JPH1028599A - 試料中に存在する微生物細胞に由来するａｔｐを検出及び／または測定する方法、及びその試薬キット - Google Patents
試料中に存在する微生物細胞に由来するａｔｐを検出及び／または測定する方法、及びその試薬キットInfo
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- JPH1028599A JPH1028599A JP10286297A JP10286297A JPH1028599A JP H1028599 A JPH1028599 A JP H1028599A JP 10286297 A JP10286297 A JP 10286297A JP 10286297 A JP10286297 A JP 10286297A JP H1028599 A JPH1028599 A JP H1028599A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 微生物細胞及び非微生物細胞を含む試料か
ら、感度良く、短時間に、試料中に存在する微生物細胞
に由来するＡＴＰを選択的に検出及び／または測定する
方法を提供する。 【解決手段】 試料中に存在する微生物細胞に由来する
ＡＴＰを検出及び／または測定する方法であって、試料
を遠心分離して上澄み液を除去し微生物細胞ペレットを
形成する工程、微生物細胞ペレットにプロテアーゼフリ
ーの可溶性タンパク質とＡＴＰ加水分解酵素を含む緩衝
液を加えてｐＨ＝６．０〜８．０の条件下でインキュベ
ートする工程、ＡＴＰ抽出剤を添加し微生物細胞からＡ
ＴＰを抽出する工程、及び微生物細胞から放出されたＡ
ＴＰを生物発光法を用いて検出及び／または測定する工
程を含むことを特徴とする前記の測定方法。
ら、感度良く、短時間に、試料中に存在する微生物細胞
に由来するＡＴＰを選択的に検出及び／または測定する
方法を提供する。 【解決手段】 試料中に存在する微生物細胞に由来する
ＡＴＰを検出及び／または測定する方法であって、試料
を遠心分離して上澄み液を除去し微生物細胞ペレットを
形成する工程、微生物細胞ペレットにプロテアーゼフリ
ーの可溶性タンパク質とＡＴＰ加水分解酵素を含む緩衝
液を加えてｐＨ＝６．０〜８．０の条件下でインキュベ
ートする工程、ＡＴＰ抽出剤を添加し微生物細胞からＡ
ＴＰを抽出する工程、及び微生物細胞から放出されたＡ
ＴＰを生物発光法を用いて検出及び／または測定する工
程を含むことを特徴とする前記の測定方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、試料の微生物学的
品質検査に関し、より詳細には、試料に存在する微生物
細胞に由来するＡＴＰを選択的に検出及び／または測定
する方法に関する。また、試料に存在する微生物細胞に
由来するＡＴＰを検出及び／または測定するための試薬
キットに関する。
品質検査に関し、より詳細には、試料に存在する微生物
細胞に由来するＡＴＰを選択的に検出及び／または測定
する方法に関する。また、試料に存在する微生物細胞に
由来するＡＴＰを検出及び／または測定するための試薬
キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】ルシフェラーゼを用いた生物発光法は、
微生物細胞ＡＴＰの迅速検出法として利用されている。
微生物細胞及び非微生物細胞混合物である試料中の微生
物細胞由来ＡＴＰを測定する方法として、非微生物細胞
を非イオン界面活性剤で溶解し、放出された非微生物細
胞由来ＡＴＰをアピラーゼのようなＡＴＰ加水分解酵素
で分解後、沸騰−Ｔｒｉｓ緩衝液などでアピラーゼを不
活性化し、微生物の溶解剤を加え微生物細胞由来ＡＴＰ
を生物発光法で定量する方法が採られている（米国特許
第３７４５０９０号）。この方法はわずか数十分で結果
が出るため、抜き取り検査などには最適であるが、沸騰
−Ｔｒｉｓ緩衝液によるアピラーゼの不活性化処理が感
度低下を引き起こし正確な測定値を得ることができなか
った。
微生物細胞ＡＴＰの迅速検出法として利用されている。
微生物細胞及び非微生物細胞混合物である試料中の微生
物細胞由来ＡＴＰを測定する方法として、非微生物細胞
を非イオン界面活性剤で溶解し、放出された非微生物細
胞由来ＡＴＰをアピラーゼのようなＡＴＰ加水分解酵素
で分解後、沸騰−Ｔｒｉｓ緩衝液などでアピラーゼを不
活性化し、微生物の溶解剤を加え微生物細胞由来ＡＴＰ
を生物発光法で定量する方法が採られている（米国特許
第３７４５０９０号）。この方法はわずか数十分で結果
