DE3882862T2

DE3882862T2 - Verfahren zum Extrahieren von ATP.

Info

Publication number: DE3882862T2
Application number: DE88308677T
Authority: DE
Inventors: John Richard Middelton Hammond; William John Simpson
Original assignee: Lumac BV
Current assignee: Lumac BV
Priority date: 1987-09-22
Filing date: 1988-09-20
Publication date: 1994-03-24
Anticipated expiration: 2008-09-21
Also published as: EP0309184A2; DE3882862D1; EP0309184A3; GB8722252D0; EP0309184B1; US5004684A; ES2058299T3

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Extraktion von ATP aus einem Mikroorganismus und insbesondere auf ein Verfahren für eine solche Extraktion, welche nachfolgende Verwerfungen an einer Probeentnahme mit der Glühwürmchen-Luciferase verringert.
Der Nachweis von Brauerei-Mikroorganismen für Steuerungszwecke der Qualität und des Verfahrens wird gegenwärtig unter Verwendung von festen oder flüssigen Kulturmedien durchgeführt, wobei Inkubationszeiträume zwischen drei und sieben Tagen benötigt werden, bevor die Ergebnisse der Tests bekannt sind. Die historische Natur von mikrobiologischen Ergebnissen beim Brauen ergibt darin ein Problem, daß als Folge der hohen Kosten des Warenhausraums Bier manchmal zum Kleinverkauf abgegeben werden muß, bevor die Ergebnisse der Tests bekannt sind. Alternativ muß das Bier in dem Warenhaus der Brauerei gelagert werden. Manche Brauereien haben nicht genügend Warenhausraum zur Verfügung, um diese Option anzuwenden. Wenn die Ergebnisse von mikrobiologischen Analysen es erfordern, daß Korrekturmaßnahmen ergriffen werden, muß daher das Bier häufig von den Einzelhändlern an die Brauerei zurückgegeben werden.
Viele andere Industrien kennen das Erfordernis für rasche mikrobische Überwachungstechniken. Möglicherweise am wichtigsten unter allen ist das Erfordernis der Nahrungsmittelindustrie zur Überwachung der Nahrungsmittel, die für den menschlichen Verbrauch bestimmt sind, auf die Anwesenheit von pathogenen Organismen (insbesondere Nahrungsmittel- Vergiftungsorganismen). Zusätzlich sind rasche Nachweistechniken für Mikroorganismen in solchen unterschiedlichen Bereichen erforderlich, wie bspw. in der klinischen Chemie, der Wasserindustrie, der Textilindustrie und der pharmazeutischen Industrie, wo ein Verderb von Waren, das Gesundheitswesen oder die Gesetzgebung das Erfordernis für solche Methoden erzeugt.
Die Verwendung von raschen mikrobischen überwachungstechniken in der Brauindustrie ergibt verschiedene Vorteile gegenüber den herkömmlichen Verfahren:
1. Verringerung des Prozessrisikos und der Unbestimmtheit
2. Eliminierung oder Verringerung des Umfangs der Handelsrückrufe
3. Möglichkeit zur Veranlassung von Korrekturmaßnahmen in Abhängigkeit von den Ergebnissen, wodurch die teure Wiederaufbereitung von Bier verringert wird. Vorteile von einer ähnlichen Natur kommen auch bei anderen Industrien zur Anwendung.

