ES2274074T3 - Medio de deteccion especifico de staphylococcus aureus y procedimientos de indentificacion y/o de recuento que usan dichos medios. - Google Patents
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Abstract
Medio de detección de Staphylococcus aureus y/o de estafilococos de coagulasa positiva, que comporta un medio de cultivo de Staphylococcus aureus y al menos un sustrato enzimático que permite destacar una actividad alfa-glucosidasa, caracterizado porque el sustrato enzimático que permite destacar una actividad alfa-glucosidasa es un agente cromógeno o fluorescente y porque usa al menos un inhibidor que favorece el crecimiento de bacterias del género Staphylococcus, como cloruro de litio (LiCl), azida de sodio (NaN3), colistina, anfotericina, aztreonam, colimicina, cloruro de sodio (NaCl) y deferoxamina.
Description
Medio de detección específico de
Staphylococcus aureus y procedimientos de identificación y/o
de recuento que usan dichos medios.
La presente invención se refiere a un medio de
detección específica de Staphylococcus aureus y/o de
discriminación de Staphylococcus de coagulasa positiva con
respecto a los Staphylococcus de coagulasa negativa que
permite el aislamiento de las bacterias del género estafilococo y
la identificación de la especie Staphylococcus aureus, que
usan al menos un sustrato enzimático. Se refiere igualmente a un
procedimiento de identificación, y en su caso de recuento, de
Staphylococcus aureus que usa dicho medio.
En 1999, el género Staphylococcus
reagrupa cuarenta y tres (43) especies y subespecies, de las que
diecisiete (17) se han encontrado en el hombre. La mayor parte de
estas especies son patógenos oportunistas en el hombre que
presentan un riesgo elevado en caso de herida cutánea por un
traumatismo o por implantación directa de un producto médico.
Además, la especie Staphylococcus aureus es una bacteria que
se encuentra a menudo en los pacientes que deben recibir cuidados
hospitalarios que hacen intervenir instrumentos como jeringuillas y
catéteres. Hay, pues, un gran interés en detectar la presencia de
esta bacteria patógena, cada vez más implicada en las enfermedades
nosocomiales.
Entre los estafilococos, Staphylococcus
aureus es incontestablemente la especie más virulenta, ya que
produce un número importante de toxinas y de enzimas
extracelulares. Puede estar en el origen de patologías numerosas y
variadas, que van del simple panadizo a las infecciones más graves
como las septicemias, endocarditis, neumopatías e infecciones
osteoarticulares, cuyo pronóstico puede ser muy reservado.
Además, solo cinco (5) especies:
Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis,
Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus saprophyticus y
Staphylococcus hominis representan al menos el 1% de las
cepas patógenas aisladas en centros clínicos y, entre ellas cinco,
más del 98% de las cepas de estafilococos que se encuentran más
frecuentemente. Las otras especies rara vez se encuentran y son
poco patógenas.
En bacteriología, es clásico oponer la especie
Staphylococcus aureus, caracterizada por la producción de
una coagulasa, a las otras especies denominadas de coagulasa
negativa.
Los procedimientos tradicionales para
diferenciar Staphylococcus aureus de Staphylococcus no
aureus se basan en la búsqueda de la coagulasa libre, de la
ADNasa y en la obtención de una aglutinación en látex con el fin
de destacar la presencia del factor de afinidad para el
fibrinógeno, de la proteína A y de antígenos capsulares.
Es preciso saber que otras especies de
estafilococos, potencialmente patógenas, son capaces de expresar
una coagulasa.
Las especies de coagulasa positiva son las
siguientes: Staphylococcus aureus, Staphylococcus intermedius,
Staphylococcus hyicus, Staphylococcus delphinis, Staphylococcus
lutrae y Staphylococcus schleiferi.
Existen técnicas de cultivo en medios selectivos
para permitir evaluar la presencia de Staphylococcus
aureus. Se trata de los medios siguientes:
- el medio hipersalino de Chapman (al 75% de
NaCl) es generalmente selectivo para Staphylococcus aureus y
los estafilococos que hidrolizan el mannitol. Estas bacterias
hacen virar el medio del rojo al amarillo. Ciertos microorganismos
y los enterococos del grupo D, en particular, pueden producir la
misma reacción en el medio; así pues, es necesario entonces
verificar la catalasa (negativa para los estreptococos).
- el medio de Baird-Parker (que
contiene telurito de potasio y cloruro de litio como agentes
selectivos) se usa para aislar y recontar los estafilococos de
coagulasa positiva en los productos alimentarios y permite destacar
la actividad de la coagulasa. En este medio, las colonias de
Staphylococcus aureus y otras especies de coagulasa positiva
aparecen con un centro negro rodeado de un halo opaco. En este
medio pueden desarrollarse otros microorganismos. Se trata
principalmente de los grupos siguientes:
- -
- Cocos Gram +: géneros Enterococcus y Listeria,
- -
- Bacilos Gram -: géneros Proteus y Pseudomonas.
De hecho, la revelación de Staphylococcus
aureus, que usa la técnica del medio hipersalino de Chapman,
adolece de falta de sensibilidad (poder de destacar la especie
buscada cuando ésta está presente en baja cantidad en una muestra
biológica sometida a prueba) y sobre todo de especificidad (poder
de detectar la especie buscada en la muestra biológica sometida a
prueba que contiene otras especies).
Asimismo, la revelación de Staphylococcus
aureus, que usa la técnica del medio de
Baird-Parker, adolece de falta de sensibilidad y de
especificidad. Así, ciertas cepas que no pertenecen a la especie
Staphylococcus aureus, en particular Staphylococcus
schleiferi y Staphylococcus saprophyticus, pueden
igualmente dar colonias rodeadas de una aureola de iluminación.
Puede suceder también que ciertas cepas de Staphylococcus
aureus no expresen la actividad enzimática buscada o no se
desarrollen en el medio, ya que pueden estar presentes en cantidad
muy baja en las muestras biológicas y/o inhibidas por los
componentes demasiado selectivos del medio.
Se comprende así que esta revelación con los
medios de Baird-Parker y Chapman no da más que un
diagnóstico supuesto y necesitan otras pruebas de confirmación.