が出るため、抜き取り検査などには最適であるが、沸騰
−Ｔｒｉｓ緩衝液によるアピラーゼの不活性化処理が感
度低下を引き起こし正確な測定値を得ることができなか
った。
【０００３】非微生物細胞を含む試料中の微生物細胞由
来ＡＴＰを選択的に測定する方法として、以下の３つの
方法が開発されている（特公昭６２−４１２０号）。い
ずれの方法でも、大量に存在する非微生物細胞由来ＡＴ
Ｐから微生物由来ＡＴＰのみを選択的に高感度に検出す
る方法に腐心している。第１の方法は、試料に非イオン
界面活性剤を作用させ、非微生物細胞由来ＡＴＰを抽出
してろ過器で分離し、ろ過器に濃縮された微生物細胞の
ＡＴＰを抽出し生物発光で測定する方法である。しか
し、この方法はろ過に時間を要し操作も煩雑であるため
適切な方法ではない。 第２の方法は、非イオン界面活
性剤を作用させ、非微生物細胞由来ＡＴＰを抽出したの
ち遠心分離操作で上澄液として除去し、微生物細胞を含
む沈殿より微生物細胞由来ＡＴＰを抽出し生物発光で測
定する方法である。この方法の欠点は、１回の遠心分離
操作で完全に非微生物細胞由来ＡＴＰを分離ができない
ことである。遠心分離操作を繰り返すことにより分離は
完全になるが、時間を要し、操作も煩雑で、遠心分離−
上澄み除去という洗浄回数が増すことによって微生物細
胞の収率は悪くなり、良好な方法とはいえない。第３の
方法は、試料に非イオン性界面活性剤などを作用させ、
非微生物細胞由来ＡＴＰを抽出した後にアピラーゼなど
のＡＴＰ加水分解酵素でこれを分解し、分解完了後アピ
ラーゼをガラスビーズなどで不動態化し、その後、微生
物細胞由来ＡＴＰを抽出して生物発光で測定する方法で
ある。しかし、この方法では、試料に対して微生物細胞
の濃縮操作が施されていないことや、タンパク質、乳脂
肪などの試料の構成成分による測定阻害を受けることに
よって高感度の検出は期待できない。また、アピラーゼ
の除去あるいは失活が不完全であって、微生物細胞から
ＡＴＰを抽出した後もアピラーゼの阻害作用があり正確
な測定値が得られない。従って、以上の方法の測定値は
バラツキが大きく、実用的には１０6 ＣＦＵ／ｍｌ（Ｃ
ＦＵ；C olony F ormingU nit ）程度の検出感度しか期
待できない。
来ＡＴＰを選択的に測定する方法として、以下の３つの
方法が開発されている（特公昭６２−４１２０号）。い
ずれの方法でも、大量に存在する非微生物細胞由来ＡＴ
Ｐから微生物由来ＡＴＰのみを選択的に高感度に検出す
る方法に腐心している。第１の方法は、試料に非イオン
界面活性剤を作用させ、非微生物細胞由来ＡＴＰを抽出
してろ過器で分離し、ろ過器に濃縮された微生物細胞の
ＡＴＰを抽出し生物発光で測定する方法である。しか
し、この方法はろ過に時間を要し操作も煩雑であるため
適切な方法ではない。 第２の方法は、非イオン界面活
性剤を作用させ、非微生物細胞由来ＡＴＰを抽出したの
ち遠心分離操作で上澄液として除去し、微生物細胞を含
む沈殿より微生物細胞由来ＡＴＰを抽出し生物発光で測
定する方法である。この方法の欠点は、１回の遠心分離
操作で完全に非微生物細胞由来ＡＴＰを分離ができない
ことである。遠心分離操作を繰り返すことにより分離は
完全になるが、時間を要し、操作も煩雑で、遠心分離−
上澄み除去という洗浄回数が増すことによって微生物細
胞の収率は悪くなり、良好な方法とはいえない。第３の
方法は、試料に非イオン性界面活性剤などを作用させ、
非微生物細胞由来ＡＴＰを抽出した後にアピラーゼなど
のＡＴＰ加水分解酵素でこれを分解し、分解完了後アピ
ラーゼをガラスビーズなどで不動態化し、その後、微生
物細胞由来ＡＴＰを抽出して生物発光で測定する方法で
ある。しかし、この方法では、試料に対して微生物細胞
の濃縮操作が施されていないことや、タンパク質、乳脂
肪などの試料の構成成分による測定阻害を受けることに
よって高感度の検出は期待できない。また、アピラーゼ
の除去あるいは失活が不完全であって、微生物細胞から
ＡＴＰを抽出した後もアピラーゼの阻害作用があり正確
な測定値が得られない。従って、以上の方法の測定値は
バラツキが大きく、実用的には１０6 ＣＦＵ／ｍｌ（Ｃ
ＦＵ；C olony F ormingU nit ）程度の検出感度しか期
待できない。
【０００４】ＡＴＰ生物発光法における検出感度向上の
有力な方法の一つとして、微生物細胞の濃縮による感度
の向上が期待できる、先の遠心分離操作を含む方法の改
良が挙げられる。特にミルク試料の場合は、微生物細胞
を測定の阻害となる他の成分から分離・濃縮するため、
キレート剤及び非イオン界面活性剤をミルクに添加して