Stand der Technik

Ein der am meisten versprechenden Verfahren, die für eine rasche mikrobische Überwachung zur Verfügung stehen, basiert auf der Messung des mikrobischen Adenosin-Triphosphat (ATP) mit einer Glühwürmchen-Luciferase-Reaktion. ATP wird in lebenden Zellen gefunden, nicht aber in toten Zellen. In Anwesenheit von gereinigtem Enzym (Luciferase) und Substrat (D-Luciferin) von dem amerikanischen Glühwürmchen (Photinus pyralis) und genügend Magnesium als Kofaktor findet die folgende Reaktion statt: ATP + Sauerstoff + D-Luciferin Magnesium Luciferase Decarboxyluciferin + Adenosin-Monophosphat + anorganisches Phosphat + Kohlenstoffdioxid + Licht
Die durch die Reaktion erzeugte Lichtmenge ist direkt proportional zu der ATP-Konzentration und wird durch Verwendung eines sensitiven Lichtdetektors nachgewiesen. Es können ATP-Konzentrationen von nur 1 · 10&supmin;¹&sup8; M unter Verwendung dieses Probeentnahmesystems aufgefunden werden. Um die Konzentration von mikrobischem ATP in einer Probe zu schätzen, muß das ATP zuerst von dem Mikroorganismus extrahiert werden. Eine maximale Empfindlichkeit der Probeentnahme kann nur erreicht werden, wenn
i) die Lichtabgabe durch den Extrakt oder das Extraktionsmittel nicht verringert (ausgelöscht) wird
ii) die Zellenextrakte nicht verdünnt werden, bevor die Probeentnahme durchgeführt wird.
Die Kationtenside Benzalkoniumchlorid (siehe Siro et al, European Journal of Applied Microbiology and Biotechnology 1982, 15, 258-264) und Dodecyltrimethylammoniumbromid (siehe Lundin, Seiten 491-501 in Analytical Applications of Bioluminescence ans Chemiluminescence. Kricka, L.J. et al (Eds) Academic Press, London, 1984) sind dafür verwendet worden, mikrobisches ATP von Hefe bzw. von Hefe und Bakterien zu extrahieren. Obwohl Lundin und Siro et al ATP von Mikroorganismen mit diesen kationischen Detergentien extrahieren konnten, haben sie gefunden, daß die aus solchen Verfahren resultierenden Extrakte die Luciferase-Reaktion gegensätzlich beeinflußten und einen raschen Abfall der Lichtausbeute brachten. Als ein Ergebnis wurde eine beträchtliche Verdünnung des Extrakts gefordert, bevor die ATP- Probeentnahme an solchen Proben ausgeführt werden konnte, was folglich die Sensivität der Probeentnahme erniedrigte. Als ein alternatives Vorgehen zu der Verdünnung hat Lundin gefunden, daß in dem Fall von Dodecyltrimethylammoniumbromid der Abfall der Lichtausbeute durch die Hinzufügung von Protein (Rinderserum Albumin) zu der Probeentnahme verringert werden konnte. Die geforderte Konzentration des Albumins (2.5 - 10% w/v) verzögerte jedoch stark die Lichtausbeute und verringerte wieder die Sensivität der Probeentnahme.
Die Verwendung von Tensiden zur Extraktion von mikrobischem ATP ist in der GB-A-1 604 249 von Kolehmainen, S. und Tarkkanen, V.: Selektive Messung von somatischen und mikrobischen Zellen. erörtert. In dieser Beschreibung wird die Verwendung sowohl von ethoxylierten Aminen wie auch von quarternären ethoxylierten Aminen für die Extraktion von ATP vorgeschlagen. Durch eine sorgfältige Manipulation des Verhältnisses zwischen dem einen Tensid und dem anderen konnten sie den Abfall der Reaktionsrate begrenzen (aber nicht eliminieren), die mit solchen Verbindungen verknüpft ist. Diese Extraktionsmittel haben jedoch immer noch eine Erhöhung der Lichtausbeute von der Reaktion beeinflußt und damit die Präzision der Probeentnahme verringert.
Ein kommerziell zu erhaltendes ATP-Freisetzmittel (Nucleotide Releasing Buffer (NRB); Lumac BV, Holland) wird von dem Hersteller als ein Gemisch von "ionischen Detergentien" bezeichnet, jedoch beeinflussen die Extrakte, die mit diesem Reagens hergestellt werden, die Kinetik der Luciferase-Reaktion, wenn sie nicht vor der Durchführung der ATP-Probeentnahme verdünnt werden (in einer ähnlichen Art und Weise wie bei den vorstehend beschriebenen Verbindungen)
Andere zur Verfügung stehende Extraktionsverfahren (siehe Stanley, P.E. in: Methods in Enzymology, 1986, 133, 14-22), wie bspw. die Trichloressigsäure-Extraktion und die Dimethylsulphoxid-Extraktion, benötigen wieder eine Verdünnung vor der Durchführung der ATP-Probeentnahme, weil das Extraktionsmittel die Luciferase-Reaktion stört, obwohl damit ATP wirksam von dem Mikroorganismus extrahiert werden kann.
Das nichtionische Detergens Polyoxyethyl en-Sorbitan-Monooleat (Tween 80, Warenzeichen) wird in mikrobiologischen Anwendungen für die Inaktivierung von vielen Antimikrobenverbindungen verwendet, einschließlich quarternären Ammoniumverbindungen (siehe Russel et al, Journal of Applied Bacteriology, 179, 46, 207-245). Die Verbindung wird bspw. während der Tests zur Bestimmung des Wirkungsgrades von antimikrobischen Mitteln für eine Inaktivierung jedes antimikrobischen Mittels verwendet, welches möglicherweise mit dem Impfmittel übertragen wurde. Wenn in dem System ein antimikrobisches Mittel verblieben ist, könnte es fortgesetzt wirken, wodurch sich eine Überschätzung des Wirkungsgrades der antimikrobischen Aktivität der Substanz ergeben könnte. Das Prinzip wurde bisher nicht auf die Inaktivierung eines ATP-Extraktionsmittels für den Zweck der Versicherung einer biochemischen Verträglichkeit mit einem Probeentnahme- System angewendet. Tatsächlich hat sich gezeigt, daß nichtionische Detergentien die Kinetik der Glühwürmchen-Luciferase-Reaktion beeinflussen, nämlich unter bestimmten Bedingungen die Reaktionsrate vergrößern (siehe Kricka, L.J. & DeLuca, M., Archives of Biochemistry and Biophysics, 1982, 217, 674-681)