Ahora bien, las manipulaciones suplementarias, necesarias para la
identificación de Staphylococcus aureus, aumentan la
duración y el coste de los análisis. Necesitan una multitud de
reactivos y la intervención de un personal cualificado.
Igualmente es posible usar sustratos con base de
glucósido, lo que permite detectar, según la configuración de las
moléculas usadas, bien una actividad
\alpha-glucosidasa o bien una actividad
\beta-glucosidasa.
El uso de \alpha-glucósidos
para la identificación de las diferentes especies de estafilococos
es ya conocida. Sin embargo, el estudio de la acidificación de
estos azúcares por las diferentes especies de estafilococos no
permite actualmente una identificación simple de Staphylococcus
aureus, ya que es o bien demasiado poco específica (por
ejemplo, en el caso de la maltosa, la turanosa, la sacarosa, la
trehalosa) o bien demasiado poco sensible (por ejemplo, en el caso
del metil-\alpha-glucósido, la
rafinosa, la turanosa) (Bascomb S. y Manafi M. 1998. Use of enzyme
tests in characterization and identification of aerobic and
facultatively anaerobic Gram positive cocci. Clin. Microbiolol.
Rev. 11:318-340). (Kloos WE y col. 1982.
Identification of Staphylococcus Species with the API Staph
-IDENT. System. J. Clin. Microbiol. 16(3):509- 516). Este
estado de los hechos no tiene la tendencia a impulsar a los
investigadores a trabajar en este tipo de actividad
\alpha-glucosidasa.
Por el contrario, publicaciones recientes han
creado interés en trabajar con la actividad
\beta-glucosidasa. Tal es, por ejemplo, el caso
de la patente EP-B-0.741.797, que
describe un procedimiento de diferenciación en un medio de cultivo
selectivo de bacterias de género Staphylococcus de otras
bacterias por el uso de dos sustratos cromógenos con base de
indoxilo que permite detectar la actividad fosfatasa de los
estafilococos y la actividad \beta-glucosidasa de
otros géneros de bacterias.
Con respecto a la detección de estafilococos en
un medio gelificado, según esta patente, que permite solamente la
diferenciación de estafilococos de bacterias de otros géneros, la
presente invención permite así distinguir los Staphylococcus
aureu de bacterias del género Staphylococcus.
En un artículo: "Evaluation of CHROMagar
Staph. aureus, a new chromogenic medium, for isolation and
presumptive identification of Staphylococcus aureus from
human clinical specimens", de Gaillot O. y col. 2000. J. Clin.
Microbiol. 38, 4, 1587-1591, se describe y
evalúa un medio de cultivo cromogénico CHROMagar (marca
registrada) Staph. aureus que permite el aislamiento de los
estafilococos y la identificación de Staphylococcus aureus
con ayuda de sustratos cromogénicos que procuran una coloración
malva de esta última especie. Las otras especies del mismo género
se detectan entonces por la coloración azul o incolora, en teoría.
Se usan esencialmente las actividades
\beta-glucosidasa,
\beta-glucuronidasa,
\beta-galactosidasa y fosfatasa, así como un
inhibidor, la deferoxamina, que permite la diferenciación de
Staphylococcus aureus y Staphylococcus epidermidis. Se
ha registrado además una solicitud de patente sobre este tema,
WO-A-00/53.799. Esta solicitud de
patente propone un medio de detección de Staphylococcus
aureus que acopla al menos los dos agentes cromógenos
siguientes:
- fosfato de
5-bromo-6-cloro-3-indoxilo,
actividad fosfatasa, y
-
5-bromo-4-cloro-3-indoxil-glucósido,
actividad \beta-glucosidasa,
ya descritos en la solicitud de
patente EP-B- 0.741.797, descrita más arriba. De
hecho, este nuevo documento añade a los cromógenos simplemente y
esencialmente un inhibidor de crecimiento, denominado deferoxamina.
Este último permite discriminar mejor Staphylococcus aureus
de Staphylococcus epidermidis. Ahora bien, la deferoxamina
es ya bien conocida como inhibidor de crecimiento de
Staphylococcus epidermidi pero no para las otras especies de
estafilococo (Lindsay J.A., Aravena-roman M.A.,
Riley T.V. - Identification of Staphylococcus epidermidis
and Staphylococcus hominis from blood cultures by testing
susceptibility to desferrioxamine - European J. of Clin. Microbiol.
et Inf. Diseases - 1993, vol. 12, páginas
127-131).
Con respecto al medio CHROMagar (marca
registrada) Staph. aureus, el medio de esta invención
permite una diferenciación más sencilla entre Staphylococcus
aureus y Staphylococcus epidermidis, dos especies que
producen colonias del mismo color en el medio CHROMagar (marca
registrada). Esto se debe a la falta de especificidad de los
sustratos de fosfatasa que son positivos para los Staphylococcus
aureus y los Staphylococcus epidermidis y al hecho de
que la inhibición de estos últimos por la deferoxamina es sólo
parcial.
Es preciso observar que según la presente
invención, al detectar únicamente la actividad
\alpha-glucosidasa, se puede ya separar
Staphylococcus aureus de Staphylococcus epidermidis y
Staphylococcus saprophyticus que son tres de las principales
especies de estafilococos aisladas en clínica.
De hecho, y contra cuanto cabría esperar, los
autores de la invención han demostrado que sustratos con base de
\alpha-glucósido podían permitir una
identificación sensible y específica de Staphylococcus
aureus. De hecho, por la elección de condiciones operativas y/o
de sustratos particulares de \alpha-glucosidasa
y/o de acoplar al menos un segundo sustrato enzimático que permite
definir un medio de reacción, es posible:
- -
- discriminar entre las principales especies de estafilococos de coagulasa positiva aisladas más frecuentemente (Staphylococcus aureus y Staphylococcus intermedios esencialmente) y los estafilococos de coagulasa negativa más presentes (Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus saprophyticus esencialmente), y/o
- -
- identificar específicamente Staphylococcus aureus.
