ES2324952T3 - Composiciones y procesos para la extraccion y deteccion de atp microbiano. - Google Patents
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Abstract
Una composición para la detección de ATP en una muestra que se sospecha que contiene un microorganismo que comprende: (a) un tampón de reacción; (b) uno o más agentes de extracción de ATP; (c) un catión divalente a una primera concentración; (d) un quelante de cationes divalentes a una segunda concentración; y (e) una enzima luciferasa; en la que la diferencia entre la primera concentración y la segunda concentración es menor de aproximadamente 5 mM.
Description
Composiciones y procesos para la extracción y
detección de ATP microbiano.
La presente invención se refiere a composiciones
y métodos para el lisado de bacterias y otras células microbianas
para detectar y cuantificar ATP.
Una de las características que diferencia las
células vivas de las células muertas es la presencia de ATP. Debido
a que el ATP es un sustrato en un sistema de detección
bioluminiscente ampliamente usado, puede proporcionar un marcador
sustituto para la viabilidad celular o contaminación celular. Se
conocen en la técnica métodos para la extracción y detección de ATP
de células usando el sistema luciferina-luciferasa.
Sin embargo, dependiendo del tipo de célula, los requisitos para la
extracción y detección de ATP pueden ser distintos. Las células
somáticas, con sus membranas bicapa de fosfolípidos estructuralmente
flexibles pueden romperse fácilmente con detergentes suaves para
liberar el ATP. Las bacterias, levaduras y hongos, con sus paredes
celulares más rígidas, representan un mayor desafío.
La patente de Estados Unidos Nº 4.303.752
(Kolehmainen et al.) describe un proceso para la
determinación selectiva de nucleótidos (tales como ATP) de células
somáticas y microbianas viables. Kolehmainen et al.
desarrollaron un proceso multi-etapa aprovechando
las permeabilidades diferenciales de células somáticas y microbianas
usando diversos agentes tensioactivos iónicos y no iónicos. Aunque
se descubrió que las células somáticas liberaban ATP después del
tratamiento con un detergente no iónico, tal como alquilfenol
etoxilado, las células bacterianas no se vieron afectadas. Esta
observación proporcionó un medio para el tratamiento de poblaciones
mixtas de células somáticas y bacterianas, que implicaba el
tratamiento de células somáticas con alquilfenol etoxilado, la
retirada por lavado del ATP somático que se liberaba y el
tratamiento de las células restantes (células microbianas que
contenían ATP y células somáticas carentes de ATP) con una mezcla
tensioactiva iónica más rigurosa que contenía una amina cuaternaria
etoxilada y una amina etoxilada para liberar el ATP microbiano. En
una etapa final, el ATP liberado se midió en un ensayo
bioluminiscente.
Recientemente, Wood et al. (documento US
2003/014507) describieron un método para la detección de ATP en
células usando una composición de reactivo homogénea que contenía
todos los componentes para la extracción y detección de ATP de
células en una sola etapa. Los componentes de reacción, formulados
únicamente para conservar la función de liberación de ATP sin
sacrificar la actividad luciferasa, proporcionaron un avance
significativo en términos de economía y tiempo. Sin embargo, el
método descrito no es óptimo para células microbianas, debido a sus
paredes celulares más rígidas.
Un problema asociado con el uso de agentes
permeabilizantes más rigurosos necesarios para microbios, tales
como detergentes iónicos, es su capacidad para inactivar las enzimas
luciferasas. Este problema de incompatibilidad del reactivo
requiere una etapa de neutralización o dilución adicional antes de
una etapa final de adición de luciferasa/luciferina para iniciar la
detección de ATP y obstaculiza el desarrollo de una composición de
reactivo de extracción/detección de ATP en una sola etapa.
Dadas las dificultades asociadas con la
liberación y detección de ATP de células microbianas, existe la
necesidad en la técnica de composiciones de reactivos y métodos
mejorados para la detección de ATP en una sola etapa en células
microbianas. Además de los desafíos asociados con la liberación de
ATP de células que llevan pared celular, las células microbianas
son típicamente mucho más pequeñas que las células somáticas. Esto
requiere mejoras adicionales con respecto a la sensibilidad. La
presente invención proporciona un avance en la aplicación de la
metodología de detección de ATP en una sola etapa a células
microbianas y se basa en parte en el descubrimiento de que las
células microbianas presentan diferencias inesperadas con respecto a
su capacidad para ayudar a la liberación y detección de ATP.
La presente invención se refiere a composiciones
de reactivos y métodos para la extracción y detección de ATP de
células microbianas. La invención se basa en parte en el
descubrimiento de que las condiciones de reacción para la
extracción y detección de ATP son diferentes entre y dentro de tanto
células microbianas como células somáticas, y que pueden formularse
composiciones de reactivos para facilitar la detección eficaz de ATP
en una sola etapa de una amplia diversidad de células
microbianas.
En un aspecto, la presente invención incluye una
composición de reactivo que incluye un tampón de reacción, al menos
un agente de extracción de ATP, un catión divalente, un quelante de
cationes divalentes y/o una mezcla de luciferasa/luciferina en la
que la concentración de catión divalente es suficientemente baja o
está suficientemente neutralizada por el quelante de cationes para
reducir los efectos negativos del catión divalente en la extracción
de ATP. En una realización, la diferencia entre la concentración de
quelante de cationes divalentes y la concentración de catión
divalente en la composición de reactivo es inferior a
aproximadamente 5 mM. En otra realización, la concentración de
quelante de cationes divalentes es al menos la mitad de la
concentración de catión divalente. El quelante de cationes
divalentes puede ser innecesario en casos en los que la
concentración de catión divalente es baja (por ejemplo, menor de
aproximadamente 5 mM, 2,5 mM o 1 mM). En una realización
particularmente preferida, la concentración de quelante es igual o
mayor que la concentración de catión divalente, el catión divalente
es Mg^{2+}, el quelante de cationes divalentes es EDTA, y el al
menos un agente de extracción de ATP incluye bromuro de
cetiltrimetilamonio, clorhexidina y un detergente no iónico, tal
como Triton-X100.
En otro aspecto, la presente invención incluye
un método para la detección de ATP en células microbianas en el que
una muestra microbiana se pone en contacto con una composición de
reactivo que incluye un tampón de reacción, al menos un agente de
extracción de ATP, un catión divalente y un quelante de cationes
divalentes para formar una mezcla en la que la concentración de
catión divalente es suficientemente baja o está suficientemente
neutralizada por el quelante de cationes para reducir los efectos
negativos del catión divalente en la extracción de ATP, y el nivel
de catión divalente es suficiente para la etapa posterior de
detección de ATP mediada por luciferasa. La diferencia entre la
concentración del quelante de cationes divalentes y la concentración
de catión divalente en la mezcla puede ser menor de aproximadamente
5 mM. De manera alternativa, la concentración de quelante de
cationes divalentes puede ser al menos la mitad de la concentración
de catión divalente en la mezcla, preferiblemente igual a o incluso
mayor en concentración. El quelante de cationes divalentes puede
ser innecesario en casos en los que la concentración de catión
divalente es baja (por ejemplo, menor de aproximadamente 5 mM, 2,5
mM o 1 mM). En una realización preferida, el método se refiere a un
método para la detección de ATP en una muestra microbiana que
contiene o se sospecha que contiene un microorganismo gram negativo,
tal como E. coli.
En un aspecto adicional, la presente invención
incluye un método para la identificación de agentes de extracción
de ATP adecuados para la detección de ATP en una muestra microbiana,
en el que una composición que contiene catión divalente, un
quelante de cationes divalentes, al menos un agente de extracción de
ATP, una enzima luciferasa y un sustrato de luciferasa se añade a
la muestra para formar una mezcla; el grado de luminiscencia se
mide para identificar una composición de reactivo adecuada para la
detección de ATP en la muestra. Típicamente, el agente de
extracción de ATP es adecuado para la detección de ATP en la fuente
microbiana si el grado de luminiscencia es suficiente para la
detección de ATP en la muestra microbiana. En una realización
preferida, el catión divalente está presente en la mezcla a una
concentración menor de aproximadamente 0,5 mM, más preferiblemente
menor de aproximadamente 0,1 mM. La muestra microbiana puede incluir
una bacteria gram positiva o gram negativa, una arqueobacteria, un
hongo o similar.
De manera alternativa, la muestra microbiana se
pone en contacto con una composición de reactivo que incluye un
catión divalente, un agente quelante de cationes divalentes, al
menos un agente de extracción de ATP y una enzima luciferasa para
formar una primera mezcla que tiene una primera concentración de
catión divalente; poner en contacto la muestra microbiana para
formar una segunda mezcla que difiere de la primera mezcla
únicamente en que tiene una mayor concentración de catión divalente
en la segunda mezcla que en la primera mezcla; e identificar una
concentración o concentraciones de agentes de extracción de ATP
microbiano adecuadas para la liberación y detección de ATP, en el
que la luminiscencia en la primera mezcla es mayor que la
luminiscencia en la segunda mezcla.
En un aspecto adicional, el sistema de
extracción/detección de ATP microbiano de la presente invención
puede usarse para ensayar la viabilidad de células microbianas o
para identificar agentes farmacéuticamente activos (por ejemplo
candidatos de fármacos antibióticos) o agentes biológicamente
activos en base a su capacidad para afectar a la viabilidad y/o
crecimiento de células microbianas.
La Figura 1 es un gráfico que representa la
cinética de la detección de ATP en P. aeruginosa (Figura 1A)
a diferentes concentraciones de MgCl_{2}. En la Fig. 1B se usó ATP
purificado como control.
La Figura 2 es un gráfico que representa los
efectos de diferentes combinaciones de agentes de extracción de ATP
en la detección de ATP en P. aeruginosa a bajas (-; 0,2 mM) y
altas (+; 20,0 mM) concentraciones de catión divalente
(MgCl_{2}).
La Figura 3 es un gráfico que representa la
neutralización de los efectos inhibidores del catión divalente
usando agentes quelantes para mimetizar la mayor luminiscencia
obtenida en condiciones de concentración de catión divalente
reducida en diversos microorganismos (E. coli, S. aureus, P.
aeruginosa y B. cereus). Se añadió CDTA a las mezclas de
reacción que contenían MgCl_{2} 20 mM a t =12 minutos
(concentración final = CDTA 20 mM).
La Figura 4 es un gráfico que representa el
efecto de concentraciones crecientes de quelante (EDTA a 0 mM, 22
mM, 23 mM, 24 mM y 25 mM) en la detección de ATP en E. coli
(Figura 4A) o P. aeruginosa (Figura 4B) en presencia de una
concentración de catión divalente (MgCl_{2}) de 20 mM.
La Figura 5 es un gráfico que representa la
cinética de la detección de ATP en diferentes bacterias E.
coli (Figura 5A), S. aureus (Figura 5B), P.
aeruginosa (Figura 5C) y B. cereus (Figura 5D) a
diversas concentraciones (0 mM, 2,5 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM) de
catión divalente (MgCl_{2}).
La Figura 6 es un gráfico que representa la
cinética de la detección de ATP a bajas (0,2 mM) y altas (20 mM)
concentraciones de catión divalente usando un panel de agentes de
extracción de ATP en E. coli (Figura 6A, 6B) o P.
aeruginosa (Figura 6C, 6D). En las Fig. 6E, 6F, se usó ATP
purificado como control.
La Figura 7 es un gráfico que representa los
efectos de Mg^{2+} (Figura 7A), Ca^{2+} (Figura 7B) y Mn^{2+}
(Figura 7C) en la extracción y detección de ATP en P.
aeruginosa a bajas (0,2 mM) y altas (20 mM) concentraciones de
catión divalente.
La Figura 8 es un gráfico que representa la
detección de ATP en P. aeruginosa a bajas (0,2 mM) y altas
(20 mM) concentraciones de catión divalente usando luciferasa de
luciérnaga recombinante (en lugar de una luciferasa
termoestable).