遠心分離する方法が新たに提唱されている。この方法で
他のミルク成分による測定阻害は防止できるが、操作が
煩雑な上、非微生物細胞由来ＡＴＰの除去が不十分で殆
ど検出感度の向上は認められず、実用的な試験法として
感度不足は否定できない（ヨーロッパ特許公開公報第５
４２７９０号）。
有力な方法の一つとして、微生物細胞の濃縮による感度
の向上が期待できる、先の遠心分離操作を含む方法の改
良が挙げられる。特にミルク試料の場合は、微生物細胞
を測定の阻害となる他の成分から分離・濃縮するため、
キレート剤及び非イオン界面活性剤をミルクに添加して
遠心分離する方法が新たに提唱されている。この方法で
他のミルク成分による測定阻害は防止できるが、操作が
煩雑な上、非微生物細胞由来ＡＴＰの除去が不十分で殆
ど検出感度の向上は認められず、実用的な試験法として
感度不足は否定できない（ヨーロッパ特許公開公報第５
４２７９０号）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】以上のような事実を鑑
み、本発明は、感度良く、短時間に、試料中に存在する
微生物細胞に由来するＡＴＰを選択的に検出及び／また
は測定する方法を提供することを目的とする。また、試
料中に存在する微生物細胞に由来するＡＴＰを選択的に
検出及び／または測定するための試薬キットを提供する
ことを目的とする。
み、本発明は、感度良く、短時間に、試料中に存在する
微生物細胞に由来するＡＴＰを選択的に検出及び／また
は測定する方法を提供することを目的とする。また、試
料中に存在する微生物細胞に由来するＡＴＰを選択的に
検出及び／または測定するための試薬キットを提供する
ことを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、試料中に存在
する微生物細胞に由来するＡＴＰを検出及び／または測
定する方法であって、試料を遠心分離して上澄み液を除
去し微生物細胞ペレットを形成する工程、微生物細胞ペ
レットにプロテアーゼフリーの可溶性タンパク質とＡＴ
Ｐ加水分解酵素を含む緩衝液を加えてｐＨ＝６．０〜
８．０の条件下でインキュベートする工程、ＡＴＰ抽出
剤を添加し微生物細胞からＡＴＰを抽出する工程、及び
微生物細胞から放出されたＡＴＰを生物発光法を用いて
検出及び／または測定する工程を含むことを特徴とする
前記の方法に関する。
する微生物細胞に由来するＡＴＰを検出及び／または測
定する方法であって、試料を遠心分離して上澄み液を除
去し微生物細胞ペレットを形成する工程、微生物細胞ペ
レットにプロテアーゼフリーの可溶性タンパク質とＡＴ
Ｐ加水分解酵素を含む緩衝液を加えてｐＨ＝６．０〜
８．０の条件下でインキュベートする工程、ＡＴＰ抽出
剤を添加し微生物細胞からＡＴＰを抽出する工程、及び
微生物細胞から放出されたＡＴＰを生物発光法を用いて
検出及び／または測定する工程を含むことを特徴とする
前記の方法に関する。
【０００７】更に本発明は、試料を遠心分離する前に非
イオン界面活性剤を添加して、試料中に存在する非微生
物細胞中のＡＴＰを細胞外へ出す工程をさらに含む上記
の測定方法に関する。
イオン界面活性剤を添加して、試料中に存在する非微生
物細胞中のＡＴＰを細胞外へ出す工程をさらに含む上記
の測定方法に関する。
【０００８】更に本発明は、非イオン界面活性剤を添加
して非微生物細胞中のＡＴＰを細胞外へ出す工程におい
て、キレート剤を添加する上記の測定方法に関する。
して非微生物細胞中のＡＴＰを細胞外へ出す工程におい
て、キレート剤を添加する上記の測定方法に関する。
【０００９】更に本発明は、微生物細胞ペレットにプロ
テアーゼフリーの可溶性タンパク質とＡＴＰ加水分解酵
素を含む緩衝液を加えてｐＨ＝６．０〜８．０の条件下
でインキュベートする工程において、ＡＴＰ加水分解酵
素活性化剤を添加する上記の測定方法に関する。
テアーゼフリーの可溶性タンパク質とＡＴＰ加水分解酵
素を含む緩衝液を加えてｐＨ＝６．０〜８．０の条件下
でインキュベートする工程において、ＡＴＰ加水分解酵
素活性化剤を添加する上記の測定方法に関する。
【００１０】更に本発明は、微生物細胞ペレットにプロ
テアーゼフリーの可溶性タンパク質とＡＴＰ加水分解酵
素を含む緩衝液を加えてｐＨ＝６．０〜８．０の条件下
でインキュベートする工程において、防腐剤を添加する
上記の測定方法に関する。
テアーゼフリーの可溶性タンパク質とＡＴＰ加水分解酵
素を含む緩衝液を加えてｐＨ＝６．０〜８．０の条件下
でインキュベートする工程において、防腐剤を添加する
上記の測定方法に関する。
