DE69924127T3 - Methode zum nachweis von atp - Google Patents

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Description

  • Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Nachweisen von ATP und auf ein Kit zur Verwendung in diesem Verfahren.
  • Ein bekanntes Verfahren zum Nachweisen von ATP (Adenosintriphosphat) macht von der Biolumineszenz Gebrauch. Die Biolumineszenz von Luciferase/Luciferin-Organismen ist bekannt, wobei Luciferin in Oxyluciferin umgewandelt wird. Diese Umwandlung wird durch das Enzym Luciferase katalysiert.
  • Eine bekannte Luciferase stammt von dem Leuchtkäfer Photinus pyralis. Diese Luciferase ist ein Enzym mit einem Molekulargewicht von ungefähr 60000 Dalton, das ungefähr 550 Aminosäuren enthält. Das Substrat für dieses Enzym ist Luciferin, das ebenfalls von dem Leuchtkäfer stammt. Dies ist eine polyheterocyclische organische Säure, D-(–)-2-(6'-Hydroxy-2'-benzothiazolyl)-Δ2-thiazolin-4-carbonsäure.
  • Es wird angenommen, dass die Luciferase-katalysierte Biolumineszenzreaktion wie folgt abläuft.
  • Figure 00010001
  • Hier steht PP für Pyrophosphat und AMP steht für Adenosinmonophosphat. Das Oxyluciferin wird ursprünglich in einem angeregten Zustand erzeugt. Wenn die Substanz zu ihrem Grundzustand zurückkehrt, geht dies mit der Emission von Licht einher.
  • Wenn ATP in einem Medium vorhanden ist, kann die Menge an ATP mittels der Luciferin-Luciferase-Reaktion bestimmt werden. Wenn man ATP oder ein ATP-haltiges Medium zu einer Zusammensetzung zugibt, die Luciferin, Luciferase, Magnesiumionen und Sauerstoff enthält, wird in Abhängigkeit von der ausgewählten Zusammensetzung der Reagenzien ein kurzes intensives Lichtsignal erhalten. Für einige Sekunden kann man von einem relativ stabilen Lichtsignal sprechen. Es wird angenommen, dass die Abnahme der Reaktionsgeschwindigkeit durch eine Produkthemmung verursacht wird.
  • Wenn mittels eines Injektionssystems eine ATP-haltige Probe zu der Zusammensetzung zugegeben wird, die die Reagenzien für die Luciferin-Luciferase-Reaktion enthält, kann die Konzentration von ATP in der Probe bestimmt werden. Der Nachteil des Messsystems ist, dass bei Gebrauch einer Mikrotiterplatte jeder Napf separat, d. h. ein Napf nach dem anderen, gemessen werden muss. Dies ist eine besonders zeitraubende Angelegenheit. Wenn eine ATP-haltige Probe zu einer Reihe von Reaktionsgefäßen oder Näpfen von Mikrotiterplatten zugegeben und anschließend gemessen wird, wird das Lichtsignal der letzten Gefäße oder Näpfe, die gemessen werden, bereits vollständig oder weitgehend verschwunden sein.
  • Deshalb ist es bevorzugt, dass ein relativ stabiles Lichtsignal in der Luciferin-Luciferase-Reaktion erhalten wird. Wenn das Lichtsignal längere Zeit stabil ist, kann von Plattenluminometern Gebrauch gemacht werden, welche kein Injektionssystem erfordern. Außerdem kann man dann eine große Zahl von Reaktionsgefäßen oder Mikrotiterplatten vorbereiten und erst einige Zeit später das Lichtsignal messen. Das Lichtsignal bleibt dann für die Menge an ATP in den verschiedenen Proben maßgebend.
  • Die Aufgabe der Erfindung ist, ein Verfahren zum Bestimmen der Konzentration von ATP mittels der Luciferin-Luciferase-Reaktion bereitzustellen, wobei die Dauer der Lichtemission während der Reaktion signifikant verlängert wird.
  • In der Literatur sind bereits viele Versuche zum Beeinflussen und Verlängern der Dauer des Lichtsignals in der Luciferase-Reaktion beschrieben worden.
  • Eine Vorgehensweise, welche die Kinetik der Luciferin-Luciferase-Reaktion beeinflusst und die Zeit der Lichtemission verlängert, macht von einem Inhibitor für das Luciferaseenzym Gebrauch. Ein Beispiel für einen Inhibitor, welcher viel Aufmerksamkeit geweckt hat, ist Arsenat. Arsenat verringert die Intensität des Blitzes und verlängert auch seine Länge. Die Empfindlichkeit der Reaktion zum Nachweisen von ATP nimmt jedoch ebenfalls ab. Außerdem ist die Verwendung von Arsenat unter Umweltgesichtspunkten weniger erwünscht. Darüber hinaus wird die Abnahme der Intensität des Lichtsignals als unerwünscht angesehen, insbesondere wenn Mikrotiterplatten oder Geräte, die Streifen ablesen können, verwendet werden.
  • Die Kinetik der Luciferin-Luciferase-Reaktion wurde von DeLuca et al. in Analytical Chemistry, 95, 194–198, 1979 untersucht. Die Auswirkungen der Zugabe von Arsenat und anderen Ionen werden von den Autoren dargelegt. Ein Nachteil des vorgeschlagenen Verfahrens ist jedoch die nichtlineare Beziehung der Abnahme der Lichtintensität über einen breiten Konzentrationsbereich der ATP-Bestimmung.