La Figura 9 es un gráfico que representa una
correlación entre el número de células bacterianas y la
luminiscencia en cuatro cepas bacterianas (E. coli, S. aureus,
P. aeruginosa y B. cereus).
La Figura 10 es un gráfico que representa la
duración de la señal luminiscente producida con el ensayo de ATP
microbiano.
La Figura 11 es un gráfico que representa la
sensibilidad de la detección de ATP para controlar el crecimiento
de E. coli.
La Figura 12 es un gráfico que representa la
exploración de compuestos antimicrobianos en una placa de 96
pocillos en función de una luminiscencia reducida a t = 5 h.
La Figura 13 es un gráfico que representa la
detección bioluminiscente del crecimiento bacteriano en función de
la dosis de antibiótico.
Para proporcionar un entendimiento claro y
coherente de la memoria descriptiva y reivindicaciones, se
proporcionan las siguientes definiciones. A menos que se defina de
otra manera, todos los términos técnicos y científicos tienen el
mismo significado que el comúnmente entendido por un especialista en
la técnica a la que pertenece esta invención. Todas las patentes y
publicaciones citadas se incorporan por referencia en su totalidad a
menos que se indique otra cosa.
Una luciferasa "aislada" o
"purificada" es una que se ha identificado y separado y/o
recuperado de un componente de su entorno natural.
El término "muestra" como se usa en este
documento, se usa en su más amplio sentido. Una muestra es una
composición que se sospecha que contiene ATP, que se analiza usando
la invención. Aunque a menudo se sabe que una muestra contiene o se
sospecha que contiene una célula o una población de células,
opcionalmente en un medio de cultivo, o un lisado celular, una
muestra también puede ser una superficie sólida, (por ejemplo, un
hisopo, membrana, filtro, partícula), que se sospecha que contiene
una célula o población de células unidas. Se contempla que para una
muestra sólida de este tipo, se prepara una muestra acuosa poniendo
en contacto el sólido con la composición de reactivo de la
invención o con otra solución acuosa a la que se añade la
composición de reactivo de la invención. En algunos casos es
deseable una filtración para generar una muestra, por ejemplo, en el
ensayo de una muestra líquida o gaseosa mediante un proceso de la
invención. Se prefiere una filtración cuando se toma una muestra de
un gran volumen de un gas o líquido diluido.
La expresión "composición de reactivo" se
usa en este documento para designar uno o más componentes para la
extracción y/o detección de ATP de una muestra. La composición de
reactivo puede incluir algunos o todos los componentes suficientes
para la extracción y/o detección de ATP de una muestra.
La expresión "mezcla de reacción", como se
usa en este documento, se refiere al contenido presente o resultante
después de poner en contacto una muestra que contiene ATP o que se
sospecha que contiene ATP con una o más composiciones de reactivo
colectivamente suficientes para extraer y detectar el ATP de la
muestra.
El término "detección", como se usa en este
documento, se refiere a la determinación cuantitativa o cualitativa
de la presencia o ausencia de un componente dentro de la
muestra.
La expresión "agente de extracción de ATP",
como se usa en este documento, se refiere a cualquier compuesto o
combinación de compuestos que modifica la permeabilidad de la
membrana celular o de la pared celular o altera la integridad de
(es decir, lisa o causa la formación de poros en) la membrana y/o la
pared celular de la fuente microbiana para efectuar la extracción o
liberación de ATP. Generalmente, los agentes de extracción de ATP
pueden incluir una diversidad de agentes, incluyendo, pero sin
limitación, antibióticos, tales como polimixina B (por ejemplo,
polimixina B1 y polimixina B2),
polimixin-beta-nonapéptido (PMBN), y
clorhexidina (CHEX); alquilglucósido o alquiltioglucósido, tales
como
octil-\beta-D-1-tioglucopiranósido
(véase la Patente de Estados Unidos Nº 6.174.704 incorporada en
este documento por referencia en su totalidad); detergentes no
iónicos, tales como Triton-X100
(TX-100); detergentes de betaína, tales como
carboxipropilbetaína (CB-18); sales de amonio
cuaternario, tales como bromuro de trimetiloctadecilamonio
(TMA-18); protaminas; aminas, tales como
trietilamina (TEA) y trietanolamina (TeolA); y polímeros catiónicos,
antibacterianos, formadores de poros, activos en la membrana, y/o
activos en la pared celular, tales como polilisina, nisina,
magainina, melitina, fosfolipasa A_{2}, péptido activador de
fosfolipasa A_{2} (PLAP); bacteriófagos; y similares. Véase por
ejemplo, Morbe et al., Microbiol. Res. (1997) vol. 152, pág.
385-394.
La expresión "señal estable" se define como
una señal luminiscente que muestra una pérdida de luminiscencia
menor del 50% por media hora con respecto a la luminiscencia en el
momento en el que se inició la reacción de luciferasa.
La expresión "proporción de
señal:interferencia" (S:N) se define mediante la ecuación S:N =
(luminiscencia media de la muestra menos la media del
fondo)/desviación típica de la luminiscencia de fondo.
La presente invención se refiere a composiciones
de reactivos y métodos para la detección y cuantificación de los
niveles de ATP de las células microbianas y se basa en el
descubrimiento inesperado de que las condiciones de reacción para
la liberación y detección de ATP de células microbianas puede
realizarse sin necesidad de una etapa de neutralización anterior a
o incorporarse en una etapa de detección de luminiscencia posterior.
La presente invención describe composiciones de reactivos capaces
de facilitar una detección luminiscente estable de ATP de una
amplia variedad de células microbianas. Adicionalmente,
seleccionando cuidadosamente una combinación apropiada de
componentes de reacción, puede obtenerse una liberación eficaz de
ATP en una sola etapa prácticamente a partir de cualquier célula
bacteriana o microbiana.
En un aspecto de la presente invención, los
inventores han descubierto que concentraciones no óptimas de catión
divalente pueden obstaculizar la liberación y detección eficaz de
ATP de algunas células microbianas. Las metodologías típicas de
detección de ATP mediada por luciferasa utilizan composiciones de
reactivos que tienen concentraciones de cationes divalentes de
hasta 10-20 mM y concentraciones de quelante de
cationes divalentes de aproximadamente 1-2 mM
(véase por ejemplo, Wood et al., documento US 2003/0104507).
La Figura 1 describe un experimento que demuestra diferencias en la
cinética de detección de ATP en función de la concentración de
catión divalente para B. cereus (Figura 1A) y P.
aeruginosa (Figura 1B). Aunque los cationes divalentes son
esenciales para la detección de ATP, los resultados de este
experimento documentan el sorprendente hallazgo de que en realidad
puede obtenerse una mejor luminiscencia en células microbianas
usando cantidades de catión divalente menores de las esperadas.
Además, los inventores de la presente invención han descubierto
sorprendentemente que la bioluminiscencia resultante del uso de
determinadas combinaciones de agentes de extracción de ATP puede
potenciarse selectivamente reduciendo la concentración de catión
divalente libre (por ejemplo, Mg^{2+}) en la composición de
reactivo o mezcla de reacción con un quelante de cationes
divalentes, tal como EDTA (Figura 2). Este "efecto de inversión
del magnesio" se confirma adicionalmente por experimentos en los
que se descubrió que la adición de compuestos quelantes, tales como
CDTA, activaba la luminiscencia (Figura 3). Los inventores de la
presente invención han documentado adicionalmente el inesperado
beneficio para la extracción y detección de ATP cuando se usa un
quelante divalente a una concentración mayor que la del catión
divalente presente en la composición de reactivo de
extracción/detección de ATP o mezcla de reacción (o simplemente
usando menores cantidades de catión divalente con o sin quelante).
Optimizando las composiciones de reactivo para aprovechar estas
observaciones, podría obtenerse una liberación y detección eficaz de
ATP de una amplia diversidad de fuentes microbianas usando la misma
composición de reactivo.
Aunque sin desear ligarse a teoría alguna, se
piensa que las características estructurales de diferentes
microorganismos pueden explicar los efectos inhibidores de cationes
divalentes con respecto a la liberación de ATP. Por ejemplo, la
pared celular de bacterias gram positivas y gram negativas difiere
con respecto a la densidad y composición de sus capas de
peptidoglicano y por la presencia o ausencia de una membrana bicapa
lipídica externa. La pared celular de bacterias gram positivas se
presenta como una pared ancha, espesa (de 20-80 nm
de espesor) constituida por numerosas capas de peptidoglicano
interconectadas que componen el 60-90% de la pared
celular gram positiva. Entretejidos en la pared celular hay ácidos
teicoicos y diversas glicoproteínas. Al contrario que la pared
celular gram positiva, la pared celular gram negativa incluye
2-3 capas de pared interna que contiene
peptidoglicano (2-3 nm de espesor) que componen
únicamente el 10-20% de la pared celular gram
negativa, y una membrana externa (de aproximadamente 7 nm de
espesor) compuesta por fosfolípidos, lipopolisacáridos (LPS) y
proteínas. Se piensa que los LPS en la membrana externa de
bacterias gram negativas añaden resistencia a la membrana externa,
de una manera similar a las glicoproteínas y ácidos teicoicos de la
pared celular gram positiva. A diferencia de bacterias, las paredes
celulares de levaduras y hongos son incluso más firmes que las
paredes celulares bacterianas, que contienen otras sustancias tales
como quitina, para proteger las frágiles membranas celulares en las
mismas.
La membrana externa de bacterias gram negativas
proporciona una función de barrera reforzada por cationes
divalentes que estabilizan la repulsión electrostática entre grupos
cargados negativamente en moléculas de LPS colindantes. (Nikaido,
Outer Membrane, In Escherichia coli and Salmonella, ASM
Press, Washington D. C., pág. 29-47). La función de
barrera explica la impermeabilidad relativa de determinados
compuestos antibióticos, tales como nafcilina, una penicilina
hidrófoba. Se piensa que la adición de EDTA, un quelante de cationes
divalentes y/o aminas voluminosas, tales como Tris, inhibe la
estrecha asociación entre moléculas de LPS. Los quelantes de
cationes divalentes, tales como EDTA o CDTA pueden desestabilizar la
membrana externa y facilitar la ruptura momentánea y la liberación
de componentes celulares (tales como ATP) cuando se usan los agentes
de extracción de ATP de la presente invención.
Puesto que, por un lado, los cationes divalentes
son capaces de inhibir la liberación de ATP, son componentes
esenciales de la reacción luminiscente para detectar ATP. Para una
sensibilidad máxima en la detección de ATP, la concentración de
cationes divalentes, particularmente magnesio, se usa típicamente en
concentraciones superiores a aproximadamente 10 mM (Véase la Figura
1B). Una composición de reactivo en una sola etapa para la
extracción y detección de ATP en muestras que contienen microbios
debe superar estos requisitos contradictorios para cationes
divalentes. Además, los inventores han descubierto que la extracción
y detección óptimas de ATP de microbios puede conseguirse
rápidamente, en 10 minutos, preferiblemente en 5 minutos después de
la adición de la composición de reactivo a la muestra. La
determinación de la cantidad o cantidades óptimas de catión
divalente o quelante de cationes a usar en la composición de
reactivo dependerá de una diversidad de factores, incluyendo, pero
sin limitación, el tipo y la estructura del microorganismo; el grado
en el que los cationes divalentes estabilizan componentes de la
pared celular y/o membrana celular; la cantidad de ATP, catión, y/o
quelante de cationes ya presentes en la muestra microbiana; y la
cantidad o estabilidad de la luciferasa en la composición de
reactivo o mezcla de reacción.
