DE69831508T2

DE69831508T2 - Verfahren zur analyse intrazellulärer substanzen

Info

Publication number: DE69831508T2
Application number: DE69831508T
Authority: DE
Inventors: Noriaki Hattori; Keiko Yajitate; Motoo Nakajima; Seiji Murakami
Original assignee: Kikkoman Corp
Current assignee: Kikkoman Corp
Priority date: 1997-12-03
Filing date: 1998-12-01
Publication date: 2006-06-08
Anticipated expiration: 2018-12-02
Also published as: EP1048739A4; DE69831508D1; AU1263299A; WO1999028495A1; US6238857B1; EP1048739B1; JP3773151B2; EP1048739A1; JPH11155597A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und ein Reagenzien-Set zur Analyse einer intrazellulären Komponente.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
In den Bereichen Lebensmittelhygiene, Biologie, klinische Tests, Medizin, Umweltstudien und Studien von ultrareinem Wasser ist es üblich, eine intrazelluläre Komponente zu analysieren, die aus in einer Probe enthaltenen Zellen extrahiert ist.
Es gibt verschiedene Gründe zur Analyse der intrazellulären Komponente, z.B. zur Bestimmung der Gegenwart/Abwesenheit, des Gehalts und der Aktivität der intrazellulären Komponente, zur Amplifikation von Nucleinsäuren, zur Bestimmung von Mikroorganismen in einer Probe (z.B. Bestimmung der Gegenwart/Abwesenheit oder des Typs von Mikroorganismen und Zählen der Anzahl an lebenden Mikroben).
Es ist ein Verfahren zum Extrahieren der intrazellulären Komponente bekannt, worin zu einer Zellen enthaltenden Probe ein Reagens zum Extrahieren der intrazellulären Komponente (im weiteren Verlauf als "Extraktionsreagens" bezeichnet) zugesetzt wird. Beispiele für das Extraktionsreagens umfassen diejenigen, die als wirksame Komponente ein Detergens, Trichloressigsäure, ein lytisches Enzym, wie z.B. Lysozym, oder Ethanol enthalten.
Unter den oben angeführten Extraktionsreagenzien wird das Detergens enthaltende Reagens häufig verwendet. Gemäß einem Verfahren, worin das Extraktionsreagens, das ein Detergens als wirksame Komponente enthält, verwendet wird (im weiteren Verlauf als "Detergensverfahren" bezeichnet), umfassen Beispiele für das verwendete Detergens anionische Detergenzien (z.B. Natriumdodecylsulfat (SDS), Kaliumlaurylsulfat, Natriummonolauroylphosphat, Natriumalkylbenzolsulfonat), kationische Detergenzien (z.B. Benzalkoniumchlorid (BAC), Benzethoniumchlorid (BZC), Cetylpyridiniumchlorid, Cetyltrimethylammoniumbromid, Myristildimethylbezylammoniumchlo rid), ampholytische Detergenzien (z.B. Twittergent-Detergens 3–08, 3–10, 3–12, 3–14, 3–16, Tego) und nichtionische Detergenzien (z.B. Tween 20, 60, 80, Span 60, 80, Triton X-45, X-100, Polyoxyethylenether, Polyoxyethylenlaurylether).
Gemäß dem Detergensverfahren kommt es bei höheren Detergenskonzentrationen im Extraktionsreagens zu einer höheren Extraktionseffizienz der intrazellulären Komponente. Höhere Detergenskonzentrationen führen jedoch zu einer verschlechterten Analyseempfindlichkeit und -genauigkeit, da das Detergens die Analyse der intrazellulären Komponente hemmt.
Es ist ein Verfahren zur Messung von Mikroorganismen bekannt, worin eine intrazelluläre Komponente, Adenosintriphosphat (ATP), mittels eines Biolumineszenzverfahrens gemessen wird. Die ATP-Messung mittels Lumineszenzverfahren ist hinsichtlich einfacher Durchführbarkeit, kurzer Messzeit und hoher Empfindlichkeit sehr nützlich. Als Biolumineszenzverfahren wird im Allgemeinen das Luciferin-Luciferase-Lumineszenzreaktionsverfahren angewandt.
Wenn im Verfahren zur Bestimmung der Anzahl an Zellen mittels Luciferin-Luciferase-Lumineszenzreaktionsverfahren das Detergens zum Extrahieren von ATP verwendet wird, führen höhere Detergenskonzentrationen zu einer Erhöhung der Effizienz der ATP-Extraktion, wobei jedoch gleichzeitig die Analyseempfindlichkeit und -genauigkeit abnimmt, da es zu einer Hemmung der Lumineszenzreaktion kommt. Es wird angenommen, dass dies durch die Deaktivierung des Enzyms Luciferase nach Kontakt mit dem Detergens verursacht wird, was zu einer raschen Abnahme der Lumineszenz führt. Andererseits kann eine geringere Detergenskonzentration die Hemmung der Lumineszenzreaktion verringern, wobei es dabei zu einer unzureichenden ATP-Extraktionseffizienz kommt.
Intrazelluläres ATP kann durch Zugabe eines Extraktionsreagens zu einer Zellen enthaltenden Probe extrahiert werden. Üblicherweise wird das Extraktionsreagens so zugesetzt, dass die Endkonzentration des Detergens circa 0,005% beträgt. Um eine zufrieden stellende Extraktionsfähigkeit zu erzielen, wird eine höhere Detergensend konzentration bevorzugt. Wenn jedoch die Endkonzentration des Detergens hoch ist (wenn die Endkonzentration beispielsweise 0,01% oder mehr beträgt), kommt es zu einer starken Verschlechterung der Messempfindlichkeit und -genauigkeit, da das Detergens die Lumineszenzreaktion wesentlich hemmt.
Zudem hemmt ein Detergens bei der Amplifikation einer Nucleinsäure mittels PCR-Verfahren die PCR-Reaktion, wodurch es zu keinem entsprechend gebildeten PCR-Produkt kommt.
Wenn die intrazelluläre Komponente ein Enzym ist, ergibt sich das Problem, dass das extrahierte Enzym vom Detergens denaturiert oder deaktiviert wird.
Als Substanz zur Unterdrückung der durch das Detergens verursachten Unterbrechung der Analyse (z.B. einer Biolumineszenzreaktion) ist ein Verfahren bekannt, das Cyclodextrin oder ein Derivat davon verwendet (japanische nationale Phase der offengelegten PCT-Anmeldung Nr. 6-504200). Ein weiteres bekanntes Verfahren zur Messung des intrazellulären ATP umfasst folgende Schritte: das Kontaktieren einer Zellen enthaltenden Probe mit einem Detergens, um das intrazelluläre ATP zu extrahieren; und Messen des ATP mittels Luciferin-Luciferase-Lumineszenzreaktionsverfahren, worin das Lumineszenzreaktionsverfahren angewandt wird, nachdem die ATP-extrahierte Probe mit Cyclodextrin in Kontakt gebracht worden ist (japanische Offenlegungsschrift Nr. 7-203995).