  • Das US-Patent 5,618,682 beschreibt ein Verfahren zum Nachweisen von Luciferase, wobei ein Reaktionsgemisch verwendet wird, das ATP enthält. Das Reaktionsgemisch enthält außer ATP Adenosinmonophosphat, einen Radikalfänger (DTT), Dithiothreitol und einen Chelatbildner (EDTA). Ein Proteaseinhibitor wie Phenylessigsäure wird ebenfalls verwendet.
  • Eine weitere Vorgehensweise entscheidet sich für den Gebrauch von Coenzym A (CoA). In Biochimica et Biophysica Acta, Band 27 (1958), 519–532 haben Airth et al. beschrieben, dass die Zugabe von CoA zu einem Luciferin-Luciferase-Reaktionsgemisch keine Auswirkung auf den Lichtblitz hat, dass aber die Intensität des Lichtsignals nach dem Blitz längere Zeit auf einem höheren Niveau bleibt.
  • Diese Vorgehensweise wird auch im US-Patent 5,650,289 gewählt, welches Methoden und Zusammensetzungen von Reaktionsgemischen vorschlägt, welche die Kinetik der Luciferin-Luciferase-Reaktion beeinflussen. Die beschriebenen Methoden beruhen auf der Verwendung von CoA und DTT. Die Halbwertszeit des Lichtsignals, d. h. die Zeit, nach der 50% des ursprünglichen Lichtsignals beobachtet werden, beträgt 300 bis 500 Sekunden.
  • Das US-Patent 4,246,340 schlägt ebenfalls ein Verfahren zum Erhalten einer Halbwertszeit des Lichtsignals in einer Luciferin-Luciferase-Reaktion von einigen Minuten vor. Das beschriebene Verfahren beruht auf dem Gebrauch von Inhibitoren wie etwa D-Luciferin-Analoga. Ein Beispiel hierfür ist L-Luciferin.
  • In Methods in Enzymology 1978, Band 57, Seiten 3–15, haben DeLuca et al. eine Untersuchung über die Reinigung und Eigenschaften der Leuchtkäfer-Luciferase beschrieben. In dieser Veröffentlichung ist offenbart, wie ATP in einer Messlösung nachgewiesen werden kann, die aus 2,1 ml eines 25 mM Glycylglycin-Puffers, 0,1 ml einer 100 mM Magnesiumsulfat-Lösung und 0,2 ml einer Probe besteht.
  • Wie erwähnt ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein verbessertes Verfahren zum Nachweisen von ATP mittels der Luciferin-Luciferase-Reaktion bereitzustellen, wobei ein Lichtsignal erhalten wird, welches signifikant länger andauert als in dem Stand der Technik beschrieben ist. Außerdem ist es eine Aufgabe der Erfindung, dafür zu sorgen, dass das vorgesehene Verfahren einfach ist und in einem Napf einer Mikrotiterplatte durchgeführt werden kann.
  • Es wurde herausgefunden, dass die gestellten Aufgaben durch Ausführen einer Luciferin-Luciferase-Reaktion in Gegenwart von relativ großen Mengen von Anionen und Kationen, die von zugegebenen Salzen herrühren, gelöst werden. Die Anionen und Kationen bewirken eine nichtkompetitive Hemmung des Luciferase-Enzyms, wodurch die Dauer des Lichtsignals auf eine Halbwertszeit von wenigstens 30 Minuten, bis zu mehr als 8 Stunden verlängert wird.
  • Folglich bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zum Nachweisen von ATP in einer Probe, wobei die Probe Zellen enthält und die Zellen vorher einer Zelllyse in einem alkalischen Medium unterworfen werden, das einen pH über 9,5 aufweist, wobei die Probe mit einem Reaktionsgemisch in Kontakt gebracht wird, um ein Lichtsignal hervorzurufen, wobei das Reaktionsgemisch Luciferin, Luciferase und ein oder mehrere wasserlösliche Salze umfasst, wobei die Gesamtsalzkonzentration wenigstens 0,05 mol/l beträgt und wobei das Lichtsignal gemessen wird.
  • Bei dem Nachweis von ATP gemäß der Erfindung hat sich herausgestellt, dass das Lichtsignal, das in der Luciferin-Luciferase-Reaktion auftritt, wenn ATP vorhanden ist, eine Halbwertszeit von 30 Minuten bis zu mehr als 8 Stunden aufweist. Wenngleich gemäß dem vorliegenden Verfahren ATP genau und einfach in jeder geeigneten Art von Behälter bestimmt werden kann, hat sich gezeigt, dass das Verfahren auf besonders geeignete Weise in den Näpfen von Mikrotiterplatten oder in Flüssigszintillationszählern angewandt werden kann.
  • Mit Luciferase wird ein Enzym bezeichnet, das die Oxidation von Luciferin katalysiert, wobei durch diese Oxidation ein Lichtsignal erzeugt wird. Luciferase kann aus Organismen isoliert werden, die Luciferase erzeugen. Luciferase kann auch aus Zellen gewonnen werden, die mit einem Polynucleotid transformiert oder transfiziert sind, das für eine Luciferase codiert. Vorzugsweise wird eine Luciferase aus dem Leuchtkäfer Photynus pyralis verwendet.