【００１１】更に本発明は、微生物細胞ペレットにプロ
テアーゼフリーの可溶性タンパク質とＡＴＰ加水分解酵
素を含む緩衝液を加えてｐＨ＝６．０〜８．０の条件下
でインキュベートする工程において、キレート剤を添加
する上記の測定方法に関する。
テアーゼフリーの可溶性タンパク質とＡＴＰ加水分解酵
素を含む緩衝液を加えてｐＨ＝６．０〜８．０の条件下
でインキュベートする工程において、キレート剤を添加
する上記の測定方法に関する。
【００１２】更に本発明は、微生物細胞ペレットにプロ
テアーゼフリーの可溶性タンパク質とＡＴＰ加水分解酵
素を含む緩衝液を加えてｐＨ＝６．０〜８．０の条件下
でインキュベートする工程において、タンパク質ＳＨ基
保護剤を添加する上記の測定方法に関する。
テアーゼフリーの可溶性タンパク質とＡＴＰ加水分解酵
素を含む緩衝液を加えてｐＨ＝６．０〜８．０の条件下
でインキュベートする工程において、タンパク質ＳＨ基
保護剤を添加する上記の測定方法に関する。
【００１３】更に本発明は、生物発光法がルシフェリン
及びルシフェラーゼを含む上記の測定方法に関する。
及びルシフェラーゼを含む上記の測定方法に関する。
【００１４】更に本発明は、ｐＨを６．０〜８．０に調
整しうる緩衝液、プロテアーゼフリーの可溶性タンパク
質及びＡＴＰ加水分解酵素を含む試薬、ＡＴＰ抽出剤を
含む試薬、並びに生物発光試薬を含むことを特徴とす
る、微生物細胞に由来するＡＴＰを検出及び／または測
定するための試薬キットに関する。
整しうる緩衝液、プロテアーゼフリーの可溶性タンパク
質及びＡＴＰ加水分解酵素を含む試薬、ＡＴＰ抽出剤を
含む試薬、並びに生物発光試薬を含むことを特徴とす
る、微生物細胞に由来するＡＴＰを検出及び／または測
定するための試薬キットに関する。
【００１５】更に本発明は、生物発光試薬がルシフェリ
ン及びルシフェラーゼを含む上記の試薬キットに関す
る。
ン及びルシフェラーゼを含む上記の試薬キットに関す
る。
【００１６】
【発明の実施の形態】本発明は、試料中に存在する微生
物細胞に由来するＡＴＰを検出及び／または測定する方
法であって、試料を遠心分離して上澄み液を除去し微生
物細胞ペレットを形成する工程、微生物細胞ペレットに
プロテアーゼフリーの可溶性タンパク質とＡＴＰ加水分
解酵素を含む緩衝液を加えてｐＨ＝６．０〜８．０の条
件下でインキュベートする工程、ＡＴＰ抽出剤を添加し
微生物細胞からＡＴＰを抽出する工程、及び微生物細胞
から放出されたＡＴＰを生物発光法を用いて検出及び／
または測定する工程を含むことを特徴とする前記の方法
に関する。試料が非微生物細胞を含む場合、試料を遠心
分離する前に非イオン界面活性剤を添加して非微生物細
胞中のＡＴＰを細胞外へ出す工程をさらに含んでもよ
い。非イオン界面活性剤を添加して非微生物細胞中のＡ
ＴＰを細胞外へ出す工程においては、キレート剤、ポリ
スチレンラテックスなどを単独で、あるいは組み合わせ
て添加してもよい。また、微生物細胞ペレットにプロテ
アーゼフリーの可溶性タンパク質とＡＴＰ加水分解酵素
を含む緩衝液を加えてｐＨ＝６．０〜８．０の条件下で
インキュベートする工程においては、ＡＴＰ加水分解酵
素活性化剤、防腐剤、キレート剤、タンパク質ＳＨ基保
護剤などを単独で、あるいは組み合わせて添加してもよ
い。本発明の方法により、試料中に存在する微生物細胞
に由来するＡＴＰを簡便かつ短時間で選択的に検出及び
／または測定することができる。特に、本発明の方法に
より、ミルク試料中に存在する微生物細胞に由来するＡ
ＴＰを、１０4 ＣＦＵ／ｍｌ以下の検出感度で、しかも
小さい測定誤差で、検出及び／または測定することがで
きる。
物細胞に由来するＡＴＰを検出及び／または測定する方
法であって、試料を遠心分離して上澄み液を除去し微生
物細胞ペレットを形成する工程、微生物細胞ペレットに
プロテアーゼフリーの可溶性タンパク質とＡＴＰ加水分
解酵素を含む緩衝液を加えてｐＨ＝６．０〜８．０の条
件下でインキュベートする工程、ＡＴＰ抽出剤を添加し
微生物細胞からＡＴＰを抽出する工程、及び微生物細胞
から放出されたＡＴＰを生物発光法を用いて検出及び／
または測定する工程を含むことを特徴とする前記の方法
に関する。試料が非微生物細胞を含む場合、試料を遠心
分離する前に非イオン界面活性剤を添加して非微生物細
胞中のＡＴＰを細胞外へ出す工程をさらに含んでもよ
い。非イオン界面活性剤を添加して非微生物細胞中のＡ
ＴＰを細胞外へ出す工程においては、キレート剤、ポリ
スチレンラテックスなどを単独で、あるいは組み合わせ
て添加してもよい。また、微生物細胞ペレットにプロテ