Die Cyclodextrin einsetzenden Verfahren haben jedoch folgende Probleme:

(1) Cyclodextrin selbst hemmt die Lumineszenz: wenn beispielsweise ein α-Cyclodextrin in einer Lumineszenzreaktionslösung in einer Konzentration von 1% oder 2% vorliegt, wird eine starke Hemmung von 25% bzw. 50% verursacht.
(2) Cyclodextrin ist kostenaufwendig: ein α-Cyclodextrin mit der besten Neutralisationsfähigkeit kostet etwa 20.000 Yen pro Kilogramm.

Wie oben beschrieben ist es für ein Verfahren, das ein Extraktionsreagens einsetzt, welches als wirksame Komponente ein Detergens aufweist, unbedingt erforderlich, ein Verfahren zu entwickeln, womit die effiziente Extraktion einer intrazellulären Komponente gewährleistet ist, ohne dabei die Analyse der intrazellulären Komponente (im weiteren Verlauf einfach als "Analyse" bezeichnet) zu hemmen.
Die hierin verwendete Bezeichnung "Analyse" bezieht sich auf einen Schritt zur Analyse einer intrazellulären Komponente, auf eine Vorbehandlung für die Analyse und zudem auf jedes beliebige Verfahren nach dem Extrahieren der intrazellulären Komponente.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Die Erfinder vorliegender Erfindung haben herausgefunden, dass verzweigtes Dextrin die beste Substanz zur Unterdrückung der durch das Reaktionsreagens verursachten Hemmung der Analyse ist (im weiteren Verlauf als "Neutralisieren des Extraktionsreagens" oder "Neutralisation" bezeichnet). Die vorliegende Erfindung wurde auf Grundlage dieses Erkenntnis fertiggestellt. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Analyse einer intrazellulären Komponente, das folgende Schritte umfasst: (1) Zusetzen eines Extraktionsreagens zu einer Zellen enthaltenden Probe, um die intrazelluläre Komponente zu extrahieren; (2) Zusetzen von verzweigtem Dextrin oder einem verzweigten Derivat davon zu der das Extraktionsreagens enthaltenden Probe; und (3) Analysieren der extrahierten intrazellulären Komponente.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein wie oben beschriebenes Analyseverfahren, worin das Extraktionsreagens ein Detergens als wirksame Komponente aufweist.
Zudem betrifft die vorliegende Erfindung ein Reagenzien-Set, das folgende Bestandteile umfasst: (a) ein Extraktionsreagens (das getrennt von den anderen Kompo nenten gelagert wird); (b) ein verzweigtes Dextrin oder ein Derivat davon; und (c) ein Reagens zur Analyse einer intrazellulären Komponente.
Im Folgenden wird die vorliegende Erfindung detaillierter beschrieben.
Verfahren zur Analyse der intrazellulären Komponente
1. Zellen enthaltende Probe
Die Zellen können von Tieren, Pflanzen, Mikroorganismen (z.B. Hefe, Schimmel, Pilzen, Bakterien, Aktinomyzeten, einzelligen Algen, Viren und Protozoen) und dergleichen stammen.
Die Probe unterliegt keinen besonderen Einschränkungen, sofern sie die oben angeführten Zellen enthält. Beispiele für eine solche Probe umfassen Lebensmittel, Getränke, Medikamente, Kosmetika, Meerwasser, Flusswasser, Industriewasser, Abwasser, Erde, Urin, Fäkalien, Blut, Sputum, Eiter und Kulturen der oben angeführten Zellen. Die Probe kann auch in Form einer Lösung vorliegen, die durch Suspension jeder beliebigen der oben angeführten Proben in einem geeigneten Lösungsmittel (z.B. destilliertes Wasser, physiologische Kochsalzlösung, Phosphatpuffer, Tris-Puffer, Natriumacetatpuffer) erhalten wird. Wenn ein Prüfling Feststoffe enthält, wird der Prüfling entweder in einem geeigneten Lösungsmittel suspendiert oder mittels Mischer oder dergleichen homogenisiert, um als Lösung behandelbar zu sein.
Zudem kann die oben beschriebene Lösungsprobe durch einen hydrophilen oder hydrophoben Filter filtriert werden, um die Zellen einzufangen und den Filter als Probe zu verwenden. Wenn ein Filter mit gefangenen Zellen als Probe verwendet wird, kann der hydrophile Filter beispielsweise ein aus hydrophilem Polytetrafluorethylen, hydrophilem Polyvinylidenfluorid, hydrophilem Polyamid, Acetylcellulose, Nitrocellulose oder dergleichen bestehender Film oder eine Folie daraus sein. Der hydrophobe Filter kann beispielsweise aus PVDF (Polyvinylidenfluorid), PTFE (Polytetrafluorethylen), PE (Polyethylen) oder dergleichen bestehen.
2. Extrahieren der intrazellulären Komponente
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird zur Zellen enthaltenden Probe zuerst ein Extraktionsreagens zugesetzt, um eine intrazelluläre Komponente zu extrahieren.
Die intrazelluläre Komponente unterliegt keinen besonderen Einschränkungen, sofern es sich um eine Substanz oder einen Metaboliten handelt, der in den Zellen enthalten ist. Die intrazelluläre Komponente kann beispielsweise eine Nucleinsäure, ein Protein, ein Lipid, ein Vitamin oder ein Polysaccharid sein. Beispiele für die Nucleinsäure umfassen DNA, RNA, ATP, ADP, AMP und zyklisches AMP. Als Beispiele für ein Lipid dienen Enzyme, Hormone und verschiedene Peptide.
Das erfindungsgemäße Extraktionsreagens weist folgende Eigenschaften auf:

1) es dient zum Extrahieren einer intrazellulären Komponente; und
2) es kann mittels eines verzweigten Dextrins oder eines Derivats davon neutralisiert werden.

Das für die vorliegende Erfindung verwendete Extraktionsreagens kann als wirksame Komponente ein Detergens enthalten. Beispiele für das Detergens umfassen anionische Detergenzien (z.B. Natriumdodecylsulfat (SDS), Kaliumlaurylsulfat, Natriummonolauroylphosphat, Natriumalkylbenzolsulfonat), kationische Detergenzien (z.B. Benzalkoniumchlorid (BAC), Benzethoniumchlorid (BZC), Cetylpyridiniumchlorid, Cetyltrimethylammoniumbromid, Myristildimethylbenzylammoniumchlorid), ampholytische Detergenzien (z.B. Twittergent-Detergens 3–08, 3–10, 3–12, 3–14, 3–16, Tego) und nichtionische Detergenzien (z.B. Tween 20, 60, 80, Span 60, 80, Triton X-45, X-100, Polyoxyethylenether, Polyoxyethylenlaurylether).
