prefiere una concentración comprendida entre 130 y 300 mg/l.
El medio de reacción útil para los fines de la
invención también puede comprender otros componentes útiles para
mejorar la especificidad y la sensibilidad del procedimiento de la
invención.
El medio de reacción también puede contener una
mezcla de inhibidores para inhibir o limitar el crecimiento de cepas
indeseables, tales como las cepas falsas positivas, por ejemplo
Candida o Staphylococcus saprophyticus, sin modificar
la sensibilidad de detección del medio.
Para ello, la mezcla de reacción puede contener
una mezcla de antibióticos. La adición de antibióticos en el medio
de reacción permite entre otros un ahorro de tiempo ya que la
identificación de Streptococcus agalactiae se realiza
directamente.
Ejemplos de antibióticos que son adecuados para
los fines de la invención comprenden aztreonam y anfotericina B.
Estos antibióticos están disponibles en el mercado de ICN, Squibb o
Sigma.
De este modo, de acuerdo con una realización de
la invención, el medio de reacción utilizado en el procedimiento de
detección específica y de identificación de Streptococcus
agalactiae también comprende una mezcla de aztreonam y de
anfotericina B.
La cantidad de cada antibiótico en el medio de
reacción varía en función del antibiótico en cuestión y será
determinada fácilmente por el experto en la materia.
De este modo, por ejemplo, la concentración de
aztreonam puede estar comprendida entre 0,01 y 0,08 g/l y la
concentración de anfotericina B puede estar comprendida entre 0,002
y 0,006 g/l.
Una mezcla preferida de estos antibióticos
contiene 0,064 g/l de aztreonam y 0,004 g/l de anfotericina B.
El medio de reacción utilizado en el
procedimiento de la invención también puede comprender al menos otro
sustrato específico de una actividad enzimática diferente de la
detectada por el sustrato de \alpha-glucosidasa.
La hidrólisis enzimática del o de los otros sustratos genera una
señal detectable, diferente de la señal detectada por el sustrato de
\alpha-glucosidasa, como por ejemplo productos
coloreados o fluorescentes diferentes, para permitir la puesta de
manifiesto como detección y/o identificación y/o cuantificación de
Streptococcus agalactiae mejorando la especificidad de puesta
de manifiesto.
Como otro sustrato específico, pueden
mencionarse los sustratos de \beta-celobiosidasa,
de \beta-glucosidasa, de
\beta-glucosaminidasa y cualquier otro sustrato
enzimático conocido por el experto en la materia que permita
eliminar los falsos positivos.
De acuerdo con una realización preferida, el
medio de reacción comprende también al menos otro sustrato de
actividad enzimática diferente, preferentemente seleccionado entre
los sustratos de \beta-celobiosidasa y los
sustratos de \beta-glucosaminidasa.
La utilización de un sustrato de
\beta-celobiosidasa tal como
6-cloro-3-indolil-\beta-D-celobiósido
permite eliminar las especies falsas positivas, tales como
Enterococcus faecalis, Listeria monocytogenes y
Enterobacter cloacae, sin degradar la sensibilidad de
detección de la actividad \alpha-glucosidasa de
los Streptococcus agalactiae.
La utilización de un sustrato de glucosaminidasa
tal como
6-cloro-3-indolil-\beta-N-acetil-glucosamidina
o
5-bromo-6-cloro-3-indolil-\beta-N-acetil-glucosamidina
permite eliminar la detección de Enterococcus faecalis,
Enterococcus faecium y Enterobacter cloacae.
La concentración del otro sustrato enzimático
específico está comprendida generalmente entre 0,01 y 2 g/l. El
experto en la materia podrá determinar fácilmente dicha
concentración en función del sustrato utilizado.
Cuando se utiliza
6-cloro-3-indolil-\beta-D-celobiósido
o
6-cloro-3-indolil-\beta-N-acetil-glucosamidina,
su concentración en el medio es preferentemente de 0,4 g/l.