アーゼフリーの可溶性タンパク質とＡＴＰ加水分解酵素
を含む緩衝液を加えてｐＨ＝６．０〜８．０の条件下で
インキュベートする工程においては、ＡＴＰ加水分解酵
素活性化剤、防腐剤、キレート剤、タンパク質ＳＨ基保
護剤などを単独で、あるいは組み合わせて添加してもよ
い。本発明の方法により、試料中に存在する微生物細胞
に由来するＡＴＰを簡便かつ短時間で選択的に検出及び
／または測定することができる。特に、本発明の方法に
より、ミルク試料中に存在する微生物細胞に由来するＡ
ＴＰを、１０4 ＣＦＵ／ｍｌ以下の検出感度で、しかも
小さい測定誤差で、検出及び／または測定することがで
きる。
【００１７】また本発明は、ｐＨを６．０〜８．０に調
整しうる緩衝液、プロテアーゼフリーの可溶性タンパク
質及びＡＴＰ加水分解酵素を含む試薬、ＡＴＰ抽出剤を
含む試薬、並びに生物発光試薬を含むことを特長とす
る、微生物細胞に由来するＡＴＰを検出及び／または測
定するための試薬キットを提供する。本発明の試薬キッ
トは、さらに非イオン界面活性剤を含む試薬を含んでも
よい。非イオン界面活性剤を含む試薬は、キレート剤、
ポリスチレンラテックス、及びそれらの組み合わせを含
んでもよい。ｐＨを６．０〜８．０に調整しうる緩衝
液、プロテアーゼフリーの可溶性タンパク質及びＡＴＰ
加水分解酵素を含む試薬は、ＡＴＰ加水分解酵素活性化
剤、防腐剤、キレート剤、タンパク質ＳＨ基保護剤、及
びそれらの組み合わせを含んでもよい。生物発光試薬は
ルシフェリン及びルシフェラーゼを含んでもよい。
整しうる緩衝液、プロテアーゼフリーの可溶性タンパク
質及びＡＴＰ加水分解酵素を含む試薬、ＡＴＰ抽出剤を
含む試薬、並びに生物発光試薬を含むことを特長とす
る、微生物細胞に由来するＡＴＰを検出及び／または測
定するための試薬キットを提供する。本発明の試薬キッ
トは、さらに非イオン界面活性剤を含む試薬を含んでも
よい。非イオン界面活性剤を含む試薬は、キレート剤、
ポリスチレンラテックス、及びそれらの組み合わせを含
んでもよい。ｐＨを６．０〜８．０に調整しうる緩衝
液、プロテアーゼフリーの可溶性タンパク質及びＡＴＰ
加水分解酵素を含む試薬は、ＡＴＰ加水分解酵素活性化
剤、防腐剤、キレート剤、タンパク質ＳＨ基保護剤、及
びそれらの組み合わせを含んでもよい。生物発光試薬は
ルシフェリン及びルシフェラーゼを含んでもよい。
【００１８】以下、本発明の方法を、微生物細胞及び非
微生物細胞混合物を含む試料の典型であるミルク試料に
適用した例について詳述する。ただし、これにより本発
明の方法を適用する対象の範囲がミルク試料に限定され
るものではない。分析に供試されるミルク試料をまず遠
心分離容器に入れ、キレート剤、及び非イオン界面活性
剤を添加する。キレート剤はミルク試料中のカルシウム
イオンを捕捉してカゼインの沈澱を抑制し、非イオン界
面活性剤は非微生物細胞からのＡＴＰ抽出剤として働
く。混合物に蓋をし、反転あるいは旋回して混合する。
試料は、遠心分離機に入れ、最小限５分間、１０，００
０×ｇ（最小相対遠心力）で遠心分離すると、３つの層
に分離する。最上層は白色または帯黄白色のクリーム及
びミルクタンパク質である。その下層には中間層である
透明液領域があり、最下層には微生物細胞ペレットがた
まる。この際、微生物細胞ペレットの形成を明確化する
ために、キレート剤及び非イオン界面活性剤と共に、ミ
ルク試料にポリスチレンラテックス等を加えてもよい。
微生物細胞ペレット以外の他のミルク成分を吸引により
除去すると、微生物細胞ペレットのみが遠心分離容器の
底部に残る。微生物細胞ペレットの大きさはミルク試料
中の細胞数及びキレート剤と非イオン界面活性剤のタイ
プにも依存するが、微生物細胞ペレットは少量の細胞と
会合した他のミルク成分も含んでいる。
微生物細胞混合物を含む試料の典型であるミルク試料に
適用した例について詳述する。ただし、これにより本発
明の方法を適用する対象の範囲がミルク試料に限定され
るものではない。分析に供試されるミルク試料をまず遠
心分離容器に入れ、キレート剤、及び非イオン界面活性
剤を添加する。キレート剤はミルク試料中のカルシウム
イオンを捕捉してカゼインの沈澱を抑制し、非イオン界
面活性剤は非微生物細胞からのＡＴＰ抽出剤として働
く。混合物に蓋をし、反転あるいは旋回して混合する。
試料は、遠心分離機に入れ、最小限５分間、１０，００
０×ｇ（最小相対遠心力）で遠心分離すると、３つの層
に分離する。最上層は白色または帯黄白色のクリーム及
びミルクタンパク質である。その下層には中間層である
透明液領域があり、最下層には微生物細胞ペレットがた
