DE60215339T2

DE60215339T2 - Spezifische detektionsmedien für staphylococcus aureus und identifizierungs- und/oder zaehlmethode unter verwendung besagter detektionsmedien

Info

Publication number: DE60215339T2
Application number: DE60215339T
Authority: DE
Inventors: Christine Cotte; Sylvain Orenga; Andrea Re; Denis Robichon
Original assignee: Biomerieux SA
Current assignee: Biomerieux SA
Priority date: 2001-03-30
Filing date: 2002-03-29
Publication date: 2007-05-03
Anticipated expiration: 2022-03-30
Also published as: FR2822847B1; WO2002079486A3; US20040121404A1; EP1390524B1; AU2002308050B2; FR2822847A1; CN1518602A; BRPI0208597B8; EP1390524A2; JP4201080B2; DE60215339D1; BR0208597B1; CN1263868C; ATE342377T1; JP2004524041A; US7807439B2; WO2002079486A2; BR0208597A; ES2274074T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Medium für den spezifischen Nachweis von Staphylococcus aureus und/oder für die Differenzierung von koagulase-positiven Staphylokokken gegenüber koagulase-negativen Staphylokokken, mit dem Bakterien der Gattung Staphylococcus isoliert werden können und die Art Staphylococcus aureus identifiziert werden kann, bei denen mindestens ein Enzymsubstrat verwendet wird. Außerdem betrifft sie ein Verfahren zur Identifikation zur gegebenenfalls zahlenmäßigen Auswertung von Staphylococcus aureus, bei dem solch ein Medium verwendet wird.
Im Jahr 1999 umfasst die Gattung Staphylococcus dreiundvierzig (43) Arten und Unterarten, von denen siebzehn (17) beim Menschen auftreten. Bei dem Großteil dieser Arten handelt es sich um opportunistische Pathogene beim Menschen, die bei Hautverletzungen durch Traumatismus oder durch direkte Implantation eines medizinischen Produkts eine erhöhte Gefahr darstellen. Außerdem handelt es sich bei der Art Staphylococcus aureus um ein Bakterium, das häufig bei Patienten auftritt, die der Krankenhauspflege bedürfen, wobei Geräte wie Spritzen oder Katheter verwendet werden. Man ist daher sehr daran interessiert, das Vorhandensein dieses pathogenen Bakteriums nachzuweisen, das immer stärker an Nosokomialinfektionen beteiligt ist.
Bei den Staphylokokken ist Staphylococcus aureus eindeutig die virulenteste Art, da sie sehr viele extrazelluläre Enzyme und Toxine produziert. Sie kann den Herd von zahlreichen verschiedenen Pathologien darstellen, die von einer einfachen eitrigen Fingerentzündung bis zu den schwersten Infektionen wie verschiedene Arten von Blutvergiftung, Endokarditis, Pneumopathie, Knochen-Gelenks-Infektionen, deren Prognose äußerst ungünstig sein kann, reicht.
Außerdem stellen nur fünf (5) Arten, nämlich Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus saprophyticus und Staphylococcus hominis, mindestens 1% der in klinischen Zentren isolierten pathogenen Stämme dar, und bei diesen fünf Arten mehr als 98% der am häufigsten anzutreffenden Staphylokokkenstämme. Die anderen Arten sind selten anzutreffen und nur wenig pathogen.
In der Bakteriologie ist es traditionell, die Art der Staphylococcus aureus, die durch die Produktion einer Koagulase gekennzeichnet ist, den anderen Arten, die als koagulase-negativ bezeichnet werden, gegenüberzustellen.
Die traditionellen Verfahren für die Differenzierung von Staphylococcus aureus gegenüber Nicht-Staphylococcus-aureus beruhen auf der Ermittlung der freien Koagulase, der DNase und einer Gerinnung auf Latex mit der Absicht, das Vorhandensein des Aftinitätsfaktors für Fibrinogen, vom Protein A und von Kapselantigenen nachzuweisen.
Andere Staphylokokkenarten, die möglicherweise pathogen sind, können nämlich eine Koagulase exprimieren.
Bei den koagulase-positiven Arten handelt es sich um: Staphylococcus aureus, Staphylococcus intermedius, Staphylococcus hyicus, Staphylococcus delphinis, Staphylococcus lutrae und Staphylococcus schleiferi.
Es gibt Kulturtechniken mit selektiven Medien, mit denen eine Auswertung des Vorhandenseins von Staphylococcus aureus ausgewertet werden kann. Es handelt sich dabei um die folgenden Medien:

• Das stark salzhaltige Milieu nach Chapman (mit 75% NaCl) ist im allgemeinen für Staphylococcus aureus und die Staphylokokken, die Mannit hydrolysieren, selektiv. Diese Bakterien lassen das Medium von Rot nach Gelb umschlagen. Gewisse Mikroorganismen und insbesondere die Enterokokken der D-Gruppe können die gleiche Reaktion auf dem Medium hervorrufen; man muss also die Katalase überprüfen (bei den Streptokokken negativ).
• Das Baird-Parker-Medium (das Kaliumtellurit und Lithiumchlorid als Selektionsmittel enthält) wird für die Isolation und zahlenmäßige Auswertung von koagulase-positiven Staphylokokken in Nahrungsmitteln verwendet; man kann hiermit die Koagulaseaktivität nachweisen. Auf diesem Medium erscheinen die Kolonien von Staphylococcus sureus sowie von anderen koagulatorpositiven Arten als schwarzes Zentrum, das von einem undurchsichtigen Hof umgeben ist. Auf diesem Medium können sich auch andere Mikroorganismen entwickeln. Es handelt sich in erster Linie um die folgenden Gruppen:
• grampositive Kokken: Enterococcus- und Listeria-Gattungen,
• gramnegative Bazillen: Proteus- und Pseudomonas-Gattungen.