Por ejemplo, una ganancia de especificidad y en
el aspecto práctico de la invención es aportada por la adición de
al menos un segundo sustrato enzimático. Así, esta ganancia se
obtiene por la detección, por una parte, de una actividad
\alpha-glucosidasa, actividad expresada
fuertemente por los Staphylococcus aureus y muy débilmente
por las otras especies de estafilococo, y por otra parte, de una
actividad \beta-glucuronidasa y/o
\beta-galactosidasa y/o
\beta-glucosidasa expresada(s)
por la mayoría de los estafilococos pero no por los Staphylococcus aureus en función de los sustratos usados. Esta segunda actividad permite diferenciar mejor los Staphylococcus aureus de otras especies del género Staphylococcus.
por la mayoría de los estafilococos pero no por los Staphylococcus aureus en función de los sustratos usados. Esta segunda actividad permite diferenciar mejor los Staphylococcus aureus de otras especies del género Staphylococcus.
A este efecto, la presente invención se refiere
a un medio de detección de Staphylococcus aureus y/o de
estafilococos de coagulasa positiva, que comporta un medio de
cultivo de Staphylococcus aureus y al menos un sustrato
enzimático que permite destacar una actividad
\alpha-glucosidasa como la definida en las
reivindicaciones.
El sustrato enzimático que permite destacar una
actividad \alpha-glucosidasa es un agente
cromógeno o fluorescente.
Según una primera variante de realización, el
agente cromógeno o fluorescente que permite destacar una actividad
\alpha-glucosidasa está basado en indoxilo o en
umbeliferona, para permitir la detección de Staphylococcus
aureus y de estafilococos de coagulasa positiva.
Este medio, según la primera variante de
realización, usa como agente(s) cromógeno(s):
-
6-bromo-3-indoxil-\alpha-D-glucósido,
-
5-bromo-4-cloro-3-indoxil-\alpha-D-glucósido,
-
5-bromo-4-cloro-3-indoxil-N-metil-\alpha-D-glucósido,
-
6-cloro-3-indoxil-\alpha-D-glucósido,
y/o
-
4-metilumbeliferil-\alpha-D-glucósido.
Según una segunda variante de realización, el
agente cromógeno que permite destacar una actividad
\alpha-glucosidasa está basado en naftol, para
permitir la detección de Staphylococcus aureus.
Este medio, según la segunda variante de
realización, usa como agente cromógeno:
2-naftil-\alpha-D-
gluco-piranósido.
Según un modo de realización, el medio usa al
menos dos sustratos enzimáticos diferentes, preferentemente dos
agentes cromógenos, uno que permite destacar una actividad
\alpha-glucosidasa y el otro permite detectar una
actividad osidasa (\beta-glucosidasa y/o
\beta-glucuronidasa y/o
\beta-galactosidasa) y/o esterasa (esterasa/lipasa
y/o fosfatasa y/o sulfatasa) y/o peptidasa y/o coagulasa.
Además, el medio usa dos agentes cromógenos,
elegidos entre los pares siguientes:
-
5-bromo-4-cloro-3-indoxil-N-metil-\alpha-D-glucósido
asociado al
5-bromo-6-cloro-3-indoxil-\beta-D-galactósido,
o
-5-bromo-4-cloro-3-indoxil-N-metil-\alpha-D-glucósido
asociado al
6-cloro-3-indoxil-\beta-D-glucurónido,
o
-
6-cloro-3-indoxil-\alpha-D-glucósido
asociado al 5-
bromo-4-cloro-3-indoxil-\beta-D-glucurónido,
o
-
6-cloro-3-indoxil-\alpha-D-glucósidoasociado
al 5-
bromo-4-cloro-3-indoxil-
\beta-D-glucósido.
El medio usa al menos un inhibidor que favorece
el crecimiento de las bacterias del género Staphylococcus,
como cloruro de litio (LiCl), azida de sodio (NaN_{3}), colistina,
anfotericina, aztreonam, colimicina, cloruro de sodio (NaCl) y
deferoxamina.
Según una variante de realización, el medio usa
una mezcla de inhibidores, que comprende cuatro inhibidores, que
favorece el crecimiento de las bacterias del género
Staphylococcus, que son:
- -
- LiCl,
- -
- O/129,
- -
- Aztreonam, y
- -
- Anfotericina.
Según otra variante, el medio usa maltosa,
preferentemente a una concentración comprendida entre 100 y 300
mg/l.
La presente invención se refiere igualmente a un
procedimiento de identificación de bacteria(s) de la
especie Staphylococcus aureus en una muestra, que contiene
al menos una especie de bacteria, que comprende las etapas
siguientes:
- inocular un medio, según se describe
anteriormente, con la totalidad o parte de la muestra, e
- incubar el medio inoculado para producir
colonias bacterianas de tamaño suficiente para observar la
coloración de cada agente cromógeno o la fluorescencia de cada
agente fluorescente, que haya reaccionado, usado en dicho
medio.
Este procedimiento puede permitir además el
recuento de bacteria(s) de la especie Staphylococcus
aureus en la muestra, en cuyo caso se efectúa una tercera etapa
que consiste en enumerar las colonias identificadas por una
coloración o una fluorescencia en relación con las bacterias de la
especie Staphylococcus aureus.
Experimento
1
Los medios siguientes se han preparado en una
base que contiene:
- -
- 11 gramos por litro (g/l) de peptona,
- -
- 0,65 g/l de tampón TRIS, y
- -
- 14 g/l de agar,
en combinación con los sustratos
cromogénicos de \alpha-glucosidasa descritos en la
tabla 1
siguiente:
Los sustratos de la
\alpha-glucosidasa se solubilizan en
dimetilsulfóxido a una concentración de 200 g/l. Se añade un
volumen suficiente a los cuatro medios en sobrefusión para obtener
una concentración final en sustrato a 100 mg/l. Se han sembrado
microorganismos extraídos de la colección interna de bioMérieux en
cada uno de los medios por aislamiento en tres cuadrantes a partir
de una suspensión de 0,5 McFarland. No obstante, resultados
obtenidos con microorganismos extraídos de colecciones disponibles
al público, por ejemplo ATCC o NCTC, darían resultados idénticos.
Las cajas se han incubado a 37ºC durante 48 horas. Las colonias
formadas se han examinado visualmente después de un tiempo de
incubación de 24 y 48 horas. Se ha anotado la coloración, así como
la intensidad de esta coloración.
