DE60119965T2 - Verfahren und medium zum nachweisen/identifizieren von mikroorganismen mit esterase- und/oder osidase- und/oder peptidase- und/oder sulfatase- und/oder phosphataseaktivität - Google Patents

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Description

  • Die Erfindung liegt auf dem Gebiet der mikrobiologischen Analyse durch biochemische Mittel, und sie betrifft insbesondere den Nachweis und die Identifizierung von Bakterienstämmen durch Inokulation von Reaktionsmedien, insbesondere Nährmedien. Letztere umfassen chromogene oder fluorogene Substrate, die dazu in der Lage sind, mit spezifischen Enzymen für die Zielstämme zu reagieren, und dabei eine Färbung oder Fluoreszenz für jede bestimmte Kolonie zu erzeugen.
  • Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist insbesondere der Nachweis/die Identifizierung von pathogenen Mikroorganismen oder qualitätsanzeigenden Mikroorganismen, sowohl im medizinischen als auch im industriellen Bereich, von Interesse und im Besonderen Mikroorganismen mit enzymatischer Esterase-, Osidase-, Peptidase-, Sulfatase- oder Phosphatase-Aktivität, beispielsweise Bakterien oder Hefen der Gattung Salmonella, Pseudomonas, Listeria, Staphylococcus, Enterococcus, Candida und noch spezieller die Spezien Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Candida albicans.
  • Die Anwesenheit von Escherichia coli-Stämmen wird häufig durch den Nachweis einer enzymatischen Osidase-Aktivität wie beispielsweise einer β-Glucuronidase- oder β-Galactosidase-Aktivität angezeigt.
  • Auf dieselbe Weise wird die Gattung Listeria durch Anzeigen der β-Glucosidase-Aktivität nachgewiesen.
  • Eine Aminopeptidase-Aktivität kann auch verwendet werden, um eine Gruppe, eine Gattung oder eine Spezies von Mikroorganismen nachzuweisen. Die Alanin-Aminopeptidase-Aktivität ermöglicht beispielsweise die Unterscheidung von gramnegativen Bakterien von grampositiven Bakterien.
  • Die Gattung Salmonella, die beim Menschen für verschiedene Infektionen verantwortlich ist (typhusartiges Fieber, Lebensmittelvergiftung) besitzt unspezifische Esterasen, die dazu in der Lage sind, synthetische chromogene Substrate wie beispielsweise indigogene Substrate zu hydrolysieren.
  • Der Nachweis/die Identifizierung von Salmonellen und allgemeiner von Bakterien mit Esterase-Aktivität wird klassischerweise auf Gelose-Medien oder flüssigen Isoliermedien durchgeführt, die den Nachweis/die Identifizierung von mutmaßlichen Bakterienkolonien mit Esterase-Aktivität, insbesondere von Salmonellen, ermöglicht. Die Inokulation von solchen Medien erfolgt, indem das Medium in der analysierten Probe eingetaucht wird, oder indem die Probe mit dem Medium in Kontakt gebracht wird.
  • Bakterien mit Esterase-, Osidase-, Peptidase-, Sulfatase- oder Phosphatase-Aktivität besitzen in ihrem enzymatischen Genotyp Esterasen, Osidasen, Peptidasen, Sulfatasen oder Phosphatasen, welche die bestimmten Verknüpfungen der in dem Medium vorhandenen Substrate spalten und so den aktivierten chromophoren oder fluorophoren Teil dieser Substrate freisetzen. Dies führt zu einer Färbung oder Fluoreszenz, welche die Hydrolyse, und somit das Vorhandensein von Zielbakterien oder Kolonien der Zielbakterien anzeigt.
  • Um Routinetests in großem Maßstab durchführen zu können, ist es erforderlich, dass die Nachweis-/Identifizierungsmedien stabil sind und eine möglichst große Vereinfachung der jeweiligen Nachweis-/Identifizierungsverfahren ermöglichen, in dem nur wenige Handgriffe erforderlich sind. Außerdem ist es wichtig, dass die Verfahren eine hohe Sensitivität (hohe Intensität der Färbung) sowie eine Spezifität erster Ordnung ermöglichen. Die Geschwindigkeit des Nachweises von mutmaßlichen Kolonien ist ebenfalls ein entscheidender Parameter dieser Arten von Medien und Verfahren zum Nachweis/zur Identifizierung von Bakterien, die die oben genannten enzymatischen Aktivitäten aufweisen.
  • Es ist nun bekannt, dass enzymatische Substrate wie Esterasen, Osidasen, Peptidasen, Sulfatasen oder Phosphatasen Probleme bereiten, im Hinblick auf die Kompatibilität mit dem Kulturmedium für Mikroorganismen und insbesondere für die Bakterien, welche diese Aktivitäten aufweisen. Außerdem sind solche Substrate nicht über längere Zeit stabil, was bedeutet, dass sich die Sensitivität gegenüber der fraglichen enzymatischen Aktivität während der Dauer der Lagerung verringert.
  • In diesem Zusammenhang sind aus dem wissenschaftlichen Artikel „Synthèse de substrats indigogéniques. Mise en èvidence de l'acfivité estérasique des salmonelles": A. Agban of al., Eur. J. Med. Chem. (1990) 25, 697-699, Gelose-Kulturmedien bekannt, die indigogene Substrate umfassen, nämlich insbesondere 5-Bromindoxylpelargonat (C9) und ein Gallensalz, nämlich Natriumdesoxycholat. Solche Kulturmedien leiden unter demselben Nachteil, wie nachfolgend mit Bezug auf das Dokument FR-2 697 028 erwähnt.
  • Das Patent FR-2 697 028 offenbart ein Kulturmedium zum Nachweis von Salmonellen, welches ein chromogenes Esterase-Substrat, das aus einem Ester der Caprylsäure mit einem Indolrest (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-caprylat) gebildet ist, sowie ein oberflächenaktives Mittel, das aus Gallensalzen ausgewählt ist (Natriumdesoxycholat), umfasst. Dieses Chromogen und dieses Gallensalz sind in einem Nährmedium enthalten, welches das Wachstum von Salmonellen ermöglicht. Gemäß der Lehre von FR-2 697 028 wird das Gallensalz direkt zu dem Selektionsmedium zugegeben, das bereits das Esterase-Substrat enthält.
  • Ein weiterer Nachteil im Zusammenhang mit der Verwendung von Gallensalzen ist auf die Tatsache zurückzuführen, dass es sich bei diesen um Ausgangsmaterialien mit tierischem Ursprung handelt, die einer gewissen Veränderlichkeit der Qualität unterliegen.
  • Außerdem sind die Ergebnisse im Hinblick auf die biologische Aktivität verbesserungsfähig.
  • Dieses Kulturmedium bietet nicht alle wünschenswerten Sicherheiten im Hinblick auf die Stabilität des Esterase-Substrats. Außerdem hat sich gezeigt, dass dieses Letztere nicht vollständig mit dem Kulturmedium mischbar ist. Dadurch wird selbstverständlich die Qualität der erhaltenen Ergebnisse im Hinblick auf die Sensibilität, Schnelligkeit und Stabilität verringert.
  • Es ist außerdem anzumerken, dass das Kulturmedium gemäß FR-2 697 023 in Form eines Pulvers vorliegt. Dies bedeutet, dass der Benutzer zunächst einen Schritt zur Rekonstituierung des flüssigen oder gelförmigen Mediums durchführen muss. Dieses Erfordernis ist eine Folge der fehlenden Stabilität der verwendeten Esterase-Substrate. Außerdem ist das nach der Lehre von FR-2 697 028 hergestellte Gelose-Medium nicht transluzent, was das Ablesen der Färbungen im Zusammenhang mit möglichen Kolonien von Zielbakterien beeinträchtigen kann.
  • Die PCT-Anmeldung WO 92/17607 betrifft ein Nachweismedium für Salmonellen, das TERGITOL-4® (7-Ethyl-2-methyl-4-undecanoat-hydrogensulfat oder dessen Natriumsalz) enthält. Dieses Additiv verbessert vermutlich die Selektivität des Nachweismediums gegenüber Zielsalmonellen. Die Konzentration an TERGITOL-4® kann in dem Kulturmedium auf Grundlage von Agargelose/Xylose-Lysin zwischen 2 und 30 ml/l variieren. Gemäß diesem Dokument beruht der Nachweis von Salmonellen allein auf dem Prinzip des selektiven Wachstums durch Wettbewerb.