Zusammenfassung der Erfindung

Gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Extraktion von ATP aus einem Mikroorganismus zur Verfügung gestellt, welches eine Berührung des Mikroorganismus mit einem ATP-Freisetzmittel und eine Berührung der resultierenden Lösung mit einem Neutralisiermittel umfaßt, welches im wesentlichen zur Eliminierung der Verwerfungswirkung des Freisetzmittels an der nachfolgenden ATP-Probeentnahme wirkt. Das Freisetzmittel ist vorzugsweise ein Kationtensid, welches vorzugsweise mit einem nichtionischen Tensid als einem Neutralisiermittel berührt wird. Das Neutralisiermittel wird vorzugsweise mit einer größeren Konzentration verwendet, um alle Reste des Freisetzmittels zu neutralisieren. Das nichtionische Tensid ist vorzugsweise ausgewählt unter Tween 20 (Warenzeichen), Tween 60 (Warenzeichen), Tween 80 (Warenzeichen), Polyoxyethylenether W1 oder Triton X-100 (Warenzeichen).
Die Probeentnahme kann durchgeführt werden durch:
a) ein Pipettieren einer Probeentnahme von 10-200 ul einer Probe in eine transparente Cuvette;
b) ein Pipettieren von 10-200 ul des Freisetzmittels in die Cuvette zur Extraktion von ATP;
c) ein Pipettieren von 10-200 ul des Neutralisiermittels in einer Konzentration in der Cuvette höher als das Freisetzmittel, um das Freisetzmittel zu neutralisieren;
d) eine Anordnung der Cuvette in einem lumineszierenden Photometer;
e) eine Messung der Menge des biolumineszierenden Lichts, das durch ATP in der Cuvette nach der Hinzufügung von 50-200 ul eines Glühwürmchen-Luciferin-Luciferase- Reagens in einem biochemischen Puffer mit einem pH-Wert von 7.2-8.5 erzeugt wurde;
f) eine Hinzufügung einer bekannten Menge von ATP in 10-20 ul in die gemessene Cuvette und wiederholte Messung der Menge der Biolumineszens in der Cuvette; und
g) eine Berechnung der Menge von ATP in der Probe durch diese beiden biolumineszierenden Lichtablesungen unter Verwendung des internen Standardisierungsprinzips.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist auch ein Kit für die Probeentnahme von ATP in der Mikroorganismusprobe bereitgestellt, wobei das Kit besteht aus:
a) einem Probeentnahmepuffer;
b) einem Glühwürmchen-Luciferin-Präparat;
c) einem Kationtensid; und
d) einem nichtionischen Tensid.
Der Probeentnahmepuffer hat vorzugsweise einen pH-Wert von 7.2-8.2, insbesondere von etwa 7.75. Vorzugsweise umfaßt der Probeentnahmepuffer ein Mittel für die Chelation von bivalenten Kationen.