El medio de reacción también puede comprender
uno o más elementos en combinación, tales como aminoácidos,
peptonas, hidratos de carbono, nucleótidos, minerales, vitaminas,
tensioactivos, tampones, sales de fosfato, de amonio, de sodio, de
metales. Ejemplos de medios se describen en las solicitudes de
patente de la Solicitante, EP 656 421 y WO99/09 207.
La aplicación del procedimiento de la invención
puede realizarse de acuerdo con las siguientes etapas que consisten
en:
- a)
- inocular un medio de reacción tal como se ha definido anteriormente, con toda o parte de la muestra,
- b)
- incubar el medio inoculado,
- c)
- revelar la presencia de al menos una actividad \alpha-glucosidasa en solitario o en combinación con al menos otra actividad enzimática diferente de una actividad \alpha-glucosidasa,
lo que constituye otro objeto de la
invención.
Las etapas de inoculación y de incubación son
muy conocidas por el experto en la materia.
Por ejemplo, la temperatura de incubación puede
ser de 37ºC. En cuanto a la atmósfera de incubación, ésta es
preferentemente aerobia.
El revelado se realiza a simple vista mediante
visualización de un cambio de coloración que no se difunde en el
medio de reacción, y por lo tanto se concentra a nivel de las
colonias. En el caso del revelado de la fluorescencia, se utilizan
los dispositivos de lectura de fluorescencia conocidos por el
experto en la materia.
Las muestras biológicas a analizar son cualquier
muestra clínica susceptible de contener Streptococcus
agalactiae, como una extracción vaginal, una extracción de orina
o cualquier otra muestra cuyo análisis pueda ayudar a un médico a
emitir un diagnóstico.
La invención se entenderá mejor con ayuda de los
siguientes ejemplos que se dan a título ilustrativo y no
limitante.
Se prepararon los medios de reacción mezclando
extracto de corazón-cerebro (4,84 g/l; Solabia),
infusión de carne (1,96 g/l; Solabia), biotiona (1 g/l; Solabia),
biotripcasa (7,2 g/l; Solabia), carbonato de sodio (0,3 g/l; VWR),
piruvato de sodio (2 g/l; Fluka), tampón HEPES (0,4 g/l; Sigma),
peptona de lactoalbúmina (2 g/l; DMV), glucosa (1 g/l; Merck), agar
americano (2 g/l; Sobigel) y agar europeo (12 g/l; Roko).
Después de la esterilización en autoclave
durante 15 minutos a 121ºC, se añadió un sustrato enzimático de
\alpha-glucosidasa tal como se indica a
continuación a razón de 0,1 g/l; después se enfría al baño maría a
50ºC.
- \bullet
- 6-bromo-3-indolil-\alpha-D-glucopiranósido (RedA-\alpha-Glu; Inalco),
- \bullet
- 6-cloro-3-indolil-\alpha-D-glucopiranósido (Rose-\alpha-Glu; Inalco),
- \bullet
- 5-bromo-6-cloro-3-indolil-\alpha-D-glucopiranósido (Magenta-\alpha-Glu; Glycosynth),
- \bullet
- 5-bromo-4-cloro-3-indolil-\alpha-D-glucopiranósido (X-\alpha-Glu; Biosynth) y
- \bullet
- 5-bromo-4-cloro-3-indolil-N-metil-\alpha-D-glucopiranósido (GreenA-\alpha-Glu; Inalco).
A continuación se vertieron los medios en placas
de Petri para la posterior inoculación con cepas bacterianas.
Ocho cepas de Streptococcus agalactiae
obtenidas de la colección de la Solicitante, suspendidas en agua
fisiológica, se sembraron para dar colonias aisladas en cada uno de
los medios. Las placas se incubaron a 37ºC durante 48 horas. Las
colonias formadas se examinaron visualmente después de 18, 24 y más
de 40 horas de incubación. La coloración de las colonias, el
crecimiento, así como la intensidad de esta coloración se
anotaron.
Los resultados se dan el la tabla 1 a
continuación y se expresan:
- -
- en crecimiento (C) con indicación del tamaño en mm,
- -
- en intensidad (I) de coloración en base a la escala arbitraria que varía entre 0 y 4, 0 correspondiendo a una ausencia de actividad y 4 correspondiendo a la presencia de una coloración muy intensa,
- -
- en color (Co) con T = Turquesa, R= Rosa o Rojo, V = Verde, Mg = Magenta,
- -
- según el tiempo de incubación en horas (T).