En la tabla 2 mostrada a continuación, como en
las tablas que seguirán, C representa la coloración de las
colonias después de incubación, I representa la intensidad de esta
coloración, el símbolo "-" es sinónimo de una ausencia de
color o de intensidad y finalmente TI define los tiempos de
incubación. Debe observarse que la intensidad de la coloración es
una escala arbitraria pero que es común al conjunto de muestras
biológicas y de medios probados. Esta escala es válida para este
experimento, así como para todos los experimentos que seguirán.
Puede definirse de la manera siguiente:
- 0 corresponde a una ausencia de actividad,
- 0,1 corresponde a la presencia de una traza de
coloración,
- 0,5 corresponde a la presencia de una
coloración muy clara,
- 1 corresponde a la presencia de una coloración
neta de baja intensidad,
- 1,5 corresponde a la presencia de una
coloración intermedia a las coloraciones 1 y 2,
- 2 corresponde a la presencia de una coloración
franca de intensidad media,
- 2,5 corresponde a la presencia de una
coloración intermedia a las coloraciones 2 y 3,
- 3 corresponde a la presencia de una coloración
intensa,
- 3,5 corresponde a la presencia de una
coloración intermedia a las coloraciones 3 y 4,
- 4 corresponde a la presencia de una coloración
muy intensa.
Los resultados se presentan en la tabla 2 a
continuación:
Para el sustrato
5-bromo-4-cloro-3-indoxil-\alpha-D-glucósido,
se obtiene una desviación de intensidad de coloración entre las
cepas de estafilococos a 24 horas, que permite identificar los
Staphylococcus aureus y distinguirlos de otras especies del
género Staphylococcus. A las 48 horas, puede existir una
duda entre Staphylococcus aureus y Staphylococcus
xylosus.
Para los otros tres sustratos, la duración de
incubación no tiene influencia, en el sentido de que la desviación
de intensidad de coloración, tanto a 24 horas como a 48 horas,
permite la identificación de Staphylococcus aureus y su
distinción con respecto a las otras especies del género
Staphylococcus.
Se observa, no obstante, que las desviaciones de
intensidad entre las cepas de Staphylococcus aureus y las
cepas de Staphylococcus xylosus (de coagulasa negativa) son
más significativos con los tres sustratos
6-cloro-3-indoxil-\alpha-D-glucósido,
6-bromo-3-indoxil-\alpha-D-glucósido
y
5-bromo-4-cloro-3-indoxil-N-metil-\alpha-D-glucósido
que dan un mejor contraste entre el color del marcador y el del
medio y son más específicas que el
5-bromo-4-cloro-3-indoxil-\alpha-D-glucósido.
Experimento
2
Los medios citados a continuación se han
preparado en una base que contiene:
- -
- 11 gramos por litro (g/l) de peptona,
- -
- 0,65 g/l de tampón TRIS, y
- -
- 14 g/l de agar,
asociada a una combinación de dos
sustratos cromogénicos de los que uno permite detectar una
actividad \alpha-glucosidasa. Estos sustratos
complejos se presentan en la tabla 3 que
sigue:
Se prepara una solución madre de cada sustrato
de \alpha-glucosidasa a 200 g/l en
dimetilsulfóxido. Se añade un volumen suficiente a los cuatro
medios en sobrefusión para obtener una concentración final para
cada sustrato de \alpha-glucosidasa de 100 mg/l.
Al mismo tiempo, se añade un volumen suficiente de sustrato de cada
una de las otras actividades osidasas, descritas anteriormente, a
los cuatro medios en una concentración comprendida entre 50 y 200
mg/l según el sustrato. Se han sembrado microorganismos obtenidos
de la colección interna de bioMérieux en cada uno de los medios por
aislamiento en tres cuadrantes a partir de una suspensión de 0,5
McFarland. Se han incubado las cajas a 37ºC durante 48 horas. Se
han examinado visualmente las colonias formadas después de 24 y 48
horas de incubación. Se han anotado la coloración y la intensidad de
esta coloración.
Los resultados se presentan en la tabla 4 a
continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados anteriores demuestran que es
posible distinguir los Staphylococcus aureus de otras
especies, las encontradas más frecuentemente (Staphylococcus
epidermidis, Staphylococcus saprophyticus, etc.) después de 24
horas de incubación con todos los pares de sustratos cromogénicos
probados.
Cada par A, B, C y D de sustratos estudiado por
la gama de colores y/o por la intensidad de color permite
distinguir las diferentes especies de estafilococos. Por una parte,
la diferencia de coloración permite recuperar Staphylococcus
xylosus sin ambigüedad, y por otra parte los niveles de
intensidad más intensos del color, obtenidos para Staphylococcus
aureus, permiten diferenciarlos de las otras especies del mismo
género que tengan la misma
coloración.
coloración.
Sólo la especie Staphylococcus
íntermedius puede plantear problemas a 48 horas con el par de
sustrato A; no obstante, no existe ninguna ambigüedad a las 24
horas de incubación, lo que resulta más interesante porque cuanto
más corta sea la duración de identificación más eficiente es el
medio. Se trata de una especie de estafilococo de coagulasa
positiva que no se distingue de Staphylococcus aureus en la
mayoría de los procedimientos de identificación, principalmente en
los medios de Chapman, Baird-Parker y CHROMagar
(marca registrada) Staph aureus.
\vskip1.000000\baselineskip
Experimento
3
Los medios de cultivo siguientes, reveladores de
la presencia de Staphylococcus aureus en una toma biológica,
pueden obtenerse en las empresas siguientes:
- medio CHROMagar Staph aureus
(referencia TA600) en la empresa CHROMagar situada en París,
Francia,
y
y
- medios de Chapman (referencia 43311) y
Baird-Parker (referencia 43521) en la empresa
bioMérieux situada en Marcy l'Étoile, Francia.
Las abreviaturas de los medios presentados en la
tabla 5 mostrada a continuación son las siguientes:
- A corresponde al medio que contiene la mezcla
A descrita en el Experimento 2,
- B corresponde al medio CHROMagar Staph
aureus usado para aislar los estafilococos e identificar la
especie Staphylococcus aureus por una coloración rosa de las
colonias, las otras especies de estafilococos dan una color
turquesa o incoloro,
- C corresponde al medio de Chapman usado para
aislar Staphylococcus aureus y los estafilococos que
hidrolizan el mannitol, estas bacterias hacen virar el indicador
coloreado, presente en el medio, del rojo al amarillo, y
- D corresponde al medio de
Baird-Parker usado para aislar y caracterizar
Staphylococcus aureus que produce en 24 horas colonias
características de centro negro rodeado por una zona de
iluminación, llamada halo, correspondiente a la detección de una
coagulasa.