Detaillierte Beschreibung

Die vorliegende Erfindung schafft somit ein einfaches Verfahren für die ATP-Extraktion von Mikroorganismen in einer solchen Art und Weise, daß die so hergestellten Extrakte die Kinetik der Glühwürmchen-Luciferase-Reaktion nicht beeinflussen, die für die Probeentnahme des extrahierten ATP angewendet wird, sodaß dadurch die maximale Sensivität und Prazision der Probeentnahme erleichtert wird. Das Verfahren umfaßt die ATP-Extraktion von einer Suspension des Mikroorganismus mit einem Kationtensid (Detergens) und dann eine Neutralisierung des Kationtensids. Auf diese Weise wird eine Störung der Luciferase-Reaktion durch das Kationdetergens (siehe Beispiel 1) vermieden. Alle Reagensien werden auf einen Bereich des pH-Wertes von 7.2-8.2 gepuffert, obwohl ein pH-Wert von 7.75 als optimaler pH-Wert für die Glühwürmchen-Reaktion bevorzugt wird. Der Puffer kann ein Mittel für eine Chelation von bivalenten Kationen enthalten, welches Ethylendiamin-Tetraessigsäure (EDTA) sein kann, wodurch die Wirkung von ATP-Abbauenzymen gestört wird, die in den Zellenextrakten vorhanden sein können. Die unter Verwendung dieser Technik hergestellten Extrakte sind in hohem Maße kompatibel mit der Glühwürmchen-Luciferase und sind daher zur Verwendung in Systemen ideal geeignet, welche das Enzym in einer immobilisierten Form verwenden.
Das niedrige Auffinden eines Mikroorganismus, eine Verdünnung der Extrakte, muß vermieden werden, sodaß aus diesem Grund die vorliegende Erfindung einen beträchtlichen Vorteil gegenüber den zur Verfügung stehenden Verfahren ergibt.
Die bei der vorliegenden Erfindung angegebenen Verfahren ergeben überhaupt keine Störung bei der Luciferase-ATP- Probeentnahme sowohl hinsichtlich der Sensitivität wie auch der Prazision. Die Sensitivität ist optimal, weil:
(a) das Extraktionsmittel die Intensität der Lichtemission von dem Luciferase-System nicht beträchlich beeinflußt,
(b) das Extraktionsmittel in wässrigen Systemen hoch löslich ist und daher auf das Zellenlösemittel in einer konzentrierten Form angewendet werden kann.
Die Präzision ist optimal, weil das Extraktionsmittel die Kinetik des Probeentnahmesystems nicht beeinträchtigt; die Berechnung einer unbekannten ATP-Konzentration aus einem Vergleich mit dem Ansprechen, das von einer bekannten ATP- Konzentration (der internen Standardtechnik) erhalten wurde, ist nicht durch Fehler beeinflußt, die durch Änderungen bei der Reaktionsrate herbeigeführt sind.
Die Erfindung wird nunmehr in den folgenden Beispielen und unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen veranschaulicht, bei welchen
Fig. 1 die Wirkung des Freisetzmittels Benzethoniumchlorid auf die Kinetik von LUMIT PM (Warenzeichen) zeigt und
Fig. 2 die Wirkungen des Freisetzmittels Benzethoniumchlorid auf die Kinetik von LUMIT PM (Warenzeichen) mit oder ohne ein nichtionisches Detergens zeigt.

Beispiel 1

Wirkung der quarternären Ammoniumverbindung Benzethoniumchlorid auf ein kommerzielles Glühwürmchen-Luciferase/ Luciferin-Reagens.
Ein Picomol von ATP-Standard (1 pM in 10 ul) wurde an eine Cuvette übergeben. Zu dieser wurden hinzugefügt 100 ul von
(a) eines Probeentnahmepuffers (N-2-Hydroxyethylpiperazin-N-2-Ethansulfonsäure (HEPES) 0.025 M: 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), pH 7.75), oder
(b) Benzethoniumchlorid (0.008-0.16% w/v in einem Probeentnahmepuffer pH 7.75).
Die lumineszierende Reaktion wurde durch die Zufügung von 100 ul eines kommerziellen Glühwürmchen-Luciferase/Luciferin- Präparats (Lumit PM, Lumac BV, Holland) gestartet. Die Lichtausbeute wurde kontinuierlich überwacht, um die Signalstabilität zu überprüfen, wobei ein mit einem LKB-Plotter verbundener LUMAC 2010A-Biozähler verwendet wurde. Die Ergebnisse sind in der Fig. 1 gezeigt. Benzethoniumchlorid ergibt eine Verringerung der Reaktionsrate (nicht Ausbeute) bei allen Konzentrationen und eine Erhöhung der Lichtausbeute bei manchen Konzentrationen.

