DE69403481T2 - Verfahren zur identifizierung von mikroorganismen mittels eines mit kohlehydraten angereicherten mediums - Google Patents
Verfahren zur identifizierung von mikroorganismen mittels eines mit kohlehydraten angereicherten mediumsInfo
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit eines speziellen Mikroorganismenstammes in einem Kulturmedium.
- Der Nachweis eines Mikroorganismus ist sehr wichtig insbesondere in der Lebensmittelindustrie, auf dem Gebiet der Kontrolle der Gewässer oder in der Medizin, wobei bekannt ist, daß diese Mikroorganismen sich nicht nur als pathogene Agentien erweisen können, sondern auch aus Agentien bestehen können, die bestimmte Typen von Kontaminationen anzeigen.
- Verschiedene Verfahren erlauben den Nachweis der Anwesenheit von Mikroorganismen in einem beliebigen Medium, die darin bestehen, daß eine Probe aus dem zu untersuchenden Medium entnommen wird, dann die Entwicklung der vorhandenen Mikroorganismen durch Kultivierung auf einem oder in einem geeigneten Medium gefördert wird.
- Um den Nachweis von vorhandenen Mikroorganismen zu vereinfachen, wurde bereits vorgeschlagen, in dem Nachweismedium gefärbte Verbindungen zu verwenden, deren Anwesenheit für einen gegebenen Mikroorganismus charakteristisch ist.
- Die Färbung weist häufig auf eine enzymatische Aktivität hin, die mit dem in Betracht gezogenen Mikroorganismus in Verbindung steht, und das Ergebnis dieser Aktivität kann zu einer Modifizierung des pH-Werts des Mediums, die durch einen gefärbten Indikator nachgewiesen wird (EP-A-0 395 532) oder auch zur Freisetzung einer chromophoren oder fluorophoren Verbindung führen (FR-A-2 684 110).
- Die chromophoren oder fluorophoren Verbindungen sind Verbindungen, die im allgemeinen durch enzymatische Hydrolyse von entsprechenden chromogenen oder fluorogenen Verbindungen, die in dem Kulturmedium vorhanden sind, erhalten werden.
- Die fluorophoren Verbindungen emittieren eine charakteristische Strahlung durch Fluoreszenz. Die chromophoren Verbindungen sind charakterisiert durch eine Farbe mit einer vorherrschenden Wellenlänge.
- Unter den bekannten chromophoren Verbindungen können insbesondere genannt werden die Derivate von Indoxyl, Hydroxychinolin oder auch die Naphthoesäure-Derivate oder die Naphthyl- und Phenyl-Derivate.
- Um zwei Genus von verschiedenen Mikroorganismen in einem Kulturmedium voneinander zu unterscheiden, wurde bereits vorgeschlagen, zwei chromogene Agentien einzuführen, von denen jedes eine chromophore Verbindung mit einer Farbe freisetzt, die charakteristisch für die Anwesenheit eines speziellen Mikroorganismus ist (US-A-5 210 022).
- Obgleich die Gesamtheit dieser Medien geeignet ist für den Nachweis von Mikroorganismen eines spezifischen Genus, wie beispielsweise Salmonella, Candida oder E. coli und auch ihre Unterscheidung von anderen Species, erlauben sie jedoch nicht den Nachweis einer großen Anzahl von Mikroorganismen unterschiedlicher Genus in ein und demselben Kulturmedium oder auch unter den Mikroorganismen des gleichen Genus die Unterscheidung von pathogenen Species von anderen.
- Eine solche Unterscheidung ist außerordentlich wichtig für bestimmte Hefearten wie Candida albicans, die für mehr als 50 % der mit Hefen verbundenen Pathologien verantwortlich ist.
- Es wurde nun auf überraschende Weise gefunden, daß man diese Nachteile beseitigen kann, indem man in das Kulturmedium mindestens ein chromogenes Substrat eines Enzyms des Stammes und mindestens eine Verbindung einführt, die ausgewählt wird unter einem Kohlenhydrat mit hoher Konzentration, um eine Sekundärfarbe (abgeleitete Farbe) zu erhalten, die von der Grundfarbe der chromophoren Verbindung verschieden ist.