Un aspecto de la invención incluye el uso de uno
o más agentes de extracción de ATP para promover la liberación de
ATP de una célula microbiana. Los agentes de extracción de ATP
microbiano pueden incluir una diversidad de agentes capaces de
permeabilizar las paredes y/o membranas celulares microbianas para
facilitar la liberación de ATP incluyendo, pero sin limitación,
antibióticos, tales como polimixina B (por ejemplo, polimixina B1 y
polimixina B2),
polimixin-beta-nonapéptido (PMBN) y
clorhexidina (CHEX); alquilglucósido o alquiltioglucósido, tal como
octil-\beta-D-1-tioglucopiranósido
(véase la Patente de Estados Unidos Nº 6.174.704 incorporada en
este documento por referencia en su totalidad); detergentes no
iónicos, tales como alquilfenoles etoxilados no iónicos incluyendo,
pero sin limitación, octilfenol etoxilado
Triton-X100 (TX-100) y otros
alquilfenoles etoxilados; detergentes de betaína, tales como
carboxipropilbetaína (CB-18); sales de amonio
cuaternario, tales como bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB);
bromuro de trimetiloctadecilamonio (TMA-18);
protaminas; aminas, tales como trietilamina (TEA) y trietanolamina
(TeolA); y polímeros catiónicos, antibacterianos, formadores de
poros, activos en la membrana y/o activos en la pared celular, tales
como polilisina, nisina, magainina, melitina, fosfolipasa A_{2},
péptido activador de fosfolipasa A_{2} (PLAP); bacteriófago; y
similares. Véase por ejemplo, Morbe et al., Microbiol. Res.
(1997) vol. 152, pág. 385-394 y la Patente de
Estados Unidos Nº. 4.303.752 que describe compuestos tensioactivos
iónicos, que se incorporan en este documento por referencia en su
totalidad.
Preferiblemente se seleccionan agentes de
extracción de ATP que no inactiven las enzimas luciferasas de la
presente invención. Para microbios que requieren agentes más
rigurosos para la liberación de ATP (por ejemplo, detergentes
iónicos etc.), se prefieren particularmente luciferasas modificadas
que muestran una estabilidad aumentada en presencia de estos
agentes, tales como las descritas en el documento U. S.
2003/0104507, cuyo contenido completo se incorpora en este
documento por referencia.
En una realización de la invención, el agente o
agentes de extracción de ATP incluyen CTAB, una sal de amonio
cuaternario. En realizaciones preferidas, el CTAB está presente en
la composición de reactivo a una concentración entre
aproximadamente el 0,04% y el 0,15% (p/v). En otra realización, los
agentes de extracción de ATP pueden incluir CHEX y un alquilfenol
etoxilado, tal como Triton X-100. En realizaciones
preferidas, el CHEX se encuentra preferiblemente entre
aproximadamente el 0,04% y el 0,16% (p/v) y el alquilfenol etoxilado
está presente entre aproximadamente el 0,25% y el 1,0% (p/v). En
una realización particularmente preferida, la composición de
reactivo puede incluir más de un agente de extracción de ATP. Una
realización preferida incluye CHEX, (entre aproximadamente el 0,04%
y el 0,16% (p/v)); un alquilfenol etoxilado, tal como Triton
X-100 (entre aproximadamente el 0,25% y el 1,0%
(p/v)) y una sal de amonio cuaternario, tal como CTAB, (entre
aproximadamente el 0,02% y el 0,08% (p/v)).
Se prevé completamente que la concentración o
concentraciones o intervalo o intervalos de concentración
funcionales más preferidos en los métodos de la invención variarán
para diferentes microbios y para diferentes agentes de extracción
de ATP y pueden determinarse empíricamente usando los métodos
descritos en la presente solicitud o comúnmente conocidos por los
especialistas en la técnica.
La reacción de
luciferasa-luciferina del escarabajo no sólo depende
del ATP, sino también de cationes divalentes. Por lo tanto, para
facilitar la actividad luciferasa, típicamente se suministran
cationes divalentes (a menos que ya estén presentes en la muestra).
Los cationes divalentes incluyen magnesio, calcio y manganeso. Los
cationes divalentes pueden suministrarse como sales o haluros tales
como sulfato, sulfonato, gluconato, carbonato, cloruro y bromuro.
Por ejemplo, pueden suministrarse cationes de magnesio como cloruro
de magnesio, sulfato de magnesio, gluconato de magnesio, acetato de
magnesio, bromuro de magnesio, carbonato de magnesio, etc.
Preferiblemente, el catión divalente se selecciona de las sales de
cloruro o sulfato de magnesio.
Debido a que la permeabilidad de determinadas
membranas o paredes celulares puede afectarse negativamente por la
presencia de cationes divalentes, pueden formularse empíricamente
concentraciones de catión divalente para un organismo determinado o
un sistema de extracción/detección determinado para proporcionar el
equilibrio adecuado entre, por ejemplo, la liberación de ATP de la
célula y la detección de ATP.
Además, dado que los quelantes de cationes
divalentes tienen la capacidad de neutralizar los efectos negativos
de cationes divalentes en la extracción de ATP, las concentraciones
de cationes divalentes pueden ajustarse dependiendo del nivel de
quelante de cationes divalentes presente en una composición de
reactivo o mezcla de reacción. Cuando el quelante de cationes
divalentes es reducido (por ejemplo, menor de aproximadamente 5 mM,
2,5 mM o 1 mM), las concentraciones de cationes divalentes serán por
consiguiente menores, preferiblemente menores de 2,5 mM, más
preferiblemente de entre 0,2-1 mM. Sin embargo,
cuando el quelante de cationes divalentes es superior (por ejemplo,
2-20 mM), la concentración de cationes divalentes
será por consiguiente mayor, preferiblemente con una concentración
menor que o igual a la concentración del quelante de cationes
divalentes.
Los agentes quelantes de cationes divalentes
incluyen, sin limitación, sales del ácido etilendiaminotetraacético
(EDTA), ácido etilenglicol tetraacético (EGTA) y ácido
1,2-ciclohexanodinitrilotetraacético (CDTA), ácido
nitriloacético (NTA), ácido cítrico, gluconato sódico, ácido
glucónico, lignosulfonatos y mezclas de los mismos.
Preferiblemente, el agente quelante se selecciona del grupo
constituido por EDTA, EGTA y CDTA, debido a su disponibilidad y
coste relativamente bajo en general. Pueden determinarse
empíricamente niveles adecuados de quelante de cationes divalentes
en base a proporcionar niveles suficientes para neutralizar los
efectos negativos del catión divalente sobre la extracción de ATP,
pero no hasta el punto de que impidan la detección de ATP
catalizada por luciferasa dependiente de cationes.
Generalmente, la concentración de quelante es de
al menos aproximadamente el 50% de la concentración de catión
divalente, preferiblemente aproximadamente el 60%, 70%, 80%, 90% o
95% de la concentración de catión divalente. Más preferiblemente,
la concentración de quelante es aproximadamente igual a o mayor que
la concentración de catión divalente. En una realización
particularmente preferida, la concentración de quelante está en un
intervalo de aproximadamente 20 a 25 mM. El quelante de catión
divalente puede ser innecesario en los casos en los que la
concentración de catión divalente sea baja (por ejemplo, menor de
aproximadamente 5 mM, 2,5 mM o 1 mM).
Un especialista en la técnica reconocerá, sin
embargo, que diferentes quelantes pueden tener diferentes
capacidades quelantes dependiendo del pH. De esta manera, los
parámetros externos de la presente invención incluyen un grado de
variabilidad en las concentraciones de quelante para quelantes que
se corresponde con el suministro de una capacidad quelante
comparable a la del EDTA en condiciones de reacción de ensayo de
luciferasa de otro modo idénticas (a por ejemplo, pH
7,0-8,0 etc.). En otras palabras, las cantidades de
quelante de cationes divalentes pueden ajustarse para proporcionar
una capacidad quelante comparable a o que supera la capacidad
quelante del EDTA en condiciones de reacción de ATP en una sola
etapa de otro modo idénticas (todos los demás reactivos y
concentraciones de reactivos son iguales, excepto por el quelante
divalente), o pueden ajustarse en una cantidad suficiente para
equilibrar los efectos negativos y positivos de los cationes
divalentes en la extracción y detección de ATP,
respectivamente.
En su nivel más básico, las luciferasas se
definen por su capacidad para producir luminiscencia. Más
específicamente, las luciferasas catalizan la oxidación de un
sustrato, luciferina, produciendo de esta manera oxiluciferina y
fotones. Las luciferasas, cuyos productos catalíticos incluyen luz,
ofrecen sensibilidad, un producto detectable y una medición fácil
de ATP. Cualquier enzima que produzca luminiscencia dependiente de
ATP se contempla para el uso en las composiciones de reactivos y
métodos de la presente invención.
Hasta ahora, se han identificado al menos cinco
clases de luciferasas (Jones et al., 1999; Thomson et
al., 1997). De estas, las luciferasas de escarabajos, tales
como la de la luciérnaga común (familia Lampyridae), forman una
clase diferente con orígenes evolutivos únicos (McElroy et
al., 1969; White et al., 1969; White et al.,
1975). Las luciferasas de escarabajos se denominan a menudo
luciferasas de luciérnaga en la bibliografía; sin embargo, las
luciferasas de luciérnaga son en realidad un subgrupo de la clase de
luciferasas de escarabajos. Pueden purificarse luciferasas de
escarabajos a partir de los fotóforos de los propios escarabajos o
de sistemas de expresión de proteínas bien conocidos en la técnica
(Baldwin y Green, 2000; Beny y Dolivo, 1976; Branchini et
al., 1980; Filippova et al., 1989).
Todas las luciferasas, variantes de luciferasa,
fragmentos de luciferasa y fragmentos de luciferasa variantes que
catalizan una reacción dependiente de ATP y generan luminiscencia se
contemplan para el uso en la invención, incluyendo, pero sin
limitación, los descritos en el documento U. S. 2003/0104507, cuyo
contenido completo se incorpora en este documento por referencia en
su totalidad. Se conocen bien en la técnica luciferasas de
escarabajos, particularmente la luciferasa de luciérnaga de la
luciérnaga norteamericana Photinus pyralis. La luciferasa de
P. pyralis (LucPpy) consta de aproximadamente 550 aminoácidos
de M, 61 kDa según se calcula por la proteína codificada por la
secuencia de nucleótidos del gen. Otras luciferasas de luciérnaga de
acuerdo con la presente invención incluyen luciferasa de luciérnaga
Photuris pennsylvanica (LucPpe2; 545 restos aminoacídicos;
GenBank 2190534, (Ye et al., 1997), así como diversas
luciferasas mutantes descritas en el documento U. S. 2003/0104507,
que proceden de LucPpe2 (por ejemplo, LucPpe2m78 (también conocida
como 78-0B10); LucPpe2m90 (también conocida como
90-1B5); LucPpe2m133 (también conocida como
133-1B2); LucPpe2m146 (también conocida como
146-1H2); y diversas luciferasas disponibles en el
mercado, tales como UltraGlo^{TM} Luciferasa (Promega). En el
documento U. S. 2003/0104507 se describen métodos para preparar
LucPpe2m78, LucPpe2m90, LucPpe2m133 y LucPpe2m146, y se incorporan
en este documento por referencia en su totalidad.
En la presente invención se usan típicamente
luciferasas aisladas y/o purificadas. Los componentes contaminantes
procedentes de su entorno natural, capaces de interferir con usos de
diagnósticos o terapéuticos, pueden incluir enzimas, hormonas y
otros materiales proteicos o no proteicos. Una técnica para
determinar la pureza es la aplicación de análisis por
SDS-PAGE en condiciones no reductoras o reductoras
usando tinción de plata o con azul de Coomassie. Pueden aislarse
luciferasas a partir de fuentes nativas productoras de luciferasa o
de una célula recombinante que expresa un polinucleótido
codificante de luciferasa exógena. Los especialistas en la técnica
conocen bien técnicas para la producción y/o purificación de enzimas
luciferasas.