Beispiel 2

Die Kinetik eines kommerziellen Glühwürmchen-Luciferase/ Luciferin-Reagens in Gegenwart von Benzethoniumchlorid mit oder ohne das Neutralisiermittel Tween 80 (Warenzeichen)
Ein Picomol von APT-Standard (1 pM in 10 ul) wurde an eine Cuvette übergeben. Zu dieser wurde eines der folgenden hinzugefügt:
(a) 200 um eines Probeentnahmepuffers (siehe Beispiel 1);
(b) 200 um von 0.02% Benzethoniumchlorid in einem Probeentnahmepuffer;
(c) 100 ul von 0.04% Benzethoniumchlorid in einem Probeentnahmepuffer, dann 100 ul von 2.2% Tween 80 (Warenzeichen) in einem Probeentnahmepuffer.
Alle Reaktionen wurden durch die Zufügung von 100 ul Lumit PM (Warenzeichen) gestartet. Die Lichtausbeute wurde wie im Beispiel 1 kontinuierlich überwacht. Die Ergebnisse sind in der Fig. 2 gezeigt. Die Erhöhung der Lichtausbeute und die erhöhte Abfallrate, die durch Benzethoniumchlorid verursacht ist, wird in Gegenwart von Tween 80 (Warenzeichen) verhindert.

Beispiel 3

Vergleich von Verfahren der ATP-Extraktion von Mikroorganismen.

Vergleich der Extraktionsverfahren

i) Präparierung von Testorganismen:
Saccharomyces cerevisiae NCYC 1342, Lactobacillus brevis BSO 28 und Obesumbacterium proteus BSO 434 wurden in 10 ul Volumina von flüssigen Medien bei 25ºC ohne ein Schütteln zum Wachsen gebracht: Sacc. cerevisiae and O. proteus wurden an einem WLM-Medium (Oxoid Ltd., Basingstoke, Hants, Produkt No. CM 309) zum Wachsen gebracht, L. brevis wurde in einem MRS- Medium (Oxoid Ltd, Produkt No. CM 359) (BSO: Sammlung eines Bierverschmutzungsorganismus, Brewing Research Foundation, Nutfield, Redhill, Surrey RH1 4 HY, U.K.; NCYC: Nationale Sammlung von Hefekulturen, Norwich NR4 7UA, U.K.) zum Wachsen gebracht. Die Organismen wurden vor der Extraktion in sterilem deionisiertem Wasser auf die gewünschte Konzentration verdünnt.
ii) ATP-Extraktion von den Testorganismen:
ATP wurde von den Verdünnungen jedes Testorganismus mit einem der folgenden extrahiert:
a) gleiche Volumen von Nucleotide Releasing Buffer (NRB, Lumac BV, Holland) und Probe
b) gleiche Volumen von 0.08% (w/v) Benzethoniumchlorid und Probe
c) neun Volumen von Dimethylsulphoxid (DM50) zu einem Volumen der Probe
d) gleiche Volumen von Trichloressigsäure (TCA) (10%, 5%, 2.5% oder 1.25% w/v) und Probe.
Das Mischen der Probe und des Extraktionsmittels wurde durch die verwendete Pipettierwirkung und ein Bewegen der Cuvetten unterstützt. Alle Extraktionsverfahren wurden bei Raumtemperatur durchgeführt.
iii) Präparierung von Extrakten für die Probeentnahme:
a) NRB-Extrakte wurden mit dem Probeentnahmepuffer pH 7.75 im Verhältnis 1 : 10 verdünnt;
b) BAX (Brewing Research Foundatin ATP Extraktionsmittel): Benzethoniumchlorid; gleiche Volumina des Extrakts und 2.2% Tween 80 (Warenzeichen) (in einem Probeentnahmepuffer pH 7.75) wurden gemischt.
Das resultierende Gemisch wurde mit einem Probeentnahmepuffer pH 7.75 im Verhältnis 1 : 10 verdünnt;
c) DM50: Extrakte wurden mit einem Probeentnahmepuffer pH 7.75 im Verhältnis 1 : 50 verdünnt;
d) TCA: Extrakte wurden mit einem Probeentnahmepuffer pH 7.75 im Verhältnis 1 : 50 verdünnt.
iv) ATP-Probeentnahme von Extrakten
100 ul jedes Extrakts wurden an eine Cuvette übergeben und 100 ul Lumit PM (Warenzeichen) wurden dann zugefügt. Die Cuvette wurde dann sofort in dem Biozähler angeordnet, und die Lichtausbeute wurde über ein 10 Sekunden Intervall integriert. 10 ul von ATP-Stardard (1 pM) wurden dann zu der Cuvette zugefügt, und es wurde die Lichtausbeute über eine weitere 10 Sekunden Periode integriert.
v) Berechnung der ATP-Konzentration
Die ATP-Konzentrationen in den Extrakten wurden in Bezug auf das von dem ATP-Standard erhaltene Lichtansprechen berechnet. Die Verdünnung des NRB-Extrakts machte das Erfordernis für eine Korrektur der Ergebnisse der Verwerfung überflüssig, die mit dem Lichtabfall verbunden ist.
Die Ergebnisse sind in der Tabelle 1 gezeigt. Das Verfahren gemäß der vorliegenden Patentanmeldung extrahierte ATP wirksam von allen getesteten Organismen. (PS: Die an den Extakten, hergestellt bei diesem Beispiel, angewandte Verdünnungsstufe diente zur Erniedrigung des ATP-Gehalts in den Extrakten auf eine mit dem ATP-Probeentnahmesystem kompatible Höhe. Für das Extraktionsverfahren gemäß der vorliegenden Patentanmeldung ist keine Verdünnung erforderlich, wenn in der Probe nur ein niedriger ATP-Gehalt anwesend ist. Eine Verdünnungsstufe wird jedoch mit den anderen Verfahren benötigt, wenn ein Löschen und ein Signalabfall vermieden werden sollen).
Die Erfindung schafft daher ein Verfahren für die ATP- Extraktion wie vorstehend beschrieben sowie Probeentnahme-Kits zur Durchführung solcher Verfahren. Tabelle 1 Vergleich der ATP-Extraktionsverfahren (ATP) · 10&supmin;¹&sup8; M/Zelle Extraktionsverfahren Sacc. cereyisiae NCYC 1342 L. brevis BSO 28 O. proteus BSO 434 * Die in den Klammern angegebenen Zahlen ergeben den % Extraktionswirkungsgrad in Bezug auf die am meisten wirksame Konzentration des verwendeten TCA.