- Unter der Sekundärfarbe (abgeleiteten Farbe) versteht man hier jede Farbe, deren überwiegende Wellenlänge von der überwiegenden Wellenlänge der chromopheren Verbindungen verschieden ist, die durch die in dem kulturmedium vorhandenen chromogenen Verbindungen isoliert in einem Standard- Medium freigesetzt werden.
- Unter einem Standard-Medium versteht man hier jedes übliche Medium zur Identifizierung, in dem ein Kohlenhydrat die einfache Funktion einer Kohlenstoffquelle mit sehr niedrigen Konzentrationen, ja sogar von 0, hat wobei in Betracht gezogen wird, daß diese Konzentrationen die Vermeidung jedes Induktor-Effekts erlauben, der auf unkontrollierte Weise das Verhalten der Mikroorganismen modifizieren könnte und Fehler bei der Identifizierung der in Betracht gezogenen Mikroorganismen einführen könnte.
- Die überwiegende Wellenlänge der chromopheren Verbindung kann errechnet werden unter Bezugnahme auf das Tageslicht, wie beispielsweise von der CIE (Commission Internationale de l'Energie) als Lichtquelle (Lichtart) D&sub6;&sub5; definiert, wobei man von irgendeinem Standard-Verfahren zur Messung der Farbe des Gegenstandes, insbesondere mit einem Spektrocolorimeter, ausgeht.
- Die vorliegende Erfindung betrifft somit ein Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit eines speziellen Mikroorganismenstammes in einem Medium, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man in das Kulturmedium mindestens ein chromogenes(farbbildendes) Substrat eines Enzyms des Stammes sowie mindestens ein Kohlenhydrat in erhöhter Konzentration einführt, um nach der Hydrolyse des chromogenen Substrats (Farbbildners) eine Farbe zu erhalten, die von der Grundfarbe der chromophoren Verbindung verschieden ist.
- Das Medium ist zweckmäßig ein Medium auf Pepton-Basis.
- Unter einem Kohlenhydrat versteht man erfindungsgemäß die Gesamtheit der natürlichen oder nicht-natürlichen Zucker, insbesondere die Osen, speziell die Pentosen oder Hexosen, vorzugsweise die Glucose, mit Ausnahme jeder Hexosamin-Verbindung.
- Die erhöhte Konzentration an Kohlenhydrat liegt in der Größenordnung von 10 bis 30 g/l Medium.
- Darüber hinaus wurde auch festgestellt, daß die Zugabe eines Phosphats in einer erhöhten Konzentration, wenn eines der Enzyme die Phosphatase ist, eine Erhöhung der Anzahl der Sekundärfarben erlaubt, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten werden können.
- Infolgedessen betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren, wie es vorstehend definiert worden ist, bei dem das Kulturmedium eine erhöhte Konzentration an Phosphat, vorzugsweise zwischen 1 und 3 g/l, enthält.
- Die chromogenen Substrate (Farbbildner) sind insbesondere Substrate der folgenden Enzyme: β-Galactosidase, β-Glucuronidase, β-Glucosidase, α- Glucosidase, α-Galactosidase, Phosphatase, N-Acetyl-β-glucosidase, N- Acetyl-β-galactosidase, α-Mannosidase, Sulfatase, Esterase, Lipase und Peptidase.
- Das Medium enthält zweckmäßig mindestens zwei chromogene Substrate (Farbbildner), die insbesondere ausgewählt werden aus den Verbindungen der gleichen chemischen Familie, vorzugsweise unter denjenigen, die durch Hydrolyse zwei verschiedene chromophore Verbindungen freisetzen, die eine Kupplungsreaktion eingehen können.
- Unter einer Kupplungsreaktion versteht man hier jede physikalischchemische Wechselwirkung, aufgrund deren die resultierende vorherrschende Wellenlänge verschieden ist von der vorherrschenden Wellenlänge der Mischung aus den beiden chromophoren Verbindungen, wenn diese isoliert genommen werden.
- Vorzugsweise sind die chromogenen Substrate (Farbbildner) solche aus der Familie der Indoxyle, insbesondere der alkylierten, halogenierten oder dihalogenierten Indoxyl-Derivate.