Dem Nachweis von Staphylococcus aureus, bei dem die Technik des stark salzhaltigen Mediums nach Chapman verwendet wird, fehlt es an Empfindlichkeit (Fähigkeit, die gesuchte Art nachzuweisen, wenn sie in einer zu prüfenden biologischen Probe in kleinen Mengen vorliegt) und insbesondere an Spezifität (Fähigkeit, die gesuchte Art in einer zu prüfenden biologischen Probe, die andere Arten enthält, nachzuweisen).
Auch den Nachweis von Staphylococcus aureus, bei dem die Technik des Baird-Parker-Mediums verwendet wird, fehlt es an Empfindlichkeit und Spezifität. So können gewisse Stämme, die nicht zur Art Staphylococcus aureus zählen, insbesondere Staphylococcus schleiferi sowie Staphylococcus saprophyticus, ebenfalls zu Kolonien, die von einem hellen Hof umgeben sind, führen. Es kann auch vorkommen, dass gewisse Staphylococcus-aureus-Stämme nicht die gesuchte Enzymaktivität exprimieren oder sich nicht auf dem Medium entwickeln, da sie in den biologischen Proben in zu geringer Menge vorkommen und/oder von den zu stark selektiv wirkenden Bestandteilen des Mediums gehemmt werden.
Man ist sich also darüber im Klaren, dass dieser Nachweis mit den Baird-Parker und Chapman-Medien nur eine vorläufige Diagnose ergeben und noch weitere Bestätigungstests erfordern. Zusätzliche Arbeitsschritte, die für die Identifikation von Staphylococcus aureus erforderlich sind, erhöhen jedoch die Analysedauer und -kosten. Dabei sind zahlreiche Reaktanten sowie qualifiziertes Personal erforderlich.
Man kann auch Substrate auf Glukosidbasis verwenden, wodurch man je nach der Konfiguration der verwendeten Moleküle eine α-Glukosidase- oder eine β-Glukosidase-Aktivität nachweisen kann.
Die Verwendung von α-Glukosiden für die Identifikation der unterschiedlichen Staphylokokkusarten ist bereits bekannt. Die Untersuchung der Säurebildung mit diesen Zuckern durch die verschiedenen Staphylokokkusarten ermöglicht jedoch nicht wirklich eine einfache Identifizierung von Staphylococcus aureus, da sie entweder zu wenig spezifisch (wie zum Beispiel bei der Maltrose, Turanose, Saccharose und Trehalose) oder zu wenig empfindlich (zum Beispiel bei Methyl- α-Glukosid, bei Raffinose oder bei Turanose) ist (Bascomb S. und Manafi M. 1998. Use of enzyme tests in characterization and identification of aerobic and facultatively anaerobic Gram positive cocci. Clin. Microbiolol. Rev. 11: 318-340.) (Kloos W.E. et al. 1982. Identification of Staphylococcus species with the API Staph-IDENT. System. J. Clin. Microbiol. 16 (3): 509-516.). Diese Tatsache leitet den Forscher nicht dazu an, sich mit dieser Art der α-Glukosidase-Aktivität zu befassen.
Ganz im Gegenteil, bei den neueren Veröffentlichungen war man daran interessiert, mit der β-Glukosidase-Aktivität zu arbeiten. Dies ist zum Beispiel bei dem Patent EP-B-0.741.797 der Fall, das ein Differenzierungsverfahren auf einem Kulturmedium beschreibt, das für Bakterien der Gattung Staphylococcus gegenüber anderen Bakterien selektiv ist, und zwar dadurch, dass zwei chromogene Substrate auf Indoxylbasis den Nachweis der Phosphatase-Aktivität der Staphylokokken und der β-Glukosidase-Aktivität der anderen Bakteriengattungen ermöglichen.
Im Vergleich zum Nachweis von Staphylokokken auf einem Agarmedium gemäß dem genannten Patent, das nur die Differenzierung von Staphylokokken gegenüber Bakterien anderer Gattungen gestattet, ist es nun mit unserer Erfindung möglich, zwischen Staphylococcus aureus und anderen Bakterien der Gattung Staphylokokkus zu unterscheiden.
In einem Artikel: „Evaluation of CHROMagar Staph. aureus, a new chromogenic medium, for isolation and presumptive identification of Staphylococcus aureus from human clinical specimens" von Gaillot O. et al. 2000. J. Clin. Microbiol. 38, 4, 1587-1591, beschreibt man ein homogenes Kulturmedium CHROMagar (eingetragenes Warenzeichen) Staph. aureus, mit dem Staphylokokken isoliert und Staphylococcus aureus mit Hilfe von homogenen Substraten, die zu einer malvenfarbenen Färbung der letztgenannten Art führen, identifiziert werden können, und wertet dieses Medium aus. Die anderen Arten derselben Gattung werden theoretisch durch blaue Färbung oder Farblosigkeit nachgewiesen. Man bedient sich im Wesentlichen der β-Glukosidase-, β-Glukoronidase-, β-Galaktosidase- und Phosphataseaktivitäten sowie eines Hemmstoffs, nämlich Deferoxamin, das Differenzierung von Staphylococcus aureus gegenüber Staphylococcus epidermidis ermöglicht. Diesbezüglich wurde also eine Patentanmeldung angemeldet, nämlich WO-A-00/53799. In dieser Patentanmeldung wird ein Medium für den Nachweis von Staphylococcus aureus vorgeschlagen, das mindestens die zwei folgenden chromogenen Wirkstoffe paarweise vereint:

• 5-Brom-6-chlor-3-indoxylphosphat, Phosphataseaktivität, und
• 5-Brom-4-chlor-3-indoxylglukosid, β-Glukosidaseaktivität,

Gegenüber dem Medium CHROMagar (eingetragenes Warenzeichen) Staph. aereus kann man mit unserem Medium eine leichtere Differenzierung von Staphylococcus aureus gegenüber Staphylococcus epidermidis durchführen; diese zwei Arten produzieren auf dem Medium CHROMagar (eingetragenes Warenzeichen) Kolonien mit der gleichen Farbe. Der Grund hierfür ist eine fehlende Spezifität für Substrate der Phosphatase, die positiv für Staphylococcus aureus und Staphylococcus epidermidis sind, und zwar deshalb, weil die Hemmung der letztgenannten Bakterien durch Deferoxamin nur teilweise erfolgt.
Es ist anzumerken, dass man gemäß unserer Erfindung durch den ausschließlichen Nachweis der α-Glukosidaseaktivität Staphylococcus aureus von Staphylococcus epidermidis und Staphylococcus saprophyticus, die die drei Hauptarten der klinisch isolierten Staphylokokken darstellen, voneinander abgrenzen kann.
Entgegen allen Erwartungen haben die Erfinder gezeigt, dass man mit Substraten auf α-Glukosidbasis Staphylococcus aureus empfindlich und spezifisch nachweisen kann. Durch Wahl der Arbeitsbedingungen und/oder von bestimmten α-Glukosidasesubstraten und/oder der Kopplung mit mindestens einem zweiten Enzymsubstrat, das ein Reaktionsmedium definieren kann, kann man nämlich:

• zwischen den wichtigsten am häufigsten isolierten koagulasepositiven Staphylokokken-Arten (im Wesentlichen Staphylococcus aureus und Staphylococcus intermedius) und den am häufigsten vorkommenden koagulase-negativen Staphylokokken (im Wesentlichen Staphylococcus epidermis, Staphylococcus haemolycitus, Staphylococcus saprophyticus) unterscheiden und/oder
• spezifisch Staphylococcus aureus identifizieren.