まる。この際、微生物細胞ペレットの形成を明確化する
ために、キレート剤及び非イオン界面活性剤と共に、ミ
ルク試料にポリスチレンラテックス等を加えてもよい。
微生物細胞ペレット以外の他のミルク成分を吸引により
除去すると、微生物細胞ペレットのみが遠心分離容器の
底部に残る。微生物細胞ペレットの大きさはミルク試料
中の細胞数及びキレート剤と非イオン界面活性剤のタイ
プにも依存するが、微生物細胞ペレットは少量の細胞と
会合した他のミルク成分も含んでいる。
【００１９】次に、遠心分離容器の底部に残る微生物細
胞ペレットに、ＡＴＰ加水分解酵素含有溶液を加えて再
懸濁させる。再懸濁させた液は、バックグランドとなる
非微生物細胞由来または遊離のＡＴＰが加水分解される
までインキュベートさせる。ＡＴＰ加水分解酵素含有液
には、ｐＨ＝６．０〜８．０とする緩衝液、プロテアー
ゼフリーの可溶性タンパク質、ＡＴＰ加水分解酵素活性
化剤を添加する。ＡＴＰ加水分解酵素を加える工程は、
非微生物細胞由来ＡＴＰ及び遊離ＡＴＰを分解するため
である。遠心分離操作で大部分の非微生物細胞由来のＡ
ＴＰは除去されているが、ミルク試料は大量の体細胞を
含むため、遠心分離操作だけで非微生物細胞由来のＡＴ
Ｐを完全に除去することはできない。そこで、ＡＴＰ加
水分解酵素によりこれらのＡＴＰを加水分解する。ま
た、ｐＨ＝６．０〜８．０に調整するのは、ＡＴＰ加水
分解酵素を最適の活性とするためであり、プロテアーゼ
フリーの可溶性タンパク質の添加は、ＡＴＰ加水分解酵
素を安定に作用させる働きがある。ＡＴＰ加水分解酵素
活性化剤も、酵素を安定に作用させ測定値のバラツキを
抑えるために添加するとよい。
胞ペレットに、ＡＴＰ加水分解酵素含有溶液を加えて再
懸濁させる。再懸濁させた液は、バックグランドとなる
非微生物細胞由来または遊離のＡＴＰが加水分解される
までインキュベートさせる。ＡＴＰ加水分解酵素含有液
には、ｐＨ＝６．０〜８．０とする緩衝液、プロテアー
ゼフリーの可溶性タンパク質、ＡＴＰ加水分解酵素活性
化剤を添加する。ＡＴＰ加水分解酵素を加える工程は、
非微生物細胞由来ＡＴＰ及び遊離ＡＴＰを分解するため
である。遠心分離操作で大部分の非微生物細胞由来のＡ
ＴＰは除去されているが、ミルク試料は大量の体細胞を
含むため、遠心分離操作だけで非微生物細胞由来のＡＴ
Ｐを完全に除去することはできない。そこで、ＡＴＰ加
水分解酵素によりこれらのＡＴＰを加水分解する。ま
た、ｐＨ＝６．０〜８．０に調整するのは、ＡＴＰ加水
分解酵素を最適の活性とするためであり、プロテアーゼ
フリーの可溶性タンパク質の添加は、ＡＴＰ加水分解酵
素を安定に作用させる働きがある。ＡＴＰ加水分解酵素
活性化剤も、酵素を安定に作用させ測定値のバラツキを
抑えるために添加するとよい。
【００２０】微生物細胞ペレットにＡＴＰ加水分解酵素
を加える工程では、ＡＴＰ加水分解酵素の活性及び反応
条件を以下のようにを制御すると好都合である。 ａ）ＡＴＰ加水分解酵素の活性値をΔｌｏｇＲＬＵ／分
＝１．０〜４．０とする。 ｂ）ＡＴＰ加水分解酵素の反応時間を１０分間以上とす
る。 ｃ）ＡＴＰ加水分解酵素の反応温度を２０〜４０℃とす
る。 なお、本発明では、ＡＴＰ加水分解酵素の活性値を、Ａ
ＴＰ加水分解酵素によって基質であるＡＴＰを加水分解
する速度をもって表す。従って、酵素活性の測定は被検
液中のＡＴＰ量の減少を経時的に測定することで実施さ
れ、被検液中のＡＴＰ量は、ＡＴＰの鋭敏な定量法であ
るホタルルシフェラーゼを用いた生物発光反応から得ら
れる相対発光量（ＲＬＵ；相対発光量、R elative L ig
htU nit）を指標として測定される。本発明では、非連
続的に被検液より一定量を採取してＡＴＰ量を生物発光
反応で測定し、得られた値から１分間当たりの相対発光
量の対数値の減少量（ΔｌｏｇＲＬＵ／分）を計算し、
その値をもってＡＴＰ加水分解酵素の活性値とする。
を加える工程では、ＡＴＰ加水分解酵素の活性及び反応
条件を以下のようにを制御すると好都合である。 ａ）ＡＴＰ加水分解酵素の活性値をΔｌｏｇＲＬＵ／分
＝１．０〜４．０とする。 ｂ）ＡＴＰ加水分解酵素の反応時間を１０分間以上とす
る。 ｃ）ＡＴＰ加水分解酵素の反応温度を２０〜４０℃とす
る。 なお、本発明では、ＡＴＰ加水分解酵素の活性値を、Ａ
ＴＰ加水分解酵素によって基質であるＡＴＰを加水分解
する速度をもって表す。従って、酵素活性の測定は被検
液中のＡＴＰ量の減少を経時的に測定することで実施さ
れ、被検液中のＡＴＰ量は、ＡＴＰの鋭敏な定量法であ
るホタルルシフェラーゼを用いた生物発光反応から得ら