- Zu den bevorzugten chromophoren Verbindungen, die von Indoxyl abgeleitet sind, gehören die Indoxyl-, Bromoindoxyl-, Chloroindoxyl-, Dichloroindoxyl-, Chlorobromoindoxyl-, Trichloroindoxyl- und Methylindoxyl-Derivate, insbesondere die folgenden Derivate: 6-Chloro-indoxyl, 5-Bromo-indoxyl, 3- Bromo-indoxyl, 4,6-Dichloro-indoxyl, 6,7-Dichloro-indoxyl, 5-Bromo-4-chloroindoxyl, 5-Bromo-6-chloro-indoxyl oder 4,6,7-Trichloro-indoxyl.
- Unter dem Mikroorganismus, dessen Anwesenheit oder Abwesenheit nach dem erfindungsgemäßen Verfahren nachgewiesen wird, versteht man die Hefen, die einzelligen Pilze oder Schimmelpilze und die Bakterien.
- Das erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere geeignet zum Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit von Hefen des Genus Candida, insbesondere von Candida albicans und Candida tropicalis.
- Desgleichen gehören zu den Bakterien, deren Anwesenheit oder Abwesenheit nach dem erfindungsgemäßen Verfahren nachgewiesen werden kann, insbesondere die Bakterien des Genus Streptococcus, Klebsiella, Enterobacter, Escherichia, Citrobacter, Staphylococcus, Listeria, Clostridium oder Proteus.
- Die nachfolgenden Beispiele sollen das erfindungsgemäße Verfahren erl utern, ohne jedoch seinen Schutzbereich darauf zu beschränken. Tabelle I Beispiele für Sekundärfärbungen
- ** Sekundärfarbe Tabelle II Beispiele für erfindungsgemäße Färbungen bei verschiedenen Hefe-Species
- * Dreifachfarbe ** Sekundärfarbe
- Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, daß die Zugabe von Glucose und Phosphat die Verbreiterung des Bereiches der verfügbaren Farben für das gleiche Medium erlauben, so daß es hier möglich ist, sieben unterschiedliche Species voneinander zu unterscheiden und insbesondere Candida albicans eindeutig zu kennzeichnen.
Claims (14)
1. Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit eines
speziellen Mikroorganismenstammes in einem Medium, dadurch
gekennzeichnet, daß man in das Kulturmedium mindestens ein Farbbildner-Substrat eines
Enzyms des Stammes sowie mindestens ein Kohlenhydrat in erhöhter
Konzentration einführt, um nach der Hydrolyse des Farbbildners eine davon
abgeleitete Farbe zu erhalten, die von der Grundfarbe des Farbbildners verschieden ist,
wobei das Kohlenhydrat keine Hexosaminverbindung ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Medium
ein Medium auf Pepton-Basis ist.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet,
daß die Kohlenwasserstoff-Konzentration in der Größenordnung von 10 bis 30
g/l liegt.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet,
daß das Medium eine erhöhte Phosphat-Konzentration aufweist.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die
Phosphat-Konzentration zwischen 1 und 3 g/l liegt.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet,
daß das Medium mindestens zwei Farbbildner enthält.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet,
daß die Farbbildner Verbindungen aus der gleichen chemischen Familie sind.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet,
daß die beiden Farbbildner durch Hydrolyse zwei unterschiedliche
Chromophore freisetzen, die eine Kupplungsreaktion eingehen können.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet,
daß die Farbbildner solche aus der Familie der Indoxyle, insbesondere der
alkylierten, halogenierten oder dihalogenierten Indoxylderivate, sind.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet,
daß der Chromophor ausgewählt wird aus den Indoxyl-, Bromoindoxyl-,
Chloroindoxyl-, Dichloroindoxyl-, Chlorobromoindoxyl-, Trichloroindoxyl- und
Methylindoxyl-Derivate, insbesondere den 6-Chloro-indoxyl-, 5-Bromo-indoxyl-, 3-
Bromo-indoxyl-, 4,6-Dichloro-indoxyl-, 6,7-Dichloro-indoxyl-,
5-Bromo-4-chloroindoxyl-, 5-Bromo-6-chloro-indoxyl- oder 4,6,7-Trichloro-indoxyl-Derivate.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch
gekennzeichnet, daß es sich bei den Mikroorganismen um Hefen handelt.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei
den Hefen um solche des Genus Candida handelt.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch
gekennzeichnet, daß es sich bei den Mikroorganismen um Bakterien handelt.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei
den Bakterien um solche der Genus Streptococcus, Klebsiella, Enterobacter,
Escherichia, Citrobacter, Staphylococcus, Listeria, Clostridium oder Proteus
handelt.
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