So wird bei dem praktischen Aspekt der Erfindung zum Beispiel die Spezifizität dadurch erhöht, dass man mindestens ein zweites Enzymsubstrat zusetzt. Diese Erhöhung erfolgt einerseits durch den Nachweis einer α-Glukosidase-Aktivität, einer Aktivität, die stark von Staphylococcus aureus und sehr schwach von den anderen Staphylokokken-Arten exprimiert wird, und zweitens einer β-Glukuronidase- und/oder β-Galaktosidase- und/oder β-Glukosidase-Aktivität, die in erster Linie von Staphylokokken, jedoch nicht von Staphylococcus aureus exprimiert wird/werden, und zwar in Abhängigkeit von den verwendeten Substraten. Mit dieser zweiten Aktivität kann man besser zwischen Staphylococcus aureus und anderen Arten der Gattung Staphylococcus differenzieren.
Diesbezüglich betrifft die vorliegende Erfindung ein Medium für den Nachweis von Staphylococcus aureus und/oder kogulasepositiven Staphylokokken, das ein Kulturmedium für Staphylococcus aureus und mindestens ein Enzymsubstrat, das die Feststellung einer α-Glukosidase-Aktivität gestattet, umfasst, wie dies in den Ansprüchen definiert ist.
Bei dem Enzymsubstrat, mit dem man eine α-Glukosidase-Aktivität nachweisen kann, handelt es sich um einen chromogenen oder fluoreszierenden Wirkstoff.
Gemäß einer ersten Ausführungsform basiert der chromogene oder fluoreszierende Wirkstoff, mit dem man eine α-Glukosidase-Aktivität nachweisen kann, auf Indoxyl oder Umbelliferon, um den Nachweis von Staphylococcus aureus und koagulase-positiven Staphylokokken zu ermöglichen.
Bei diesem Medium werden gemäß einer ersten Ausführungsform als chromogene(r) Wirkstoff(e) verwendet:

• 6-Bromo-3-indoxyl-α-D-glukosid,
• 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-α-D-glukosid,
• 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-N-methyl-α-D-glukosid,
• 6-Chloro-3-indoxyl-α-D-glukosid, und/oder
• 4-Methylumbelliferyl-α-D-glukosid.

Gemäß einer zweiten Ausführungsform basiert der chromogene Wirkstoff, mit dem eine α-Glukosidase-Aktivität nachgewiesen werden kann, auf Naphthol, um den Nachweis von Staphylococcus aureus zu ermöglichen.
Bei diesem Medium wird gemäß der zweiten Ausführungsform 2-Naphthyl-α-D-glukopyranosid als chromogenener Wirkstoff verwendet.
Gemäß einer Ausführungsform werden bei dem Medium mindestens zwei verschiedene enzymatische Substrate verwendet, vorzugsweise zwei chromogenene Wirkstoffe, wobei der eine die Feststellung einer α-Glukosidase-Aktivität und der andere die Feststellung einer Osidase-(β-Glukosidase- und/oder β-Glukuronidase- und/oder β-Galaktosidase-) und/oder Esterase- (Esterase/Lipase- und/oder Phosphatase- und/oder Sulfatase-) und/oder Peptidase- und/oder Koagulase-Aktivität gewährleistet.
Weiterhin werden bei dem Medium zwei chromogene Wirkstoffe aus der Reihe der folgenden Paare verwendet:

• 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-N-methyl-α-D-glukosid in Verbindung mit 5-Brom-6-chlor-3-indoxyl-β-D-galaktosid, oder
• 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-N-methyl-α-D-glukosid in Verbindung mit 6-Chlor-3-indoxyl-β-D-glukuronid, oder
• 6-Chloro-3-indoxyl-α-D-glukosid in Verbindung mit 5-Brom-4-chloro-3-indoxyl-β-D-glukuronid, oder
• 6-Chloro-3-indoxyl-α-D-glukosid in Verbindung mit 5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-β-D-glukosid.

Bei dem Medium wird mindestens ein Hemmstoff verwendet, der das Wachstum von Bakterien der Gattung Staphylococcus begünstigt, wie Lithiumchlorid (LiCl), Natriumazid (NaN₃), Colistin, Amphoterizin, Aztreonam, Colimizin, Natriumchlorid (NaCl) und Deferoxamin.
Gemäß einer Ausführungsform wird bei dem Medium eine Mischung von Hemmstoffen, enthaltend vier Hemmstoffe, die das Wachstum von Bakterien der Gattung Staphylococcus begünstigt, verwendet, wobei diese

• LiCl,
• O/129,
• Aztreonam, und
• Amphoterizin sind.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird bei dem Medium Maltose verwendet, und zwar vorzugsweise in einer Konzentration zwischen 100 und 300 mg/l.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Bestimmung des Bakteriums/der Bakterien der Art Staphylococcus aureus in einer Stichprobe, enthaltend mindestens eine Art des Bakteriums, welches die folgenden Schritte umfasst:

• Beimpfen eines Mediums, wie oben beschrieben, mit der ganzen oder einem Teil der Stichprobe, und
• Inkubieren des beimpften Mediums zur Erzeugung von Bakterienkolonien in genügend großer Größe, um die Färbung jedes chromogenenen Wirkstoffs oder die Fluoreszenz jedes fluoreszierenden Wirkstoffs, die reagiert haben und in diesen Medien verwendet wurden, zu beobachten.

Diese Methode gestattet ferner die Zählung der Bakterie(n) der Art Staphylococcus aureus in der Stichprobe, wobei man in diesem Fall einen dritten Schritt durchführt, der darin besteht, die identifizierten Kolonien durch eine Färbung oder eine Fluoreszenz im Verhältnis zu den Bakterien der Gattung Staphylococcus aureus auszuzählen.
Versuch 1: Auswertung von unterschiedlichen α-Glukosidase-Substraten, die aus verschiedenen chromogenenen Markern auf Indoxylderivatbasis bestehen:
Es wurden die folgenden Medien hergestellt, und zwar mit einem Basalmedium, das folgendes enthält:

• 11 Gramm Pepton pro Liter (g/l),
• 0,65 g/l TRIS-Puffer, sowie
• 14 g/l Agar

Die α-Glukosidase-Substrate werden in Dimethylsulfoxid mit einer Konzentration von 200 g/l solubilisiert. Die vier Medien werden, so lange sie noch flüssig sind, mit solch einem Volumen versetzt, dass man zu einer Endkonzentration von 100 mg/l für Substrat gelangt. Anschließend wird jedes Medium mit Mikroorganismen aus der hauseigenen bioMérieux-Sammlung geimpft, und zwar dreimal in Zifferblattform, wobei man als Ausgangsmaterial eine 0,5-MacFarland-Suspension verwendet.
Ergebnisse, die mit Mikroorganismen aus öffentlich zugänglichen Sammlungen, wie zum Beispiel ATCC oder NCTC, erhalten werden, würden ebenfalls zu den gleichen Ergebnissen führen. Die Schalen wurden 48 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Die gebildeten Kolonien wurden nach einer Inkubationsdauer von 24 und 48 Stunden visuell ausgewertet. Es wurden die Färbung und die Intensität dieser Färbung festgehalten.
In Tabelle 2 unten sowie in den folgenden Tabellen bedeutet C die Färbung der Kolonien nach der Inkubation, I die Intensität dieser Färbung, das Symbol « – » ist synonym mit Fehlern der Farbe bzw. Fehlern der Intensität, und TI schließlich bedeutet Inkubationszeit. Es ist anzumerken, dass die Intensität der Färbung eine willkürliche Skala ist, die jedoch allen biologischen Stichproben und geprüften Medien gemeinsam ist. Diese Skala gilt für jeden hier beschriebenen Versuch sowie für alle folgenden Versuche. Sie kann folgendermaßen definiert werden:

• 0 bedeutet fehlende Aktivität,
• 0,1 bedeutet Spuren von Färbung,
• 0,5 bedeutet eine sehr schwache Färbung,
• 1 bedeutet eine deutliche Färbung mit schwacher Intensität,
• 1,5 bedeutet eine Färbung, die zwischen den Färbungen 1 und 2 liegt,
• 2 bedeutet eine klare Färbung mit mittlerer Intensität,
• 2,5 bedeutet eine Färbung, die zwischen den Färbungen 2 und 3 liegt,
• 3 bedeutet eine intensive Färbung,
• 3,5 bedeutet eine mittlere Färbung, die zwischen den Färbungen 3 und 4 liegt,
• 4 bedeutet eine sehr intensive Färbung.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 unten dargestellt:
Tabelle 2: Auswertung von unterschiedlichen α-Glukosidase-Substraten, die aus verschiedenen chromogenen Markern auf Indoxylderivatbasis bestehen.
Bei dem Substrat 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-α-D-glukosid erhält man zum Zeitpunkt 24 Stunden zwischen den Staphylokokkenstämmen eine abweichende Färbungsintensität, wodurch man Staphylococcus aureus identifizieren und gegenüber anderen Arten der Gattung Staphylococcus differenzieren kann. Zum Zeitpunkt 48 Stunden kann es zwischen Staphylococcus aureus und Staphylococcus xylosus Zweifel geben.
Bei den anderen drei Substraten hat die Inkubationsdauer keinen Einfluss insofern als man aufgrund des Unterschieds der Färbungsintensität zum Zeitpunkt 24 Std. als auch zum Zeitpunkt 48 Stunden Staphylococcus aureus identifizieren und gegenüber den anderen Arten der Gatten Staphylococcus differenzieren kann.
Jedenfalls ist anzumerken, dass die Intensitätsunterschiede zwischen den Stämmen von Staphylococcus aureus und den Stämmen von Staphylococcus xylosus (die koagulase-negativ sind) bei den drei Substraten 6-Chloro-3-indoxyl-α-D-glukosid, 6-Bromo-3-indoxyl-α-D-glukosid und 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-N-methyl-α-D-glukosid, die zu einem besseren Kontrast zwischen der Farbe des Markers und der Farbe des Mediums führen und spezifischer als 5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-α-D-glukosid sind, stärker ausgeprägt sind.
Versuch 2: Differenzierung von Staphylococcus aureus gegenüber Arten derselben Gattung durch direkten Nachweis der α-Glukosidaseaktivität und einer anderen Osidaseaktivität in einem Agarmedium:
Es wurden die folgenden Medien hergestellt, und zwar mit einem Basalmedium, das folgendes enthält:

Es wird eine Stammlösung von jedem α-Glukosidase-Substrat mit einer Konzentration von 200 g/l in Dimetylsulfoxid hergestellt. Die vier Medien werden, so lange sie noch flüssig sind, mit solch einem Volumen versetzt, dass man zu einer Endkonzentration von 100 mg/l für jedes α-Glukosidase-Substrat gelangt. Gleichzeitig werden die vier Medien mit einem ausreichenden Volumen an Substrat für jede der anderen oben beschriebenen Osidase-Aktivitäten auf eine Konzentration von – je nach Substrat – zwischen 50 und 200 mg/l versetzt. Anschließend wird jedes Medium mit Mikroorganismen aus der hauseigenen bioMérieux-Sammlung geimpft, und zwar dreimal in Zifferblattform, wobei man als Ausgangsmaterial eine 0,5-MacFarland-Suspension verwendet. Die Schalen wurden 48 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Die gebildeten Kolonien wurden nach einer Inkubationsdauer von 24 und 48 Stunden visuell ausgewertet. Es wurden die Färbung und die Intensität dieser Färbung festgehalten.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 unten dargestellt:

Tabelle 4: Auswertung von unterschiedlichen Substratkombinationen
Aus den oben angeführten Ergebnissen geht hervor, dass man Staphylococcus aureus gegenüber anderen Arten, nämlich den am häufigsten auftretenden Arten (Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus etc.) nach 24 stündiger Inkubation mit allen geprüften Paaren von chromogenen Substraten differenzieren kann.
Mit jedem Substratpaar A, B, C und D, das auf den Farbbereich und/oder die Farbintensität untersucht wurde, kann man die unterschiedlichen Staphylokokkenarten voneinander unterscheiden. Erstens kann man aufgrund des Färbungsunterschieds Staphylococcus xylosus unzweideutig identifizieren, und zweitens kann man aufgrund der stärksten Farbintensitäten, die bei Staphylococcus aureus erhalten werden, diese Art von anderen Arten derselben Gattung, die dieselbe Färbung aufweisen, differenzieren.
Nur die Art Staphylococcus intermedius kann bei dem Substratpaar A zum Zeitpunkt 48 Stunden zu Problemen führen; bei 24 stündiger Inkubation bestehen jedoch keierlei Zweifel, was interessanter ist, da das Medium und bei kürzerer Identifizierungsdauer immer leistungsfähiger wird. Es handelt sich um eine koagulase-positive Staphylokkenart, die man mit den meisten Identifikationsmethoden nicht von Staphylococcus aureus unterscheiden kann, insbesondere auf dem Chapman-Medium, dem Baird-Parker-Medium und dem Medium CHROMagar (eingetragenes Warenzeichen) Staph aureus.
Versuch 3: Vergleichende Untersuchung mit einem unserer Medien, das eine in versuch 2 beschriebene Substratmischung enthält, im Vergleich zu im Handel erhältlichen Medien:
Die folgenden Kulturmedien, die das Vorhandensein von Staphylococcus aureus in einer biologischen Probe anzeigen, sind von den folgenden Firmen erhältlich:

• das Medium CHROMagar Staph aureus (Bestellnummer TA600) von der Firma CHROMagar mit Sitz in Paris, Frankreich, und
• das Chapman-Medium (Bestellnummer 43311) und das Baird-Parker-Medium (Bestellnummer 43521) von der Firma bioMérieux mit Sitz in Marcy I'Etoile, Frankreich.

Die in Tabelle 5 unten angegebenen Medien werden folgendermaßen abgekürzt:

• A ist das Medium, das die in Versuch 2 beschriebene Mischung A enthält,
• B ist das Medium CHROMagar Staph aureus, das für die Isolation der Staphylokokken und die Identifikation der Art Staphylococcus aureus aufgrund einer Rosafärbung der Kolonien verwendet wird; die anderen Staphylokokken-Arten führen zu einer türkisen oder farblosen Farbe,
• C ist das für die Isolation von Staphylococcus aureus und Staphylokokken, die Mannitol hydrolydieren, verwendete Chapman-Medium; diese Bakterien lassen den in dem Medium vorhandenen Indikator von rot nach gelb umschlagen; und
• D ist das für die Isolation und Charakterisierung von Staphylococcus aureus verwendete Baird-Parker-Medium, das innerhalb von 24 Stunden zu typischen Kolonien mit einem schwarzen Zentrum, das von einer Aufhellungszone, auch Hof genannt, umgeben ist, führt, wobei dies einen Koagulasenachweis darstellt.