En los medios descritos anteriormente se han
probado treinta y seis (36) cepas que pertenecen a doce (12)
especies de estafilococos, encontradas más frecuentemente en
análisis clínico. Estos microorganismos obtenidos de la colección
interna de bioMérieux se han sembrado en cada uno de los medios por
aislamiento en tres cuadrantes a partir de una suspensión de 0,5
McFarland. Se han incubado las cajas a 37ºC durante 48 horas. Se
han examinado visualmente las colonias formadas después de 24 y 48
horas de incubación. Se ha anotado la coloración de las colonias en
el medio de la invención y el medio cromogénico CHROMagar Staph
aureus según el procedimiento y la escala descritos en el
ejemplo 1. Para la lectura del medio de Chapman, el símbolo
"-" corresponde a una ausencia de viraje del indicador
coloreado, y la gelosa permanece roja alrededor de las colonias
(cepas mannitol -) y el símbolo "+" corresponde a un viraje
del indicador coloreado, y la gelosa se vuelve amarilla alrededor
de las colonias (cepa mannitol +). Para la lectura del medio de
Baird-Parker, el símbolo "-" corresponde a una
ausencia de halo de iluminación alrededor de las colonias (cepa
coagulasa -) y el símbolo "+" corresponde a la presencia de un
halo de iluminación alrededor de dichas colonias (cepa coagulasa
+).
En la tabla 5 mostrada a continuación, la
coloración corresponde a la coloración de las colonias después de
incubación; las iniciales "C.M." representan la coloración del
medio de Chapman alrededor de las colonias después de incubación;
el término "Halo" representa la zona de iluminación del medio
de Baird-Parker alrededor de las colonias después
de incubación, y finalmente el símbolo "nº" representa el
número de cepas por especies identificadas, según el medio, por la
coloración específica o el halo.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En el medio, según la invención, y en los medios
CHROMagar Staph aureus y Chapman, se han identificado todas
las cepas de Staphylococcus aureus. Además, las cepas de
Staphylococcus intermedius, especie de coagulasa positiva,
se identifican tanto en el medio según la invención como en los
medios CHROMagar Staph aureus y Baird-Parker.
Los resultados demuestran también que no se ha identificado ningún
falso positivo en el medio según la invención y en el medio de
Baird-Parker. Se observa igualmente que en el medio
CHROMagar Staph aureus y en el medio hipersalino de Chapman
(con el 75% de NaCl) no es posible distinguir los Staphylococcus
aureus de ciertas especies de coagulasa negativa. Así pues, es
necesario realizar pruebas complementarias con el objeto de
destacar la presencia de estos Staphylococcus aureus.
Este experimento destaca la especificidad y la
fiabilidad del procedimiento según la invención.
\newpage
Experimento
4
El experimento mostrado a continuación se ha
realizado en un medio líquido y en presencia de sustratos
cromogénicos basados en derivados de naftol.
El medio y los sustratos se reparten en galerías
API (marca registrada) producidas por la empresa bioMérieux
situada en Marcy l'Étoile, Francia.
Estas galerías constituyen un procedimiento
semicuantitativo de búsqueda de actividades enzimáticas de
microorganismos y permiten estudiar rápidamente y simultáneamente
diecinueve actividades enzimáticas. Cada galería comporta veinte
cúpulas en las cuales se reparten las soluciones que contienen los
sustratos enzimáticos. Las pruebas enzimáticas se realizan
repartiendo 65 \mul de suspensión bacteriana de 5 a 6 McFarland
en cada cúpula.
Se examina visualmente la intensidad de
coloración para cada cúpula después de 4 horas de incubación a 37ºC
y después de la adición de reactivos apropiados: ZYM A (ref.:
70470) y ZYM B (ref.: 70480) que pueden obtenerse en bioMérieux ya
citado anteriormente. La intensidad de coloración será directamente
proporcional a la cantidad de sustrato hidrolizado por la
enzima.
A continuación se anotan los valores de la
intensidad de coloración en una ficha de resultados según la
siguiente clasificación: la nota 0 corresponde a una reacción
negativa, la nota 5 a una reacción de intensidad máxima, las notas
1, 2, 3 y 4 indican niveles de coloración y, así, de actividad
enzimática intermedios. Pueden encontrarse informaciones más
extensas sobre esta notación en la escala de lectura API
suministrada con las galerías del mismo nombre.
Como en los experimentos 1 y 2, los
microorganismos se obtienen de la colección interna de
bioMérieux.
Las actividades enzimáticas buscadas y los
sustratos de derivados de naftol correspondientes se describen en
la tabla 6 siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados de las actividades enzimáticas se
reúnen en la tabla 7 siguiente:
Según los resultados de la tabla 7 anterior,
sólo la detección de la actividad
\alpha-glucosidasa con ayuda del sustrato
2-naftil-\alpha-D-glucopiranósido,
expresada intensamente por la cepa de Staphylococcus aureus,
permite distinguir esta especie, de coagulasa positiva, de otras
especies de estafilococos. Para las otras actividades enzimáticas,
las desviaciones de intensidad de coloración entre la cepa de
Staphylococcus aureus y las cepas de las otras especies son
mucho menos significativas y hacen difícil la distinción entre las
diferentes especies. Debe destacarse que, en el caso de un sustrato
cromógeno con base de naftol, no es posible la distinción de un
estafilococo de coagulasa positiva como Staphylococcus
intermedius. Los otros estafilococos Staphylococcus
saprophyticus, Staphylococcus epidermidis y Staphylococcus
haemolyticus son de coagulasa negativa.
Experimento
5
Los medios mostrados a continuación se han
preparado en la base del medio descrito en el experimento 1 pero en
ausencia de agar y en presencia de un sustrato fluorescente en
lugar de un sustrato cromógeno. Para subrayar el interés del uso de
un sustrato fluorescente para la manifestación de las especies de
estafilococos de coagulasa positiva, se han comparado cuatro
sustratos fluorescentes, descritos en la tabla 8, específicos de
las actividades enzimáticas siguientes:
Los sustratos se solubilizan en el disolvente
usado durante los experimentos 1 y 2, la concentración final de
cada sustrato es de 200 mg/l de medio.