Die Bedingungen zur Zugabe des Extraktionsreagens zur Probe (und zwar der Typ und die Konzentration der wirksamen Komponente des Extraktionsreagens, die Reaktionszeit und Temperatur) unterliegen keinen besonderen Einschränkungen und können je nach Typ der zu analysierenden intrazellulären Komponente und den Bedingungen der Probe sowie der Zelle entsprechend ausgewählt werden.
3. Zugabe des verzweigten Dextrins oder eines Derivats davon
Anschließend wird ein verzweigtes Dextrin oder ein Derivat davon (im weiteren Verlauf zusammen als "verzweigtes Dextrin" bezeichnet) zur das Extraktionsreagens enthaltenden Probe zugesetzt.
Das hierin verwendete verzweigte Dextrin bezieht sich auf ein Dextrin, das einen verzweigten Abschnitt aufweist, der durch Hydrolysieren von Stärke mittels eines enzymatischen (z.B. mittels Amylase) oder chemischen Verfahrens gebildet wird.
Die Typen, die Quelle und das Molekulargewicht des verzweigten Dextrins unterliegen keinen besonderen Einschränkungen, sofern dieses das Extraktionsreagens neutralisieren kann. Das verzweigte Dextrin kann mittels eines enzymatischen Verfahrens unter Einsatz von Amylase oder eines chemischen Verfahrens mittels Säure aus Stärke hergestellt werden, die aus Mais, Süßkartoffel, Tapioka, Kartoffeln oder dergleichen stammt. Die Amylase, die zur Herstellung des verzweigten Dextrins verwendet werden kann, kann eine Amylase vom Endotyp sein, die Stärke an einem beliebigen Punkt abbauen kann, oder eine Exotyp-Amylase sein, die Stärke nacheinander von einem nichtreduzierten Ende abbaut. Insbesondere kann die Amylase vom Endotyp eine α-Amylase und die Amylase vom Exotyp eine exo-1,4-α-D-Glucosidase, eine β-Amylase, eine Exo-Maltotrihydrolase, eine Exo-Maltotetrahydrolase oder eine Exo-Maltohexahydrolase sein. Die zur Herstellung des verzweigten Dextrins verwendete Säure kann eine anorganische Säure, wie z.B. Salzsäure, oder eine organische Säure, wie z.B. Oxalsäure, sein. Das in der vorliegenden Erfindung verwendete verzweigte Dextrin kann durch Verwendung der oben angeführten Amylase und/oder Säure als Katalysator verwendet werden, während die Stärke bei einer geeigneten Temperatur, einem geeigneten pH und einer geeigneten Reaktionszeit behandelt wird. Das durch dieses Verfahren hergestellte verzweigte Dextrin weist Verunreinigungen, wie z.B. ungelöste Stärke, Glukose und niedermolekulares Oligo saccharid, auf. Das verwendete verzweigte Dextrin kann solche Verunreinigungen enthalten. Es kann auch ein gereinigtes verzweigtes Dextrin verwendet werden, bei dem jegliche Verunreinigungen entfernt worden sind. Außerdem kann im Handel erhältliches verzweigtes Dextrin ebenfalls verwendet werden. Im Handel erhältliches verzweigtes Dextrin, das verwendet werden kann, ist beispielsweise BLD8, BLD12, BLD16 (Sanmatsu Kogyo Ltd.), SR-7 (Organo Corp.), Pinedex #100 (Matsutani Chemical Industry Co., Ltd.) oder NSD Nr. 510 (Nihon Shiryo Kogyo K. K.).
Es wird angenommen, dass verzweigtes Dextrin eine neutralisierende Wirkung hat, indem es sich an ein Detergens bindet und damit einen Komplex bildet. Folglich liegt sich die Menge an verwendetem verzweigtem Dextrin vorzugsweise in einem molaren Überschuss des Extraktionsreagens vor, wenn eine stöchiometrische Menge des zu bildenden Komplexes berücksichtigt wird.
Das verzweigte Dextrin kann vor der Verwendung in einer Pufferlösung oder in Wasser gelöst werden.
Die Zugabebedingungen des verzweigten Dextrins zur Probe, die das Extraktionsreagens enthält (und zwar der Typ und die Konzentration des verzweigten Dextrins, die Reaktionszeit und Temperatur), unterliegen keinen besonderen Einschränkungen und können je nach Typ des zu verwendenden Extraktionsreagens sowie der zu analysierenden intrazellulären Komponente und dem Zustand der Probe sowie der Zelle entsprechend ausgewählt werden. Wenn die Endkonzentration des Detergens nach der Analyse etwa 0,01 bis 0,05% beträgt, wird das verzweigte Dextrin zur Endkonzentration im Allgemeinen in einer Menge von 0,1 bis 30%, vorzugsweise 1 bis 10%, zugesetzt.
Die Zugabe des verzweigten Dextrins ermöglicht die Neutralisation des Extraktionsreagens, und die Analyse kann mit hoher Empfindlichkeit und Genauigkeit durchgeführt werden.
4. Analyse der extrahierten intrazellulären Komponente
Anschließend wurde zur Probe ein Reagens zur Analyse der intrazellulären Komponente zugesetzt, um die intrazelluläre Komponente zu analysieren.
Das zur Analyse der intrazellulären Komponente verwendete Verfahren und Reagens unterliegt keinen besonderen Einschränkungen, sofern das Verfahren und das Reagens zur Analyse für die Bestimmung der Gegenwart/Abwesenheit, des Gehalts und der Aktivität des intrazellulären Inhalts, zur Amplifikation von Nucleinsäuren, zur Bestimmung von Mikroorganismen in einer Probe (z.B. Bestimmung der Gegenwart/Abwesenheit oder des Typs von Mikroorganismen und Bestimmen der Anzahl an lebenden Mikroben) angewandt werden kann.
Ein solches Verfahren kann beispielsweise ein enzymatisches Verfahren, insbesondere eine Nucleinsäureamplifikation mittels PCR-Reaktion unter Verwendung einer DNA-Polymerase, und die Bestimmung des intrazellulären ATP unter Verwendung von Luciferase sein.
Wenn die intrazelluläre Komponente ATP ist, wird diese vorzugsweise anhand eines Verfahrens bestimmt, das auf einer Biolumineszenzreaktion beruht, beispielsweise ein Luciferin-Luciferase-Lumineszenzreaktionsverfahren. Das Biolumineszenzverfahren ist hinsichtlich einfacher Durchführbarkeit, kurzer Messzeit und hoher Empfindlichkeit sehr geeignet.
Gemäß dem Luciferin-Luciferase-Lumineszenzreaktionsverfahren wird das Analysereagens für die Lumineszenz zur Probe zugesetzt, und der Lumineszenzwert davon wird gemessen. Das hierbei verwendbare Analysereagens ist beispielsweise ein Luciferin, Luciferase und Magnesium enthaltendes Biolumineszenzreagens (im weiteren Verlauf als "Luciferin-Luciferase-Lumineszenzreagens" bezeichnet).