  • Die PCT-Anmeldung WO 99/41409 betrifft chromogene Esterase-Substrate für den Nachweis von Salmonellen. Diese PCT-Anmeldung entspricht dem Dokument COOKE VENITIA M. ET AL.; APPLIED AND ENVIRONMENTAL MIKROBIOLOGY, Vol. 65, Nr. 2, Februar 1999 (1990-02) Seiten 807-812.
  • In diesem Dokument wird vorgeschlagen, eine chromogene Verbindung zu verwenden, die mit einer Esterase/Lipase, die für die Gattung Salmonella spezifisch ist und eine Affinität für C8-Fettsäureester aufweist, reagiert. Die fragliche chromogene Verbindung umfasst ein Anion und ein Kation der Formel: [4-[2-(4-Oxctanoyloxy-3,5-dimethoxyphenyl)vinyl]-quinolinium-1-(propan-3-yl-)carboxylat]+, [Bromid oder Chlorid]–. Genauer handelt es sich bei den verwendeten Substraten um C8-Ester, beispielsweise mit dem Kation Carboxylat.
  • Außerdem beschreibt das Verfahren nach WO 99/41409 die Umsetzung eines Sorbitanfettsäureesters (insbesondere des Monolaurinsäureesters TWEEN®20). Diese Produkte werden als oberflächenaktive Mittel in einer Menge von 2 g/l des Mediums eingesetzt.
  • Außerdem kann das spezifische Substrat gemäß der Lehre dieser PCT-Anmeldung in das Kulturnährmedium als Gemisch mit Methanol, Ethanol oder N,N-Dimethylformamid (DMF) eingebracht werden. Das optionale oberflächenaktive Mittel wird nicht zusammen mit Substrat und Lösungsmittel, sondern separat von diesen zugefügt.
  • In jedem Fall werden die in WO 99/41409 offenbarten Mittel nicht dazu bereitgestellt, um eine Verbesserung der Stabilität der in dem Nachweismedium enthaltenen enzymatischen Substrate zu ermöglichen.
  • Es sind darüber hinaus aus verschiedenen Dokumenten Kulturmedien bekannt, die mehrere Substrate für den Nachweis einer einzelnen enzymatischen Aktivität beinhalten sowie Kulturmedien, die mehrere Substrate beinhalten, die den Nachweis unterschiedlicher enzymatischer Aktivitäten ermöglichen.
  • Beispielsweise beschreibt das Dokument WO 95/04157 Kulturmedien, die unterschiedliche chromogene Osidase-Substrate wie beispielsweise 5-Brom-4-chlor-3-indoxylgalctosid, 5-Brom-4-chlor-3-indoxylglucuronid, 5-Brom-4-chlor-3-indoxylglucosid oder 6-Chlor-3-indoxylgalactosid beinhalten. Solche Medien werden verwendet, um insbesondere die Bakterien der Spezies Escherichia coli von anderen Coli-Formen zu unterscheiden.
  • Dieses Dokument beschreibt außerdem ein Medium, das chromogene Substrate beinhaltet, die spezifisch für verschiedene Enzyme wie Osidasen und Phosphatasen sind. Bei diesen Substraten handelt es sich beispielsweise um 5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-N-acetyl-glucosaminid und 5-Brom-6-chlor-3-indoxyl-phosphat. Ein solches Medium ermöglicht insbesondere die Unterscheidung von Candida albicans und anderen Hefen der Gattung Candida.
  • Das Dokument WO 00/53799 beschreibt ein chromogenes Nachweismedium für Staphylococcus aureus-Bakterien. Dieses Medium umfasst zwei chromogene Substrate in Kombination, insbesondere 5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-glucosid und 5-Brom-6-chlor-3-indoxylphosphat. Das Hauptinteresse an einem solchen Medium liegt darin, falsch positive oder falsch negative Ergebnisse zu vermeiden und S. aureus von anderen Spezien und anderen Gattungen wie den Streptococcus zu unterscheiden.
  • Die Dokumente WO 95/04157 und WO 00/53799 enthalten jedoch keinen Hinweis darauf, dass die beschriebenen Medien dazu entwickelt wurden, um die Stabilität der enthaltenen enzymatischen Substrate zu verbessern.
  • Fettsäuresorbitanester (ESAG) sind bekannte oberflächenaktive Mittel, die insbesondere bei Nahrungsmittelzubereitungen und pharmazeutischen Präparaten weithin verwendet werden. Zur Veranschaulichung kann auf den Artikel von Dickinson et al.: „J Colloid interface Sci 1999 Apr 15, 212 (2): 466-473" verwiesen werden, der die Stabilisierung von Emulsionen betrifft, die Natriumcaseinat und ein polyethoxyliertes Sorbitanmonolaurat, das 20 Einheiten Ethylenoxid aufweist (TWEEN 20), enthalten. Bei den betreffenden Emulsionen handelt es sich um Öl-in-Wasser-Emulsionen (30 Vol.-% n-Tetradecan bei pH 6,8). Dieser technische Bereich ist relativ fernliegend zu dem Nachweis von Bakterien mit spezifischer enzymatischer Aktivität durch Farbreaktion auf einem selektiven Kulturmedium.
  • Der Artikel von Gram of al.: „Clin Chem 1985 Okt; 31 (10): 1683-8" betrifft die Umsetzung von polyethoxyliertem Sorbitanmonooleat (TWEEN 80) in einem Antithrombin III-Assaymedium, wobei dieses Medium außerdem Polyethylenglycol, eine Lösung von Thrombin und synthetischen chromogenen Peptidsubstraten enthält. Die verwendeten Additive dienen dazu, eine Erhöhung der Konzentration an aktivem Thrombin zu ermöglichen, um so ein gutes Gelingen der Analyse zu gewährleisten. Es ist nochmals festzustellen, dass derartige technische Angelegenheiten sich deutlich unterscheiden von denjenigen eines Nachweismediums für Bakterien mit spezifischer enzymatischer Aktivität mit Hilfe von selektiven Kulturmedien, die chromogene Substrate enthalten.
  • In einem solchen technischen Gebiet liegt eines der wesentlichen Ziele der vorliegenden Erfindung darin, ein Medium für den Nachweis/die Identifizierung von Bakterien mit enzymatischer Aktivität, ausgewählt aus Esterase- und/oder Osidase- und/oder Peptidase- und/oder Sulfatase- und/oder Phosphatase-Aktivitäten bereitzustellen, das so konzipiert ist, dass die Sensitivität der Analyse optimiert wird, d.h. dass die Intensität der Färbung oder Fluoreszenz, durch die das Vorhandensein von Zielbakterien nachgewiesen wird, maximiert wird.
  • Ein weiteres wesentliches Ziel der vorliegenden Erfindung liegt dann, ein Medium für den Nachweis/die Identifizierung von Mikroorganismen, insbesondere Bakterien oder Hefen mit einer enzymatischen Aktivität, ausgewählt aus Esterase- und/oder Osidase- und/oder Peptidase- und/oder Sulfatase- und/oder Phosphatase-Aktivitäten bereitzustellen, das vor der Inokulation mit der zu analysierenden Probe vollständig transluzent ist.
  • Ein weiteres wesentliches Ziel der Erfindung liegt darin, ein Medium für den Nachweis/die Identifizierung von Mikroorganismen, insbesondere Bakterien oder Hefen mit einer enzymatischen Aktivität ausgewählt aus Esterase- und/oder Osidase- und/oder Peptidase- und/oder Sulfatase- und/oder Phosphatase-Aktivitäten bereitzustellen, das wenigstens ein chromogenes oder fluorogenes Enzymsubstrat, ausgewählt aus Esterase-Substraten und/oder Osidase-Substraten und/oder Peptidase-Substraten und/oder Sulfatase-Substraten und/oder Phosphatase-Substraten, enthält und das bei Lagerung stabil ist (die Intensität der angezeigten Färbung oder Fluoreszenz wird für wenigstens mehrere Wochen bei einem Maximalwert gehalten).
  • Ein weiteres wesentliches Ziel der Erfindung liegt darin, ein Medium für den Nachweis/die Identifizierung von Mikroorganismen, insbesondere Bakterien oder Hefen mit einer enzymatischen Aktivität, ausgewählt aus Esterase- und/oder Osidase- und/oder Peptidase- und/oder Sulfatase- und/oder Phosphatase-Aktivitäten bereitzustellen, das nicht in Form eines trockenen Pulvers vorliegt, das mit einer Flüssigkeit regeneriert werden muss, um ein flüssiges oder gelförmiges Medium zu rekonstituieren, sondern das direkt in einer verwendungsfertigen Form vorliegt.