  • Mit Luciferin wird die Substanz D-(–)-2-(6'-Hydroxy-2'-benzothiazolyl)-Δ2-thiazolin-4-carbonsäure bezeichnet. Luciferin kann ebenfalls aus der Natur isoliert werden. Es ist jedoch bevorzugt, dass synthetisch hergestelltes Luciferin verwendet wird, wegen der Zugänglichkeit und der höheren Reinheit, welche diese Form typischerweise aufweist.
  • In diesem Reaktionsgemisch ist Luciferin gewöhnlich in einer Menge zwischen 0,01 und 1 mM, vorzugsweise zwischen 0,05 und 0,5 mM vorhanden. Das Enzym Luciferase ist gewöhnlich in einer Menge zwischen 0,0003 und 0,05, vorzugsweise zwischen 0,001 und 0,03 Gramm pro Liter des Reaktionsgemisches vorhanden.
  • Vorzugsweise enthält das Reaktionsgemisch auch Magnesiumionen. Die Magnesiumionen sind in einer Menge von wenigstens 0,0005 mol pro Liter vorhanden. Üblicherweise ist die Menge an Magnesiumionen nicht größer als 0,2 mol pro Liter.
  • Die Gesamtmenge an Salzen, die in dem Reaktionsgemisch vorhanden ist, beträgt wenigstens 0,05 mol/Liter und vorzugsweise wenigstens 0,10 mol pro Liter. Es wurde herausgefunden, dass die Anwesenheit einer großen Menge von Salzen zu einer Verlängerung des Lichtsignals, das in der Luciferin-Luciferase-Reaktion auftritt, bis zu einer halben Stunde oder mehr führt.
  • Die Menge an Salzen in dem Reaktionsgemisch hängt natürlich von dem Ausmaß ab, in dem die Ionen der Salze imstande sind, eine Hemmung der Luciferase zu verursachen. Ferner ist es wichtig, dass sich die Salze vollständig in dem Reaktionsgemisch auflösen. Die maximale Menge an Salzen, welche verwendet wird, wird deshalb insbesondere durch die Löslichkeit der ausgewählten Salze bestimmt.
  • Im Prinzip kommen alle wasserlöslichen Salze in Frage. Beispiele für geeignete Salze sind Alkalisalze oder Erdalkalisalze von Cl–, Br–, SO4 2–, HSO4 –, HPO4 2–, H2PO4 –, NO3 – und HCO3 –. Gute Ergebnisse werden mit Salzlösungen von Na2HPO4, NaH2PO4 und NaCl erhalten. Vorzugsweise beträgt die Konzentration von NaCl in dem Reaktionsgemisch ungefähr 100 mM.
  • Außer den erwähnten Substanzen kann das Reaktionsgemisch alle üblichen Substanzen enthalten, welche in Luciferin-Luciferase-Reaktionsgemischen verwendet werden.
  • Das Reaktionsgemisch umfasst vorzugsweise auch einen geeigneten Puffer wie Tricin, HEPPS, HEPES, MOPS, Tris, CHAPS oder ein Phosphatsalz. Vorzugsweise wird HEPES oder ein Gemisch aus diesen Puffern verwendet. Solche Puffer können den pH auf einem geeigneten Wert halten. Vorzugsweise wird der pH zwischen 6,5 und 8,2 gehalten. Die Menge des Puffers kann vom Fachmann zweckmäßig ausgewählt werden und liegt gewöhnlich im Bereich zwischen 25 mM und 1 M.
  • Ferner umfasst das Reaktionsgemisch vorzugsweise einen Stabilisator für die Luciferase. Geeignete Beispiele für Stabilisatoren sind ein Serumalbumin eines Säugers, ein Lactalbumin und ein Ovalbumin. Vorzugsweise wird Rinderserumalbumin (BSA) verwendet. Die Menge des Stabilisators liegt unter 1 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht des Reaktionsgemisches.
  • Ferner umfasst das Reaktionsgemisch vorzugsweise ein Maskierungsmittel wie EDTA oder CDTA. Eine solche Substanz ist vorzugsweise in einer Menge von 0,1 bis 10 mM vorhanden.
  • Bei der Probe, welche mit dem vorstehend beschriebenen Reaktionsgemisch in Kontakt gebracht wird, kann es sich im Prinzip um eine beliebige Zellen enthaltende Probe handeln, bei der die Anwesenheit von ATP bestimmt werden soll.
  • Es handelt sich um eine biologische Probe, die z. B. von einer Zellkultur herrührt. Lebende Zellen enthalten bekanntlich ATP. Die Probe enthält Zellen, sollte zuvor einer Zelllyse unterzogen werden, um das in den Zellen vorhandene ATP freizusetzen und nachweisen zu können. Die Menge an ATP ist ein Maß für die Menge der vorhandenen Zellen.