Der Lumineszenzwert wird mit einem Luminometer, wie z.B. dem Lumitester K-100 (Kikkoman Corp.), dem (weiterentwickelten) Lumineszenzmessgerät BLR-201 (Aloka) und Lumat LB9501 (Berthold), gemessen. Wenn als Probe ein Filter mit gefan genen Zellen verwendet wird, kann die Anzahl der Zellen durch Abbildung der Lumineszenzstellen auf dem Filter unter Einsatz eines Biolumineszenz-Bildanalysesystemgeräts, wie z.B. ARGUS-50/CL [mit zugespitzten Fasern, hergestellt von Hamamatsu Photonics K. K.], ermittelt werden.
Der Einsatz des Luciferin-Luciferase-Lumineszenzreaktionsverfahrens ermöglicht die Bestimmung einer Menge von intrazellulärem ATP, die Bestimmung einer Anzahl von Zellen in der Probe und dergleichen.
Das in der Erfindung verwendete Luciferin und die Luciferase können beispielsweise aus Insekten (wie z.B. aus Luciola cruciata, Luciola lateralis, dem amerikanischen Glühwürmchen, dem russischen Glühwürmchen, Pynophorus plagiophthalamus und Arachnocampa luminosa) stammen. Die Luciferase kann eine natürliche, aus einem lumineszierenden Gewebe der oben angeführten Organismen gereinigte Luciferase, eine durch Gentechnik hergestellte rekombinante Luciferase und eine mutierte Luciferase sein, die durch Einführung einer Mutation, wie z.B. einer Addition, Deletion und Substitution in einer oder mehreren Aminosäuren der Aminosäuresequenz der natürlichen Luciferase, erhalten wird.
Als Luciferin-Luciferase-Lumineszenzreagens kann auch ein im Handel erhältliches Reagenzien-Set, wie z.B. "Lucifer LU" (Kikkoman Corp.), eingesetzt werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung unterliegt die Reihenfolge der Zugabe des verzweigten Dextrins zur Probe und der Analyse keinen besonderen Einschränkungen. Deshalb kann die Analyse nach der Zugabe des verzweigten Dextrins erfolgen, oder beide Schritte können gleichzeitig durchgeführt werden, um den Vorgang zu vereinfachen. Wenn beide Schritte gleichzeitig ausgeführt werden, wird ein Reagensgemisch hergestellt, indem das verzweigte Dextrin zum Analysereagens zugesetzt wird und dies der Probe zugesetzt wird, die das Extraktionsreagens enthält.
Reagenzien-Set der vorliegenden Erfindung
Ein Reagenzien-Set der vorliegenden Erfindung umfasst folgende Bestandteile:

(a) ein Extraktionsreagens (das getrennt von den anderen Komponenten gelagert wird);
(b) ein verzweigtes Dextrin oder ein Derivat davon; und
(c) ein Reagens zur Analyse einer intrazellulären Komponente.

Von den oben angeführten Bestandteilen wird der Bestandteil (a) getrennt von den anderen Bestandteilen gelagert, wobei die Bestandteile (b) und (c) entweder voneinander getrennt oder zusammengemischt sein können. Der Einfachheit halber wird jeder der Bestandteile vorzugsweise in einer geeigneten Pufferlösung gelöst. Zudem kann jedem der Bestandteile eine Substanz zugesetzt sein, die zur pH-Einstellung oder Verbesserung der Haltbarkeit des Reagens führt. Beispiele für solche Substanzen umfassen EDTA2Na, Dithiothreit, Ammoniumsulfat, Saccharose, 2-Mercaptoethanol, HEPES, Tricin und Tris. Diese Substanzen können dem Reagenzien-Set getrennt von den oben angeführten Bestandteilen (a) bis (c) zugesetzt werden.
Der Bestandteil (c) kann entsprechend der zu analysierenden intrazellulären Komponente ausgewählt werden. Wenn ein intrazelluläres ATP analysiert werden soll, kann der Bestandteil (c) beispielsweise ein Biolumineszenzreagens (insbesondere Luciferin-Luciferase-Lumineszenzreagens) sein. Ein im Handel erhältliches Reagenzien-Set, z.B. Lucifer LU (Kikkoman Corp.), kann ebenfalls als Lumineszenz-Reagens verwendet werden.
Wenn das erfindungsgemäße Reagenzien-Set verwendet wird, kann jede der Komponenten zur Probe gemäß dem oben beschriebenen Verfahren zugesetzt werden, um die intrazelluläre Komponente zu analysieren.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 stellt die Fähigkeiten der verschiedenen verzweigten Dextrine zur Neutralisation der Lumineszenzhemmung dar.
2 stellt die Fähigkeiten der verschiedenen verzweigten Dextrine zur Neutralisation der Lumineszenzhemmung dar.
3 stellt die Fähigkeiten verzweigter Dextrine zur Neutralisation von BAC dar.
4 stellt die Fähigkeiten verzweigter Dextrine zur Neutralisation von BZC dar.
5 stellt die Fähigkeiten verzweigter Dextrine zur Neutralisation von Twittergent 3–16 dar.
6 stellt die Fähigkeiten verzweigter Dextrine zur Neutralisation von SDS dar.
7 stellt die Fähigkeiten verzweigter Dextrine zur Neutralisation von Triton X-100 dar.
BESTE ARTEN DER DURCHFÜHRUNG DER ERFINDUNG
Im Folgenden wird die vorliegende Erfindung anhand von Beispielen spezifischer beschrieben.
Beispiel 1
Neutralisation von Detergenzien mit verschiedenen verzweigten Dextrinen
1. Verzweigte Dextrine
Es wurden verschiedene verzweigte Dextrine, die aus verschiedenen Quellen stammten, auf deren Fähigkeit zur Neutralisation von Detergenzien untersucht. Es wurden, wie in Tabelle 1 angeführt, zwölf Arten verzweigter Dextrine verwendet.
Während BLD 8 ein im Handel erhältliches Produkt von Sanmatsu Kogyo Ltd. ist, wurden andere Proben durch Behandeln verschiedener in der Tabelle angeführter Stärkematerialien mit Amylase für diesen Test hergestellt. In der Tabelle bezieht sich DE auf einen Index, der die Abbaugeschwindigkeit von Stärke darstellt, worin ein geringerer DE eine höhere Viskosität bedeutet. Die verschiedenen verzweigten Dextrine wurden verwendet, nachdem diese bei einer Konzentration von 10% (Gew./Vol.) in 25 mM Tricin (pH 7,7%) aufgelöst worden waren. Zudem wurde α-Cyclodextrin (αCD, Mercian Corp.) als Vergleichsneutralisationsmittel verwendet.