Los diferentes medios líquidos se reparten en
las cúpulas de un soporte del tamaño de una tarjeta bancaria
específica del sistema automatizado VITEK 2 (marca registrada) de la
empresa bioMérieux. El sistema VITEK 2 con estufa integrada gestiona
todas las etapas, desde el inóculo a la producción de los
resultados. Sólo la preparación del inóculo de 0,5 McFarland es
realizada por el operador, con ayuda de un nefelómetro, para cada
una de las cepas probadas directamente en tubos específicos del
sistema. El sistema automatizado permite la lectura del crecimiento
bacteriana por nefelometría y de la actividad enzimática por la
fluorescencia en intervalos regulares de 15 minutos y durante un
periodo de 19 horas.
Como en los experimentos 1, 2 y 4, las cepas
estudiadas forman parte de la colección interna de bioMérieux.
Los resultados, reunidos en la tabla 9 mostrada
a continuación, representan el tiempo en horas de incubación
necesario para tener el nivel máximo de fluorescencia medible por
el aparato:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El análisis de los resultados demuestra que, al
detectar la actividad \alpha-glucosidasa con ayuda
de un sustrato fluorescente con base de umbeliferona, es posible
distinguir las especies de coagulasa positiva (Staphylococcus
aureus y Staphylococcus intermedius) de las especies de
coagulasa negativa (Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus
xylosus, Staphylococcus saprophyticus y Staphylococcus
haemolyticus) en función del tiempo de lectura. En efecto, la
hidrólisis del sustrato
4-MU-\alpha-GLU
por \alpha-glucosidasa permite obtener un nivel
máximo de fluorescencia antes de 8 horas de incubación para las
cepas de estafilococos de coagulasa positiva y después de 10 horas
de incubación para las cepas de coagulasa negativa.
Para los otros tres sustratos estudiados, parece
difícil distinguir las especies de estafilococos de coagulasa
positiva de los estafilococos de coagulasa negativa como
Staphylococcus epidermidis, ya que el retardo para alcanzar
el nivel de fluorescencia máximo para esta especie es muy próximo,
casi idéntico, al suministrado por las especies de coagulasa
positiva.
Este ejemplo ilustra claramente una de las
ventajas de la detección de una actividad
\alpha-glucosidasa con ayuda de un sustrato
fluorescente.
\vskip1.000000\baselineskip
Experimento
6
Se han realizado numerosos trabajos para mejorar
aún más la especificidad de los sustratos de la invención. Entre
las soluciones planteadas, la posibilidad de añadir inhibidores ha
llevado a una solución completamente sorprendente y particularmente
interesante.
Se han planteado ciertas combinaciones de
inhibidores, ya que ningún inhibidor podría permitir por sí solo la
mejora de la detección de los estafilococos. Entre éstas, una
mayoría podría disuadir al experto en la materia de continuar con
los ensayos para encontrar una solución en esta dirección, como es,
por ejemplo, el caso de:
- La primera combinación es la de tres
inhibidores: cloruro de litio LiCl (2 g/l), anfotericina (0,005
g/l) y aztreonam (0,008 g/l). El crecimiento de los estafilococos
está afectado muy ligeramente por estos tres compuestos; como
contrapartida no hay ningún efecto en las actividades enzimáticas
detectadas (\alpha-glucosidasa y
\beta-glucuronidasa).
- La segunda composición de la mezcla de
inhibidores es idéntica al ensayo precedente, sólo se modifican
simultáneamente (realización de una gama de concentraciones
cruzadas) las concentraciones de LiCl (variando de 3 g/l a 7 g/l) y
aztreonam (variando al mismo tiempo de 0,008 g/l a 0,003 g/l).
Cuanto más aumenta la concentración de LiCl, más disminuye el
crecimiento de los estafilococos. Este efecto no se observa para el
aztreonam, el aumento de concentración no perturba al crecimiento
de las bacterias. En lo que se refiere a las actividades
enzimáticas, no hay ningún efecto de los inhibidores (con
independencia de la concentración) en la detección de la
\alpha-glucosidasa y de la
\beta-glucuronidasa. La selectividad se mejora con
el aumento de la concentración de los inhibidores; sin embargo, la
fertilidad de los estafilococos disminuye.
- La mezcla de inhibidores precedente se
completa por una parte con colistina y por otra parte con un
aumento de la concentración de aztreonam. Este aumento, así como la
adición de colistina en el medio, no tiene casi ningún impacto en
el crecimiento de los estafilococos. Además se mejora la
selectividad, ya que las especies críticas identificadas en los
ensayos precedentes se inhiben en estas nuevas condiciones. La
sensibilidad de detección de la \alpha-glucosidasa
se reduce muy ligeramente en presencia de aztreonam, y con
independencia de la concentración usada (de 0 a
32 mg/l).
32 mg/l).
- Los rendimientos del medio, fertilidad de los
estafilococos y de los no estafilococos y expresión de las
actividades enzimáticas, se evalúan en presencia de la mezcla de
inhibidores definida en el ensayo precedente (LiCl, aztreonam,
anfotericina y colistina) pero en una muestra de cepas más grande.
La adición de los cuatro agentes selectivos en el medio sólo entraña
una disminución muy ligera del crecimiento de los estafilococos y
se mantiene globalmente sin efecto en el nivel de expresión de la
\alpha-glucosidasa de Staphylococcus
aureus. Como contrapartida, la detección/expresión de la
actividad \beta-glucuronidasa se altera
significativamente en presencia de estos inhibidores. La
selectividad se mantiene todavía imperfecta, principalmente en
cuanto a Listeria, Enterococcus faecium, Klebsiella pneumoniae,
Acinetobacter baumanii y Bacillus.
- A continuación se ha añadido el compuesto
vibriostático O/129, se ha aumentado la concentración en aztreonam
(32 mg/l), se ha retirado la colistina de la mezcla de inhibidores
y se ha caracterizado la actividad
\beta-glucosidasa. El experimento mostrado a
continuación se ha realizado en el medio siguiente:
- -
- 20,1 g/l de peptona,
- -
- 0,65 g/l de tampón Tris,
- -
- 14 g/l de agar,
- -
- 0,125 g/l de 6-cloro-3-indoxil-\beta-D-glucósido,
- -
- 0,100 g/l de 5-bromo-4-cloro-3-indoxil-N-metil-\alpha-D-glucós ido,
- -
- 0,0018 g/l de cloruro de manganeso, y
- -
- 4 g/l de piruvato de sodio.