  • Ein Problem, das mit dem Nachweis von ATP in einer zellhaltigen Probe verbunden ist, ist, dass Zellen gewöhnlich ATP-verbrauchende Enzyme wie ATP-asen enthalten, welche das nachzuweisende ATP abbauen und folglich die Messung stören. Gemäß der Erfindung wurde herausgefunden, dass die störende Wirkung von jeglichen ATP-asen durch Ausführen der Zelllyse in einem alkalischen Medium, vorzugsweise unter Verwendung eines nicht-ionischen Detergens, beseitigt werden kann. Als besonders geeignete lysierende Detergenzien haben sich Nonylphenoxypolyethoxyethanol (Triton N101®) und Triton X-100 erwiesen.
  • Bevor die vorliegende Erfindung gemacht wurde, schwankte die Abnahme des Lichtsignals während der Bestimmung von ATP mittels der Luciferin-Luciferase-Reaktion von einigen Prozenten pro Minute bis zu einer Abnahme auf die Hälfte des ursprünglichen Lichtsignals innerhalb einer Minute. Die schnelle Abnahme der Lichtemission der Biolumineszenzreaktion zum Bestimmen von ATP hat dazu geführt, dass die Verwendung der Bestimmung von ATP z. B. zum Quantifizieren von Zellzahlen begrenzt geblieben ist, da nicht nur das Lichtsignal rasch abnimmt, sondern auch ATP-verbrauchende Enzyme das Lichtemissionsmuster beeinflussen und eine noch schnellere Abnahme der Lichtemission verursachen. Mittels dieser Zelllyse stellt die vorliegende Erfindung auch für dieses Problem eine Lösung bereit.
  • Zum Ausführen der Zelllyse wird die Probe mit einer lysierenden Lösung in Kontakt gebracht. Diese Lösung enthält das lysierende Detergens in einer Menge von vorzugsweise 0,1–10 Gramm pro Liter. Der pH der Lösung liegt über 9,5, besonders bevorzugt über 10 und kann mit einer Base wie Natriumhydroxid zweckmäßig eingestellt werden. Der zum Ausführen der Zelllyse erforderliche Inkubationszeitraum kann vom Fachmann auf der Grundlage seiner Fachkenntnis zweckmäßig ausgewählt werden.
  • Nach der Zelllyse wird die Probe mit dem vorstehend beschriebenen Reaktionsgemisch in Kontakt gebracht. Dieser Schritt wird in Gegenwart von Sauerstoff, z. B. an der Luft, durchgeführt. Vorzugsweise werden sowohl die Zelllyse als auch die Luciferin-Luciferase-Reaktion in einem Napf einer Mikrotiterplatte durchgeführt. Zu diesem Zweck werden vorzugsweise 100 μl der aufgelösten Probe und 50 μl des Zelllysegemisches, gefolgt von 50 μl des Reaktionsgemisches, zusammengegeben.
  • Sobald die Probe mit dem Reaktionsgemisch in Kontakt gebracht ist, wird ein Lichtsignal emittiert, wenn ATP in der Probe vorhanden ist. Dieses Lichtsignal ergibt ein Maß für die Menge an ATP, die in der Probe vorhanden ist. Die Menge an ATP kann als ein Maß für die Menge an lebenden Zellen angesehen werden, welche in der Probe vorhanden waren.
  • Das Messen des Lichtsignals und auf dessen Grundlage das Quantifizieren der Menge an ATP kann auf eine beliebige bekannte Weise erfolgen. Hierfür können Geräte wie das TopCount (Packard) oder das Lumicount (Packard) oder andere Plattenluminometer verwendet werden, die für das Messen von Mikrotiterplatten eingerichtet sind. Außerdem können sogenannte Streifenluminometer (strip luminometers) oder Luminometer, die mit Injektionssystemen versehen sind, verwendet werden. Es können auch Flüssigkeitsszintillatoren und andere Geräte verwendet werden, die das Niveau des resultierenden Lichtsignals messen können.
  • Um der Reaktionskinetik der Luciferin-Luciferase-Reaktion Zeit zum Stabilisieren zu geben, ist es bevorzugt, dass man nach dem Zusammengeben der Probe und des Reaktionsgemisches einige Zeit wartet, bevor die Messung begonnen wird. Diese Zeit kann vom Fachmann zweckmäßig festgelegt werden und liegt üblicherweise im Bereich zwischen 5 und 15 Minuten.
  • Die Erfindung stellt auch ein Kit zur Verwendung in dem vorstehend beschriebenen Verfahren zum Nachweisen von ATP bereit.
  • Aufgrund ihrer geringen Stabilität liegen Luciferase und Luciferin in dem Kit vorzugsweise in lyophilisierter Form vor. Um diese Form zu erhalten, kann man wie folgt vorgehen. Ein Gemisch aus den gewünschten Mengen an Luciferase und Luciferin wird in einem Puffer, z. B. einem PBS-Puffer aufgelöst. Vorzugsweise wird auch eine kleine Menge eines Stabilisators, wie etwa BSA, dazugegeben. Die resultierende Zusammensetzung kann in Gegenwart eines üblichen Hilfsmittels wie etwa Trehalose lyophilisiert werden.
  • Außer dem vorstehend beschriebenen Gemisch von Luciferin und Luciferase, vorzugsweise in lyophilisierter Form, umfasst das Kit gemäß der Erfindung eine Pufferlösung, welche die anderen Bestandteile des vorstehend beschriebenen Reaktionsgemisches enthält. Das Kit umfasst auch die vorstehend beschriebene lysierende Lösung.