Tabelle 1
2. Detergens
Als Detergens wurde Benzalkoniumchlorid (BAC, Osbanlösung gemäß der japanischen Pharmakopöe) in einer Konzentration von 0,1% verwendet, das in 25 mM Tricin (pH 7,75) gelöst war.
3. Bestimmung des ATP
Zu einer 100-μl-ATP-Lösung (2 × 10^–8 M) wurden 50 μl 0,1%iges BAC und zudem 50 μl Lösung von verzweigtem Dextrin zugesetzt. Danach wurden 50 μl eines Lumineszenzreagens, "Lucifer LU" (Kikkoman Corp.), zugesetzt, um den erzeugten Lumineszenzwert in 1-Sekunden-Intervallen 1 Minute lang unter Verwendung von Lumat LB-9501 (Berthold) zu messen.
4. Ergebnisse
Die 1 und 2 zeigen die Ergebnisse der Bestimmung. "Ohne BAC" stellt jenen Fall dar, bei dem statt 0,1% BAC 25 mM Tricin (pH 7,75) verwendet wurden. "Nur BAC" stellt jenen Fall dar, bei dem statt einer Lösung von verzweigtem Dextrin 25 mM Tricin (pH 7,75) verwendet wurden. In den Figuren stellt die vertikale Linie den Lumineszenzwert und die horizontale Linie die verstrichene Zeit nach der Zugabe des Biolumineszenzreagens dar.
Im Fall von "nur BAC" wurde die Luciferase, die im Biolumineszenzreagens enthalten war, mittels BAC deaktiviert. Dies führte zu einer Abnahme des anfänglichen Lumineszenzwertes, und der Lumineszenzwert wurde, verglichen mit den Ergebnissen im Falle ohne BAC, stark abgeschwächt. Wenn αCD, das als Substanz zur Neutralisation eines Detergens bekannt ist, zugesetzt wurde, kam es zu einer Reduktion des anfänglichen Lumineszenzwertes, während die Abschwächung des Lumineszenzwertes stark verringert wurde. Ähnlich wie αCD verringerten alle verschiedenen verzweigten Dextrine die Abschwächung der Lumineszenz. Insbesondere zeigten die Proben A, D, F, G, I und BLD8 eine starke Verringerungswirkung.
Folglich hat sich herausgestellt, dass verzweigte Dextrine, ähnlich wie αCD, die von einem Detergens verursachte Deaktivierung von Luciferase neutralisieren und die Verringerung der Lumineszenz hemmen.
Beispiel 2
Hemmung der durch unterschiedliche Neutralisationsmittel selbst verursachten Biolumineszenz
Cyclodextrin, das als Neutralisationsmittel für ein Detergens bekannt ist, weist an sich eine Lumineszenzhemmung auf und verursacht eine Verschlechterung der Empfindlichkeit und Genauigkeit. Folglich wurden verzweigte Dextrine auf Biolumineszenzhemmung untersucht.
1. Verwendete verzweigte Dextrine
Als verzweigte Dextrine wurden BLD8, BLD12 und BLD16 (alle von Sanmatsu Kogyo Ltd. hergestellt) sowie α-Cyclodextrin als Vergleich (αCD, Mercian Corp.) verwendet.
2. Bestimmung des ATP
Zu einer 100-μl-ATP-Lösung (2 × 10^–8 M) wurden 50 μl 25 mM Tricin (pH 7,75) und zudem 50 μl von 5- und 10%igen Neutralisationslösungen (verzweigte Dextrine und αCD-Lösung) zugesetzt. Danach wurden 50 μl eines Lumineszenzreagens, "Lucifer LU" (Kikkoman Corp.), zugesetzt, um den erzeugten Lumineszenzwert unter den Bedingungen von 5 Sekunden Latenz und 3 Sekunden Integrationszeit unter Verwendung von Lumat LB-9501 (Berthold) zu messen.
Zusammen mit den ermittelten Werten ist auch der relative Prozentsatz des Lumineszenzwertes, der für das jeweilige Neutralisationsmittel erhalten wird, in Tabelle 2 angeführt, wobei der ohne Neutralisationsmittel erhaltene Lumineszenzwert (und zwar wenn statt der Neutralisationslösung 25 mM Tricin (pH 7,75) verwendet wurde) 100% beträgt.
Tabelle 2
3. Ergebnisse
αCD wies eine starke Lumineszenzhemmung von etwa 25 bzw. 50% nach der Verwendung einer 5%igen Lösung (1%ige Konzentration bei der Lumineszenzreaktion) und einer 10%igen Lösung (2%ige Konzentration bei der Lumineszenzreaktion) auf. Andererseits zeigten die drei verzweigten Dextrine eine geringe Lumineszenzhemmung, und deren Hemmung betrug nur wenige Prozent, sogar bei der Verwendung der 10%igen Lösung. Folglich hat sich herausgestellt, dass verzweigte Dextrine, verglichen mit αCD, das auch als Neutralisationsmittel verwendet werden kann, eine geringe Lumineszenzhemmung induzieren und somit hinsichtlich Empfindlichkeit und Genauigkeit der Bestimmung von Vorteil sind.
Beispiel 3
Neutralisation verschiedener Detergenzien mit verzweigten Dextrinen
Es wurden verzweigte Dextrine auf ihre Fähigkeit, verschiedene Detergenzien zu neutralisieren, untersucht.
1. Verwendete verzweigte Dextrine
Als verzweigte Dextrine wurden BLD8, BLD12 und BLD16 verwendet. Als Vergleich wurde auch α-Cyclodextrin (αCD, Mercian Corp.) verwendet.
Jedes der verzweigten Dextrine und αCD wurde in 25 mM Tricin (pH 7,75) bei einer Konzentration von 10% (Gew./Vol.) aufgelöst, um als Neutralisationslösung verwendet zu werden.
2. Verwendete Detergenzien
Als Detergenzien wurden Benzalkoniumchlorid (BAC, Osbanlösung gemäß der japanischen Pharmakopöe), Benzethoniumchlorid (BZC, Hyaminlösung gemäß der japanischen Pharmakopöe), Twittergent 3–16 (Calbiochem), Natriumdodecylsulfat (SDS, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) und Triton X-100 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) verwendet. Diese Detergenzien wurden jeweils in 25 mM Tricin (pH 7,75) bei einer Konzentration von 0,1 oder 0,01% gelöst, um als Detergenslösungen verwendet zu werden.
3. Bestimmung des ATP
Wie in Beispiel 1 beschrieben, wurden zu einer 100-μl-ATP-Lösung (2 × 10^–8 M) 50 μl Detergens zu zudem 50 μl Neutralisationsmittel zugesetzt. Danach wurden 50 μl ei nes Lumineszenzreagens, "Lucifer LU" (Kikkoman Corp.), zugesetzt, um den erzeugten Lumineszenzwert in 1-Sekunden-Intervallen 30 Sekunden lang unter Verwendung von Lumat LB-9501 (Berthold) zu messen.