Claims

1. Verfahren zur Extraktion von ATP aus einem Mikroorganismus, welches eine Berührung des Mikroorganismus mit einem Kationtensid als einem Freisetzmittel umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß die resultierende Lösung danach mit einem nichtionischen Tensid als einem Neutralisiermittel berührt wird, welches im wesentlichen zur Ausschaltung der Verwerfungswirkung des Freisetzmittels an der nachfolgenden ATP-Probeentnahme wirkt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Freisetzmittel Benzethoniumchlorid in einer Konzentration von 0.008-0.16% w/v ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Neutralisiermittel ein nichtionisches Tensid ist, welches in einer größeren Konzentration als das Freisetzmittel verwendet wird, um alle Reste des Freisetzmittels zu neutralisieren.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Neutralisiermittel ist: - Polyoxyethylen-Sorbitan-Monolaurat - Polyoxyethylen-Sorbitan-Monostearat - Polyoxyethylen-Sorbitan-Monooleat - Polyoxyethylen-Ether W1 oder - Triton X - 100TM

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe für ATP ausgeführt wird durch:

a) Pipettieren einer Probeentnahme von ¹0-²00ul einer Probe in eine transparente Cuvette;

b) Pipettieren von 10-200 ul des Kationtensids in die Cuvette zur Extraktion von ATP;

c) Pipettieren von 10-200 ul des nichtionischen Tensids in die Cuvette in einer Konzentration höher als das Kationtensid, um das Freisetzmittel zu neutralisieren;

d) Anordnung der Cuvette in einem lumineszierenden Photometer;

e) Messung der Menge des biolumineszierenden Lichts, das durch ATP in der Cuvette nach einer Hinzufügung von 50-200 ul eines Glühwürmchen-Luciferin-Luciferase- Reagens in einem biochemischen Puffer mit einem pH-Wert von 7.2-8.2 erzeugt wurde;

f) Hinzufügung einer bekannten Menge von ATP in 10-20 ul in die gemessene Cuvette und wiederholte Messung der Menge der Biolumineszenz in der Cuvette; und

g) Berechnung der Menge von ATP in der Probe durch diese beiden biolumineszierenden Lichtablesungen unter Verwendung des internen Standardisierungsprinzips.

6. Kit für die Probeentnahme von ATP in einer Mikroorganismusprobe, dadurch gekennzeichnet, daß das Kit besteht aus:

a) einem Probeentnahmepuffer;

b) einem Glühwürmchen-Luciferin-Präparat;

c) einem Kationtensid; und

d) einem nichtionischen Tensid.

7. Kit nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Probeentnahmepuffer einen pH-Wert von etwa 7.75 hat.

8. Kit nach Anspruch 6 oder Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Probeentnahmepuffer ein Mittel für die Chelation von bivalenten Kationen umfassen kann.