Los resultados tal como se indican en la tabla 1
ponen de manifiesto que los estreptococos B pueden detectarse
utilizando un sustrato enzimático de
\alpha-glucosidasa, al menos a partir de 18 h de
incubación.
Se repitió el modo operatorio anterior, salvo
que se hace variar la concentración de sustrato enzimático.
La tabla 2 a continuación da el número de cepas
detectadas (consideradas positivas cuando I \geq 0,6) en función
de la concentración de sustrato.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Esta tabla pone de manifiesto que la
concentración de 200 o 300 mg/l da una buena detección.
\vskip1.000000\baselineskip
Se respetó el modo operatorio descrito en el
ejemplo 1 con el
GreenA-\alpha-Glu, salvo que se
utilizaron 133 mg/l de este sustrato, y que se añadieron al medio
después de la esterilización en autoclave, 0,047 g/l de Aztreonam
(ICN), 0,004 g/l de Anfotericina B (Squibb) y los siguientes
componentes:
Medio 1: medio de control correspondiente al
medio del ejemplo 1 con
GreenA-\alpha-Glu modificado como
se ha indicado anteriormente
Medio 2: 400 mg/l de
6-cloro-3-indolil-\beta-D-celobiósido
(Rose-\beta-celobiósido)
Medio 3: 400 mg/l de
6-cloro-3-indolil-\beta-N-acetilglucosamina
(Rose-\beta-NAGlu) y 0,5 g/l de
N-acetilglucosaminida.
Los resultados se dan en la tabla 3 a
continuación, en la que C, Co y T son tales como se han definido
anteriormente, con, en el caso de la columna Co, V = verde, G =
gris, Mv = malva, Mg = magenta, B = azul y Vi = violeta, R =
rosa.
Las cepas se obtienen todas de la colección de
la Solicitante.
Esta tabla pone de manifiesto que la utilización
de un segundo sustrato enzimático permite mejorar la especificidad
de la detección sin degradar no obstante la sensibilidad de
detección de los Estreptococos B y que es posible distinguir a los
Estreptococos B de las especies más próximas y que se encuentran más
frecuentemente de manera asociada después de 24 h de incubación.
Para este estudio de sensibilidad, se utilizó un
medio de acuerdo con la invención preparado como se ha descrito en
los ejemplos anteriores pero que contiene 0,130 g/l de
GreenA-\alpha-Glu, 0,250 g/l de
Rose-\beta-D celobiósido, 0,064
g/l de Aztreonam y 0,004 g/l de Anfotericina B (Medio
\alpha-Glu).
Como medio de comparación, se utilizó el medio
Granada (ref. 10 077, BIOLYS, Francia) (Medio Granada).
Se sembraron 69 cepas de microorganismos, de las
cuales 14 de Streptococcus agalactiae, se deja incubar a 37ºC
hasta 24 h y en adelante a temperatura ambiente. Se visualizaron las
colonias como se ha descrito anteriormente. La confirmación de las
colonias sospechosas de Estreptococos B, es decir que aparecían
verdes, se realizó mediante ensayo de aglutinación utilizando el
reactivo Slidex Strepto Kit de acuerdo con las recomendaciones del
proveedor (bioMérieux, Francia). Las colonias no características, es
decir diferentes de las verdes o que tienen una coloración
característica pero que dan una respuesta negativa al ensayo de
aglutinación (cepas falsas positivas) se identificaron mediante la
Galería ID 32 Strep (bioMérieux, Francia).