El sustrato de origen natural para luciferasas
de escarabajos es la luciferina de luciérnaga, un ácido orgánico
poliheterocíclico, ácido
D-(-)-2-(6'-hidroxi-2'-benzotiazolil)-\Delta^{2}-tiazolin-4-carboxílico
(luciferina). Puede aislarse luciferina de la naturaleza (por
ejemplo, de luciérnagas) o sinterizarse. La luciferina sintética
puede tener la misma estructura que la luciferina de origen natural
o puede ser una variante o derivatización, siempre que funcione
análogamente (Bowie et al., 1973; Branchini, 2000; Craig
et al., 1991; Miska y Geiger, 1987; Yang y Thomason, 1993).
Los derivados de luciferina ejemplares para usar en la presente
invención incluyen, pero sin limitación,
6-desoxiaminoluciferina, éster metílico de
D-luciferina,
D-luciferil-L-fenilalanina,
D-luciferil-L-N-\alpha-arginina,
D-luciferin-O-sulfato
y
D-luciferin-O-fosfato
(Miska y Geiger, 1987), ésteres de luciferasas que se hidrolizan
por, o sobre los que actúan, esterasas a luciferina por los
componentes en una muestra (Craig et al., 1991; Yang y
Thomason, 1993). Otros ejemplos de análogos de luciferina útiles
incluyen naftil- y quinolilluciferina, que emiten luz en los
espectros de luz verde y roja, respectivamente (Branchini et
al., 1989). Existen múltiples fuentes comerciales para la
luciferina (por ejemplo, Promega Corp. Madison, WI; Molecular
Probes, Eugene, OR).
La reacción catalizada por luciferasa de
escarabajo que produce una señal luminiscente a partir de la
reacción de luciferasa-luciferina requiere una
enzima luciferasa, luciferina, trifosfato de adenosina (ATP),
magnesio (u otro catión divalente) y oxígeno molecular. En la
reacción inicial, la luciferina y el ATP reaccionan para formar
adenilato de luciferilo con la eliminación de pirofosfato
inorgánico. El adenilato de luciferilo permanece firmemente unido
al sitio catalítico de la luciferasa. Cuando esta forma de la enzima
se expone a oxígeno molecular, el adenilato de luciferilo unido a
enzima se oxida para dar oxiluciferina en un estado electrónicamente
excitado. La luciferina oxidada excitada emite luz al volver al
estado de fondo:
Los análogos de ATP (por ejemplo, TP) también
son capaces de realizar la reacción anterior. Además, otros
cationes divalentes pueden sustituir al magnesio en la reacción
anterior (por ejemplo, Mn^{2+} o Ca^{2+}). Puesto que el
oxígeno es un reactivo de la reacción, la reacción no puede
realizarse en condiciones anaerobias. Sin embargo, generalmente no
es necesario proporcionar más oxígeno sobre o por encima del
presente en el aire. Las reacciones pueden realizarse en
recipientes cerrados, a condición de que exista suficiente oxígeno
en la solución de reacción.
La mayoría de las reacciones
luciferasa-luciferina generan un destello de luz de
corta duración. Sin embargo, algunas de las luciferasas preferidas
para usar con la invención, por ejemplo, las luciferasas LucPpe2m146
y LucPpe2m90, en las condiciones de la invención generan una señal
luminiscente de "tipo resplandor" con pérdida de luminiscencia
menor del 50% por hora después de que la composición de reactivo se
combine con la muestra para formar una mezcla. Las luciferasas,
variantes de luciferasa, fragmentos de luciferasa o fragmentos de
de luciferasa variantes preferidos dentro del alcance de la presente
invención incluyen los que son capaces de preservar su estabilidad
en el entorno de la composición de reactivo y conservar su capacidad
para generar una luminiscencia estable cuando estén en el contexto
de la misma composición de reactivo.
Para facilitar la finalización de la reacción
catalizada por luciferasa, puede incluirse un sustrato para la
luciferasa, tal como luciferina, en la composición de reactivo.
Algunas realizaciones dentro del alcance de la presente invención
pueden eliminar la luciferina y permitir a un usuario proporcionar
una luciferina de su elección; de manera alternativa, la luciferina
puede proporcionarse por separado para su adición a los otros
componentes de reacción. El tipo de luciferina proporcionada puede
variar, pero debe ser un sustrato para la luciferasa particular
usada en una aplicación determinada.
La capacidad para crear una composición de
reactivo homogénea, para la extracción y detección en una sola
etapa no depende necesariamente de la quimio- o termoestabilidad de
la luciferasa, ya que las enzimas nativas también pueden funcionar
en dichas composiciones. Sin embargo, se prefiere el uso de
luciferasas termoestables, porque son menos susceptibles a la
pérdida de actividad de otros componentes en la formulación, tales
como los agentes de extracción de ATP, y pueden proporcionar una
mayor selectividad y/o sensibilidad, y más compatibilidad con un
intervalo más amplio de condiciones de reacción (es decir
temperaturas ambiente y/o superiores). De manera similar, se
preferirán en la medida en que las "luciferasas quimioestables"
sean más capaces de conservar su actividad o aumentar su
sensibilidad y/o rendimiento en presencia de compuestos o
condiciones (en comparación con, por ejemplo, enzimas de tipo
silvestre).
Las luciferasas preferidas para usar en las
composiciones de reactivos, mezclas o métodos de la invención
generan una señal estable, es decir, dichas luciferasas, cuando se
usan en una reacción de luciferasa, producen luminiscencia con una
duración aumentada definida como una pérdida de luminiscencia menor
del 50% por media hora respecto a la luminiscencia en el momento en
que se inició la reacción de luciferasa. Las luciferasas preferidas
incluyen las que mantienen al menos aproximadamente el 30%
(preferiblemente al menos aproximadamente el 50%, 60%, 70%, 80%,
90%, 95% o 99%) de la actividad enzimática durante al menos una
hora, preferiblemente durante al menos dos horas, aún más
preferiblemente al menos cuatro horas (como se mide por
luminiscencia).
Las células microbianas pueden incluir
sustancias capaces de distorsionar la cantidad de ATP presente en
una célula a lo largo del tiempo. Esto puede deberse a la presencia
de ATPasas, inhibidores de ATPasas y/o inhibidores de enzimas
generadoras de ATP. Debido a que la concentración de ATP se
determina en un momento específico, la actividad inadecuada
asociada con la generación o pérdida de ATP, si no se controla,
puede conducir a una sobreestimación de la concentración de ATP
presente en las células microbianas.
Para medir con exactitud los niveles de ATP en
una muestra, es preferible inhibir las enzimas capaces de degradar
las reservas de ATP microbiano o generar inadecuadamente nuevas
fuentes de ATP. No incorporar inhibidores adecuados puede conducir
a una determinación inexacta de la concentración de ATP. Los
inhibidores de ATPasa ejemplares incluyen agentes de extracción de
ATP de la presente invención (tales como CTAB), detergentes
catiónicos o no iónicos, o cualquiera de los inhibidores de ATPasas
descritos en el documento U. S. 2003/0104507. Inhibidores tales
como el DTAB pueden inactivar determinadas ATPasas, mientras que
otras moléculas tales como el fluoruro de sodio (NaF) pueden
inactivar fosfatasas que afectan a la actividad de quinasas
microbianas implicadas en la regulación del metabolismo del
ATP.
Los inhibidores ejemplares de enzimas
generadoras de ATP pueden incluir inhibidores de quinasa o fosfatasa
(tales como NaF), como se describen en el documento U. S.
2003/0104507. En realizaciones preferidas, las composiciones de
reactivos de la presente invención pueden comprender NaF a
concentraciones de al menos aproximadamente 0,2 mM, preferiblemente
al menos aproximadamente 1 mM, más preferiblemente al menos
aproximadamente 2 mM. Otros inhibidores de enzimas generadoras de
ATP pueden incluir otros inhibidores de quinasas, tales como
vanadato, AMP, DAPP (Bostick et al., 1982) y ácido
dicloroacético (Kiechle et al., 1980).
El uso de inhibidores para evitar la producción
inadecuada o pérdida de ATP puede ser particularmente útil en
aplicaciones de alto rendimiento en las que deben leerse muchas
placas de muestras a lo largo de un periodo de tiempo prolongado,
proporcionando una mayor oportunidad para distorsionar el nivel de
ATP original presente en la muestra.
La selección de tampones adecuados depende de la
capacidad tamponante de pH y de la interacción con la reacción de
luciferasa-luciferina. Se contempla cualquier tampón
que mantenga un pH adecuado para la solución de trabajo y que no
interfiera con la reacción de luciferasa-luciferina.
El intervalo de pH preferido está entre aproximadamente pH 4,5 y
aproximadamente pH 9,0, más preferiblemente entre aproximadamente pH
6,0 y aproximadamente pH 8,0. Además de tampones MES y citrato, los
tampones típicos pueden incluir solución salina tamponada con
fosfato (PBS), Tris, ácido
N-(2-hidroxietil)piperazin-N'-2-etanosulfónico
(HEPES), ácido
piperazin-1,4-bis-2-etanosulfónico
(PIPES), borato y puede ser adecuado cualquier otro tampón conocido
por los especialistas en la técnica. Los agentes tamponantes
típicos pueden incluir Tricina, HEPPS, HEPES, MOPS, Tris,
Glicilglicina y sales de fosfato usadas para mantener un pH y una
fuerza iónica adecuados. La concentración de tampón preferida puede
variar de aproximadamente 50 mM a 200 mM.
Son deseables agentes desespumantes para evitar
la pérdida de muestra y/o la contaminación cruzada de muestras
debido a la formación de espuma. La adición de desespumante puede
facilitar también la administración de producto durante la
fabricación o uso. Los agentes desespumantes adecuados incluyen los
disponibles bajo el nombre comercial MAZU® (PPG Industries, Gurnee,
IL) y pueden ser orgánicos o basados en silicona. La selección de
desespumantes puede depender de su capacidad para eliminar espuma
sin interferir con la reacción de
luciferasa-luciferina.
La composición de reactivo también puede incluir
un agente estabilizante o agente de control de la volatilidad. El
agente estabilizante o agente de control de la volatilidad puede ser
cualquier compuesto que estabilice la luciferasa frente a la
degradación y/o ayude a la liofilización de luciferasa y/o
luciferina. Los agentes estabilizantes de enzimas adecuados
incluyen, pero sin limitación, albúmina de suero bovino (BSA);
sustitutos de BSA, tales como Prionex (Pentapharm, Ltd., Basel,
Suiza); gelatina; y detergentes (preferiblemente detergentes no
iónicos, más preferiblemente THESIT).
La composición de reactivo de la presente
invención también puede incluir sustancias que se sabe que aumentan
la duración de la luminiscencia (prolongaban la semivida de
detección), incluyendo, pero sin limitación, pirofosfato de sodio
(NaPPI; por ejemplo a aproximadamente 25 mM); coenzima A (CoA);
reactivos tiol, tales como ditiotreitol y
\beta-mercaptoetanol (Wood, documento US
5.283.179, 1994; Wood, documento US 5.650.289, 1997); agentes
quelantes de iones metálicos (además de su uso en la
extracción/detección de ATP) o inhibidores de proteasas (Scheirer,
documento US 5.618.682, 1997; Scheirer, documento US 5.866.348,
1999); o altas concentraciones de sales (Van Lune y Trer Wiel,
documento WO 00/18953, 2000).
Los métodos, composiciones y kits de la
invención proporcionan la detección cualitativa o cuantitativa
sencilla de ATP (o de un análogo de ATP que puede funcionar como un
sustrato de luciferasa) en una muestra microbiana. Generalmente, un
experimento cualitativo sencillo que demuestra luminiscencia en una
muestra es indicativo de la presencia de ATP.