4. Ergebnisse
(1) 3 zeigt die Ergebnisse für den Fall, bei dem ein 0,1%iges Benzalkoniumchlorid (BAC) als Detergens verwendet wurde. In dem Fall, bei dem nur BAC verwendet wurde, war der anfängliche Lumineszenzwert etwas geringer als jener in dem Fall ohne BAC, wodurch es zu einer raschen Abschwächung des Lumineszenzwertes kam. Dies wird auf die durch BAC verursachte Deaktivierung der Luciferase im Lumineszenzreagens zurückgeführt.
Wenn αCD als Neutralisationsmittel verwendet wurde, kam es im Laufe der Zeit zu einer Reduzierung der Abschwächung des Lumineszenzwertes. Ähnlich wie αCD reduzierten verzweigte Dextrine auch die Abschwächung der Lumineszenz im Laufe der Zeit. Folglich hat sich herausgestellt, dass verzweigte Dextrine, ähnlich wie αCD, eine Neutralisationswirkung für BAC aufweisen.
Jedes der verzweigten Dextrine bewirkte einen höheren anfänglichen Lumineszenzwert als der mit αCD erhaltene, und der im Laufe der Zeit erhaltene Lumineszenzwert war immer höher als der mit αCD erhaltene.
Für BAC wurden höhere Lumineszenzwerte erhalten, wenn die verzweigten Dextrine als Neutralisationsmittel verwendet wurden, was bewies, dass die verzweigten Dextrine über eine bessere Neutralisationswirkung als αCD verfügten.
(2) 4 zeigt die Ergebnisse für den Fall, bei dem 0,1%iges Benzethoniumchlorid (BZC) als Detergens verwendet wurde.
Im Lumineszenzverlauf, bei dem nur BZC verwendet wurde, war der anfängliche Lumineszenzwert geringer als der ohne BZC erhaltene, und es kam zu einer raschen Abschwächung der Lumineszenz. Wenn αCD als Neutralisationsmittel verwendet wurde, wurde die Abschwächung des Lumineszenzwertes im Laufe der Zeit reduziert. Auf ähnliche Weise reduzierten verzweigte Dextrine auch die Abschwächung der Lumineszenz im Laufe der Zeit. Folglich hat sich herausgestellt, dass verzweigte Dextrine, ähnlich wie αCD, eine Neutralisationswirkung für BZC aufweisen.
Die Verwendung jedes beliebigen verzweigten Dextrins führte zu einem höheren anfänglichen Lumineszenzwert als einem mit αCD erhaltenen, und der im Laufe der Zeit erhaltene Lumineszenzwert war immer höher als der mit αCD erhaltene.
Für BZC wurden höhere Lumineszenzwerte erhalten, wenn die verzweigten Dextrine als Neutralisationsmittel verwendet wurden, was bewies, dass die verzweigten Dextrine über eine bessere Neutralisationswirkung als αCD verfügten.
(3) 5 zeigt die Ergebnisse für den Fall, bei dem ein 0,1%iges Twittergent 3–16 als Detergens verwendet wurde. Im Lumineszenzverlauf, bei dem nur Twittergent 3–16 verwendet wurde, betrug der anfängliche Lumineszenzwert ein Drittel des ohne Twittergent 3–16 erhaltenen Lumineszenzwertes, und es kam zu einer raschen Abschwächung der Lumineszenz. Wenn αCD als Neutralisationsmittel verwendet wurde, kam es sowohl beim anfänglichen Lumineszenzwert als auch bei der Abschwächung des Lumineszenzwertes zu einer großen Verbesserung. Wenn verzweigte Dextrine verwendet wurden, kam es darüber hinaus, verglichen mit αCD, zu einer Verbesserung des anfänglichen Lumineszenzwertes und der Abschwächung des Lumineszenzwertes. Insbesondere wiesen BLD8 und BLD12 bessere Neutralisationsfähigkeiten auf.
Für Twittergent 3–16 wurden höhere Lumineszenzwerte erhalten, wenn die verzweigten Dextrine als Neutralisationsmittel verwendet wurden, was bewies, dass die verzweigten Dextrine über eine bessere Neutralisationswirkung als αCD verfügten.
(4) 6 zeigt die Ergebnisse für den Fall, bei dem ein 0,01%iges Natriumdodecylsulfat (SDS) als Detergens verwendet wurde. Im Lumineszenzverlauf, bei dem nur SDS verwendet wurde, lag der Lumineszenzwert signifikant unter demjenigen, der ohne SDS erhalten wurde. Dies war auf die durch SDS verursachte Hemmung der Luciferase im Biolumineszenzreagens zurückzuführen, was den Gesamtlumineszenzwert reduzierte. Wenn αCD als Neutralisationsmittel verwendet wurde, war der Lumineszenzwert höher als derjenige, der ohne Neutralisationsmittel erhalten wurde. Wenn verzweigte Dextrine verwendet wurden, kam es, ähnlich wie mit αCD, zu einem hohen Lumineszenzwert.
Folglich hat sich herausgestellt, dass verzweigte Dextrine, ähnlich wie αCD, eine Neutralisationswirkung für SDS aufweisen. Es wurden, insbesondere wenn BLD8 und BLD12 verwendet wurden, höhere Lumineszenzwerte erhalten, und diese verzweigten Dextrine wiesen höhere Neutralisationsfähigkeiten auf als αCD.
(5) 7 zeigt die Ergebnisse für den Fall, bei dem ein 0,01%iges Triton X-100 als Detergens verwendet wurde. Hinsichtlich des Lumineszenzübergangs im Fall, bei dem nur Triton X-100 verwendet wurde, war der Lumineszenzwert, verglichen mit dem ohne Triton X-100 erhaltenen Wert, etwas geringer, und das Triton X-100 hatte keine nennenswerten negativen Auswirkungen auf die Lumineszenzreaktion. Wenn αCD als Neutralisationsmittel verwendet wurde, war der Lumineszenzwert aufgrund der dem αCD inhärenten Lumineszenzhemmung gering. Wenn verzweigte Dextrine verwendet wurden, kam es, verglichen mit den ohne Triton X-100 erhaltenen Werten, andererseits zu gleichen oder leicht geringeren Lumineszenzwerten.
Für Triton X-100 wurden höhere Lumineszenzwerte erhalten, wenn die verzweigten Dextrine als Neutralisationsmittel verwendet wurden, was bewies, dass die verzweigten Dextrine über eine bessere Neutralisationswirkung als αCD verfügten.
Beispiel 4
Bestimmung des intrazellulären ATP
Im Folgenden wird die Bestimmung von intrazellulärem Mikroorganismus-ATP gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren im Vergleich zu Bestimmungen gemäß den drei herkömmlichen Verfahren beschrieben.