  • Ein weiteres wesentliches Ziel der Erfindung liegt darin, ein Medium für den Nachweis/die Identifizierung von Mikroorganismen, insbesondere Bakterien oder Hefen mit einer enzymatischen Aktivität, ausgewählt aus Esterase- und/oder Osidase- und/oder Peptidase- und/oder Sulfatase- und/oder Phosphatase-Aktivitäten, bereitzustellen, das ökonomisch ist, insbesondere aufgrund der Tatsache, dass es geringere Mengen eines oder mehrerer chromogener oder fluorogener Enzymsubstrate enthält, die üblicherweise teuer sind.
  • Ein weiteres wesentliches Ziel der Erfindung liegt darin, ein Verfahren zum Erhalten des oben genannten Nachweis-/Identifizierungsmediums bereitzustellen, das einfach durchzuführen und ökonomisch ist.
  • Ein weiteres wesentliches Ziel der vorliegenden Erfindung liegt dann, ein Verfahren zum Nachweisen/Identifizieren von Stämmen mit enzymatischer Aktivität, ausgewählt aus Esterase- und/oder Osidase- und/oder Peptidase- und/oder Sulfatase- und/oder Phosphatase-Aktivitäten bereitzustellen, das einfach durchzuführen ist (Routinetests), das ökonomisch ist (Menge des Reagenzes, Handhabung, Arbeitskraft, Geschwindigkeit, etc.), das verlässlich, sensitiv, spezifisch und reproduzierbar ist.
  • Ein weiteres wesentliches Ziel der vorliegenden Erfindung liegt darin, die Verwendung eines neuen stabilisierenden Additivs in einem Medium für den Nachweis/die Identifizierung von Mikroorganismen, insbesondere Bakterien oder Hefen, mit einer enzymatischen Aktivität, ausgewählt aus Esterase- und/oder Osidase- und/oder Peptidase- und/oder Sulfatase- und/oder Phosphatase-Aktivitäten bereitzustellen, wobei diese Aktivität als Ergebnis einer Hydrolysereaktion, durch die ein Farbstoff oder ein fluoreszierendes Produkt freigesetzt wird, angezeigt wird.
  • Diese und andere Ziele werden durch die vorliegende Erfindung erreicht, die in erster Linie ein Medium zum Nachweisen/Identifizieren von Mikroorganismen nach Anspruch 1 betrifft.
  • Ein Medium zum Nachweisen/Identifizieren von Mikroorganismen und insbesondere Bakterien und/oder Hefen mit enzymatischer Aktivität, ausgewählt aus Esterase- und/oder Osidase- und/oder Peptidase- und/oder Sulfatase- und/oder Phosphatase-Aktivitäten, kann erfindungsgemäß ausgehend von den in den beschriebenen Dokumenten WO 95/04157 und WO 00/53799 offenbarten Medien erhalten werden.
  • Das erfindungsgemäße Medium besitzt den Vorteil, dass es verwendungsfertig ist und in einer flüssigen oder halbflüssigen (Gel) Form vorliegt, ohne dass dadurch Probleme im Hinblick auf die Stabilität auftreten. Tatsächlich werden die Esterase- und/oder Osidase- und/oder Peptidase- und/oder Sulfatase- und/oder Phosphatase-Substrate, die in diesem Medium vorhanden sind und für ihre Neigung zu einer relativ schnellen Zersetzung bekannt sind, durch das Vorhandensein des emulgierenden Stabilisierungsmittels ESAG, AG oder ESAG/AG stabilisiert.
  • Dieses Additiv, das gegebenenfalls mit dem Lösungsmittel S assoziiert ist, bringt einen weiteren Vorteil mit sich, in dem es eine hervorragende Auflösung der Esterase- und/oder Osidase- und/oder Peptidase- und/oder Sulfatase- und/oder Phosphatase-Substrate ermöglicht, die sich üblicherweise einer Auflösung widersetzen. Dadurch wird es möglich, Nachweis-/Identifizierungsmedien zu erhalten, die vor der Inokulation transluzent sind, wodurch es leichter ist, die Färbungs- oder Fluoreszenzergebnisse abzulesen.
  • Dieses ESAG-, AG- oder ESAG/AG-Additiv ist kostengünstig und ermöglicht eine Vereinfachung der Vorgehensweise und eine Verringerung der Menge der verwendeten Substrate (Stabilisierung), was zu einer gewissen ökonomischen Ersparnis führt.
  • Außerdem führen die erfindungsgemäßen Mittel zu einer verbesserten biologischen Aktivität der zuvor genannten Substrate, was zu einer intensiveren Färbung der Zielkolonien und einer besseren Spezifizität führt.
  • Es ist der Verdienst der Erfinder, dass diese bestimmte Klasse von emulgierenden Stabilisierungsmitteln, insbesondere ESAG, eingesetzt wurde, die auf überraschende und unerwartete Weise die Eigenschaften der Stabilität, Lichtdurchlässigkeit, biologischen Aktivität, Sensitivität, Zuverlässigkeit und Spezifität ermöglichen, die bei der erfindungsgemäßen mikrobiologischen Analyse auf biochemischen Weg jeweils willkommen sind.
  • Nach einer bemerkenswerten Eigenschaft der Erfindung wird das betreffende Nachweis-/Identifizierungsmedium erhalten, indem wenigstens eine Substratstammlösung in dem Lösungsmittel S und ESAG- oder AG- oder einem ESAG/AG-Gemisch gemischt wird und diese Lösung zu wenigstens einem Teil der Bestandteile des Kulturmediums zugegeben wird.
  • Tatsächlich scheint es gemäß der Erfindung wichtig zu sein, das Esterase- und/oder Osidase- und/oder Peptidase- und/oder Sulfatase- und/oder Phosphatase-Substrat in dem Lösungsmittel S in Gegenwart von ESAG- oder AG- oder einem ESAG/AG-Gemisch, wie oben definiert, zu solubilisieren. Dieses Gemisch aus Substrat, ESAG, AG, ESAG/AG und Lösungsmittel S wird anschließend in wenigstens einem Teil des Kulturmediums, das vorzugsweise in unterkühltem gelförmigen Zustand vorliegt, zugegeben. Es wurde gefunden, dass diese Charakteristik der Vorgehensweise eine Optimierung der Ergebnisse ermöglicht, die vorteilhafterweise durch die erfindungsgemäßen Mittel hervorgerufen werden.
  • Bevorzugt ist der ESAG ausgewählt aus der Gruppe umfassend:
    • • Polyoxyethylen-Sorbitan-Monolaurat, welches 20 Ethylenoxid-Gruppen (OE) umfasst, – TWEEN® 20 –;
    • • Polyoxyethylen-Sorbitan-Monopalmitat (20 OE), – TWEEN® 40 –;
    • • Polyoxyethylen-Sorbitan-Monostearat (20 OE), – TWEEN® 60 –;
    • • Polyoxyethylen-Sorbitan-Tristearat (20 OE), – TWEEN® 65 –;
    • • Polyoxyethylen-Sorbitan-Monooleat (20 OE), – TWEEN® 80 –;
    • • Polyoxyethylen-Sorbitan-Sesquioleat (20 OE), – TWEEN® 83 –;
    • • Polyoxyethylen-Sorbitan-Trioleat (20 OE), – TWEEN® 85 –;
    • • und deren Gemische;
    und die AG ist ausgewählt aus der Gruppe, umfassend gesättigte oder ungesättigte Fettsäuren mit C4-C20, bevorzugt gesättigte oder ungesättigte Fettsäuren mit C6-C11 und weiter bevorzugt Fettsäuren mit C8-C9 und deren Gemische.
  • Die gemäß der Erfindung insbesondere ausgewählten Produkte sind Ester von Sorbitansäure, die in der Nahrungsmittelindustrie und der kosmetischen Industrie als nicht-ionische oberflächenaktive Mittel weithin verwendet werden, die aber bislang nicht in mikrobiologischen Nachweis-/Identifizierungsmedien als Stabilisatoren für Esterase- und/oder Osidase- und/oder Peptidase- und/oder Sulfatase- und/oder Phosphatase-Substrate verwendet worden sind.
  • Die "Hydrophil-Lipophil-Gleichgewichte" (HLD) der oben genannten ESAG betragen jeweils: 8,6; 6,7; 4,7; 2,1; 4,3; 3,7; 1,8.