En un aspecto, la presente invención incluye un
método para la detección de ATP en células microbianas, en el que
una muestra microbiana se pone en contacto con una composición de
reactivo que contiene un tampón de reacción, al menos un agente de
extracción de ATP microbiano, un catión divalente y un quelante de
cationes divalentes, en el que la diferencia entre la concentración
de quelante de cationes divalentes y la concentración de catión
divalente es menor de aproximadamente 5 mM. De manera alternativa,
la concentración de quelante de cationes divalentes en la
composición de reactivo o mezcla de reacción puede ser al menos la
mitad de la concentración de catión divalente, preferiblemente
igual o incluso mayor. Sin embargo, el quelante de cationes
divalentes puede ser innecesario en los casos en los que la
concentración de catión divalente sea baja (por ejemplo, menor de
aproximadamente 5 mM, 2,5 mM o 1 mM). Preferiblemente, se produce
una señal luminiscente detectable en 5 ó 10 minutos después de
poner en contacto la muestra microbiana con la composición de
reactivo. Esencialmente, cualquiera de las composiciones de
reactivos descritas en esta descripción se contempla para el uso en
los métodos de la presente invención.
La puesta en contacto de la muestra microbiana
con la composición de reactivo facilita la extracción o liberación
de ATP de las células microbianas para la reacción con los reactivos
de bioluminiscencia apropiados presentes en la composición de
reactivo, produciendo de esta manera una señal bioluminiscente
fácilmente detectable. La muestra microbiana puede constituir una
muestra microbiana purificada, una población mixta de células
microbianas o un material de fuente que se sospecha que contiene
células microbianas. En una realización preferida, la presente
invención se refiere a métodos para la extracción y detección de ATP
de E. coli o de materiales de fuentes microbianas que se
sospeche que contienen E. coli.
Puede generarse una señal luminiscente adecuada
usando una composición de reactivo que contiene, por ejemplo, al
menos un agente de extracción de ATP, tal como un detergente
catiónico o no catiónico; un catión divalente, tal como magnesio;
un agente quelante divalente, tal como EDTA; una fuente de
luciferasa, tal como LucPpe2m78, LucPpe2m90, LucPpe2m133 o
LucPpe2m146; y uno o más sustratos de luciferasa, tales como
luciferina (que puede reconstituirse a partir de una preparación
liofilizada u otro sustrato análogo de luciferina apropiado). La
composición de reactivo puede incluir adicionalmente uno o más
inhibidores de enzimas generadoras de ATP, agentes estabilizantes
de enzimas, agentes desespumantes, etc.
En un aspecto, la presente invención proporciona
un método para la extracción y detección de ATP en una muestra
microbiana o en una muestra que se sospecha que contiene una muestra
microbiana, tal como una bacteria, levadura u otros hongos. Existen
una diversidad de fuentes microbianas adecuadas para el uso de
acuerdo con la presente invención, incluyendo, pero sin limitación,
eubacterias (tanto bacterias gram positivas como bacterias gram
negativas), arqueobacterias, levaduras u hongos. Por ejemplo, se ha
descubierto que las composiciones de reactivos de la presente
invención funcionan con una diversidad de organismos microbianos
diferentes, incluyendo pero sin limitación, bacterias gram
negativas, tales como Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa,
Enterobacter cloacae, Flavobacterium okeanokoites, Haemophilus
influenzae, Proteus vulgaris, Salmonella typhimurium, Yersinia
enterocolitica y Francisella philomiragia; bacterias gram
positivas tales como Staphylococcus aureus, Enterococcus
faecalis, Streptococcus pneumoniae, Bacillus subtilis, Bacilus
cereus, Arthrobacter luteus; y microorganismos eucariotas,
tales como Saccharomyces cerevisiae y Candida
albicans. En una realización preferida, la muestra contiene o
se sospecha que contiene E. coli o P. aeruginosa.
Aunque los métodos de la invención pueden usarse con una muestra
que contiene cualquier cantidad de ATP, es preferible usar una
muestra que contiene una cantidad no saturada de ATP (es
decir, un intervalo en el que la luminiscencia es linealmente
proporcional a la concentración de ATP).
La muestra microbiana puede ser cualquier cosa
que se sospeche que contiene microbios, tal como lisados celulares,
células intactas, biopsias, alimentos, bebidas, hisopos frotados
sobre superficies tales como las de animales, plantas u objetos
inanimados y similares. Las muestras de control pueden incluir una
concentración de ATP conocida para generar una curva patrón que
facilite una determinación cuantitativa de los niveles de ATP en
una
muestra.
muestra.
Un lisado celular comprende componentes
celulares que ya no están organizados en una arquitectura celular
intacta reconocible. Los lisados celulares pueden tener componentes
solubles e insolubles, pudiendo eliminarse cualquiera de ellos
antes de usar el lisado. Los lisados pueden prepararse por cualquier
medio, incluyendo ruptura física usando sonicación, un
homogeneizador Dounce, mortero y triturador, ciclos de
congelación-descongelación, o cualquier otro
dispositivo o proceso que destruya la integridad física de las
células; o lisis mediante detergentes, tales como en los que la
LucPpe2m146 conserva su actividad, tales como detergentes
zwitteriónicos y no iónicos, o detergentes catiónicos DTAB o CTAB.
Preferiblemente, el lisado celular se produce de tal modo que se
conserva la integridad de la concentración de ATP en el momento en
el que se recogen las células.
La extracción o liberación eficaz de ATP a
partir de fuentes microbianas puede depender de las limitaciones
estructurales presentadas por la fuente microbiana. Estas
circunstancias pueden requerir equilibrar la cantidad de compuestos
quelantes divalentes para la estabilización inversa mediada por
cationes divalentes al tiempo que niveles suficientes de catión
divalente para promover la detección bioluminiscente de ATP. La
selección de agentes de extracción de ATP apropiados para la
extracción y detección de ATP puede determinarse empíricamente para
una fuente microbiana determinada. Preferiblemente, la selección de
estos compuestos se basará en la extracción eficaz de ATP y en la
conservación de las actividades de detección de ATP (por ejemplo,
actividad luciferasa, etc.) para la extracción y detección de ATP
en una sola etapa de acuerdo con la presente invención.
La reacción de
luciferasa-luciferina de escarabajo da como
resultado la generación de luz ("luminiscencia"). Debido a que
la reacción de luciferasa-luciferina de escarabajo
es dependiente de ATP, puede usarse luciferasa para ensayar para
ATP. La reacción es notablemente sensible, permitiendo que se
detecte el ATP en una muestra que contiene tan poco como 10^{-16}
moles de ATP o menos. Las composiciones, métodos y kits de la
invención permiten a un usuario cuantificar la cantidad de ATP en
una muestra cuantificando la cantidad de luminiscencia. La
invención se aplica a una muestra de interés y también a muestras
que contienen cantidades conocidas de ATP (controles). La señal
generada a partir de una muestra de concentración de ATP desconocida
puede correlacionarse con señales generadas a partir de controles
internos (por ejemplo, adición de una cantidad conocida de ATP a
una muestra y medición de la luminiscencia posterior) o curvas
patrón externas, generadas midiendo la luminiscencia de varias
muestras de concentraciones de ATP conocidas y representándolas
gráficamente. Los especialistas en la técnica conocen dichos
métodos. (Moyer y Henderson, 1983; Ronner et al., 1999;
Stanley, 1959; Wood et al., 1989).
La luminiscencia generada por una reacción de
luciferasa se detecta típicamente con un luminómetro, aunque pueden
usarse otros medios de detección. Para medir la luminiscencia y por
tanto determinar la actividad de la composición de reactivo, puede
medirse el valor de unidades relativas de luz (URL) generado por la
reacción de luciferasa en un momento de interés después de que la
composición de reactivo se combine con una muestra. La presencia de
luz superior al nivel de fondo indica la presencia de ATP en la
muestra. El nivel de fondo de luminiscencia puede medirse en las
mismas condiciones de reacción en las que se encuentra la muestra
(por ejemplo, composición de reactivo, etc.), pero sin la muestra.
Pueden emplearse reacciones de control positivas que impliquen ATP
para facilitar una determinación de las cantidades de ATP presentes
en una muestra. Un especialista en la técnica puede determinar
estas y otras reacciones de control.
Las luciferasas preferidas para usar en las
composiciones y métodos de la presente invención generan una señal
luminiscente estable, de una duración marcada, que muestra una
pérdida de luminiscencia menor del 50% por media hora respecto a la
señal luminiscente generada en el momento en que se inició la
reacción de luciferasa. Las luciferasas preferidas para usar en las
composiciones y métodos de la invención pueden tener propiedades de
termoestabilidad aumentadas y/o pueden poseer propiedades cinéticas
favorables para análisis múltiples de una muestra a lo largo del
tiempo o el análisis de muchas muestras a lo largo del tiempo,
incluyendo, pero sin limitación, una hora después del inicio de la
reacción de luciferasa, más preferiblemente dos horas y, más
preferiblemente, cuatro horas o más después del inicio.
La cuantificación de la cantidad de luz emitida
puede permitir la cuantificación de la cantidad de ATP en una
muestra, y por tanto la cantidad de células microbianas vivas. Se
realizan valores de ATP cuantitativos, por ejemplo, cuando la
cantidad de luz emitida a partir de una muestra de ensayo se compara
con la cantidad de luz emitida a partir de una muestra de control o
con una curva patrón determinada usando cantidades conocidas de ATP
y la misma luciferasa, sustrato y condiciones de reacción (es decir,
temperatura, pH, etc.). Se entiende que la cuantificación implica
la resta de los valores de fondo. Se realizan valores de ATP
cualitativos cuando la luminiscencia emitida a partir de una
muestra se compara con la luminiscencia emitida a partir de otra
muestra sin necesidad de conocer la cantidad absoluta de ATP
presente en las muestras, por ejemplo, una comparación de muestras
en presencia o ausencia de un compuesto de ensayo. Un especialista
en la técnica puede diseñar fácilmente muchos experimentos de
este
tipo.
tipo.
Las realizaciones preferidas de acuerdo con la
presente invención se refieren a métodos de detección de ATP usando
composiciones de reactivos de una sola etapa que contienen un
conjunto completo de componentes para facilitar la extracción y
detección de ATP. Sin embargo, las composiciones de reactivos que
contienen agentes de extracción de ATP de la presente invención
pueden usarse independientemente de los reactivos de luciferasa y
luciferina para lisar primero las células, antes de la adición de
agentes neutralizantes (por ejemplo, tampones) y/o de agentes de
luciferasa y/o luciferina exógenos en una etapa final de detección
de ATP, de acuerdo con otras metodologías de detección de ATP "de
dos etapas" conocidas por los especialistas en la técnica.
La presencia de ATP es un reflejo de los
procesos metabólicos activos, característicos de células viables.
Las composiciones, métodos y kits de la presente invención pueden
por tanto usarse para ensayar la viabilidad celular (Cree, 1998;
Jassim et al., 1990; Petty et al., 1995). Una medida
exacta de la viabilidad celular permite la evaluación exacta de los
efectos de sustancias en las células; los especialistas en la
técnica conocen otras aplicaciones relacionadas con la viabilidad
celular. La determinación de la viabilidad celular puede ser útil
en la evaluación de, por ejemplo, la citotoxicidad, proliferación
celular, necrosis, alteraciones en el metabolismo celular, etc.
Las muestras microbianas usadas para evaluar la
viabilidad celular pueden ser células nativas viables o pueden
incluir lisados celulares (como un marcador sustituto para
viabilidad celular) o cualquier otro material de fuente microbiana
que se sospeche que contiene células, se sospeche que procede de
células, o que se prevea que refleja la viabilidad de los
materiales de fuentes microbianas.
Se contempla un kit de ensayo para el uso de
acuerdo con la presente invención y puede incluir los componentes
para preparar el reactivo homogéneo de lisis y detección y un
conjunto de instrucciones para el uso. Preferiblemente, el kit
puede incluir una fuente liofilizada de luciferina/luciferasa y un
vial de tampón de reconstitución que contiene el agente (o agentes)
de extracción de ATP para preparar el reactivo homogéneo de lisis y
detección. El tampón de reconstitución puede suministrarse con
cationes y/o quelantes a una concentración fija o estos componentes
pueden suministrarse por separado, permitiendo al usuario añadir
cationes divalentes y/o quelantes a una concentración apropiada
para el uso, dependiendo de los materiales de la fuente de células
microbianas en particular (por ejemplo, células individuales,
población, etc.).