Gemäß dem herkömmlichen Verfahren 1 wurde das intrazelluläre ATP mittels eines TCA-Extraktionsverfahrens unter Verwendung von Trichloressigsäure (TCA) extrahiert, um die ATP-Menge durch eine Luciferin-Luciferase-Reaktion zu bestimmen. Das TCA-Extraktionsverfahren ist hinsichtlich der ATP-Extraktionseffizienz sehr vorteilhaft. Da TCA jedoch die Luciferin-Luciferase-Reaktion stark hemmt, muss die Reaktionslösung stark verdünnt werden. Folglich umfasst dieses Verfahren komplizierte Verfahren und ist auch hinsichtlich der Bestimmungsempfindlichkeit problematisch, da diese aufgrund der Verdünnung verschlechtert werden kann.
Gemäß dem herkömmlichen Verfahren 2 wurde ATP mit einem Detergens extrahiert, um eine Menge des extrahierten ATP durch eine Luciferin-Luciferase-Reaktion ohne Neutralisationsmittel zu bestimmen.
Gemäß dem herkömmlichen Verfahren 3 wurde ATP mit einem Detergens extrahiert, die Wirkung des Detergens wurde mit Cyclodextrin neutralisiert; und eine Menge des extrahierten ATP wurde durch eine Luciferin-Luciferase-Reaktion bestimmt (japanischen nationale Phase der offengelegten PCT-Anmeldung Nr. 6-504200, offengelegte japanische Veröffentlichung Nr. 7-203995).
1. Verwendetes verzweigtes Dextrin
Als verzweigtes Dextrine wurde BLD8 verwendet. Als Vergleich wurde α-Cyclodextrin (αCD, Mercian Corp.) verwendet.
2. Verwendete Detergenzien
Als Detergenzien wurden Benzalkoniumchlorid (BAC, Osbanlösung gemäß der japanischen Pharmakopöe) und Benzethoniumchlorid (BZC, Hyaminlösung gemäß der japanischen Pharmakopöe) verwendet. Diese Detergenzien wurden jeweils in 25 mM Tricin (pH 7,75) bei einer Konzentration von 0,1% gelöst, um als Detergenslösungen verwendet zu werden.
3. Verwendete Mikroorganismen
Als Mikroorganismen wurden 3 Typen von Mikroben verwendet, Escherichia coli (ATCC 25922), Staphylococcus aureus (ATCC 25923) und Bacillus subtilis (ATCC 9372). Diese Mikroorganismen wurden über Nacht in einer Nährlösung (Eiken Chemical Co., Ltd.) bei 35°C kultiviert, und die Kulturlösungen wurden als Bestimmungsproben verwendet.
Gemäß dem herkömmlichen Verfahren 1 müssen die Proben 100fach verdünnt sein, bevor die Menge des extrahierten ATP bestimmt wird, um die Hemmung der Lumineszenz durch TCA zu verhindern. Folglich wurde im herkömmlichen Verfahren 1 eine rohe Übernacht-Kulturlösung als Probe verwendet, und 100fach verdünnte Lösungen davon wurden als Proben in anderen Bestimmungsverfahren verwendet.
4. Bestimmung des intrazellulären ATP
(1) Vorliegende Erfindung
Zu 100 μl einer Probe wurden 50 μl einer Detergenslösung zugesetzt und 20 Sekunden lang stehen gelassen, um das ATP aus dem Mikroorganismus zu extrahieren. Dann wurden 50 μl einer 10%igen Lösung aus verzweigtem Dextrin und zudem 50 μl eines Biolumineszenzreagens zugesetzt und die Lumineszenz unmittelbar danach gemessen.
(2) Herkömmliches Verfahren 1
Zu 100 μl einer Probe wurde eine äquivalente Menge einer 5%igen Trichloressigsäurelösung zugesetzt und 1 Minute lang stehen gelassen, um das ATP aus dem Mikro organismus zu extrahieren. Zur extrahierten Lösung wurden 9,8 ml 25 mM Tricin (pH 7,75) zugesetzt und gut gerührt. 100 μl dieser Probe wurden in eine Lumineszenzmessröhre platziert, wozu 100 μl 25 mM Tricin (pH 7,75) und 100 μl eines Lumineszenzreagens, "Lucifer LU" (Kikkoman Corp.), zugesetzt wurden. Unmittelbar danach wurde die Lumineszenz gemessen.
(3) Herkömmliches Verfahren 2
Zu 100 μl einer Probe wurden 50 μl einer Detergenslösung zugesetzt und 20 Sekunden lang stehen gelassen, um das ATP aus dem Mikroorganismus zu extrahieren. Dann wurden 50 μl 25 mM Tricin (pH 7,75) und zudem 50 μl eines Biolumineszenzreagens zugesetzt und die Lumineszenz unmittelbar danach gemessen.
(4) Herkömmliches Verfahren 3
Zu 100 μl einer Probe wurden 50 μl einer Detergenslösung zugesetzt und 20 Sekunden lang stehen gelassen, um das ATP aus dem Mikroorganismus zu extrahieren. Dann wurden 50 μl einer 10%igen α-Cyclodextrinlösung (αCD-Lösung) und zudem 50 μl eines Biolumineszenzreagens zugesetzt und die Lumineszenz unmittelbar danach gemessen.
5. Ergebnisse
Tabelle 3 zeigt die gemäß den oben beschriebenen Bestimmungsverfahren erhaltenen Lumineszenzwerte, bei denen Benzalkoniumchlorid (BAC) als Detergens verwendet wurde. Eine relative Prozentzahl des durch jedes Bestimmungsverfahren erhaltenen Lumineszenzwertes ist ebenfalls in der Tabelle angeführt, wobei der gemäß dem herkömmlichen Verfahren 1 (TCA-Extraktionsverfahren) erhaltene Lumineszenzwert auf 100% eingestellt ist.
Tabelle 3
Der gemäß dem herkömmlichen Verfahren 2 erhaltene Lumineszenzwert (und zwar jenes Verfahren, bei dem keine Neutralisationsverfahren verwendet wurden) betrug etwa 30 bis 40% jenes durch das herkömmliche Verfahren 1 (TCA-Extraktionsverfahren) erhaltenen Wertes, was auf eine signifikante Lumineszenzhemmung hinweist. Der gemäß dem herkömmlichen Verfahren 3 erhaltene Lumineszenzwert (und zwar jenes Verfahren, bei dem α-CD als Neutralisationsmittel verwendet wurde) war, verglichen mit jenem des herkömmlichen Verfahrens 2, zwar höher, betrug jedoch etwa 50% des durch das herkömmliche Verfahren 1 (TCA-Extraktionsverfahren) erhaltenen Wertes.