  • Gemäß einer interessanten Variante der Erfindung können das oder die oben beschriebenen emulgierenden Stabilisierungsmittel, insbesondere der oder die ESAG mit wenigstens einem synergistischen Co-Agens, vorzugsweise mit wenigstens einem anionischen oberflächenaktiven Mittel, bevorzugt 7-Ethyl-2-methyl-4-undecyl-hydrogensulfat oder dessen Salzen und insbesondere dessen Natriumsalzen (TERGITOL-4®) assoziiert sein.
  • Die Verwendung eines solchen synergistischen Co-Agens erleichtert das Anzeigen der enzymatischen Aktivität in den Zielbakterien. Es handelt sich um eine hervorragende Ergänzung des oder der emulgierenden Stabilisierungsmittel. Dadurch wird eine Verbesserung der Selektivität des Nachweises von Esterase- und/oder Osidase- und/oder Peptidase- und/oder Sulfatase- und oder Phosphatase-Aktivitäten der Zielmikroorganismen ermöglicht, ohne die Expression anderer enzymatischer Aktivitäten zu beeinträchtigen, die möglicherweise zum Anzeigen der betreffenden Zielmikroorganismen verwendet werden können. Ohne an eine Theorie gebunden sein zu wollen, wird angenommen, dass das synergistische Co-Agens TERGITOL-4® eine Wirkung besitzt, die das Durchdringen der chromogenen oder fluorogenen Esterase- und/oder Osidase- und/oder Peptidase- und/oder Sulfatase- und/oder Phosphatase-Substrate oder die Exkretion der Enzyme durch die Membranen der Zellen der Zielmikroorganismen begünstigt, so dass die Zugänglichkeit dieser Substrate gegenüber den Enzymen, deren Aktivität untersucht wird, optimiert wird. Dadurch wird es ermöglicht, die Menge der verwendeten Substrate zu verringern, was zu einem gewissen ökonomischen Vorteil führt.
  • Noch weiter bevorzugt scheint die Kombination aus TWEEN® und TERGITOL-4® in dem erfindungsgemäßen Medium zum Nachweisen/Identifizieren besonders leistungsfähig zu sein.
  • Das chromogene oder fluorogene Substrat, das aus einem Zielteil für das Enzym und einem chromophoren oder fluorophoren Teil gebildet ist, ist vorteilhafterweise ausgewählt aus den Substraten, deren Zielteil ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend insbesondere:
    • • Glycoside, die aus Mono-, Di- und/oder Polysacchariden gebildet sind, die in der α- oder β-Position an die Hydroxylfunktion des chromophoren oder fluorophoren Teils gebunden sind;
    • • α-Aminosäuren oder Peptide;
    • • organische Säuren wie beispielsweise -O-CO(CH2)n-CH3, mit n zwischen einschließlich 0 und 20;
    • • ein Sulfat, ein Phosphat, ein Pyrosulfat, ein Pyrophosphat oder einen Phosphodiester;
    und wobei der chromophore oder fluorophore Teil ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend insbesondere:
    • • Chinone/Anthrachinone und Derivate, insbesondere Dihydroxyanthrachinon (Alizarin);
    • • Amino- oder Hydroxy-Cumarine und Derivate;
    • • Fluoreszeine und Derivate;
    • • Indoxyle und Derivate.
  • Als Beispiele für Esterase-Substrate können die von Indol abgeleiteten chromogenen Ester-Substrate genannt werden und insbesondere 5-Brom-3-indolyl-nonanoat, 6-Chlor-3-indolyl-nonanoat oder 5-Brom-3-indolyl-decanoat.
  • Als Beispiele für chromogene Esterase-Substrate, die von Anthrachinon abgeleitet sind, kann 2-Alizerin-octanoat genannt werden.
  • Beispiele für Osidase-Substrate sind chromogene Osidase-Substrate, die von Indol abgeleitet sind und insbesondere 6-Chlor-3-indolyl-β-galactosid, 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-N-acetylglucosaminid, 5-Brom-6-chlor-α-glucosid.
  • Als Beispiel für chromogene Osidase-Substrate, die von Anthrachinon abgleitet sind, kann 2-Alizerin-β-glucuronid genannt werden.
  • Als fluorogene Osidase-Substrate können die von Hydroxycumarin abgeleiteten Substrate genannt werden, und insbesondere 4-Methylumbelliferon-β-glucosid.
  • Als chromogene Peptidase-Substrate können die von Indol abgeleiteten Substrate genannt werden.
  • Fluorogene Peptidase-Substrate sind insbesondere die Substrate, die von Hydroxycumarin abgeleitet sind, wie beispielsweise Alanyl-aminomethylcumarin.
  • Als Sulfatase-Substrate können chromogene Substrate genannt werden, die von Indol abgeleitet sind, insbesondere 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-sulfat. Fluorogene Sulfatase-Substrate sind beispielsweise 4-Methylumbelliferon-sulfat.
  • Ebenso können unter den Phosphatase-Substraten chromogene Substrate genannt werden, die von Indol abgeleitet sind, wie beispielsweise 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-phosphat. Ein fluorogenes Phosphatase-Substrat ist beispielsweise 4-Methylumbelliferon- phosphat.
  • Das Lösungsmittel S ist ein Hilfsmittel zur Solubilisierung eines Enzymsubstrats von Interesse, insbesondere eines chromogenen Substrats. Es ergänzt außerdem die Wirkung des emulgierenden Stabilisierungsmittels ESAG, AG oder ESAG/AG. Es stellt also vorzugsweise einen Bestandteil des erfindungsgemäßen Mediums dar.
  • Nach einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung ist das Lösungsmittel S ausgewählt aus der Gruppe umfassend:
    • • Alkohole, vorzugsweise Methanol, Ethanol, Methoxyethanol;
    • • Amide, vorzugsweise Dimethylformamid (DMF);
    • • schwefelhaltige Lösungsmittel, vorzugsweise Dimethylsulfoxid (DMSO);
    • • wässrige Lösungsmittel, vorzugsweise Wasser, gepuffertes Wasser;
    • • und deren Gemische.
  • Die in der Praxis bevorzugt verwendeten Lösungsmittel sind Methanol, DMF und DMSO.
  • Im Hinblick auf das Gewichtsverhältnis wurde gefunden, dass es erfindungsgemäß besonders vorteilhaft ist, wenn das Verhältnis von Fettsäuresorbitanester(n) (ESAG): Lösungsmittel (S) zwischen einschließlich 20:80 und 80:20 liegt, vorzugsweise zwischen einschließlich 30:70 und 70:30 und noch weiter bevorzugt 40:60 oder 60:40 entspricht.
  • Die verwendeten Mengen des homogenen oder fluorogenen Substrats sind derart, dass seine Konzentration in dem Medium wie folgt definiert ist (in mg/l):
    1 ≤ [Substrat] ≤ 2000,
    bevorzugt 5 ≤ [Substrat] ≤ 1500,
    und noch weiter bevorzugt 25 ≤ [Substrat] ≤ 1000.
  • Die verwendeten Mengen des Substrats in der Lösung aus ESAG und Lösungsmittel (S) sind derart, dass seine Konzentration in dem Medium wie folgt definiert ist (in g/l):
    0,5 ≤ [Substrat in der Stammlösung] ≤ 2000,
    bevorzugt 1 ≤ [Substrat in der Stammlösung] ≤ 1000,
    und noch weiter bevorzugt 2 ≤ [Substrat in der Stammlösung] ≤ 200.
  • Im Hinblick auf das in dem Nachweis-/Identifizierungsmedium vorhandene Kulturmedium kann dieses so präzisiert werden, dass es ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend:
    • • Selektionsmedien vom Typ: Mac Conkey, Columbia ANC, PALCAM, Sabouraud Gentamycin-Chloramphenicol, vorzugsweise Mac Conkey Medium,
    • • nicht-selektive Medien vom Typ Columbia +/– Blut, Trypcase Soja, Nähr-Gelose, Sabouraud, vorzugsweise Columbia Medium.
  • In der Praxis wird ein Fachmann das Kulturmedium in Abhängigkeit von den Zielbakterien nach gut bekannten Kriterien, mit denen ein Fachmann vertraut ist, auswählen.
  • Ohne dass dies eine Einschränkung bedeutet wurde gefunden, dass das erfindungsgemäße Medium besonders geeignet ist für den Nachweis/die Identifizierung von Mikroorganismen von medizinischem oder industriellem Interesse, insbesondere von Mikroorganismen der Gattung Salmonella, Pseudomonas, Listeria, Staphylococcus, Enterococcus oder Candida.