  • Die Erfindung wird nun anhand der folgenden Beispiele näher erläutert.
  • Beispiel 1
  • Testempfindlichkeit und Linearität des ATPLite-M-Kit. Verdünnungsreihen U937 (menschliche Promyelocyten), HeLa (menschliche Cervixkarzinom) und CHO (chinesische Hamster-Ovarien)-Zellen.
  • U937-Zellen wurden in RPMI-Medium, das mit fötalem Kälberserum (FKS) bis zu einer Endkonzentration von 10% ergänzt war, kultiviert. HeLa-Zellen wurden in Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM), das mit FKS bis zu einer Endkonzentration von 10% ergänzt war, kultiviert. CHO-Zellen wurden in einem 1:1-Gemisch aus DMEM und Ham's F12-Medium, das mit FKS bis zu einer Endkonzentration von 5% ergänzt war, in einem 37°C-Inkubator in einer 5% CO2-Atmosphäre kultiviert.
  • Adhärente CHO- und HeLa-Zellen wurden mit PBS ohne Calciumsalze und Magnesiumsalze gewaschen. Die Zellen wurden durch Inkubation mit einer dünnen Schicht aus 1:10 verdünnter im Handel erhältlicher Trypsin-EDTA-Lösung von dem Kultursubstrat abgelöst und anschließend in Kulturmedium + FKS gesammelt. U937-Suspensionszellen wurden 5 Minuten bei 500 × g in einem 50 ml Falcon-Röhrchen zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in frischem Kulturmedium aufgenommen. Der Zelltiter wurde mittels eines Coulter Counters durch Auszählen einer 1:20-Verdünnung der gesammelten Zellsuspensionen in einer isotonen Lösung bestimmt.
  • Reihenverdünnungen der Zellsuspensionen wurden in Kulturmedium + FKS hergestellt. Ausgehend von Zellsuspensionen mit einem Titer von 781250 Zellen pro Milliliter wurden 1:5-Verdünnungen hergestellt, um Verdünnungsreihen mit 781250, 156250, 31250, 6250, 1250, 250 und 50 Zellen pro Milliliter zu erhalten. 100 Mikroliter Zellsuspensionen wurden in die Näpfe einer 96 Napf-Mikrotiterplatte pipettiert. Nach 2 Stunden Inkubation in einem Inkubator wurden die Zellen durch Zugeben von 50 Mikroliter Säugerzell-Lyselösung (Mammalian Cell Lysis Solution) (Lösung D von Beispiel 4) zu jedem der Näpfe und 2 Minuten Schütteln der Lysate an einer Schüttelplattform lysiert. Danach wurden 50 Mikroliter ATP-M-Puffer (Lösung E von Beispiel 4) zu jedem Napf zugegeben, um die ATP-abhängige Luciferin-Luciferase-Reaktion zu starten. Nach einer Stunde Inkubation wurde die Intensität des freigesetzten Lichts in jedem Napf mittels eines Packard Top-Count bestimmt. Die Ergebnisse sind in den 1, 2 und 3 gezeigt.
  • Die 1, 2 und 3 zeigen, dass ungeachtet der gemessenen Zelllinie es eine lineare Beziehung bzw. Korrelation zwischen der Zahl der Zellen, die sich in jedem Napf befinden, und der zugehörigen gemessenen Lichtintensität (ausgedrückt in Zählereignissen pro Sekunde (counts per second)) besteht. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Zahl von Zellen, die in einem Napf vorhanden sind, der getestet werden soll, genau bestimmt werden kann, indem die gemessene Lichtintensität mit einer Standardlinie in Beziehung gesetzt wird. Ferner erweist sich die gemessene Lichtintensität über eine weite Bandbreite von Zellzahlen als direkt proportional zu der Zahl der Zellen.
  • Legende zu der Figur:
  • Linearität ATPLite-M-Assay bei Gebrauch von verschiedenen Zelllinien. Es wurde eine Verdünnungsreihe von Zellen aus einer Zellsuspension hergestellt. Zellen (0; 5; 25; 125; 625; 3125; 15625; 78125) wurden zu den Näpfen einer 96 Napf-Platte zugegeben. Nach 2 Stunden Inkubation wurden 50 μl Lyselösung zugegeben. Nach der Lyse wurden 50 μl Assay-Substratpuffer zugegeben. Die Lichtintensität wurde mittels eines Packard Top-Count gemessen. Die Figur zeigt auf einer doppelt-logarithmischen Skala die Beziehung zwischen der Zellzahl (X-Achse) und der gemessenen Lichtintensität (in Zählereignissen pro Sekunde) (CPS, Y-Achse). Die punktierte Linie in jedem Diagramm gibt das Hintergrundniveau des Assays an.
  • Die folgenden Beispiele/Versuche zeigen, dass mit einer einfachen Formulierung ein Lichtsignal erhalten werden kann, welches mit der Zeit langsam abnimmt. Das Signal ist der Konzentration von ATP in dem Gemisch, das gemessen werden soll, proportional.