Debido a que diferentes microorganismos muestran
diferencias en el grado en que pueden ayudar a un proceso de lisis
celular-detección de ATP en una etapa en base a
diferencias estructurales que afectan a este proceso, en otro
aspecto la presente invención proporciona un método para identificar
condiciones de reacción apropiadas para una lisis y detección de
ATP eficaz en una etapa en un microorganismo o grupo de
microorganismos particular. En particular, la presente invención
proporciona un ensayo para evaluar o determinar un equilibrio óptimo
entre agentes de extracción de ATP microbiano, cationes divalentes
y compuestos quelantes divalentes capaces de efectuar,
individualmente o colectivamente, la extracción y detección de
ATP.
En una realización preferida, la presente
invención proporciona un método para la identificación de un agente
o agentes de extracción de ATP adecuados para la extracción y
detección de ATP en una muestra microbiana, en el que (1) una
primera composición de reactivo que incluye una primera
concentración de catión divalente, un agente quelante de cationes
divalentes, uno o más agentes de extracción de ATP microbiano, una
enzima luciferasa y un sustrato de luciferasa (por ejemplo,
luciferina) se combina con una muestra bacteriana en un medio de
cultivo para producir una primera mezcla que produce una primera
señal luminiscente; y (2) una segunda composición de reactivo que
incluye una concentración mayor de catión divalente que en la
primera composición de reactivo, un agente quelante de cationes
divalentes, uno o más agentes de extracción de ATP microbiano, una
enzima luciferasa y un sustrato de luciferasa (por ejemplo,
luciferina), se combina con la misma muestra bacteriana para
producir una segunda mezcla que produce una segunda señal
luminiscente; en el que la segunda composición de reactivo es
adecuada para la extracción y detección de ATP en la muestra
bacteriana si la primera señal luminiscente de la primera mezcla es
superior a la segunda señal luminiscente que se obtiene como
resultado de la segunda mezcla.
Preferiblemente, la concentración de catión
divalente en la primera composición de reactivo es preferiblemente
al menos aproximadamente diez veces, más preferiblemente al menos
aproximadamente 25 veces y, aún más preferiblemente, al menos
aproximadamente 100 veces menos concentrada que la concentración de
catión divalente en la segunda composición de reactivo. La
concentración de catión divalente en la primera composición de
reactivo puede variar entre aproximadamente 0 y 2 mM, entre
aproximadamente 0,05 mM y 0,5 mM, entre aproximadamente 0,1 y 0,3
mM o ser de aproximadamente 0,2 mM. Preferiblemente, la
concentración de catión divalente en la segunda composición de
reactivo es de entre aproximadamente 20 mM y 200 mM, entre
aproximadamente 5 mM y 50 mM, entre aproximadamente 10 mM y 30 mM o
aproximadamente 20 mM.
Puede usarse una variación del método anterior
para identificar composiciones de reactivos adecuadas para la
extracción y detección eficaz de ATP de una amplia diversidad de
células microbianas. Brevemente, este método puede implicar la
preparación de una composición de reactivo que incluye luciferasa
(por ejemplo, termoestable, quimioestable o nativa), luciferina,
una concentración fija de Mg^{2+}, (por ejemplo, a 5 mM) y un
tampón; la adición de un supuesto agente de extracción de ATP de
interés a la composición de reactivo y el examen de las diferencias
comparativas en luminiscencia en presencia de ATP exógeno (control
positivo) y una colección de diferentes fuentes de células
microbianas. En una realización, las fuentes de células microbianas
pueden incluir una diversidad de microorganismos diferentes que
representan varias clases, incluyendo, pero sin imitación,
bacterias Gram negativas, bacterias Gram positivas, Arqueobacterias
y hongos. En otra realización, las fuentes de células microbianas
pueden incluir una diversidad de microorganismos específicos para
una clase microbiana particular (por ejemplo, bacterias Gram
negativas, bacterias Gram positivas, Arqueobacterias u hongos). El
agente de extracción de ATP de elección debería tener un impacto
mínimo sobre la luminiscencia de muestras de control de ATP, pero
proporcionar una extracción suficiente y la generación de una señal
de luminiscencia estable (por ejemplo, semivida de al menos 24
minutos). Varios agentes de extracción de ATP pueden ensayarse
individualmente o combinarse y evaluarse sus efectos de dosificación
en un formato de matriz para identificar la mejor combinación y
concentración para cada compuesto activo. El efecto del Mg^{2+}
podría evaluarse adicionalmente por dosificación de diversas
concentraciones de Mg^{2+}, al tiempo que se fijan todos los
demás componentes en las composiciones de reactivo para mantenerlos
igual.
Una aplicación principal de la presente
invención es para la determinación de la viabilidad relativa de
muestras de células microbianas, poblaciones de células
microbianas, o fuentes sospechosas de contaminación microbiana
usando los métodos descritos anteriormente.
El uso de ensayos de viabilidad celular de
acuerdo con la presente invención puede aplicarse adicionalmente al
desarrollo y ensayo de agentes farmacéuticamente activos o
biológicamente activos. En una realización preferida, las
composiciones, métodos y kits de la presente invención pueden usarse
para evaluar la eficacia de compuestos candidatos a antibióticos o
para ensayar el efecto de compuestos, tales como inorgánicos,
orgánicos pequeños, péptidos, proteínas y polipéptidos, sobre el
metabolismo bacteriano (Aiginger et al., 1980; Andreotti
et al., 1995; Bradbury et al., 2000; Cree y
Andreotti, 1997; Crouch et al., 1993; Kangas et al.,
1984). La medición de la viabilidad celular después del tratamiento
de células microbianas con agentes farmacéuticamente activos o
biológicamente activos (por ejemplo, antibióticos, etc.) puede
proporcionar un medio para la exploración e identificación de
nuevos agentes farmacéuticamente o biológicamente activos que
afecten negativamente al crecimiento
microbiano.
microbiano.
Por ejemplo, pueden tratarse cultivos
microbianos en un aparato de cultivo adecuado (por ejemplo, una
placa multipocillo, etc.) con un conjunto de agentes antibióticos
candidatos (en paralelo con cultivos de control sin tratar),
cultivarse durante un tiempo suficiente para el crecimiento
microbiano, y se ensayarse para ATP (ensayo de luminiscencia)
usando las composiciones y métodos de la presente invención.
Generalmente, se descubrirá que un agente antibiótico candidato
muestra actividad antibiótica si la luminiscencia detectada a partir
del cultivo de control sin tratar es mayor que la luminiscencia del
cultivo tratado. A la inversa, se descubrirá típicamente que un
agente antibiótico candidato no tiene actividad antibiótica si la
luminiscencia es equivalente (o incluso mayor) en el cultivo
tratado, en comparación con el cultivo de control sin tratar.
Una aplicación adicional de la presente
invención proporciona un método para la exploración de péptidos
antimicrobianos análogos a los usados en los mecanismos de defensa
inmunológica innata (véase, por ejemplo, Lehrer y Ganz, Curr. Opin.
Immunol., 11 (1): 23-27, 1999). Este método usa una
modificación del método descrito en la parte E. para identificar
péptidos antimicrobianos capaces de alterar células microbianas, en
los que péptidos antimicrobianos (o bibliotecas de péptidos
adecuadas) sustituyen a los agentes de extracción de ATP en la parte
E. anterior. Pueden tratarse dianas microbianas seleccionadas
(tales como microorganismos resistentes a antibióticos), por
ejemplo, con bibliotecas de péptidos en lugar de los agentes de
extracción de ATP y explorarse para determinar la bioluminiscencia
en base a promover la extracción y detección eficaz de ATP para
identificar agentes microbicidas potenciales que tienen una
capacidad selectiva para lisar células microbianas. Sin embargo, el
método no debe limitarse a la exploración de péptidos. Pueden
ensayarse una diversidad de compuestos químicos o bioquímicos
diferentes para identificar agentes candidatos que muestren una
capacidad selectiva para lisar células microbianas en base a los
resultados obtenidos usando el sistema de ensayo de ATP descrito.
Los siguientes ejemplos tienen por objeto ilustrar la presente
invención sin limitación.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se evaluó la cinética de la detección de ATP en
una célula microbiana usando una composición de reactivo de
luciferasa compuesta por un reactivo de reconstitución (HEPES 200
mM, pH 7,5 (Sigma), MgCl_{2} (0 mM, 2,5 mM, 5 mM, 10 mM o 20 mM),
CTAB al 0,08% (Sigma), CHEX al 0,16% (Sigma),
Triton-X100 al 1% (Sigma), fluoruro de sodio 2 mM
(Sigma), NaPPI 25 \muM (Sigma)) y un sustrato (citrato 4 mM,
luciferina 5 mM, Prionex al 0,4% (Pentapharm, Ltd), luciferasa
termoestable \sim0,08 mg/ml, sulfato de magnesio 1 mM y CDTA 1,25
mM). Se añadieron 100 \mul de un cultivo de P. aeruginosa
o 100 \mul de una solución madre de ATP (control) 1 x 10^{-9} M
a 100 \mul de la composición de reactivo de luciferasa y se midió
la luminiscencia periódicamente durante un periodo de tiempo de 35
minutos. Se ensayó P. aeruginosa a aproximadamente 10^{6}
células por pocillo. Los resultados de este análisis (Figura 1)
destacan diferencias en la detección de ATP en función de la
concentración de catión divalente.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Se ensayaron los efectos de diferentes
combinaciones de agentes de extracción de ATP sobre la detección de
ATP a bajas (0,2 mM) y altas (20,0 mM) concentraciones de catión
divalente. Se trató P. aeruginosa con diferentes agentes de
extracción de ATP en presencia de "altas" (+; 20 mM) o
"bajas" (-; 0,2 mM) concentraciones de MgCl_{2} en una
composición de reactivo BacTiter-Glo^{TM}
(UltraGlo^{TM} Luciferasa 0,358 mg/ml (Promega), luciferina de
escarabajo 6 mM (Promega) HEPES 200 mM (Signia), CTAB al 0,08%
(Sigma), CHEX al 0,16% (Sigma), Triton-X100 al 1%
(Sigma), NaF 2 mM (Sigma), NaPPI 25 \muM (Sigma)). Se añadieron
100 \mul de un cultivo de P. aeruginosa a 100 \mul de la
composición de reactivo BacTiter-Glo^{TM} y se
midió la luminiscencia. Se ensayó P. aeruginosa a
aproximadamente 10^{6} células por pocillo. Los resultados de este
análisis (Figura 2) demuestran un efecto "de inversión de
magnesio" caracterizado por una luminiscencia aumentada en un
punto equivalente en el intervalo de tiempo (por ejemplo, a t = 0
min) cuando se reduce el nivel de magnesio en la composición de
reactivo o mezcla de 20 mM a 0,2 mM.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Para demostrar que la neutralización de cationes
divalentes con agentes quelantes puede mimetizar la mayor
luminiscencia obtenida en condiciones de baja concentración de
catión divalente, se trataron cultivos de E. coli, S aureus, P.
aeruginosa y B. cereus con una composición de reactivo de
luciferasa compuesta por un reactivo de reconstitución (HEPES 200
mM (Sigma), MgCl_{2} 20 mM, CTAB al 0,08% (Sigma), CHEX al 0,16%
(Sigma), Triton-X100 al 1% (Sigma), NaF 2 mM
(Sigma), NaPPI 25 \muM (Sigma)) y un sustrato (citrato 4 mM,
luciferina 5 mM, Prionex al 0,4% (Pentapharm, Ltd), luciferasa
termoestable -0,08 mg/ml, sulfato de magnesio 1 mM y CDTA 1,25 mM).