  • Für den Nachweis von Bakterien der Gattung Salmonella wird beispielsweise Mac Conkey-Medium als Kulturmedium ausgewählt werden.
  • Darüber hinaus kann das erfindungsgemäße Medium gegebenenfalls weitere Additive enthalten wie beispielsweise: ein oder mehrere andere Enzymsubstrate, z.B. chromogene oder fluorogene Enzymsubstrate, Peptone, ein oder mehrere Wachstumsfaktoren, Kohlenhydrate, ein oder mehrere selektive Mittel, Puffer und ein oder mehrere Geliermittel.
  • Das erfindungsgemäße Medium liegt in flüssiger Form oder in Gelform in verwendungsbereitem Zustand vor, d.h. bereit für die Inokulation in einer Röhre, einem Kolben oder auf Petrischalen.
  • Das erfindungsgemäße Medium kann in seinen Behältern für mehrere Wochen bei 4 °C in flüssiger Form oder in Gelform gelagert werden.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ferner ein Verfahren zum Erhalten eines wie oben definierten Mediums, dadurch gekennzeichnet, dass es insbesondere daraus besteht:
    • • wenigstens eine Stammlösung von chromogenen oder fluorogenen Esterase- und/oder Osidase- und/oder Peptidase- und/oder Sulfatase- und/oder Phosphatase-Substraten in dem Lösungsmittel S und wenigstens einem ESAG, einer AG oder einem ESAG/AG herzustellen,
    • • diese Lösung und gegebenenfalls weitere Zusatzstoffe zu dem Kulturmedium zuzugeben, und
    • • das Ganze zu homogenisieren.
  • Die Herstellung der Stammlösung erfolgt separat durch sukzessive Zugabe des Substrats, des Lösungsmittels S und des ESAG, der AG oder des ESAG/AG-Gemischs, die gegebenenfalls Co-Additive enthalten. Die verwendeten Produkte und Mengen sind wie oben definiert.
  • Nach der Homogenisierung wird die Stammlösung zu dem unterkühlten gelförmigen Kulturmedium, das zuvor in Wasser regeneriert wurde, hinzugefügt. Das Medium kann auch ein nicht-gelförmiges flüssiges Medium, beispielsweise eine Nährbrühe sein.
  • Nach dem Vermischen des Kulturmediums und der Stammlösung wird ein flüssiges oder gelförmiges Nachweismedium erhalten, das bereit für die Inokulation ist.
  • Gemäß noch einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ferner ein Verfahren zum Nachweisen/Identifizieren von Stämmen mit Esterase- und/oder Osidase- und/oder Peptidase- und/oder Sulfatase- und/oder Phosphatase-Aktivität, welches darin besteht:
    • • das oben definierte Nachweis-/Identifizierungsmedium per se oder so wie es durch das ebenfalls oben beschriebene Verfahren erhalten wird mit den zu analysierenden Bakterien zu beimpfen,
    • • das beimpfte Medium unter geeigneten Bedingungen zu inkubieren, die dem Fachmann bekannt sind
    • • und die Färbungen oder Fluoreszenzen der Kolonien, die sich nach der Inkubation entwickelt haben, beispielsweise in einem Ofen bei 37 °C zu lesen/interpretieren, wobei diese Färbungen die Hydrolyse des chromogenen oder fluorogenen Esterase- und/oder Osidase- und/oder Peptidase- und/oder Sulfatase- und/oder Phosphatase-Substrats durch die Zielbakterien anzeigen.
  • Schließlich betrifft die Erfindung ferner die Verwendung von Sorbitanfettsäureester(n) (ESAG), von Fettsäuren (AG) oder von einem ESAG/AG-Gemisch als emulgierendes Stabilisierungsmittel für ein (flüssiges oder gelförmiges) Medium zum Nachweisen/Identifizieren von Mikroorganismen, insbesondere von Bakterien oder Hefen, mit enzymatischer Aktivität, die ausgewählt ist aus Esterase- und/oder Osidase- und/oder Peptidase- und/oder Sulfatase- und/oder Phosphatase-Aktivitäten, wobei dieses Medium insbesondere ein Reaktionsmedium und wenigstens ein chromogenes oder fluorogenes Esterase- und/oder Osidase- und/oder Peptidase- und/oder Sulfatase- und/oder Phosphatase-Substrat umfasst, wobei Substrate ausgenommen sind, die ein Carboxylat von 4-[2-(4-Octanoyloxy-3,5-dimethoxyphenyl)-vinyl-]quinolinium-1-(propan-3-yl) und ein Anion umfassen, gegebenenfalls zusammen mit wenigstens einem Lösungsmittel für das in dem Medium vorhandene chromogene oder fluorogene Esterase- und/oder Osidase- und/oder Peptidase- und/oder Sulfatase- und/oder Phosphatase-Substrat.
  • Die folgenden Beispiele ermöglichen ein besseres Verständnis der Erfindung und sie ermöglichen es, alle Vorteile der Erfindung sowie ihre verschiedenen Ausführungsformen und Durchführungsvarianten zu erkennen.
  • BEISPIELE
  • Beispiel 1: Untersuchung der Löslichkeit eines Esterase-Substrats auf Grundlage von Indoxyl, 5-Brom-3-indolyl-nonaoat (chromogenes Esterase-Substrat) in einem gelförmigen Medium
  • Unterschiedliche Stammlösungen des Substrats werden in Methanol in Gegenwart von Nr. 3-Gallensalzen (bioMérieux) hergestellt. Anschließend werden unterschiedliche Volumina dieser Lösungen zu einem unterkühlten gelförmigen Medium, Mac Conkey-Medium (regeneriert in Wasser mit einer Konzentration von 50 g/l), zugegeben.
  • Das Protokoll und die Beobachtung der Erscheinungsform des Mediums sind in der folgenden Tabelle 1 wiedergegeben.
  • TABELLE 1
    Figure 00170001
  • Optisch am homogensten sind die Medien 3, 4 und 5: die Medien, in denen die Methanolkonzentration am höchsten ist. Allerdings besitzen diese Medien ein "milchiges" Erscheinungsbild: scheinbar liegt also das Esterase-Substrat in Form einer Emulsion vor.
  • Beispiel 2: Verbesserung der Solubilisierung des Esterase-Substrats durch Zugabe von TWEEN® 20 (ESAG)
  • Zwei unterschiedliche Substrat-Stammlösungen werden in Methanol als Lösungsmittel S hergestellt, wobei eine der Lösungen in Gegenwart von Gallensalzen Nr. 3 und die andere in Gegenwart von Gallensalzen Nr. 3 und TWEEN® 20 [Polyoxyethylen-Sorbitan-Monolaurat, welches 20 Ethylenoxid-Gruppen (EO) umfasst] hergestellt. Anschließend wird ein Volumen, das einer Endkonzentration des Substrats von 500 mg/l entspricht, zu einem unterkühlten gelförmigen Kulturmedium, nämlich Mac Conkey-Medium, zugegeben. Das Protokoll und die Beobachtung der Erscheinungsform dieser Medien sind in der folgenden Tabelle 2 wiedergegeben.
  • TABELLE 2
    Figure 00180001
  • Das Medium 2 weist eine bessere optische Homogenität auf, als das Medium 1. Das Esterase-Substrat ist entweder vollständig aufgelöst oder es liegt in Form einer Emulsion vor, deren mizelläre Partikel für das Auge nicht sichtbar sind.
  • Beispiel 3: Biologische Untersuchung der beiden in dem vorigen Beispiel beschriebenen Medien
  • Mikroorganismen aus der Sammlung der Anmelderin wurden auf jedes der beiden zuvor beschriebenen Mediums geimpft, aus einer 0,5 McFarland-Suspension, durch Unterteilung in drei Bereiche. Die Schalen wurden bei 37 °C für 48 Stunden inkubiert. Die gebildeten Kolonien wurden nach 24 und 48 Stunden der Inkubation visuell untersucht. Die Färbung dieser Kolonien und die Intensität dieser Färbung wurden notiert. Die Ergebnisse sind unten in Tabelle 3 gezeigt.
  • TABELLE 3
    Figure 00180002
  • Figure 00190001
  • Das Medium, das TWEEN® 20 enthält, ermöglicht es also, intensivere Färbungen für die Stämme von Mikroorganismen mit Esterase-Aktivität zu erhalten. Das Substrat wird daher häufiger verwendet, entweder wegen der besseren Löslichkeit oder weil es leichter verfügbar ist. Angesichts der Unterschiede in der Intensität zwischen den beiden Medien scheint es möglich, in Gegenwart von TWEEN® 20 die verwendete Substratkonzentration zu verringern und somit die durch die Verwendung dieser Art von Substrat verursachten Kosten zu verringern.