Los resultados se expresan en % de diagnóstico
correcto con respecto a todos los ensayos en términos de
sensibilidad y especificidad y se dan en la tabla 4 a continuación,
correspondiendo el % de sensibilidad al número de auténticos
positivos detectados en el medio por el número total de auténticos
positivos a detectar (*100) y correspondiendo el % de especificidad
al número de auténticos negativos detectados en el medio por el
número total de auténticos negativos a detectar (*100).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados indicados en esta tabla ponen de
manifiesto la mejora de la sensibilidad de detección de los
Estreptococos B utilizando el procedimiento de la invención. Por
otro lado, también muestran que el medio de detección de la
invención también posee una buena especificidad, especificidad
mejorada después del enriquecimiento debido a un paso por caldo de
Todd-Hewitt 18-24 horas a
35-37ºC con o sin el 5% de CO_{2} antes de la
siembra de gelosa (véase la recomendaciones del CDC (Centrer for
Disease Control), MMWR (Morbidity and Mortality Weekly Report) 16 de
agosto de 2002, Vol. 51, Nº RR-11).
\vskip1.000000\baselineskip
Para este estudio se utilizó el medio de acuerdo
con la invención tal como se preparó como se ha descrito
anteriormente en el ejemplo 4.
Un total de 134 muestras/escobillas procedentes
de extracciones vaginales o del interior del cuello del útero de
mujeres embrazadas se utilizaron en este estudio.
\newpage
Cada escobilla se emulsionó en 1 ml de agua
fisiológica estéril y 100 \mul de esta solución se depositaron por
un lado en una Gelosa Columbia que contenía el 5% de sangre de
caballo y por otro lado en el medio que utiliza el procedimiento de
la invención. Por otro lado, 100 \mul de la solución anterior se
utilizaron para inocular un caldo Todd Hewitt. Después de 20 horas
de incubación a 37ºC y en aerobiosis, la gelosa con sangre y el
medio de la invención se sembraron a partir del caldo Todd Hewitt y
a continuación se incuban 20 h a 37ºC en aerobiosis.
La confirmación de las colonias sospechosas
características de Estreptococo B, es decir que aparecen verdes, se
realizó mediante ensayo de aglutinación utilizando el reactivo
Slidex Strepto Kit de acuerdo con las recomendaciones del proveedor
(bioMérieux, Francia).
Entre las 134 muestras, 112 se sembraron en
medios con gelosa por un lado directamente a partir de la suspensión
en agua fisiológica y por otro lado después del enriquecimiento en
caldo Todd Hewitt. Las 22 muestras restantes se sembraron en medios
únicamente con gelosa directamente a partir de la suspensión en agua
fisiológica.
Los resultados, calculados en porcentaje medio
de sensibilidad y especificidad, se presentan en la tabla 5 a
continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados de la tabla muestran que el
medio, utilizado con muestras clínicas, posee una buena sensibilidad
(18/20 Streptococcus agalactiae detectados) y que la
especificidad de detección mejora con respecto a un medio
convencional (10 resultados falsos + frente a 24 en el medio
Columbia con sangre), siendo estos resultados prácticamente
equivalentes a los obtenidos a partir de las cepas de
laboratorio.
Claims (6)
1. Procedimiento de detección específica y de
identificación de Streptococcus agalactiae,
caracterizado porque utiliza un medio de reacción que
comprende al menos un sustrato enzimático de
\alpha-glucosidasa.
2. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado porque el sustrato enzimático
es un sustrato a base de derivados de indoxilo.
3. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 2, caracterizado porque la concentración del
sustrato enzimático en el medio de reacción está comprendida entre
10 y 2000 mg/l.
4. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque dicho
medio de reacción también comprende una mezcla de aztreonam y de
anfotericina B.
5. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el medio
de reacción también comprende al menos otro sustrato de actividad
enzimática diferente, preferentemente seleccionado entre los
sustratos de \beta-celobiosidasa y los sustratos
de \beta-glucosaminidasa.
6. Procedimiento de detección específica y de
identificación de bacteria(s) de la especie Streptococcus
agalactiae en una muestra susceptible de contener esta bacteria,
caracterizado porque comprende las etapas que consisten
en:
- a)
- inocular un medio de reacción tal como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, con toda o parte de la muestra,
- b)
- incubar el medio inoculado,
- c)
- revelar la presencia de al menos una actividad \alpha-glucosidasa en solitario o en combinación con al menos otra actividad enzimática diferente de una actividad \alpha-glucosidasa.
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