Andererseits betrug der gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren (nämlich jenem Verfahren, bei dem als Neutralisationsmittel verzweigtes Dextrin verwendet wurde) erhaltene Lumineszenzwert etwa 60 bis 80% des durch das herkömmliche Verfahren 1 (TCA-Extraktionsverfahren) erhaltenen Wertes, der etwa dem zweifachen Wert des durch das herkömmliche Verfahren 2 erhaltenen Wertes ohne Verwendung von Neutralisationsmitteln entspricht, was bezüglich Empfindlichkeit und Genauigkeit eine große Verbesserung darstellt. Der durch die vorliegende Erfindung erhaltene Lumineszenzwert war, verglichen mit dem durch das herkömmliche Verfahren 3 unter Verwendung von αCD als Neutralisationsmittel erhaltenen Wert, höher, was darauf hinweist, dass die Neutralisationsfähigkeit des verzweigten Dextrins bei der Bestim mung des intrazellulären ATP von Mikroorganismen unter Verwendung von BAC besser als die des αCD ist.
(2) Tabelle 4 zeigt die gemäß den oben beschriebenen Bestimmungsverfahren erhaltenen Lumineszenzwerte, bei denen Benzethoniumchlorid (BZC) als Detergens verwendet wurde. Eine relative Prozentzahl des durch jedes Bestimmungsverfahren erhaltenen Lumineszenzwertes ist ebenfalls in der Tabelle angeführt, wobei der gemäß dem herkömmlichen Verfahren 1 (TCA-Extraktionsverfahren) erhaltene Lumineszenzwert auf 100% eingestellt ist.
Tabelle 4
Der gemäß dem herkömmlichen Verfahren 2 (nämlich einem Verfahren, bei dem keine Neutralisationsmittel verwendet wurden) erhaltene Lumineszenzwert betrug etwa 30% des gemäß dem herkömmlichen Verfahren 1 (TCA-Extraktionsverfahren) erhaltenen Wertes, was, ähnlich dem BAC-Fall, eine signifikante Lumineszenzhemmung darstellt. Der gemäß dem herkömmlichen Verfahren 3 (nämlich einem Verfahren, bei dem αCD als Neutralisationsmittel verwendet wurde) erhaltene Lumineszenzwert war nur gering höher als jener Wert, der ohne Neutralisationsmittel erhalten wurde.
Andererseits betrug der gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren (nämlich jenem Verfahren, bei dem als Neutralisationsmittel verzweigtes Dextrin verwendet wurde) erhaltene Lumineszenzwert etwa 50 bis 60% des durch das herkömmliche Verfahren 1 (TCA-Extraktionsverfahren) erhaltenen Wertes, der etwa dem zweifachen Wert des durch das herkömmliche Verfahren 2 erhaltenen Wertes ohne Verwendung von Neutralisationsmitteln entspricht, was bezüglich Empfindlichkeit und Genauigkeit eine große Verbesserung darstellt. Der durch die vorliegende Erfindung erhaltene Lumineszenzwert war, verglichen mit dem durch das herkömmliche Verfahren 3 unter Verwendung von αCD als Neutralisationsmittel erhaltenen Wert, höher, was darauf hinweist, dass die Neutralisationsfähigkeit des verzweigten Dextrins bei der Bestimmung des intrazellulären ATP von Mikroorganismen unter Verwendung von BZC besser als die des αCD ist.
GEWERBLICHE ANWENDBARKEIT
Verzweigte Dextrine erweisen sich als sehr gute Substanzen zur Unterdrückung der Unterbrechung der durch ein Extraktionsreagens verursachten Analyse. Verzweigte Dextrine verfügen darüber hinaus über folgende Vorteile:

(1) Die verzweigten Dextrine weisen, verglichen mit Cyclodextrin, eine schwache Hemmungsaktivität auf eine Biolumineszenzreaktion auf (wenn α-Cyclodextrin in einer Lumineszenzreaktionslösung in einer Konzentration von 1% oder 2% vorliegt, wird eine starke Hemmung von 25% bzw. 50% verursacht; die verzweigten Dextrine verfügen andererseits über eine geringe Lumineszenzhemmung und hemmen nur wenige Prozent, wenn sie in einer Lumineszenzreaktionslösung in einer Konzentration von 2% vorliegen).
(2) Die verzweigten Dextrine sind kostengünstig (ein α-Cyclodextrin mit der besten Neutralisationsfähigkeit kostet etwa 20.000 Yen pro Kilogramm, während die verzweigten Dextrine etwa 200 Yen kosten, was in etwa 1/1000 des Preises für α-Cyclodextrin entspricht).

Die vorliegende Erfindung wird insbesondere bevorzugt, wenn ein Extraktionsreagens verwendet wird, das als wirksame Komponente ein Detergens aufweist. Folglich ist die vorliegende Erfindung vorzugsweise ein Verfahren zur Analyse verschiedener intrazellulärer Komponenten, einschließlich intrazellulärem ATP.

Claims

Verfahren zur Analyse einer intrazellulären Komponente, folgende Schritte umfassend: (1) Zusetzen eines Extraktionsreagens zu einer Zellen enthaltenden Probe, um die intrazelluläre Komponente zu extrahieren; (2) Zusetzen von verzweigtem Dextrin oder einem verzweigten Derivat davon zu der das Extraktionsreagens enthaltenden Probe; und (3) Analysieren der extrahierten intrazellulären Komponente.
Analyseverfahren nach Anspruch 1, worin das Extraktionsreagens ein Detergens als wirksame Komponente enthält.
Analyseverfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin die intrazelluläre Komponente eine beliebige aus Nucleinsäuren, Proteinen, Lipiden, Vitaminen oder Polysacchariden ist.
Analyseverfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin die intrazelluläre Komponente ATP ist.
Analyseverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin der Schritt des Analysierens der extrahierten intrazellulären Komponente zum Zweck der Amplifikation von Nucleinsäuren durchgeführt wird, um die Gegenwart/Abwesenheit eines Mikroorganismus oder die Anzahl an lebenden Mikroben zu bestimmen.
Analyseverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin der Schritt des Analysierens der extrahierten intrazellulären Komponente unter Verwendung eines Enzyms erfolgt.
Analyseverfahren nach Anspruch 6, worin sich der unter Verwendung eines Enzyms erfolgende Schritt auf ein Luciferin-Luciferase-Lumineszenzreaktionsverfahren bezieht.
Reagenzien-Set, folgende Bestandteile umfassend: (a) ein Extraktionsreagens zum Extrahieren einer intrazellulären Komponente; (b) verzweigtes Dextrin oder ein verzweigtes Derivat davon; und (c) ein Reagens zur Analyse einer intrazellulären Komponente.
Reagenzien-Set nach Anspruch 8, worin das Extraktionsreagens ein Detergens als wirksame Komponente enthält.
Reagenzien-Set nach Anspruch 8 oder 9, worin das Reagens zur Analyse der intrazellulären Komponente ein Luciferin-Luciferase-Biolumineszenzreagens ist.