  • Beispiel 4: Untersuchung dieser Art der Auflösung für ein anderes Indoxyl-Derivat (chromogenes Esterase-Substrat) an grampositiven und gramnegativen Bakterienspezies und an Hefen
  • Eine Stammlösung mit 40 g/l an 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-octanoat (chromogenes Esterase-Substrat) wurde in einem Gemisch aus Methanol (40 %) und TWEEN® 20 (60 %) hergestellt. Anschließend wurde ein Volumen, das einer Endkonzentration von 500 g/ml an Substrat entspricht, zu einem unterkühlten gelförmigen Medium, einem Medium vom Typ Columbia, zugegeben. Dieses Medium wurde in Petrischalen gegeben.
  • Mikroorganismen aus der Sammlung der Anmelderin wurden auf jedes der beiden zuvor beschriebenen Mediums geimpft, aus einer 0,5 McFarland-Suspension, durch Unterteilung in drei Bereiche. Die Schalen wurden anschließend bei 37 °C für 48 Stunden inkubiert. Die gebildeten Kolonien wurden nach 24 und 48 Stunden der Inkubation visuell untersucht. Die Färbung dieser Kolonien und die Intensität dieser Färbung wurden notiert. Die Ergebnisse sind unten in Tabelle 4 gezeigt.
  • Tabelle 4
    Figure 00200001
  • In Gegenwart von TWEEN 20 ist es daher möglich, die Expression einer Esterase-Aktivität in allen Mikroorganismen, die diese aufweisen unabhängig von der Gruppe, zu der sie gehören, anzuzeigen. Außerdem ist diese Art der Verwendung unabhängig von dem untersuchten Indoxylderivat (chromogenen Esterase-Substrat).
  • Beispiel 5: Ersetzen von Methanol durch andere Lösungsmittel in Gegenwart von TWEEN 20 und in Abwesenheit oder Gegenwart von Gallensalzen
  • Das in den vorigen Beispielen verwendete Methanol wird durch zwei andere Lösungsmittel, nämlich Dimethylsulfoxid (DMSO) und Dimethylformamid (DMF) ersetzt. Die drei Lösungsmittel wurden in Gegenwart von Tween 20 und in Gegenwart oder Abwesenheit von Gallensalzen in einer Endkonzentration von 6,5 g/l in dem Medium untersucht. Die folgende Tabelle 5 zeigt die Zusammensetzung der sechs untersuchten Medien.
  • TABELLE 5
    Figure 00210001
  • Die Aktivität des Substrats wurde auf dieselbe Weise wie in dem vorherigen Beispiel überprüft, d.h. in Gegenwart von Mikroorganismen, die auf dem gelförmigen Mac Conkey-Medium geimpft waren, welches das obige Esterase-Substrat, gelöst in einem der zuvor genannten Lösungsmittel, enthält. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 6 gezeigt.
  • TABELLE 6
    Figure 00210002
  • Es ist also möglich, unterschiedliche Lösungsmittel zu verwenden, um das Esterase-Substrat aufzulösen, wenn TWEEN 20 vorhanden ist. Außerdem ergibt sich durch die Zugabe von Gallensalzen kein Unterschied, weder hinsichtlich der Löslichkeit noch hinsichtlich der biologischen Ergebnisse, unabhängig von dem untersuchten Lösungsmittel. Daraus kann geschlossen werden, dass die einfachste Art der Auflösung das Gemisch aus einem Lösungsmittel und TWEEN® 20 ohne zusätzliche Zugabe von Gallensalzen ist.
  • Beispiel 6: Untersuchung verschiedener Verhältnisse von Lösungsmittel S zu TWEEN 20
  • Unterschiedliche Substratstammlösungen wurden in DMSO in Gegenwart von TWEEN® 20 hergestellt. Jede Stammlösung entspricht einem anderen Verhältnis von DMSO zu TWEEN® 20. Ein Volumen entsprechend einer Endkonzentration von 500 mg/l an Substrat wird anschließend zu einem unterkühltem gelförmigen Medium, nämlich Mac Conkey-Medium, zugegeben. Die folgende Tabelle 7 zeigt die Zusammensetzung der sechs untersuchten Medien.
  • TABELLE 7
    Figure 00220001
  • Mikroorganismen aus der Sammlung der Anmelderin wurden auf jedes der sechs zuvor beschriebenen Medien durch Unterteilung in drei Bereiche geimpft, ausgehend von einer Suspension von 0,5 McFarland. Die Schalen wurden bei 37 °C für 48 Stunden inkubiert. Die gebildeten Kolonien wurden nach 24 und 48 Stunden der Inkubation visuell untersucht. Die Färbung dieser Kolonie und die Intensität dieser Färbung wurden notiert. Die Ergebnisse sind unten in der folgenden Tabelle 8 gezeigt.
  • TABELLE 8
    Figure 00230001
  • Die sechs untersuchten Verhältnisse ermöglichen es, eine gute Löslichkeit der Substrate zu erhalten und die Hydrolyse des Substrats mit sehr guten Färbungsintensitäten anzuzeigen. Maximale Intensitäten der Färbung bei den Verhältnissen 40 % DMSO/60 % TWEEN® 20 und 60 % DMSO/40 % TWEEN® 20 erhalten.
  • Beispiel 7: Untersuchung eines Solubilisierungsverfahrens an einem Esterase-Substrat mit einer anderen Markierungsgruppe als Indoxyl
  • Bei dem untersuchten Substrat handelt es sich um 1,2-Dihydroxy-anthrachinon-octanoat (2-Alizarin-octanoat). Unterschiedliche Substratstammlösungen wurden hergestellt, wobei als Lösungsmittel DMS oder DMSO oder Methanol oder Methoxyethanol verwendet wurde, jeweils in Gegenwart von TWEEN® 20. Die folgende Tabelle 9 zeigt das Erscheinungsbild der Stammlösungen in Abhängigkeit von ihrer Zusammensetzung.
  • TABELLE 9
    Figure 00240001
  • Anschließend wird ein Volumen entsprechend einer Endkonzentration von 100 mg/l an Substrat zu dem unterkühlten gelförmigen Medium, nämlich Mac Conkey-Medium, zugegeben. Eisencitrat mit einer Endkonzentration von 50 mg/l wurde ebenfalls zu dem Medium zugegeben, so dass die Esterase-Aktivität in Gegenwart eines Substrats auf Alizarin-Basis angezeigt werden konnte. Nur eine der Stammlösungen, die eine vollständige Auflösung des Substrats zeigte, wurde untersucht (Stammlösung in DMF). Mikroorganismen aus der Sammlung der Anmelderin wurden auf jedes der sechs zuvor beschriebenen Medien geimpft, durch Unterteilung in drei Bereiche, ausgehend von einer Suspension von 0,5 McFarland. Die Schalen wurden bei 37 °C für 48 Stunden inkubiert. Die gebildeten Kolonien wurden nach 24 und 48 Stunden Inkubation visuell untersucht. Die Färbung dieser Kolonien und die Intensität dieser Färbung wurden notiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 gezeigt.
  • TABELLE 10
    Figure 00240002
  • Figure 00250001
  • Diese Art der Auflösung ist also nicht-spezifisch für Indoxylester, sondern sie kann insbesondere bei anderen Familien von Enzymsubstraten verwendet werden.
  • Beispiel 8: Untersuchung unterschiedlicher von TWEEN® 20 abgeleiteter ESAG auf die Solubilisierung des Esterase-Substrats 5-Brom-3-indolyl-nonanoat
  • Verschiedene Substratstammlösungen wurden in DMSO in Gegenwart von TWEEN® 20 oder TWEEN® 80 (Polyoxyethylen-Sorbitan-Monooleat) oder TWEEN® 60 (Polyoxyethylen-Sorbitan-Monostearat) oder TWEEN® 65 (Polyoxyethylen-Sorbitan-Tristearat) hergestellt. Anschließend wurde ein Volumen entsprechend einer Endkonzentration von 500 mg/l an Substrat zu einem unterkühlten gelförmigen Medium, nämlich Mac Conkey-Medium, zugegeben. Tabelle 11 zeigt die Zusammensetzung der untersuchten Medien.