\newpage
Además, la mezcla de inhibidores tiene la
composición siguiente:
- -
- LiCl en 5 g/l,
- -
- O/129 en 0,010 g/l,
- -
- Aztreonam en 0,032 g/l, y
- -
- Anfotericina en 0,005 g/l.
El conjunto de los rendimientos del medio es
sorprendentemente bueno. En efecto, el crecimiento de todas las
especies de estafilococos es correcto. Además, la detección de las
actividades \alpha-glucosidasa y
\beta-glucosidasa no se ve afectada por los
inhibidores y el nivel de selectividad es satisfactorio, ya que se
inhibe el crecimiento de los no estafilococos (Listeria,
Acinetobacter, Klebsiella...).
\vskip1.000000\baselineskip
Experimento
7
El experimento mostrado a continuación se ha
realizado en medios que contienen:
- -
- 20,1 g/l de peptona,
- -
- 0,65 g/l de tampón Tris,
- -
- 14 g/l de agar,
- -
- 0,125 g/l de 6-cloro-3-indoxil-\beta-D-glucósido,
- -
- 0,100 g/l de 5-bromo-4-cloro-3-indoxil-N-metil-\alpha-D-glucósido,
- -
- 0,004 g/l de cloruro de manganeso,
- -
- 4 g/l de piruvato de sodio,
- -
- 4 g/l de cloruro de litio,
- -
- 0,032 g/l de aztreonam,
- -
- 0,002 g/l de anfotericina, y
- -
- maltosa a una concentración final de 0 ó 0,1 ó 0,3 ó 0,4 g/l.
La maltosa se solubiliza en agua a una
concentración de, por ejemplo, 100 g/l, después se añade un volumen
suficiente a los tres medios en sobrefusión para obtener las
concentraciones finales anteriores. Las cepas de estafilococos
extraídas de la colección interna de bioMérieux se han sembrado en
cada uno de los medios cromógenos por aislamiento (estrías
perpendiculares ceñidas en toda la superficie de la caja) a partir
de una suspensión de 0,5 McFarland diluida al 1/30.000. Las cajas
se han incubado a 37ºC durante 48 horas. Se han examinado
visualmente las colonias formadas después de 18, 24 y 48 horas de
incubación y se ha anotado la intensidad de coloración de
las
colonias.
colonias.
Entre las concentraciones sometidas a prueba,
los mejores resultados se obtienen con 100 y 300 mg/l de maltosa;
son concentraciones que se comunican, así, en la tabla 10 mostrada
a continuación. Incluso si los resultados con 400 mg/l de maltosa
son tan buenos, puede haber falsos positivos, ya que algunos otros
estafilococos de coagulasa negativa poseen también una actividad
\alpha-glucosidasa.
Se han anotado la coloración y la intensidad de
estas coloraciones. La escala de lectura es la misma que la usada
más arriba para las tablas 2 y 4.
La maltosa activa así la expresión de la
\alpha-glucosidasa de Staphylococcus aureus
y principalmente de las cepas críticas (3, 4, 5 y 6) lo que permite
así a estas cepas generar colonias verdes/verde claro en los
medios que contienen maltosa, mientras que las colonias
permanecerían blancas en ausencia de maltosa, con el riesgo de
hacer una identificación de no Staphylococcus aureus según
se explica más arriba.
Los sustratos cromógenos siguientes, reveladores
de \alpha-glucosidasa, pueden obtenerse en las
empresas siguientes:
-
5-bromo-4-cloro-3-indoxil-\alpha-D-glucósidoen
BIOSYNTH situada en Staad, Suiza, con la referencia
B-7230,
-
6-cloro-3-indoxil-\alpha-D-glucósidoen
BIOSYNTH citada anteriormente y lleva la referencia
C-5015, y
-
6-bromo-3-indoxil-\alpha-D-glucósido,
cuya síntesis se describe en la patente nº
W0-99/50.438 de la empresa Inalco, y
-
2-naftil-\alpha-D-glucopiranósido
bien conocido para el experto en la materia y que puede obtenerse
en la empresa Sigma, por ejemplo.
El sustrato fluorescente
4-metilumbeliferil-\alpha-D-glucósido,
revelador de la \alpha-glucosidasa, es bien
conocido por el experto en la materia y puede obtenerse en la
empresa Sigma, por ejemplo.
En lo que se refiere al
5-bromo-4-cloro-3-indoxil-N-metil-\alpha-D-glucósido,
puede sintetizarse de la manera siguiente:
El
5-bromo-4-cloro-l-metil-indol-3-il-\alpha-D-glucósido,
con la fórmula siguiente:
se obtiene a partir de acetato de
5-bromo-4-cloro-3-indolilo
o de
5-bromo-4-cloro-indolil-1,3-diacetato.
Etapa
1
Se disuelven 3 mmol de uno u otro de los ésteres
anteriores en 35 ml de éster dietílico anhidro y se metilan con
Nitrógeno 1 por adición de un exceso de complejo
diazometano-trifluoruro de boro en éter. Se extrae
la fase orgánica con ácido clorhídrico 1 M, se lava con agua y se
seca (Na_{2}SO_{4}). Se elimina el disolvente y se seca el
residuo al vacío en presencia de pentóxido de fósforo para obtener
0,62 g de producto.
Etapa
2
A. Se disuelve el éster de acetato
N-metilado obtenido anteriormente (0,6 g, 2 mmol)
en acetato de etilo anhidro y se hidroliza por adición de un exceso
de amoniaco metanólico en atmósfera de argón. Después de 16 horas
a temperatura ambiente, se eliminan el disolvente y el exceso de
amoniaco por evaporación a presión reducida, y se glicosila el
residuo sólido directamente sin purificación suplementaria.
B. Se toma el
5-bromo-4-cloro-l-metil-indol-3-ilo
en diclorometano y se trata a 0ºC con una solución de pentaacetato
de glucosa en diclorometano (1,45 g, 5 mmol/20 ml), después con
cloruro de estaño (2 mmol) disuelto en diclorometano, en agitación.