れる相対発光量（ＲＬＵ；相対発光量、R elative L ig
htU nit）を指標として測定される。本発明では、非連
続的に被検液より一定量を採取してＡＴＰ量を生物発光
反応で測定し、得られた値から１分間当たりの相対発光
量の対数値の減少量（ΔｌｏｇＲＬＵ／分）を計算し、
その値をもってＡＴＰ加水分解酵素の活性値とする。
【００２１】微生物細胞ペレットにＡＴＰ加水分解酵素
を加える工程では、以下の試薬を加えることもできる。 ａ）防腐剤 ｂ）キレート剤 ｃ）タンパク質ＳＨ基保護剤
を加える工程では、以下の試薬を加えることもできる。 ａ）防腐剤 ｂ）キレート剤 ｃ）タンパク質ＳＨ基保護剤
【００２２】ＡＴＰ加水分解酵素を作用させインキュベ
ートの終了した再懸濁液に、イオン界面活性剤からなる
微生物細胞ＡＴＰ抽出剤を加え、微生物細胞からＡＴＰ
を放出させ、直ちに発光試薬（例えば、ルシフェリン／
ルシフェラーゼを含む発光試薬）を加えて生物発光さ
せ、ＡＴＰ量を検出装置（例えば、ルミノメーター）で
定量する。この時の測定温度は１５℃〜２５℃、ＡＴＰ
抽出剤を接触させて発光試薬を添加するまでの時間は１
０秒以上６０秒以内、発光試薬を添加してから発光量の
測定が終了するまでの時間は３０秒以内とする。
ートの終了した再懸濁液に、イオン界面活性剤からなる
微生物細胞ＡＴＰ抽出剤を加え、微生物細胞からＡＴＰ
を放出させ、直ちに発光試薬（例えば、ルシフェリン／
ルシフェラーゼを含む発光試薬）を加えて生物発光さ
せ、ＡＴＰ量を検出装置（例えば、ルミノメーター）で
定量する。この時の測定温度は１５℃〜２５℃、ＡＴＰ
抽出剤を接触させて発光試薬を添加するまでの時間は１
０秒以上６０秒以内、発光試薬を添加してから発光量の
測定が終了するまでの時間は３０秒以内とする。
【００２３】本発明のミルク試料とは、生乳、生山羊
乳、生めん羊乳、牛乳、超高温殺菌乳、低温長時間殺菌
乳、殺菌山羊乳、特別牛乳、部分脱脂乳、脱脂乳、加工
乳、液状に戻した粉末ミルク、クリーム、スキムミル
ク、液化されたアイスクリームあるいはアイスミルクあ
るいは関連製品、豆乳、および試料中のミルクあるいは
懸濁液を包含するミルクの生材料あるいはコーヒー等と
の混合液、ミルクの培養液（増菌培養液）等の乳製品を
起源とする全ての液状溶液を含む。本明細書において、
「微生物」とは、単細胞の原核生物を意味し、バクテリ
アあるいは非真核細胞が挙げられる。なお、真核細胞
は、遺伝材料が核により囲まれている生物体である。
乳、生めん羊乳、牛乳、超高温殺菌乳、低温長時間殺菌
乳、殺菌山羊乳、特別牛乳、部分脱脂乳、脱脂乳、加工
乳、液状に戻した粉末ミルク、クリーム、スキムミル
ク、液化されたアイスクリームあるいはアイスミルクあ
るいは関連製品、豆乳、および試料中のミルクあるいは
懸濁液を包含するミルクの生材料あるいはコーヒー等と
の混合液、ミルクの培養液（増菌培養液）等の乳製品を
起源とする全ての液状溶液を含む。本明細書において、
「微生物」とは、単細胞の原核生物を意味し、バクテリ
アあるいは非真核細胞が挙げられる。なお、真核細胞
は、遺伝材料が核により囲まれている生物体である。
【００２４】本明細書において、「非微生物細胞」とは
微生物ではない細胞であり、大部分は体細胞である。体
細胞とは、生物体を構成する全細胞のうち生殖細胞以外
の細胞であり、例えば体液由来の白血球、赤血球、血小
板等の細胞、あるいは乳房内部組織、筋肉組織、皮膚組
織等より剥離した細胞などを示す。ＡＴＰ（アデノシン
−５’−三リン酸）は、アデニン、Ｄ−リボースおよび
３個のリン酸基からなるヌクレオチドであり、呼吸、発
酵および光合成におけるリン酸化反応によって生成さ
れ、生物エネルギー代謝において重要である。全ての生
細胞は、ＡＴＰを含有する。
微生物ではない細胞であり、大部分は体細胞である。体
細胞とは、生物体を構成する全細胞のうち生殖細胞以外
の細胞であり、例えば体液由来の白血球、赤血球、血小
板等の細胞、あるいは乳房内部組織、筋肉組織、皮膚組
織等より剥離した細胞などを示す。ＡＴＰ（アデノシン
−５’−三リン酸）は、アデニン、Ｄ−リボースおよび
３個のリン酸基からなるヌクレオチドであり、呼吸、発
酵および光合成におけるリン酸化反応によって生成さ
れ、生物エネルギー代謝において重要である。全ての生
細胞は、ＡＴＰを含有する。
【００２５】本発明のキレート剤とは、カルシウムイオ
ン、マグネシウムイオン、鉄イオン、カドミウムイオ
ン、ベリリウムイオン、コバルトイオン、ニッケルイオ
ン、銅イオン、鉛イオンなどの二価金属イオン、および
他の金属イオンと結合する全ての分子あるいは巨大分子