Se añadieron 100 \mul de cultivo bacteriano o 100 \mul de una
solución madre de ATP (control) 1x10^{-9} M a 100 \mul del
reactivo de reconstitución y se midió periódicamente la
luminiscencia durante un periodo de tiempo de 35 minutos. Los
cultivos microbianos se ensayaron a aproximadamente 10^{6}
células por pocillo. Se añadió CDTA adicional a t = 12 minutos a
cada una de las muestras (concentración final = CDTA 20 mM). Los
resultados de este análisis (Figura 3) indican que el CDTA es capaz
de neutralizar los efectos inhibidores de cationes divalentes en
P. aeruginosa.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Para demostrar la detección de ATP en presencia
de agentes quelantes de cationes divalentes, se preparó una
composición de reactivo de reconstitución (HEPES 200 mM (Sigma),
CTAB al 0,08% (Sigma), CHEX al 0,16% (Sigma),
Triton-X100 al 1% (Sigma), NaF 2 mM (Sigma), NaPPI
25 \muM (Sigma), MgCl_{2} 20 mM (Sigma)) que contenía distintas
concentraciones de EDTA (0 mM, 22 mM, 23 mM, 24 mM y 25 mM). Después
se generaron composiciones de reactivo de luciferasa mezclando las
composiciones de reactivo de reconstitución con sustrato (citrato 4
mM, luciferina 5 mM, Prionex al 0,4% (Pentapharm, Ltd), luciferasa
termoestable \sim0,08 mg/ml, sulfato de magnesio 1 mM y CDTA 1,25
mM). Se añadieron 100 \mul de E. coli (Figura 4A), P.
aeruginosa (Figura 4B) o una solución madre de ATP (no se
muestra) 1 x 10^{-9} M a 100 \mul de la composición de reactivo
de luciferasa y se midió la luminiscencia periódicamente durante un
periodo de tiempo de 40 minutos. Los cultivos bacterianos se
ensayaron a aproximadamente 10^{6} células por pocillo. Los
resultados de este análisis (Figura 4A, 4B) indican que los efectos
inhibidores del catión divalente pueden valorarse usando
concentraciones de quelante divalente optimizadas para promover un
equilibrio apropiado entre la liberación y la detección de ATP.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Para determinar los efectos de la concentración
de catión divalente sobre la detección de ATP entre diferentes
bacterias, se preparó un reactivo de reconstitución (HEPES 200 mM
(Sigma), CTAB al 0,08% (Sigma), CHEX al 0,16% (Sigma),
Triton-X100 al 1% (Sigma), NaF 2 mM (Sigma), NaPPI
25 \muM (Sigma), y se añadió a distintas concentraciones de
MgCl_{2} (0 mM, 2,5 mM, 5 mM, 10 mM y 20 mM)) y un sustrato
(citrato 4 mM, luciferina 5 mM, Prionex al 0,4% (Pentapharm, Ltd),
luciferasa termoestable \sim0,08 mg/ml, sulfato de magnesio 1 mM y
CDTA 1,25 mM). Se ensayaron E coli (Figura 5A), S
aureus (Figura 5B), P. aeruginosa (Figura 5C) y B.
cereus (Figura 5D) a aproximadamente 10^{6} células por
pocillo. También se ensayó una solución de ATP purificado como
control (no se muestra). Se añadieron 100 \mul de cultivo
bacteriano o 100 \mul de una solución madre de ATP 1 x 10^{-9}
M a 100 \mul del reactivo y se midió la luminiscencia
periódicamente durante un periodo de tiempo de 35 minutos. Los
resultados de este análisis (Figuras 5A-5D) destacan
diferencias en la detección de ATP dependiendo del microorganismo y
de la concentración de catión divalente.
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Ejemplo
6
Para evaluar la cinética de la detección de ATP
a bajas (0,2 mM) y altas (20 mM) concentraciones de catión
divalente, se incluyeron diversas combinaciones de agentes de
extracción de ATP diferentes en una composición de reactivo (HEPES
200 mM (Sigma), NaF 2 mM (Sigma), NaPPI 25 \muM (Sigma),
UltraGlo^{TM} Luciferasa 0,358 mg/ml (Promega) y luciferina de
escarabajo 6 mM (Promega)) que contenía una baja (0,2 mM) o alta
(20,0 mM) concentración de MgCl_{2} para formar una serie de
composiciones de reactivos, diferenciándose cada una en lo que
respecta a los agentes de extracción y/o concentraciones de catión
divalente contenidos en las mismas. Se añadieron 100 \mul de cada
una de las diferentes composiciones de reactivos a 100 \mul de
E. coli (Figura 6A, 6B), P. aeruginosa (Figura 6C,
6D) o una solución control de ATP 1 x 10^{-9} M (Figura 6E, 6F)
en un pocillo pequeño. Se midió la luminiscencia periódicamente
durante un periodo de tiempo de 50 minutos. Los resultados de este
análisis (Figura 6A-6F) indican diferencias en la
cinética de Glo dependiendo del microbio, la combinación de agentes
de extracción de ATP y la concentración de catión divalente.
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Ejemplo
7
Para evaluar los efectos de cationes divalentes
alternos sobre la extracción y detección de ATP a bajas (0,2 mM) y
altas (20 mM) concentraciones de catión divalente, se cultivó
Pseudomonas aeruginosa (ATCC27853) en caldo Mueller Hinton
II (MH II) a 37ºC durante una noche. El cultivo durante una noche se
diluyó 50 veces en caldo MH II recién preparado y después se incubó
durante varias horas hasta alcanzar la fase logarítmica. Las
células se diluyeron hasta aproximadamente 1 x 10^{6} células por
pocillo. Se diluyó una solución de control de ATP hasta
aproximadamente 10^{-9} M. Se prepararon 100 \mul de una
composición de reactivo BacTiter-Glo^{TM} (HEPES
200 mM (Sigma), CTAB al 0,08% (Sigma), CHEX al 0,16% (Sigma),
Triton-X100 al 1% (Sigma), NaF 2 mM (Sigma), NaPPI
25 \muM (Sigma), UltraGlo^{TM} Luciferasa 0,358 mg/ml (Promega)
y luciferina de escarabajo 6 mM (Promega) que contenía distintas
concentraciones de MgCl_{2} (Figura 7A), CaCl_{2} (Figura 7B) o
MnCl_{2} (Figura 7C) a 0,002, 0,02., 0,2, 2,0 o 20 mM y se
añadieron a 100 \mul de las muestras bacterianas o de control de
ATP. La luminiscencia se registró en un luminómetro de microplacas
Veritas^{TM} de Turner Biosystems. Los resultados de este
análisis (Figura 7A-7C) indican que el impacto de
los cationes divalentes sobre la extracción y detección de ATP no
se limita a Mg^{2+}, ya que se encontró de manera similar que el
uso de Ca^{2+} (Figura 7B) y Mn^{2+} (Figura 7C) elevados
obstaculizaba la detección de ATP.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8
Se cultivó Pseudomonas aeruginosa
(ATCC27853) en caldo Mueller Hinton II (MH II) a 37ºC durante una
noche. El cultivo durante una noche se diluyó 50 veces en caldo MH
II recién preparado y después se incubó durante varias horas hasta
alcanzar la fase logarítmica. Las células se diluyeron hasta
aproximadamente 1 x 10^{6} células por pocillo. Se diluyó una
solución de control de ATP hasta aproximadamente 10^{-9} M. Se
prepararon 100 \mul de una composición de reactivo
BacTiter-Glo^{TM} (HEPES 200 mM (Sigma), CTAB al
0,08% (Sigma), CHEX al 0,16% (Sigma), Triton-X100
al 1% (Sigma), NaF 2 mM (Sigma), NaPPI 25 \muM (Sigma), Luciferasa
Recombinante QuantiLum 0,358 mg/ml (Promega) y luciferina de
escarabajo 6 mM (Promega) que contenía bajas (0,2 mM) o altas (20
mM) concentraciones de MgCl_{2} y se añadieron a la muestra
bacteriana o de control de ATP. La luminiscencia se registró en un
luminómetro de microplacas Veritas^{TM} de Turner Biosystems. Los
resultados de este análisis (Figura 8) indican que los efectos
inhibidores de los cationes divalentes sobre la extracción y
detección de ATP en una sola etapa no se limitan al uso de
luciferasas termoestables.
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Ejemplo
9
Se usaron cuatro cepas bacterianas para evaluar
la relación entre el número de células microbianas y la
luminiscencia. Se cultivaron cepas bacterianas de Escherichia
coli (ATCC25922), Staphylococcus aureus (ATCC25923),
Pseudomonas aeruginosa (ATCC27853) y Bacillus cereus
(ATCC10987) en caldo Mueller Hinton II (MH II) a 37ºC durante una
noche. El cultivo de una noche se diluyó 50 veces en caldo MH II
recién preparado y después se incubó durante varias horas hasta
alcanzar la fase logarítmica. Se realizaron diluciones seriadas de
muestras de cultivo usando caldo MH II en una placa de 96 pocillos.
Se equilibró una composición de reactivo
BacTiter-Glo^{TM} reconstituido (HEPES 200 mM
(Sigma), CTAB al 0,08% (Sigma), CHEX al 0,16% (Sigma),
Triton-X100 al 1% (Sigma), MgCl_{2} 20 mM, EDTA
23 mM, NaF 2 mM (Sigma), NaPPI 25 \muM (Sigma), UltraGlo^{TM}
Luciferasa 0,358 mg/ml (Promega) y luciferina de escarabajo 6 mM
(Promega)) durante 1,5 horas a temperatura ambiente para mejorar la
sensibilidad y se añadió a cada una de las diferentes muestras de
cultivo. La luminiscencia se registró en un luminómetro de
microplacas Veritas^{TM} de Turner Biosystems (Sunnyvale, CA).
Los resultados de este análisis se muestran en
la Figura 9, que es un gráfico que representa una correlación entre
el número de células bacterianas y la bioluminiscencia. Las señales
luminiscentes representan la media de tres repeticiones para cada
medición. El número de células bacterianas se determinó por recuento
en placa de unidades formadoras de colonias en placas de agar
Luria-Bertani. Se calculó la proporción de
señal-interferencia donde S:N = [media de señal -
media del fondo]/desviación típica del fondo]. La Figura 9 demuestra
una correlación lineal entre la señal luminiscente y el número de
células de más de cinco órdenes de magnitud. Los límites de
detección extraídos de este experimento para E coli, S.
aureus, P. aeruginosa y B. cereus son de aproximadamente
40, 150, 70 y 10 células, respectivamente.
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Ejemplo
10
Se cultivaron cuatro bacterias diferentes
(E. coli, S. aureus, P. aeruginosa y B. cereus)
y se ensayaron como se ha descrito en el Ejemplo 9. Se usaron
aproximadamente 10^{6} células en cada ensayo. La estabilidad de
la señal luminiscente se controló a lo largo del tiempo. La
luminiscencia se registró en un luminómetro de microplacas
Veritas^{TM} de Turner Biosystems (Sunnyvale, CA). Los resultados
de este análisis (Figura 10) indican que un sistema de ensayo
microbiano de la presente invención puede producir una señal
luminiscente de "tipo resplandor" estable con una semivida
(T_{1/2}) de >30 minutos en una variedad de células
microbianas.
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Ejemplo
11
Se cultivó una cepa de E. coli ATCC 25922
en caldo MH II a 37ºC durante una noche. El cultivo de una noche se
diluyó 1:10^{6} en 50 ml de caldo MH II recién preparado y se
incubó a 37ºC con agitación a 250 rpm. Se tomaron muestras a
diversos puntos de tiempo y se realizó un ensayo de detección de
luciferasa como se ha descrito en el Ejemplo 9. La luminiscencia se
registró en un luminómetro de microplacas Veritas^{TM}. La
densidad óptica se midió a 600 nm (D.O. 600) usando un
espectrofotómetro Beckman DU650. Se usaron muestras diluidas cuando
las lecturas de URL y D.O. superaban 10^{8} y 1, respectivamente.