In den oben beschriebenen Medien wurden sechsunddreißig (36) Stämme geprüft, die zu zwölf (12) Arten von Staphylokokken, nämlich den bei der klinischen Analyse am häufigsten aufgefundenen, gehören. Anschließend wird jedes Medium mit Mikroorganismen aus der hauseigenen bioMérieux-Sammlung geimpft, und zwar dreimal in Zifferblattform, wobei man als Ausgangsmaterial eine 0,5-MacFarland-Suspension verwendet. Die Schalen wurden 48 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Die gebildeten Kolonien wurden nach einer Inkubationsdauer von 24 und 48 Stunden visuell ausgewertet. Die Färbung der Kolonien auf unterem Medium und auf dem chromogenen Medium CHROMagar Staph aureus wurde gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren und Boniturschema beurteilt. Für die Auswertung des Champman-Mediums bedeutet das Symbol "-" einen fehlenden Umschlag des gefärbten Indikators, der Agar bleibt um die Kolonien herum rot (mannitolnegative Stämme), und das Symbol "+" entspricht einem Umschlagen des gefärbten Indikators, der Agar wird um die Kolonien herum gelb (mannitolpositiver Stamm). Bei der Auswertung des Baird-Parker-Mediums entspricht das Symbol "-" einem fehlenden Aufhellungshof um die Kolonien herum (koagulasenegativer Stamm) und das Symbol "+" entspricht dem Vorhandensein eines Aufhellungshofes um diese Kolonien herum (koagulasepositiver Stamm).
In der Tabelle 5 unten entspricht die Färbung der Färbung der Kolonien nach der Inkubation, die Buchstaben "C.M." bedeuten die Färbung des Chapman-Mediums und die Kolonien nach der Inkubation, der Begriff "Hof" bedeutet die Aufhellungszone des Baird-Parker-Mediums und die Kolonien nach der Inkubation, und das Symbol "Nr." bedeutet die Anzahl Stämme, die pro Art identifiziert wurden, und zwar je nach dem Medium durch spezifische Färbung oder durch den Hof.

Tabelle 5: Vergleich eines erfindungsgemäßen Mediums mit den im Handel erhältlichen Medien.
Auf dem erfindungsgemäßen Medium sowie auf dem Medium CHROMagar Staph aureus und dem Chapman-Medium wurden alle Staphylococcus aureus Stämme identifiziert. Außerdem werden die Stämme von Staphylococcus intermedius, einer koagulase-positiven Art, auf unserem erfindungsgemäßen Medium sowie auf dem Medium CHROMagar Staph aureus und dem Baird-Parker Medium identifiziert. Die Ergebnisse zeigen außerdem, dass auf dem erfindungsgemäßen Medium und auf dem Baird-Parker-Medium keine falsch-Positiven identifiziert wurden. Außerdem ist festzustellen, dass auf dem Medium CHROMagar Staph aureus und auf dem Chapman-Medium mit hohem Salzgehalt (mit 75% NaCl) nicht zwischen Staphylococcus aureus und gewissen koagulase-negativen Arten unterschieden werden kann. Es müssen also zusätzliche Tests durchgeführt werden, mit denen das Vorhandensein dieser Staphylococcus aureus aufgezeigt werden soll.
Dieser Versuch zeigt die Spezifität und Verlässlichkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens auf.
Versuch 4: Auswertung von unterschiedlichen Arbeitsbedingungen mit einem Medium, das ein α-Glukosidase-Substrat auf Naphthofderivatbasis enthält:
Der folgende Versuch wurde in einem Flüssigmedium sowie in Gegenwart von chromogenen Substraten auf Naphtholderivatbasis durchgeführt.
Das Medium und Substrate werden in API (eingetragenes Warenzeichen)-Galerien, die von der Firma bioMérieux mit Sitz in Marcy I'Etoile, Frankreich, hergestellt werden, gefüllt.
Bei diesen Galerien handelt es sich um ein halbquantitatives Verfahren zur Erforschung von Enzymaktivitäten von Mikroorganismen; man kann damit rasch gleichzeitig 19 Enzymaktivitäten untersuchen. Jede Galerie enthält 20 Näpfchen, die mit den Lösungen gefüllt sind, die die Enzymsubstrate enthalten. Die Enzymtests werden dadurch durchgeführt, dass man 65 μl Bakteriensuspension in einer Konzentration von 5-6-McFarland in jedes Näpfchen füllt.
Die Färbungsintensität jedes Näpfchens wird visuell nach 4 stündiger Inkubation bei 37°C und anschließendes Versetzen mit geeigneten Reaktanten geprüft: ZYM A (Best. Nr. 70470) sowie ZYM B (Best. Nr. 70480), die von der bereits genannten bioMérieux erhältlich sind. Die Färbungsintensität wird der Menge an von dem Enzym hydrolysierten Substrat direkt proportional sein.
Die Werte der Färbungsintensität werden anschließend gemäß der folgenden Bonitur auf einem Ergebbnisblatt festgehalten: Die Note 0 bedeutet eine negative Reaktion, die Note 5 eine Reaktion mit maximaler Intensität, und die Noten 1, 2, 3 und 4 geben mittlere Färbungsstufen und daher mittlere Enzymaktivitätsstufen an. Genauere Informationen zu diesen Notenwerten finden sich in der API-Ableseskala, die zusammen mit den Galerien desselben Namens geliefert wird.
Wie bei den Versuchen 1 und 2 stammen auch hier die Mikroorganismen aus der hausinternen bioMérieux-Sammlung.
Die gesuchten Enzymaktivitäten und die entsprechenden Naphtholderivat-Substrate sind in der folgenden Tabelle 6 beschrieben:
Tabelle 6: Aufzählung der mit Hilfe von chromogenen Substraten, die aus Naphtholderivaten bestehen, untersuchten Enzymaktivitäten.
Die Ergebnisse der Enzymaktivitäten sind in der folgenden Tabelle 7 zusammengestellt:
Tabelle 7: Identifikation von positiven Staphylococcus aureus Stämmen durch Nachweis der α-Glukosidase-Aktivität gegenüber anderen Staphylokokkenarten.
Gemäß den Ergebnissen der Tabelle 7 oben kann man nur mittels des Nachweises der α-Glukosidase-Aktivität mit dem Substrat 2-Naphthyl-α-D-Glukopyranosid, die von dem Staphylococcus aureus Stamm stark expremiert wird, diese koagulase-positive Art von den anderen Staphylokokken-Arten unterscheiden. Bei den anderen Enzymaktivitäten sind die Unterschiede der Färbungsintensität zwischen dem Staphylococcus aureus Stamm und den Stämmen der anderen Arten wesentlich weniger signifikant und machen die Unterscheidung zwischen den unterschiedlichen Arten schwierig. Anzumerken ist, dass bei einem chromogenen Substrat auf Naphtholbasis die Unterscheidung eines koagulase-positiven Staphylokokkus wie Staphylococcus indermedius nicht möglich ist. Die anderen Staphylokokken Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus epidermidis und Staphylococcus haemolyticus sind koagulase-negativ.
Versuch 5: Nachweis der α-Glukosidase mit anderen nichtchromogenen Substraten wie einem fluoreszierenden Substrat:
Die folgenden Medien wurden mit dem in Versuch 1 beschriebenen Basismedium durchgeführt, jedoch ohne Agar und mit einem fluoreszierenden Substrat statt einem chromogenen Substrat. Um hervorzuheben, wie wichtig es ist, ein fluoreszierendes Substrat für den Nachweis von koagulase-positiven Staphylokokkenarten zu verwenden, wurden vier fluoreszierende Substrate, die in Tabelle 8 beschrieben sind, und die für die folgenden Enzymaktivitäten spezifisch sind, verglichen.
Tabelle 8: Abkürzungen der geprüften fluoreszierenden Substrate.
Die Substrate werden in den bei den Versuchen 1 und 2 verwendeten Lösungsmittel solubilisiert; die Endkonzentration jedes Substrats beträgt 200 mg/l Medium.
Die verschiedenen Flüssigmedien werden in die Näpfchen eines Trägers mit der Größe einer Kreditkarte, der für das automatische System VITEK 2 (eingetragenes Warenzeichen) der Firma bioMérieux spezifisch ist, gefüllt. Das mit Ofen ausgestattetem System VITEK 2 führt alle Schritte vom Inokulum bis zur Darstellung der Ergebnisse durch. Nur die Herstellung des Inokulums in einer Konzentration von 0,5 McFarland wird von der Arbeitskraft mit Hilfe eines Nephelometers durchgeführt, und zwar für jeden geprüften Stamm direkt in den systemspezifischen Röhrchen. Mit dem automatischen System kann man in regelmäßigen Abständen von 15 Minuten über einene Zeitraum von 19 Stunden das Bakterienwachstum nephelometrisch und die Enzymaktivität fluorimetrisch ablesen.
Wie in den Versuchen 1, 2 und 4 stammen auch die hier untersuchten Stämme aus der hausinternen Sammlung von bioMérieux.
Die Ergebnisse, die in Tabelle 9 unten zusammengefasst sind, geben die Zeit in Inkubationsstunden an, die für die maximale Fluoreszenz, die von dem Gerät gemessen werden kann, erforderlich ist:
Tabelle 9: Zusammenfassende Tabelle der Ergebnisse in Inkubationsstunden, die zum Erhalt des maximalen Fluorezenzniveaus jeder Enzymaktivität für jeden Stamm erforderlich sind.
Die Analyse der Ergebnisse zeigt, dass man auch durch Nachweisen der α-Glukosidase-Aktivität mit einem fluoreszierenden Substrat auf Umbelliferonbasis zwischen koagulase-positiven Arten (Staphylococcus aureus und Staphylococcus intermedius) und koagulase-negativen Arten (Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus xylosus, Staphylococcus saprophyticus und Staphylococcus haemolyticus) in Abhängigkeit von der Ablesezeit unterscheiden kann, weil man aufgrund der Hydrolyse des Substrats 4-MU-α-GLU durch die α-Glukosidase bei den koagulasepositiven Staphylokokkenstämmen vor 8 Stunden Inkubation und bei den koagulase-negativen Stämmen nach 10 Stunden Inkubation zu einer maximalen Fluoreszenz gelangt.
Bei den drei anderen untersuchten Substraten scheint es schwierig zu sein, zwischen koagulase-positiven Staphylokokkenarten und koagulasenegativen Staphylokokkenarten wie Staphylococcus epidermidis zu unterscheiden, da der Zeitabstand für ein Erzielen der maximalen Fluoreszenz bei dieser Art und denjenigen für die koagulase-positiven Arten sehr ähnlich bzw. damit identisch ist.
Dieses Beispiel veranschaulicht deutlich einen der Vorteile des Nachweises einer α-Glukosidase-Aktivität mit einem fluoreszierenden Substrat.
Versuch 6: Mischung von Hemmstoffen, die den Nachweis der α-Glukosidase mit einem erfindungsgemäßen Enzymsubstrat begünstigen:
Um die Spezifität unserer Substrate noch weiter zu verbessern, wurden zahlreiche Arbeiten durchgeführt. Unter den ins Auge gefassten Lösungen hat die Möglichkeit, Hemmstoffe zuzusetzen, zu einer völlig überraschenden und besonders interessanten Lösung geführt.
Es wurden gewisse Hemmstoffkombinationen ins Auge gefasst, da mit keinem Hemmstoff allein eine Verbesserung des Nachweises von Staphylokokken möglich war. Die meisten dieser Hemmstoffe konnten den Fachmann davon wegleiten, weiter zu versuchen, eine Lösung in dieser Richtung zu finden, nämlich zum Beispiel in folgenden Fällen:

• Die erste Kombination ist die Kombination der drei Hemmstoffe Lithiumchlorid LiCl (2 g/l), Amphoterizin (0,005 g/l) und Aztreonam (0,008 g/l). Das Wachstum von Staphylokokken wird von diesen drei Verbindungen sehr leicht negativ beeinflusst, auf die nachgewiesenen Enzymaktivitäten (α-Glukosidase und β-Glukuronidase) hat es hingegen keinerlei Wirkung.
• Die zweite Zusammensetzung der Hemmstoffmischung ist mit dem oben genannten Versuch identisch, nur werden gleichzeitig die Konzentrationen von LiCl ( von 3 g/l bis 7 g/l) und Aztreonam (gleichzeitig von 0,008 g/l bis 0,003 g/l) gleichzeitig verändert (Herstellung von einer Reihe gegenläufiger Konzentrationen). Je stärker die LiCl-Konzentration zunimmt, desto mehr verringert sich das Wachstum der Staphylokokken. Dieser Effekt wurde für Aztreonam nicht beobachtet; eine Konzentrationszunahme hat keine negative Auswirkung auf das Bakterienwachstum. Bei den Enzymaktivitäten wird (unabhängig von der Konzentration) keinerlei Hemmstoffeffekt auf den Nachweis der α-Glukosidase und der β-Glukuronidase beobachtet. Die Selektivität wird mit zunehmender Hemmstoffkonzentration verbessert, während die Vermehrungsfähigkeit der Staphylokokken verringert ist.
• Die oben genannte Hemmstoffmischung wird einerseits von Colistin und andererseits durch eine Erhöhung der Aztreonamkonzentration vervollständigt. Diese Erhöhung sowie der Colistinzusatz in das Medium hat praktisch keinerlei Auswirkung auf das Wachstum der Staphylokokken. Die Selektivität wird insofern verbessert, als die in den oben genannten Versuchen identifizierten kritischen Arten unter diesen neuartigen Bedingungen gehemmt werden. Die Sensitivität des α-Glukosidase-Nachweises ist in Gegenwart von Aztreonam unabhängig von der verwendeten Konzentration (von 0 bis 32 mg/l) sehr wenig verringert.
• Die Schlagkräftigkeit des Mediums, die Vermehrungsfähigkeit der Staphylokokken und der Nichtstaphylokokken sowie die Expression der Enzymaktivitäten werden in Gegenwart der in dem obigen Versuch definierten Hemmstoffmischung (LiCl, Aztreonam, Amphoterizin und Colistin) ausgewertet, jedoch an einer größeren Stichprobe von Stämmen. Der Zusatz der vier selektiven Wirkstoffe zu dem Medium führt nur zu einer sehr leichten Verringerung des Staphylokokkenwachstums und bleibt allgemein ohne Auswirkung auf das α-Glukosidase-Expressionsniveau von Staphylococcus aureus. Der Nachweis bzw. die Expression der β-Glukurunidase-Aktivität hingegen ist in Gegenwart dieser Hemmstoffe signifikant verändert. Die Selektivität ist jedoch insbesondere gegenüber Listeria, Enterococcus faecium, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumanii und Bacillus noch immer nicht perfekt.
• Nun versetzte man mit der vibriostatischen Verbindung O/129, erhöhte die Aztreonamkonzentration (32 mg/l), entfernte das Colistin aus der Hemmstoffmischung und charakterisierte die β-Glukosidase-Aktivität. Der Versuch unten wurde mit dem folgenden Medium durchgeführt: – 20,1 g/l Pepton, – 0,65 g/l Tris-Puffer, – 14 g/l Agar-Agar, – 0,125 g/l 6-Chloro-3-indoxyl-β-D-glukosid, – 0,100 g/l 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-N-methyl-α-D-glukosid, – 0,0018 g/l Manganchlorid und – 4 g/l Natriumpyruvat.