  • Beispiel 2 (nicht Teil der beanspruchten Erfindung)
  • Zu diesem Zweck wurde eine Verdünnungsreihe (1:10) von ATP in Wasser von 1E-06 M bis 1E-11 M ATP hergestellt. Zu 100 μl von jeder von diesen ATP-Lösungen wurden 100 μl Lösung A in Näpfe einer weißen 96 Napf-Mikroplatte zugegeben und das Lichtsignal wurde an einem Packard TopCount im Zeitraum von 4 Stunden wiederholt gemessen. Formulierung Lösung A:
    HEPES 50 mM
    EDTA 4 mM
    MgCl2 10 mM
    NaCl 260 mM
    BSA 1,50 Gramm pro Liter
    Trehalose 5,0 Gramm pro Liter
    D-Luciferin 0,2 mM
    Luciferase 6 mg pro Liter
    pH mit NaOH auf 7,8 eingestellt
  • Die Endkonzentrationen der Komponenten von Lösung A und des ATP in dem 1:1-Gemisch von Lösung A und der ATP-Lösung werden aufgrund der Vermischung dieser zwei Lösungen in den Näpfen zweimal niedriger.
  • Die Ergebnisse sind wie folgt:
    Top Count CPS (Zählereignisse pro Sekunde)
    ATP-Konzentration in mol pro Liter
    Zeit (Minuten) 5,00E-07 5,00E-08 5,00E-09 5,00E-10 5,00E-11 5,00E-12 0
    0 18775000 1982067 195134 20115 2553 742 505
    15 17535000 1839266 181276 18525 2071 379 204
    30 16785000 1757748 173262 17671 1975 353 177
    60 15660000 1648084 162572 16667 1819 305 139
    90 14700000 1553360 152886 15739 1676 305 135
    120 13795000 1461522 144238 14641 1549 274 122
    150 12955000 1376604 135801 13854 1505 261 117
    180 12135000 1292035 127490 12934 1434 242 117
    210 11455000 1222251 120558 12274 1350 234 113
    240 10830000 1155314 114113 11587 1265 217 103
  • Aus den Ergebnissen folgt, dass das Signal zu der Konzentration von ATP linear ist und dass das Signal mit der Zeit langsam abnimmt, es dauert mehr als 4 Stunden, bevor das Signal auf die Hälfte des Signals der ersten Messung abgenommen hat (siehe auch 4).
  • Beispiel 3 (nicht Teil der beanspruchten Erfindung)
  • Zu diesem Zweck wurde eine Verdünnungsreihe (1:10) von ATP in Wasser von 1E-06 M bis 1E-11 M ATP hergestellt. Zu 100 μl von jeder dieser ATP-Lösungen wurden 100 μl Lösung B in Näpfe einer weißen 96 Napf-Mikroplatte zugegeben und das Lichtsignal wurde an einem Packard TopCount im Zeitraum von 9,5 Stunden wiederholt gemessen. Formulierung Lösung B
    HEPES 175 mM
    EDTA 2 mM
    MgCl2 2 mM
    NaCl 100 mM
    NaH2PO4 75 mM
    BSA 1,5 Gramm pro Liter
    Trehalose 5,0 Gramm pro Liter
    D-Luciferin 0,2 mM
    Luciferase 6 Milligramm pro Liter
    Triton N-101 2,0 Gramm pro Liter
    pH mit NaOH auf 7,4 eingestellt
  • Die Endkonzentrationen der Komponenten von Lösung B und des ATP in dem 1:1-Gemisch von Lösung B und den ATP-Lösungen werden aufgrund der Vermischung dieser zwei Lösungen in den Näpfen zweimal niedriger.
  • Die Ergebnisse sind wie folgt:
    Top Count CPS (Zählereignisse pro Sekunde)
    ATP-Konzentration in mol pro Liter
    Zeit (Minuten) 5,00E-07 5,00E-08 5,00E-09 5,00E-10 5,00E-11 5,00E-12 0
    0 13350000 1347570 136270 14221 2091 524 376
    30 12393333 1256867 127691 13369 1597 404 292
    60 11700000 1192631 121205 12775 1533 384 320
    90 11063333 1134309 115303 12177 1461 360 258
    120 10500000 1079513 110011 11573 1380 355 241
    150 9934357 1024827 104686 11020 1314 337 232
    180 9475816 980343 100124 10504 1246 323 215
    210 9031766 935826 95537 10113 1198 307 216
    240 8632510 897371 91619 9647 1130 298 196
    270 8256822 859530 87607 9299 1101 277 190
    300 7912674 825082 84268 8927 1042 261 175
    330 7572644 791870 80809 8531 1010 262 169
    360 7250944 758263 77532 8193 959 247 164
    390 6949015 727838 74190 7828 943 242 157
    420 6660917 698798 71069 7471 901 219 157
    450 6382937 671368 68224 7192 844 208 144
    480 6118376 643632 65336 6928 820 209 139
    510 5874066 618683 62905 6608 785 197 137
    540 5638346 594449 60334 6366 750 179 127
    570 5416984 571113 57747 6134 716 186 124
  • Aus den Ergebnissen geht hervor, dass das Signal zu der Konzentration von ATP linear ist und dass das Signal mit der Zeit langsam abnimmt, wobei die Halbwertszeit in diesem Beispiel ungefähr 7 Stunden beträgt (siehe auch 5).