Los resultados de este análisis (Figura 11) indican que el ensayo
de detección de ATP proporciona una medida más sensible del
crecimiento bacteriano que las mediciones de densidad óptica
convencionales (compárense los resultados con el recuadro).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
12
Se cultivó la cepa de S. aureus ATCC
25923 en caldo MH II a 37ºC durante una noche. El cultivo durante
una noche se diluyó 100 veces en caldo MH II recién preparado y se
usó como inóculo para la exploración antimicrobiana. Se prepararon
reservas de trabajo (50X) de compuestos LOPAC y antibióticos patrón
en DMSO. Cada pocillo de la placa multipocillo de 96 pocillos
contenía 245 \mul del inóculo y 5 \mul de la reserva de trabajo
50X. La placa multipocillo se incubó a 37ºC durante 5 horas. Se
tomaron cien microlitros del cultivo de cada pocillo, y el ensayo
de detección de luciferasa se realizó como se ha descrito en el
Ejemplo 9. La luminiscencia se midió usando un luminómetro de
microplacas Veritas^{TM} de Turner Biosystems (Sunnyvale, CA). Las
muestras y concentraciones eran: pocillos 1-4 y
93-96, control negativo de DMSO al 2%, pocillos
5-8 y 89-92, controles positivos de
los antibióticos patrón tetraciclina, ampicilina, gentamicina,
cloranfenicol, oxacilina, kanamicina, piperacilina y eritromicina
32 \mug/ml; pocillos 9-88, compuestos LOPAC a 10
\muM. Los resultados de este análisis (Figura 12), validan el uso
de este método de exploración para la identificación de agentes
antibióticos (indicados por círculos en comparación con los
controles positivos, que están recuadrados).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
13
Se preparó la cepa de S. aureus ATCC
25923 y oxacilina como se ha descrito en el Ejemplo 8 y se incubó a
37ºC; el ensayo de detección de ATP se realizó después de 19 horas
de incubación según lo recomendado para la determinación de la CMI
por el NCCLS (6). Se muestra el porcentaje relativo de URL en
comparación con el control sin oxacilina. La luminiscencia se
registró en un luminómetro de microplacas Veritas^{TM} de Turner
Biosystems (Sunnyvale, CA). Los resultados de este análisis
(Figura.13) demuestran un efecto dependiente de la dosis de
antibióticos sobre la detección de ATP.
Claims (43)
1. Una composición para la detección de ATP en
una muestra que se sospecha que contiene un microorganismo que
comprende:
- (a)
- un tampón de reacción;
- (b)
- uno o más agentes de extracción de ATP;
- (c)
- un catión divalente a una primera concentración;
- (d)
- un quelante de cationes divalentes a una segunda concentración; y
- (e)
- una enzima luciferasa;
en la que la diferencia entre la primera
concentración y la segunda concentración es menor de aproximadamente
5 mM.
2. La composición de la reivindicación 1, en la
que la diferencia entre la primera concentración y la segunda
concentración es menor de aproximadamente 2,5 mM.
3. La composición de la reivindicación 1, en la
que la diferencia entre la primera concentración y la segunda
concentración es menor de aproximadamente 1,0 mM.
4. La composición de la reivindicación 1, en la
que la segunda concentración es al menos la mitad de la primera
concentración.
5. La composición de la reivindicación 1, en la
que la segunda concentración es al menos aproximadamente igual a o
mayor que la primera concentración.
6. La composición de la reivindicación 1, en la
que la primera concentración es al menos 10 mM.
7. La composición de la reivindicación 1, en la
que la primera concentración es al menos 20 mM.
8. La composición de la reivindicación 1, en la
que la primera concentración es al menos aproximadamente 20 mM y la
segunda concentración es al menos aproximadamente 20 mM.
9. Una composición para la detección de ATP en
una muestra que se sospecha que contiene un microorganismo que
comprende:
- (a)
- un tampón de reacción;
- (b)
- uno o más agentes de extracción de ATP;
- (c)
- un catión divalente a una primera concentración;
- (d)
- una enzima luciferasa;
en la que la primera concentración es menor de
aproximadamente 5 mM.
10. La composición de la reivindicación 9, en la
que la primera concentración es menor de aproximadamente 2,5
mM.
11. La composición de la reivindicación 9, en la
que la primera concentración es menor de aproximadamente 1 mM.
12. La composición de la reivindicación 9, en la
que la primera concentración es menor de aproximadamente 0,5
mM.
13. La composición de la reivindicación 9, que
comprende adicionalmente un quelante de cationes divalentes.
14. La composición de la reivindicación 1 ó 9,
en la que el microorganismo es una bacteria gram negativa.
15. La composición de la reivindicación 1 ó 9,
en la que el microorganismo es E. coli o P.
aeruginosa.
16. La composición de la reivindicación 1 ó 9,
en la que uno o más agentes de extracción de ATP comprenden bromuro
de cetiltrimetilamonio.
17. La composición de la reivindicación 1 ó 9,
en la que uno o más agentes de extracción de ATP comprenden
clorhexidina y un detergente no iónico.
18. La composición de la reivindicación 1 ó 9,
en la que uno o más agentes de extracción de ATP comprenden bromuro
de cetiltrimetilamonio, clorhexidina y un detergente no iónico.
19. La composición de la reivindicación 1 ó 9,
en la que el catión divalente es Mg^{2+}, Ca^{2+} o
Mn^{2+}.
20. La composición de la reivindicación 1 ó 9,
en la que el quelante de cationes divalentes es EDTA o CDTA.
21. La composición de la reivindicación 1 ó 9,
en la que el catión divalente es Mg^{2+} y el quelante de
cationes divalentes es EDTA.
22. Un método de detección de ATP en una muestra
que contiene o se sospecha que contiene un microorganismo que
comprende:
- (a)
- poner en contacto la muestra con una composición que comprende un catión divalente a una primera concentración, un quelante de cationes divalentes a una segunda concentración, uno o más agentes de extracción de ATP y una enzima luciferasa para formar una mezcla;
- \quad
- en el que la diferencia entre la primera concentración y la segunda concentración es menor de aproximadamente 5 mM; y
- (b)
- detectar la luminiscencia.
23. El método de la reivindicación 22, en el que
la concentración de quelante de cationes divalentes en la
composición es al menos aproximadamente igual o superior a la
concentración de catión divalente en la composición.
24. El método de la reivindicación 22, en el que
la concentración de quelante de cationes divalentes en la mezcla es
al menos la mitad de la concentración de catión divalente en la
mezcla.
25. El método de la reivindicación 22, en el que
la luminiscencia produce una señal luminiscente suficiente para
detectar al menos 1 x 10^{-14} moles de ATP en la muestra.
26. El método de la reivindicación 22, en el que
la composición produce una señal luminiscente suficiente para
detectar al menos 1000 células de E. coli.
27. Un método de detección de ATP en una muestra
que contiene o se sospecha que contiene un microorganismo que
comprende:
- (a)
- poner en contacto la muestra con una composición que comprende un catión divalente, uno o más agentes de extracción de ATP y una enzima luciferasa para formar una mezcla;
- \quad
- en el que el catión divalente está presente en la composición a una concentración de menos de aproximadamente 5 mM; y
- (b)
- detectar la luminiscencia.
28. El método de la reivindicación 27, en el que
el catión divalente está presente en la composición a una
concentración de menos de aproximadamente 2,5 mM.
29. El método de la reivindicación 27, en el que
el catión divalente está presente en la composición a una
concentración de menos de aproximadamente 1 mM.
30. El método de la reivindicación 27, en el que
el catión divalente está presente en la composición a una
concentración de menos de aproximadamente 0,5 mM.
31. El método de la reivindicación 22 ó 27, en
el que el microorganismo es una bacteria gram negativa.
32. El método de la reivindicación 22 ó 27, en
el que el microorganismo es E. coli o P.
aeruginosa.
33. El método de la reivindicación 22 ó 27, en
el la muestra contiene o se sospecha que contiene una población
heterogénea de células microbianas.
34. El método de la reivindicación 22 ó 27, en
el que la muestra contiene o se sospecha que contiene un microbio
patógeno.
\newpage
35. El método de la reivindicación 22 ó 27, en
el que se produce una señal luminiscente detectable en 10 minutos
después de poner en contacto la muestra con la composición.
36. El método de la reivindicación 22 ó 27, en
el que se produce una señal luminiscente detectable en 5 minutos
después de poner en contacto la muestra con la composición.
37. El método de la reivindicación 22 ó 27, en
el que la luminiscencia produce una señal luminiscente con una vida
media de al menos 30 minutos.
38. Un método para identificar un agente de
extracción de ATP adecuado para detectar ATP en una muestra
microbiana que comprende:
- (a)
- añadir a una muestra microbiana de una fuente microbiana una composición que comprende un catión divalente, un quelante de cationes divalentes, al menos un agente de extracción de ATP, una enzima de luciferasa y un sustrato de luciferasa para formar una mezcla;
- \quad
- en el que el catión divalente está presente en la mezcla a una concentración de menos de o igual a aproximadamente 0,5 mM;
- (b)
- medir el grado de luminiscencia en dicha mezcla y determinar la idoneidad del al menos un agente de extracción de ATP para el uso en la detección de ATP en una muestra microbiana;
- \quad
- en el que dicho al menos un agente de extracción de ATP es adecuado para detectar ATP en la fuente microbiana si el grado de luminiscencia es suficiente para la detección.
39. El método de la reivindicación 38, en el que
el catión divalente está presente en la mezcla a una concentración
menor de o igual a aproximadamente 0,1 mM.
40. Un método de identificación de un agente de
extracción de ATP adecuado para la detección de ATP en una muestra
microbiana que comprende:
- (a)
- añadir a una primera muestra microbiana de una fuente microbiana una primera concentración de catión divalente, un quelante de cationes divalentes, al menos un agente de extracción de ATP, una enzima luciferasa y un sustrato de luciferasa para formar una primera mezcla;
- (b)
- añadir a una segunda muestra microbiana de la fuente microbiana en (a), una segunda concentración de catión divalente, un quelante de cationes divalentes, al menos un agente de extracción de ATP, una enzima luciferasa y un sustrato de luciferasa para formar una segunda mezcla,
- \quad
- en el que la segunda concentración de catión divalente en la segunda mezcla es mayor que la primera concentración de catión divalente en la primera mezcla; y
- (c)
- detectar por separado la luminiscencia en dichas primera y segunda mezclas y determinar la idoneidad del al menos un agente de extracción de ATP para el uso en la detección de ATP en una muestra microbiana;
- \quad
- en el que dicho al menos un agente de extracción de ATP es adecuado para la detección de ATP en la fuente microbiana si la luminiscencia en la primera mezcla es mayor que la luminiscencia en la segunda mezcla.
41. Un método de exploración de agentes
antibióticos candidatos que comprende:
- (a)
- tratar un primer cultivo microbiano con al menos un agente antibiótico candidato;
- (b)
- cultivar el primer cultivo microbiano tratado con dicho al menos un agente antibiótico candidato y un segundo cultivo de control microbiano no tratado con dicho al menos un agente antibiótico candidato durante un periodo de tiempo suficiente para detectar el crecimiento en el segundo cultivo de control micro- biano;
- (c)
- poner en contacto por separado el primer cultivo microbiano y el segundo cultivo de control microbiano con una composición que comprende un catión divalente, un agente quelante de cationes divalentes, al menos un agente de extracción de ATP y una luciferasa para formar una primera y segunda mezclas, respectivamente;
- \quad
- en el que la diferencia en la cantidad de catión divalente y quelante de cationes divalentes en cada una de dichas primera y segunda mezclas es menor de aproximadamente 2,5 mM; y
- (d)
- detectar la luminiscencia; y,
- (e)
- determinar si el antibiótico candidato tiene actividad antibiótica.
42. El método de la reivindicación 41, en el que
la diferencia en la cantidad de catión divalente y quelante de
cationes divalentes en cada una de dichas primera y segunda mezclas
es menor de aproximadamente 1,25 mM.
43. El método de la reivindicación 41, en el que
la diferencia en la cantidad de catión divalente y quelante de
cationes divalentes en cada una de dichas primera y segunda mezclas
es menor de aproximadamente 0,4 mM.
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