Außerdem weist die Hemmstoffmischung die folgende Zusammensetzung auf:

– LiCl: 5 g/l,
– O/129: 0,010 g/l,
– Aztreonam: 0,032 g/l und
– Amphoterizin: 0,005 g/l.

Die Leistungsfähigkeit des Mediums insgesamt ist erstaunlich gut, das Wachstum aller Staphylokokkenarten ist nämlich korrekt. Außerdem wird der Nachweis der α-Glukosidase- und β-Glukosidase-Aktivität nicht von den Hemmstoffen beeinflusst und die Selektivitätshöhe ist ausreichend, da das Wachstum von Nichtstaphylokokken (Listeria, Acinetobacter, Klebsiella usw.) gehemmt wird.
Versuch 7: Verbesserung der Sensitivität bei schwachen Inocula durch Zusatz von Maltose:
Der Versuch unten wurde mit Medien durchgeführt, die folgendes enthielten:

– 20,1 g/l Pepton,
– 0,65 g/l Tris-Puffer,
– 14 g/l Agar-Agar,
– 0,125 g/l 6-Chloro-3-indoxyl-β-D-glukoside,
– 0,100 g/l 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-N-methyl-α-D-glukosid,
– 0,004 g/l Manganchlorid,
– 4 g/l Natriumpyruvat,
– 4 g/l Lithiumchlorid,
– 0,032 g/l Aztreonam,
– 0,002 g/l Amphoterizin und
– Maltose auf einer Endkonzentration von 0 bzw. 0,1 bzw. 0,3 bzw. 0,4 g/l.

Die Maltose wird in Wasser in einer Konzentration von zum Beispiel 100 g/l solubilisiert und anschließend wird ein ausreichendes Volumen den drei Medien vor dem Abkühlen zugegeben, wodurch man zu den oben stehenden Endkonzentrationen gelangte. Jedes der chromogenen Medien wurde mit den Staphylokokkenstämmen aus der firmeneigenen Sammlung von bioMérieux beimpft, und zwar durch Isolation (senkrechte nebeneinanderstehende Ausstriche auf der gesamten Plattenoberfläche) einer Suspension mit einer Konzentration von 0,5 MacFarland, die 1/30000 verdünnt worden war. Die Schalen wurden anschließend 48 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Die gebildeten Kolonien wurden visuell nach 18, 24 bzw. 48 stündiger Inkubation ausgewertet und die Färbungsintensität der Kolonien wurde schriftlich festgehalten.
Unter den geprüften Konzentrationen wurden die besten Ergebnisse mit 100 bzw. 300 mg/l Maltose erhalten, also Konzentrationen, die daher in Tabelle 10 unten beschrieben sind. Obwohl die Ergebnisse mit 400 mg/l Maltose ziemlich gut sind, können sie falsch-Positive enthalten, da gewisse andere koagulase-negative Staphylokokken ebenfalls über eine α-Glukosidase-Aktivität verfügen.
Tabelle 10: Auswertung der Maltosewirkung auf die α-Glukosidase-Aktivität von Staphylokokken
Es wurden die Färbung sowie die Intensität dieser Färbungen schriftlich festgehalten. Bei dem Boniturschema handelt es sich um dasselbe, das auch weiter oben für die Tabellen 2 und 4 verwendet wurde.
Die Maltose aktiviert also die α-Glukosidase-Expression von Staphylococcus aureus, insbesondere von den kritischen Stämmen (3, 4, 5 und 6), wodurch es diesen Stämmen ermöglicht wird, grüne/hellgrüne Kolonien auf den maltosehaltigen Medien zu produzieren, während die Kolonien ohne Maltose weiß geblieben wären, was das Risiko birgt, Nicht-Staphylococcus-aureus zu identifizieren, wie dies weiter oben erklärt wurde.
Sonstiges:
Die folgenden chromogenen Substrate, bei denen es sich um Nachweismittel für die α-Glukosidase handelt, sind von den folgenden Firmen erhältlich:

• 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-α-D-glukosid von BIOSYNTH, Standort Staad, Schweiz, Bezugsnummer B-7230,
• 6-Chloro-3-indoxyl-α-D-glukosid von BIOSYNTH mit der Bezugsnummer C-5015 und
• 6-Bromo-3-indoxyl-α-D-Glukosid, dessen Synthese in dem Patent Nr. WO 99/50438 der Fa. Inalco beschrieben ist sowie
• 2-Naphthyl-α-D-glukopyranosid, das dem Fachmann gut bekannt ist und zum Beispiel von der Firma Sigma bezogen werden kann.

Das fluoreszierende Substrat 4-Methylumberilliferyl-α-D-Glukosid, ein Nachweismittel für die α-Glukosidase, und dem Fachmann gut bekannt kann zum Beispiel von der Firma Sigma bezogen werden.
5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-N-methyl-α-D-glukosid kann folgendermaßen dargestellt werden: 5-Bromo-4-chloro-1-methylindol-3-yl-α-D-glukosid mit der folgenden Formel:
wird ausgehend von 5-Bromo-4-chloro-3-indolylacetat oder 5-Brom-4-chlorindolyl-1,3-diacetat erhalten.
Schritt 1: Synthese von 5-Bromo-4-chloro-N-methyl-3-indolylacetat
3 mmol des einen oder anderen oben genannten Esters werden in 35 ml wasserfreiem Diethylester gelöst und 1 durch Versetzen mit einem Überschuss an Diazomethan-Bortrifluorid-Komplex im Ether am Stickstoff methyliert. Die organische Phase wird mit 1 M Salzsäure extrahiert, mit Wasser gewaschen und getrocknet (Na₂SO₄). Das Lösungsmittel wird entfernt und der Rückstand wird im Vakuum in Gegenwart von Phosphorpentoxid getrocknet, wodurch man 0,62 g Produkt erhält.
Schritt 2: Synthese von 5-Bromo-4-chloro-1-methyl-3-indolyl-α-glukosid