  • Beispiel 4
  • Zu diesem Zweck wurde eine Verdünnungsreihe (1:2) von CHO (chinesische Hamster-Ovarien)-Zellen in Dulbecco's MEM, das mit fötalem Kälberserum (FKS) bis zu einer Endkonzentration von 10% ergänzt war, von 37000 Zellen pro 100 μl bis 36 Zellen pro 100 μl in einer weißen ”Gewebekultur-behandelten” Mikroplatte hergestellt. Zu 100 μl von jeder Zellverdünnung wurden 100 μl Lösung C zugegeben und das ATP-abhängige Lichtsignal wurde an einem Packard TopCount im Zeitraum von 9,5 Stunden wiederholt gemessen. Formulierung Lösung C:
    HEPES 175 mM
    EDTA 2 mM
    MgCl2 2 mM
    NaCl 65 mM
    NaH2PO4 75 mM
    BSA 1,5 Gramm pro Liter
    Trehalose 5,0 Gramm pro Liter
    D-Luciferin 0,2 mM
    Luciferase 6 Milligramm pro Liter
    Triton N-101 2,0 Gramm pro Liter
    pH mit NaOH auf 7,4 eingestellt
  • Die Ergebnisse sind wie folgt:
    Top Count CPS (Zählereignisse pro Sekunde)
    Zellzahl pro 100 μl DMEM, 10% FKS
    Zeit (min) 37000 18500 9250 4625 2313 1156 578 289 145 72 36 0
    0 15960000 8418265 4754536 2402330 1231988 636875 333584 171599 90251 46440 25290 307
    30 10543599 5818309 3514526 1829353 948150 494213 257975 133956 71035 36786 20003 232
    60 7845328 4409567 2776537 1516077 798829 420828 220374 114631 61226 31897 17466 326
    90 6081600 3499910 2300989 1304974 697804 371671 195253 101888 54620 28734 15716 384
    120 4861105 2851444 1950778 1143700 619684 333162 176169 92174 49329 26481 14342 421
    150 3969965 2354948 1672153 1011224 554333 301213 159991 83877 45045 24537 13194 478
    180 3288088 1962123 1442805 899695 498440 273310 145935 76865 41211 23034 12292 557
    210 2753856 1646775 1250622 803773 450312 249347 133912 70599 37878 21785 11425 601
    240 2326726 1388681 1087504 720162 407623 227830 122869 64991 34916 20438 10603 652
    270 1977520 1175021 946291 646642 368666 208627 112948 59850 32069 19261 9919 705
    300 1689400 995294 825327 580632 335085 191058 103885 55207 29751 18112 9332 775
    330 1451102 846160 719904 522876 304543 175235 95993 51077 27398 17061 8653 814
    360 1250777 721240 628896 470600 277002 161169 88484 47213 25469 16006 8137 895
    390 1082119 617318 550186 423884 252183 148175 81697 43773 23414 15137 7675 960
    420 939287 529036 481362 382755 229965 136601 75596 40654 21879 14198 7186 996
    450 817431 455126 421545 345867 209675 125485 70111 37690 20180 13248 6803 1037
    480 712973 392617 369411 312679 191303 116137 64888 34819 18795 12439 6384 1079
    510 622275 339440 323655 282342 174756 106854 60168 32401 17426 11603 6048 1100
    540 544737 294403 283647 255059 159870 98720 56112 30079 16271 10952 5714 1157
    570 478681 257095 249556 231073 146335 91334 52145 28072 15183 10261 5406 1181
  • Die Ergebnisse zeigen, dass das Lichtsignal mit der Zahl der Zellen korreliert, dass aber die Geschwindigkeit der Abnahme des Lichtsignals von der Zahl der Zellen abhängt. Die Halbwertszeit bei hohen Zellzahlen beträgt ungefähr 1 Stunde. Diese Zeit nimmt entsprechend zu, wenn weniger Zellen vorhanden sind (siehe auch 6).
  • Durch Aufteilen der Lösung C in zwei Teile, Lösung D und Lösung E, und aufeinanderfolgendes Zugeben dieser zu einer Zellsuspension kann ein System hergestellt werden, dessen Geschwindigkeit der Abnahme des Lichtsignals von der Zahl der Zellen unabhängig ist. Formulierung Lösung D:
    Triton N-101 4 Gramm pro Liter
    NaOH 100 mM
    Formulierung Lösung E:
    HEPES 350 mM
    EDTA 4 mM
    MgCl2 4 mM
    NaCl 130 mM
    NaH2PO4 150 mM
    BSA 3,0 Gramm pro Liter
    Trehalose 10,0 Gramm pro Liter
    D-Luciferin 0,4 mM
    Luciferase 12 Milligramm pro Liter
    pH mit NaOH auf 7,4 eingestellt
  • Zu diesem Zweck wurde eine Verdünnungsreihe (1:2) aus CHO (chinesische Hamster-Ovarien)-Zellen in Dulbecco's MEM, das mit fötalem Kälberserum (FKS) bis zu einer Endkonzentration von 10% ergänzt war, von 37000 Zellen pro 100 μl bis 36 Zellen pro 100 μl in einer weißen ”Gewebekultur-behandelten” Mikroplatte hergestellt. Zu 100 μl von jeder Zellverdünnung wurden 50 μl von Lösung D zugegeben und die Mikroplatte wurde ungefähr 2 Minuten geschüttelt. Anschließend wurden 50 μl Lösung E zugegeben und nochmals geschüttelt. Das ATP-abhängige Lichtsignal wurde an einem Packard TopCount im Zeitraum von 9,5 Stunden wiederholt gemessen.