Se prosigue con la reacción durante una noche y se aísla el
producto por agitación con ácido clorhídrico glacial 1 M. Después
de eliminación de las sales de estaño, se filtra la fase orgánica
en papel PHASE-SEP y se seca en MgSO_{4}. En CCM,
se detectan dos puntos al UV. Después de una primera separación en
una columna de gel de sílice con
diclorometano-acetato de etilo como eluyente, se
desacetilan por separado los dos compuestos en presencia de una
solución metanólica de metóxido de sodio para dar mezclas de
\alpha y \beta-glucósido.
C. La forma \alpha parece predominante, el
\beta-glucósido residual puede eliminarse por
disolución en agua caliente, enfriada a 37ºC e incubada en
presencia de \beta-glucosidasa. Se filtra la
solución y se extraen los pigmentos de índigo con éter. Se evapora
la solución acuosa residual a presión reducida y después se
liofiliza para obtener el \alpha-glucósido (120
mg).
El sustrato cromógeno
6-cloro-3-indoxil-\beta-D-glucurónido,
revelador de la \beta-glucuronidasa, puede
obtenerse en BIOSYNTH situada siempre en Staad en Suiza con la
referencia C-5050.
El sustrato cromógeno
5-bromo-4-cloro-3-indoxil-\beta-D-glucurónido,
igualmente revelador de la \beta-glucuronidasa,
puede obtenerse en BIOSYNTH con la referencia
B-7400.
El sustrato cromógeno
6-cloro-3-indoxil-\beta-D-galactósido,
revelador de la \beta-galactosidasa, puede
obtenerse en BIOSYNTH con la referencia C-5000.
El sustrato cromógeno
5-bromo-4-cloro-3-indoxil-\beta-D-glucósido,
revelador de la \beta-glucosidasa, puede obtenerse
en BIOSYNTH con la referencia B-7250.
Claims (11)
1. Medio de detección de Staphylococcus
aureus y/o de estafilococos de coagulasa positiva, que comporta
un medio de cultivo de Staphylococcus aureus y al menos un
sustrato enzimático que permite destacar una actividad
\alpha-glucosidasa, caracterizado porque el
sustrato enzimático que permite destacar una actividad
\alpha-glucosidasa es un agente cromógeno o
fluorescente y porque usa al menos un inhibidor que favorece el
crecimiento de bacterias del género Staphylococcus, como
cloruro de litio (LiCl), azida de sodio (NaN_{3}), colistina,
anfotericina, aztreonam, colimicina, cloruro de sodio (NaCl) y
deferoxamina.
2. Medio, según la reivindicación 1, de
detección de Staphylococcus aureus y de estafilococos de
coagulasa positiva, caracterizado porque el agente cromógeno
o fluorescente que permite destacar una actividad
\alpha-glucosidasa está basado en indoxilo o
umbeliferona.
3. Medio, según las reivindicaciones 1 ó 2,
caracterizado porque usa como agente(s)
cromógeno(s):
-
6-bromo-3-indoxil-\alpha-D-glucósido,
-
5-bromo-4-cloro-3-indoxil-\alpha-D-glucósido,
-
5-bromo-4-cloro-3-indoxil-N-metil-
\alpha-D-glucósido,
-
6-cloro-3-indoxil-
\alpha-D-glucósido, y/o
- 4-metilumbeliferil-
\alpha-D-glucósido.
4. Medio, según la reivindicación 1, de
detección de Staphylococcus aureus, caracterizado
porque el agente cromógeno que permite destacar una actividad
\alpha-glucosidasa está basado en naftol.
5. Medio, según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 4, caracterizado porque usa como agente
cromógeno:
2-naftil-\alpha-D-glucopiranósido.
6. Medio, según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque usa al menos
dos sustratos enzimáticos diferentes, preferentemente dos agentes
cromógenos, uno que permite destacar una actividad
\alpha-glucosidasa y el otro que permite detectar
una actividad osidasa (\beta-glucosidasa y/o
\beta-glucuronidasa y/o
\beta-galactosidasa) y/o esterasa (esterasa/lipasa
y/o fosfatasa y/o sulfatasa) y/o peptidasa y/o coagulasa.
7. Medio, según la reivindicación 6,
caracterizado porque usa dos agentes cromógenos, elegidos
entre los pares siguientes:
-
5-bromo-4-cloro-3-indoxil-N-metil-\alpha-D-glucósido
asociado al
5-bromo-6-cloro-3-indoxil-\beta-D-galactósido,
o
-
5-bromo-4-cloro-3-indoxil-N-metil-\alpha-D-glucósido
asociado al
6-cloro-3-indoxil-\beta-D-glucurónido,
o
-
6-cloro-3-indoxil-\alpha-D-glucósidoasociado
al
5-bromo-4-cloro-3-indoxil-\beta-D-glucurónido,
o
-
6-cloro-3-indoxil-\alpha-D-glucósidoasociado
al
5-bromo-4-cloro-3-indoxil-\beta-D-glucósido.
8. Medio, según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque usa una mezcla
de inhibidores, que comprende cuatro inhibidores, que favorece el
crecimiento de bacterias del género Staphylococcus, que
son:
- -
- LiCl,
- -
- O/129,
- -
- Aztreonam, y
- -
- Anfotericina.
9. Medio, según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque usa maltosa,
preferentemente a una concentración comprendida entre 100 y 300
mg/l.
10. Procedimiento de identificación de
bacteria(s) de la especie Staphylococcus aureus en
una muestra, que contiene al menos una especie de bacteria, que
comprende las etapas siguientes:
- inocular un medio, según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, con toda o parte de la muestra, e
\newpage
- incubar el medio inoculado para producir
colonias bacterianas de tamaño suficiente para observar la
coloración de cada agente cromógeno o la fluorescencia de cada
agente fluorescente, que haya reaccionado, usado en dicho
medio.
11. Procedimiento, según la reivindicación 10,
que permite además el recuento de bacteria(s) de la especie
Staphylococcus aureus en la muestra caracterizado
porque se efectúa una tercera etapa que consiste en enumerar las
colonias identificadas por una coloración o una fluorescencia en
relación con las bacterias del género Staphylococcus
aureus.
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