  • TABELLE 11
    Figure 00250002
  • Figure 00260001
  • Mikroorganismen aus der Sammlung der Anmelderin wurden auf jedes der sechs zuvor beschriebenen Medien geimpft, durch Unterteilung in drei Bereiche, ausgehend von einer Suspension von 0,5 McFarland. Die Schalen wurden bei 37 °C für 48 Stunden inkubiert. Die gebildeten Kolonien wurden nach 24 und 48 Stunden Inkubation visuell untersucht. Die Färbung dieser Kolonien und die Intensität dieser Färbung wurden notiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 gezeigt.
  • TABELLE 12
    Figure 00260002
  • Anmerkung: Verschiedene Verhältnisse von TWEEN® zu Lösungsmittel wurden für jedes untersuchte TWEEN® hergestellt. Es ist jedoch nur eines der Verhältnisse in diesem Beispiel aufgelistet, da die Ergebnisse unabhängig von dem untersuchten Verhältnis sehr ähnlich waren.
  • TWEEN® 20, TWEEN® 80 und TWEEN® 60 ermöglichen es, eine gute Substratlöslichkeit zu erhalten und die Hydrolyse des Substrats mit sehr guten Färbungsintensitäten anzuzeigen.
  • Beispiel 9: Vergleich der Stabilität von gelförmigen Medien die das Esterase-Substrat 5-Brom-3-indolyl-nonanoat enthalten solubilisiert oder nicht-solubilisiert in Gegenwart von TWEEN® 20
  • Zwei Substratstammlösungen wurden hergestellt: Eine mit einer Konzentration von 40 g/l in Methanol in Gegenwart von 6,5 g/l an Gallensalzen Nr. 3 und die andere mit einer Konzentration von 40 g/l in einem Gemisch aus DMSO (40%) und TWEEN® 20 (60 %). Ein Volumen entsprechend einer Endkonzentration von 500 mg/l an Substrat wurde anschließend zu einem unterkühlten gelförmigen Medium, dem Mac Conkey-Medium zugegeben. Diese beiden Medien wurden in Petrischalen mit einem Durchmesser von 90 mm geschüttet und bei 4 °C für 8 Wochen aufbewahrt. Nach einer Woche, zwei Wochen, vier Wochen und 8 Wochen wurden zwei Medien, wie zuvor beschrieben, für die sofortige Verwendung hergestellt.
  • Mikroorganismen aus der Sammlung der Anmelderin wurden durch Unterteilung in drei Bereiche, aus einer Suspension von 0,5 McFarland auf die beiden für die sofortige Verwendung hergestellten Medien und auf die beiden bei + 4 °C gelagerten Medien geimpft. Die Schalen wurden bei 37 °C für 48 Stunden inkubiert. Die gebildeten Kolonien wurden nach 24 und 48 Stunden Inkubation visuell untersucht. Die Färbung dieser Kolonien und die Intensität dieser Färbung wurden notiert. Die Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen dargestellt.
  • TABELLE 13
    Figure 00280001
  • TABELLE 14
    Figure 00290001
  • TABELLE 15
    Figure 00300001
  • TABELLE 16
    Figure 00310001
  • Das Medium, welches das Substrat gelöst in einem Gemisch aus Methanol und Gallensalzen enthält, zeigt einen sehr starken Abfall der Expression an Esterase-Aktivität nach Lagerung für zwei Wochen. Dieser Abfall verstärkt sich mit der Zeit. Das Medium, welches das Substrat gelöst in einem Gemisch aus DMSO und TWEEN 20 enthält, zeigt eine konstante Expression der Esterase-Aktivität über einen Zeitraum von wenigstens sechs Wochen. Nach acht Wochen erfolgt ein leichter Abfall der Expression der Esterase-Aktivität, der aber nicht zu ihrer Unterbindung führt. TWEEN 20 ermöglicht es also, das Esterase-Substrat zu stabilisieren und die Lagerung und Verwendung von Kulturmedium, welches diese Art von Substrat enthält, wird vereinfacht.
  • Anmerkung: In obigen Beispielen entsprechen die Nummern, die den Stämmen angehängt sind, der Referenznummer jedes Stamms in der Sammlung der Anmelderin. Die Färbungsintensität entspricht einer willkürlichen Skala, die wie folgt definiert ist:
    • 0 keine Aktivität
    • 0,1 Spuren von Färbung
    • 0,5 sehr schwache Färbung
    • 1 deutliche Färbung mit schwacher Intensität
    • 2 klare Färbung mit mittlerer Intensität
    • 3 intensive Färbung
    • 4 sehr intensive Färbung
  • Beispiel 10: Vergleich der Stabilität von gelförmigen Medien die das Osidase-Substrat 6-Chlor-3-indolyl-β-N-acetylglucosaminid enthalten solubilisiert oder nicht-solubilisiert in Gegenwart von TWEEN® 20
  • Zwei Substratstammlösungen wurden hergestellt: Eine mit einer Konzentration von 50 g/l in DMF und die andere mit einer Konzentration von 50 g/l in einem Gemisch aus DMF (40 %) und TWEEN® 20 (60 %). Anschließend wurde ein Volumen entsprechend einer Endkonzentration von 175 mg/l an Substrat zu einem unterkühlten gelförmigen Medium, dem Columbia-Medium ohne Blut, zugegeben. Diese beiden Medien wurden in Petrischalen mit einem Durchmesser von 90 mm geschüttet und bei + 4 °C für 8 Wochen gelagert. Nach drei Wochen, sechs Wochen, neuen Wochen und zwölf Wochen wurden zwei Medien, wie oben beschrieben, für die sofortige Verwendung hergestellt.
  • Mikroorganismen aus der Sammlung der Anmelderin wurden durch Unterteilung in drei Bereiche, ausgehend von einer Suspension von 0,5 McFarland, auf die beiden für die sofortige Verwendung hergestellten Medien und auf die beiden bei +4 °C gelagerten Medien geimpft. Die Schalen wurden bei 37 °C für 48 Stunden inkubiert. Die gebildeten Kolonien wurden nach 24 und 48 Stunden Inkubation visuell untersucht. Die Färbung dieser Kolonien und die Intensität dieser Färbung wurden notiert. Die Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen dargestellt.
  • TABELLE 17
    Figure 00330001
  • TABELLE 18
    Figure 00330002
  • Figure 00340001
  • TABELLE 19
    Figure 00340002
  • TABELLE 20
    Figure 00350001
  • Das Medium, welches das Substrat nur in DMF gelöst enthält, zeigt einen sehr starken Abfall der Expression der β-N-Acetyl-glucosaminidase-Aktivität nach drei Wochen der Beobachtung. Dieser Abfall verstärkt sich mit der Zeit. Nach zwölf Wochen ist es nicht mehr möglich, eine Aktivität nachzuweisen. Das Medium, welches das Substrat gelöst in dem Gemisch aus DMF und TWEEN 20 enthält, zeigt eine konstante Expression der β-N-Acetyl-glucosaminidase-Aktivität über einen Zeitverlauf von wenigstens sechs Wochen. Nach neun und zwölf Wochen erfolgt ein leichter Abfall der Expression der β-N-Acetyl-glucosaminidase-Aktivität, der jedoch nicht zu einer Unterbindung der Aktivität führt. Das TWEEN 20 ermöglicht somit eine Stabilisierung des Substrats β-N-Acetyl-glucosaminidase und die Lagerung und Verwendung des Kulturmediums, das diese Art von Substraten enthält, wird vereinfacht.