A. Der oben erhaltene N-methylierte Acetatester (0,6 g, 2 mmol) wird in wasserfreiem Essigester gelöst und durch versetzen mit einem Überschuss an methanolischem Ammoniak unter Argonatmosphäre hydrolysiert. Nach 16 Stunden bei Raumtemperatur werden das Lösungsmittel und der überschüssige Ammoniak durch Eindampfen unter verringertem Druck entfernt und der feste Rückstand wird direkt ohne weitere Aufreinigung glykosyliert.
B. Das 5-Bromo-4-chloro-1-methylindol-3-yl wird in Dichlormethan aufgenommen und bei 0°C unter Rühren mit einer Lösung von Glukosepentaacetat in Dichlormethan (1,45 g, 5 mmol/20 ml) und anschließend mit Zinnchlorid (2 mmol), das in Dichlormethan gelöst worden war, versetzt. Die Reaktion wird eine Nacht lang ablaufen gelassen und das Produkt wird durch Rühren mit 1 M Eisessig isoliert. Nach Entfernung der Zinnsalze wird die organische Phase über PHASE-SEP-Papier filtriert und über MgSO₄ getrocknet. In der Dünnschichtchromatographie werden zwei Flecken unter UV nachgewiesen. Nach einer ersten Aufreinigung an einer Silikagelsäule mit Dichlormethan-Essigester als Elutionsmittel werden die zwei Verbindungen separat in Gegenwart einer methanolischen Natriummethanolatlösung desacetyliert, wodurch man zu Mischungen aus α- und β-Glukosid gelangt.
C. Die α-Form scheint vorzuherrschen, und das restliche β-Glukosid kann durch Lösen in heißem Wasser, abkühlen auf 37°C und Inkubation mit β-Glukosidase eliminiert werden. Die Lösung wird filtriert und die Indigopigmente werden mit Ether extrahiert. Die verbleibende wässrige Lösung wird unter verringertem Druck eingeengt und anschließend lyophilisiert, wodurch man das α-Glukosid erhält (120 mg).

Das chromogene Substrat 6-Chloro-3-indoxyl-β-D-glukuronid, das Nachweismittel für die β-Glukuronidase, kann von BIOSYNTH, Standort Staad, Schweiz, unter der Bezugsnummer C-5050 bezogen werden.
Das chromogene Substrat 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-β-D-glukuronid, das Nachweismittel für die β-Glukuronidase, kann von BIOSYNTH unter der Bezugsnummer B-7400 bezogen werden.
Das chromogene Substrat 6-Chloro-3-indoxyl-β-D-galaktosid, das Nachweismittel für die β-Galaktosidase, kann von BIOSYNTH unter der Bezugsnummer C-5000 bezogen werden.
Das chromogene Substrat 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-β-D-glukosid, das Nachweismittel für die β-Glukosidase, kann von BIOSYNTH unter der Bezugsnummer B-7250 bezogen werden.

Claims

Medium für den Nachweis von Staphylococcus aureus und/oder koagulase-positiven Staphylokokken, das ein Kulturmedium für Staphylococcus aureus und mindestens ein Enzymsubstrat, das die Feststellung einer α-Glukosidase-Aktivität gestattet, umfasst, gekennzeichnet dadurch, dass das Enzymsubstrat, das die Feststellung einer α-Glukosidase-Aktivität gestattet, ein chromogener oder fluoreszierender Wirkstoff ist und dass dieses mindestens einen Hemmstoff verwendet, der das Wachstum von Bakterien der Gattung Staphylococcus begünstigt, wie zum Beispiel Lithiumchlorid (LiCl), Natriumazid (NaN₃), Colistin, Amphoterizin, Aztreonam, Colimizin, Natriumchlorid (NaCl) und Deferoxamin.
Medium nach Anspruch 1 für den Nachweis von Staphylococcus aureus und koagulase-positiven Staphylokokken, gekennzeichnet dadurch, dass der chromogene oder fluoreszendierende Wirkstoff, der die Feststellung einer α-Glukosidase-Aktivität gestattet, auf Indoxyl oder Umbelliferon basiert.
Medium nach Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, dass es als (einen) chromogene(n) Wirkstoff(e) verwendet: • 6-Bromo-3-indoxyl-α-D-glukosid, • 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-α-D-glukosid, • 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-N-methyl-a-D-glukosid, • 6-Chloro-3-indoxyl-α-D-glukosid, und/oder • 4-Methylumbelliferyl-α-D-glukosid.
Medium nach Anspruch 1 für den Nachweis von Staphylococcus aureus, gekennzeichnet dadurch, dass der chromogene Wirkstoff, der die Feststellung einer α-Glukosidase-Aktivität gestattet, auf Naphthol basiert.
Medium nach einem der Ansprüche 1 oder 4, gekennzeichnet dadurch, dass es als chromogenen Wirkstoff 2-Naphthyl-α-D-Glukopyranosid verwendet.
Medium nach einem der Ansprüche 1 bis 5, gekennzeichnet dadurch, dass es mindestens zwei verschiedene Enzymsubstrate verwendet, vorzugsweise zwei chromogene Wirkstoffe, wobei der eine die Feststellung einer α-Glukosidase-Aktivität und der andere die Feststellung einer Osidase- (β-Glukosidase und/oder β-Glukuronidase und/oder β-Galaktosidase) und/oder Esterase(Esterase/Lipase und/oder Phosphotase und/oder Sulfatase) und/oder Peptidase- und/oder Koagulase-Aktivität gewährleistet.
Medium nach Anspruch 6, gekennzeichnet dadurch, dass es zwei chromogene Wirkstoffe verwendet, ausgewählt aus den folgenden Paaren: • 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-N-methyl-α-D-glukosid in Verbindung mit 5-Bromo-6-chloro-3-indoxyl-β-D-galaktosid, oder • 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-N-methyl-α-D-glukosid in Verbindung mit 6-Chloro-3-indoxyl-β-D-glukuronid, oder • 6-Chloro-3-indoxyl-α-D-glukosid in Verbindung mit 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-β-D-glukuronid, oder • 6-Chloro-3-indoxyl-α-D-glukosid in Verbindung mit 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-β-D-glukosid.
Medium nach einem der Ansprüche 1 bis 7, gekennzeichnet dadurch, dass es eine Mischung von Hemmstoffen verwendet, enthaltend vier Hemmstoffe, die das Wachstum von Bakterien der Gattung Staphylococcus begünstigen, wobei diese: • LiCl, • O/129, • Azetreonam, und • Amphoterizin sind.
Medium nach einem der Ansprüche 1 bis 8, gekennzeichnet dadurch, dass es Maltose verwendet, vorzugsweise in einer Konzentration zwischen 100 und 300 mg/l.
Verfahren zur Bestimmung des Bakteriums/der Bakterien der Art Staphylococcus aureus in einer Stichprobe, enthaltend mindestens eine Art des Bakteriums, welches die folgenden Schritte umfasst: • Beimpfen eines Mediums nach einem der Ansprüche 1 bis 9 mit der ganzen oder einem Teil der Stichprobe, und • Inkubieren des beimpften Mediums zur Herstellung von Bakterienkolonien in genügend großer Größe, um die Färbung jedes chromogenen Wirkstoffes oder die Fluoreszenz jedes fluoreszierenden Wirkstoffes, die reagiert haben und im besagten Medium verwendet wurden, zu beobachten.
Medium nach Anspruch 10, welches ferner die Zählung der Bakterie(n) der Art Staphylococcus aureus in einer Stichprobe gestattet, dadurch gekennzeichnet, dass man einen dritten Schritt durchführt, der darin besteht, die identifizierten Kolonien durch eine Färbung oder eine Fluoreszenz im Verhältnis zu den Bakterien der Gattung des Staphylococcus aureus auszuzählen.