  • Die Ergebnisse sind wie folgt:
    Top Count CPS (Zählereignisse pro Sekunde)
    Zellzahl pro 100% μl DMEM, 10% FKS
    Zeit (min) 37000 18500 9250 4625 2313 1156 578 289 145 72 36 0
    0 15926667 9265862 5064576 2701038 1377222 729482 377677 201242 107055 54417 30508 476
    30 15266667 8565421 4633551 2466607 1258022 666151 345293 183669 96291 49516 27265 362
    60 14260000 7866295 4254332 2273127 1159500 613956 317827 169234 88363 45655 25126 319
    90 13343333 7273971 3934740 2107094 1075668 569032 294829 157511 81935 42201 23379 292
    120 12473333 6749126 3655833 1961272 1001506 528935 274806 147387 76593 39225 22192 273
    150 11666667 6267367 3398278 1822955 932186 492629 256308 137758 71842 36445 20962 260
    180 10900000 5824752 3160377 1697725 868001 458433 239121 129036 67342 33961 20084 243
    210 10170000 5425512 2944913 1582163 808965 426978 223166 120719 63158 31531 19098 229
    240 9499379 5053815 2742458 1475159 754209 398221 208299 112792 59781 29540 18104 229
    270 8881891 4709434 2555135 1373624 703270 370603 194672 105689 56624 27415 17170 228
    300 8286678 4391574 2379784 1281135 656101 345122 181686 98815 53510 25638 16183 218
    330 7753348 4097355 2220083 1195051 612369 322145 170040 92561 50709 23823 15318 221
    360 7249262 3824937 2070513 1114717 571713 300295 158893 86465 48232 22270 14375 214
    390 6782170 3572479 1932779 1040446 534360 280340 148864 81022 45735 20814 13719 212
    420 6353719 3342239 1805662 973076 499430 262197 139251 76002 43376 19535 12818 220
    450 5946932 3125245 1687138 908986 467072 244972 130067 71109 40732 18211 12120 211
    480 5579366 2923640 1576153 849185 436177 228964 121946 66829 38820 17005 11397 209
    510 5232171 2736005 1473761 793583 408269 214142 114224 62631 36733 15963 10582 213
    540 4908614 2561487 1377321 742845 382487 200094 106784 58884 34706 14993 9992 210
    570 4612006 2401882 1289080 695193 358281 187441 100059 55115 32806 14008 9323 212
  • Aus den Ergebnissen geht hervor, dass das Lichtsignal linear mit der Zahl der Zellen korreliert. Nun ist auch die Geschwindigkeit der Abnahme des Signals von der Zahl der Zellen unabhängig geworden. In diesem Beispiel beträgt die Halbwertszeit ungefähr 5 Stunden (siehe auch 7).

Claims (8)

  1. Verfahren zum Nachweisen von ATP in einer Probe, wobei die Probe Zellen enthält und die Zellen vorher einer Zelllyse in einem alkalischen Medium unterworfen werden, das einen pH über 9,5 aufweist, wobei die Probe mit einem Reaktionsgemisch in Kontakt gebracht wird, um ein Lichtsignal hervorzurufen, wobei das Reaktionsgemisch Luciferin, Luciferase und ein oder mehrere wasserlösliche Salze umfasst, wobei die Gesamtsalzkonzentration wenigstens 0,05 mol/Liter beträgt und wobei das Lichtsignal gemessen wird.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Gesamtsalzkonzentration wenigstens 0,10 mol/Liter beträgt.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Salze ausgewählt sind aus Alkalisalzen oder Erdalkalisalzen von Cl–, Br–, SO4 2–, HSO4 –, HPO4 2–, H2PO4 –, NO3 – und HCO3 –.
  4. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Reaktionsgemisch auch einen Puffer enthält, der das Reaktionsgemisch bei einem pH zwischen 6,5 und 8,2 hält.
  5. Verfahren nach den Ansprüchen 1–4, wobei die Zelllyse unter Verwendung eines lysierenden Detergens erfolgt.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das lysierende Detergens ein nicht-ionisches Detergens ist.
  7. Kit zur Verwendung in einem Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, umfassend ein Gemisch aus Luciferin und Luciferase und eine Pufferlösung, umfassend ein oder mehrere wasserlösliche Salze, um ein Reaktionsgemisch mit einer Gesamtsalzkonzentration, die wenigstens 0,05 mol/Liter beträgt, zu erhalten, wobei der Kit außerdem eine alkalische Zelllyselösung umfasst, wobei die Lösung ein lysierendes Detergens umfasst und einen pH über 9,5 aufweist.
  8. Kit nach Anspruch 7, wobei das Gemisch aus Luciferin und Luciferase in lyophilisierter Form vorhanden ist.
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