  • In obigen Beispielen entsprechen die Nummern, die den Stämmen angehängt sind, der Referenznummer des jeweiligen Stamms in der Sammlung der Anmelderin. Die Färbungsintensität entspricht einer willkürlichen Skala, die wie folgt definiert ist:
    • 0 keine Aktivität
    • 0,1 Spuren von Färbung
    • 0,5 sehr schwache Färbung
    • 1 deutliche Färbung mit schwacher Intensität
    • 2 klare Färbung mit mittlerer Intensität
    • 3 intensive Färbung
    • 4 sehr intensive Färbung

Claims (14)

  1. Medium zum Nachweisen/Identifizieren von Mikroorganismen und insbesondere von Bakterien und/oder Hefen mit enzymatischer Aktivität, ausgewählt aus Esterase- und/oder Osidase- und/oder Peptidase- und/oder Sulfatase- und/oder Phosphatase-Aktivität, welches insbesondere ein Reaktionsmedium und wenigstens ein chromogenes oder fluorogenes Esterase-, Osidase- und/oder Peptidase- und/oder Sulfatase- und/oder Phosphatase-Substrat umfasst, wobei Substrate ausgenommen sind, die ein Kation von 4-[2-(4-Oktanoyloxy-3,5-dimethoxyphenyl)-vinyl]chinolinium-1-(propan-3-yl-carbonsäure) und ein Anion umfassen, wobei dieses Nachweisen/Identifizieren im Wesentlichen darauf beruht, die Esterase- und/oder Osidase- und/oder Peptidase- und/oder Sulfatase- und/oder Phosphatase-Aktivität aufzuzeigen, wobei das Medium • in gebrauchsfertiger und lagerungsbeständiger flüssiger Form oder Gelform vorliegt, d.h. die Intensität der Färbung oder der Fluoreszenz wird für wenigstens mehrere Wochen auf einem Maximalwert gehalten, • umfasst: – wenigstens einen Fettsäuresorbitanester (ESAG) oder wenigstens eine Fettsäure (AG) oder ein ESAG/AG-Gemisch als emulgierendes Stabilisierungsmittel, – die Konzentration an [ESAG] in dem Medium ist wie folgt definiert (in Gew.-%): 0,5 ≤ [ESAG] ≤ 5, vorzugsweise 1,5 ≤ [ESAG] ≤ 3,5; – und gegebenenfalls wenigstens ein Lösungsmittel (S).
  2. Medium nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es durch Vermischen von wenigstens einer Substrat-Stammlösung in dem Lösungsmittel S und von ESAG, AG oder ESAG/AG-Gemisch mit wenigstens einem Teil der Bestandteile des Kulturmediums erhalten wird.
  3. Medium nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der ESAG ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend: • Polyoxyethylen-Sorbitan-Monolaurat, welches 20 Ethylenoxid-Gruppen (EO) umfasst, – TWEEN® 20 –; • Polyoxyethylen-Sorbitan-Monopalmitat (20 EO), – TWEEN® 40 –; • Polyoxyethylen-Sorbitan-Monostearat (20 EO), – TWEEN® 60 –; • Polyoxyethylen-Sorbitan-Tristearat (20 EO), – TWEEN® 65 –; • Polyoxyethylen-Sorbitan-Monooleat (20 EO), – TWEEN® 80 –; • Polyoxyethylen-Sorbitan-Sesquioleat (20 EO), – TWEEN® 83 –; • Polyoxyethylen-Sorbitan-Trioleat (20 EO), – TWEEN® 85 –; • und deren Gemische.
  4. Medium nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die AG ausgewählt ist aus der Gruppe, umfassend gesättigte oder ungesättigte Fettsäuren mit C4-C20, bevorzugt gesättigte oder ungesättigte Fettsäuren mit C6-C11 und weiter bevorzugt Fettsäuren mit C8-C9 und deren Gemische.
  5. Medium nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass es weiter wenigstens ein anionisches oberflächenaktives Mittel umfasst, vorzugsweise 7-Ethyl-2-methyl-4-undekyl-hydrogensulfat oder dessen Salze und insbesondere dessen Natriumsalze (TERGITOL-4®).
  6. Medium nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das chromogene oder fluorogene Substrat aus einem Ziel-Teil für das Enzym und einem chromophoren oder fluorophoren Teil gebildet ist, wobei der Ziel-Teil ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend insbesondere: – Glycoside, die aus Mono-, Di- und/oder Polysacchariden gebildet sind, die in der α- oder β-Position an die Hydroxylfunktion des chromophoren oder fluorophoren Teils gebunden sind; – α-Aminosäuren oder Peptide; – organische Säuren wie beispielsweise -O-CO(CH2)n-CH3, mit n zwischen einschließlich 0 und 20; – ein Sulfat, ein Phosphat, ein Pyrosulfat, ein Pyrophosphat oder einen Phosphodiester; wobei der chromophore oder fluorophore Teil ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend insbesondere: – Chinone/Anthrachinone und Derivate, insbesondere Dihydroxyanthrachinon (Alizarin); – Amino- oder Hydroxy-Cumarine und Derivate; – Fluoreszeine und Derivate; – Indoxyle und Derivate.
  7. Medium nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Lösungsmittel S ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend: – Alkohole, vorzugsweise Methanol, Ethanol, Methoxyethanol; – Amide, vorzugsweise Dimethylformamid (DMF); – schwefelhaltige Lösungsmittel, vorzugsweise Dimethylsulfoxid (DMSO); – wässrige Lösungsmittel, vorzugsweise Wasser, gepuffertes Wasser; – und deren Gemische.
  8. Medium nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Gewichtsverhältnis von Fettsäuresorbitanester(n) (ESAG) zu Lösungsmittel (S) zwischen einschließlich 20 : 80 und 80 : 20 liegt, vorzugsweise zwischen einschließlich 30 : 70 und 70 : 30 und noch weiter bevorzugt 40 : 60 oder 60 : 40 entspricht.
  9. Medium nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die [Substrat]-Konzentration in dem Medium wie folgt definiert ist (in mg/l): 1 ≤ [Substrat] ≤ 2000, bevorzugt 5 ≤ [Substrat] ≤ 1500, noch weiter bevorzugt 25 ≤ [Substrat] ≤ 1000.
  10. Medium nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Kulturmedium, welches darin enthalten ist, ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend: – Selektionsmedien vom Typ Mac Conkey, Columbia ANC, PALCAM, Sabouraud Gentamycin-Chloramphenicol, vorzugsweise Mac Coney Medium, – nicht-selektive Medien vom Typ Columbia +/– Blut, Trypcase Soja, Nähr-Gelose, Sabouraud, vorzugsweise Columbia Medium.
  11. Medium nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikroorganismen, die nachgewiesen/detektiert werden sollen, Mikroorganismen von medizinischem oder industriellem Interesse, und insbesondere von der Gattung Salmonella, Pseudomonas, Listeria, Staphylococcus, Enterococcus oder Candida sind.
  12. Verfahren zum Erhalten eines Mediums nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass es insbesondere daraus besteht: – wenigstens eine Substrat-Stammlösung von chromogenen oder fluorogenen Esterasen und/oder Osidasen und/oder Peptidasen und/oder Sulfatasen und/oder Phosphatasen in dem Lösungsmittel S und wenigstens einem ESAG, einer AG oder einem ESAG/AG herzustellen, – diese Lösung und gegebenenfalls weitere Zusatzstoffe zu dem Kulturmedium zuzugeben – und das Ganze zu homogenisieren.
  13. Verfahren zum Nachweisen/Identifizieren von Stämmen mit Esterase- und/oder Osidase- und/oder Peptidase- und/oder Sulfatase- und/oder Phosphatase-Aktivität, dadurch gekennzeichnet, dass es daraus besteht: – das Medium nach einem der Ansprüche 1 bis 11 oder das durch das Verfahren nach Anspruch 12 erhaltene Medium mit den zu analysierenden Bakterien zu beimpfen; – das beimpfte Medium unter geeigneten Bedingungen zu inkubieren, – und die Färbungen in der Umgebung der Kolonien zu lesen und zu interpretieren, wobei die Färbungen die Hydrolyse des Substrats durch die Bakterien anzeigen.
  14. Verwendung von Fettsäuresorbitanester(n) (ESAG), Fettsäure(n) (AG) oder ESAG/AG als emulgierendes Stabilisierungsmittel eines (flüssigen oder gelförmigen) Mediums zum Nachweisen/Identifizieren von Mikroorganismen, insbesondere Bakterien oder Hefen mit enzymatischer Aktivität, ausgewählt aus Esterase- und/oder Osidase- und/oder Peptidase- und/oder Sulfatase- und/oder Phosphatase-Aktivität, wobei dieses Medium insbesondere ein Kulturmedium und wenigstens ein chromogenes oder fluorogene Esterase- und/oder Osidase- und/oder Peptidase- und/oder Sulfatase- und/oder Phosphatase-Substrat umfasst, wobei Substrate ausgenommen sind, die ein Carboxylat von 4-[2-(4-Oktanoyloxy-3,5-dimethoxyphenyl)-vinyl]chinolinium-1-(propan-3-yl) und ein Anion umfassen, gegebenenfalls zusammen mit wenigstens einem Lösungsmittel S für das in dem Medium vorhandene chromogene oder fluorogene Esterase- und/oder Osidase- und/oder Peptidase- und/oder Sulfatase- und/oder Phosphatase-Substrat, wobei die [ESAG]-Konzentration in dem Medium wie folgt definiert ist (in Gew.-%): 0,5 ≤ [ESAG] ≤ 5, vorzugsweise 1,5 ≤ [ESAG] ≤ 3,5.
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