であり、合成あるいは天然の有機化合物、上記イオンに
結合できるタンパク質、炭水化物、脂質、あるいは生物
起源分子の複製品または修飾製品などである。
ン、マグネシウムイオン、鉄イオン、カドミウムイオ
ン、ベリリウムイオン、コバルトイオン、ニッケルイオ
ン、銅イオン、鉛イオンなどの二価金属イオン、および
他の金属イオンと結合する全ての分子あるいは巨大分子
であり、合成あるいは天然の有機化合物、上記イオンに
結合できるタンパク質、炭水化物、脂質、あるいは生物
起源分子の複製品または修飾製品などである。
【００２６】遠心分離操作の前にミルク試料へキレート
剤を添加すると、キレート剤の作用は、ミルク試料中に
おけるカゼインミセルがサブミセルへ解離する（L. C.
Chaplin, J. Dairy Res., 51, 251-257 (1984)）。もし
キレート剤無しのミルク試料を同様にして遠心分離にか
けると、ミルク試料の上澄液は透明化せず、ミセル状ミ
ルクタンパク質は遠心分離管の中で浮遊し、あるいは会
合して分子量の大きくなったカゼインミセルは沈降し
て、底部に巨大なペレットを形成し明瞭な微生物細胞ペ
レットを形成できない。キレート剤は、ミセル構造に寄
与する主成分であるカルシウムイオンと結合し（S. H.
C. Lia, Biochemistry, 11, 1818-1821 (1972)）、カゼ
インミセルを解離する。従って、本発明ではカルシウム
イオンと結合するキレート剤が好ましい。
剤を添加すると、キレート剤の作用は、ミルク試料中に
おけるカゼインミセルがサブミセルへ解離する（L. C.
Chaplin, J. Dairy Res., 51, 251-257 (1984)）。もし
キレート剤無しのミルク試料を同様にして遠心分離にか
けると、ミルク試料の上澄液は透明化せず、ミセル状ミ
ルクタンパク質は遠心分離管の中で浮遊し、あるいは会
合して分子量の大きくなったカゼインミセルは沈降し
て、底部に巨大なペレットを形成し明瞭な微生物細胞ペ
レットを形成できない。キレート剤は、ミセル構造に寄
与する主成分であるカルシウムイオンと結合し（S. H.
C. Lia, Biochemistry, 11, 1818-1821 (1972)）、カゼ
インミセルを解離する。従って、本発明ではカルシウム
イオンと結合するキレート剤が好ましい。
【００２７】このキレート剤としては、エチレンジアミ
ン四酢酸（ＥＤＴＡ、商品名Ｖｅｒｓｅｎｅ）、ビス−
（Ｏ−アミノフェノキシ）−エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，
Ｎ’−四酢酸（ＢＡＰＴＡ）、エチレングリコール−ビ
ス−（β−アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’
−四酢酸（ＥＧＴＡ）、ニトリロ三酢酸（トリグリシ
ン、アンモニア三酢酸塩、トリロンＡ）、トランス−
１，２−ジアミノシクロヘキサン四酢酸（ＣＤＴＡ）、
ジエチレントリアミノペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、Ｎ−
（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、クエン
酸塩、アルギニン、ハイポザンチン、４，５−ジヒドリ
キシベンゼン−１，３−ジスルホン酸、クラウンエーテ
ルタイプ化合物およびこれら分子の全ての誘導体および
前駆体を使用することができる。
ン四酢酸（ＥＤＴＡ、商品名Ｖｅｒｓｅｎｅ）、ビス−
（Ｏ−アミノフェノキシ）−エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，
Ｎ’−四酢酸（ＢＡＰＴＡ）、エチレングリコール−ビ
ス−（β−アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’
−四酢酸（ＥＧＴＡ）、ニトリロ三酢酸（トリグリシ
ン、アンモニア三酢酸塩、トリロンＡ）、トランス−
１，２−ジアミノシクロヘキサン四酢酸（ＣＤＴＡ）、
ジエチレントリアミノペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、Ｎ−
（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、クエン
酸塩、アルギニン、ハイポザンチン、４，５−ジヒドリ
キシベンゼン−１，３−ジスルホン酸、クラウンエーテ
ルタイプ化合物およびこれら分子の全ての誘導体および
前駆体を使用することができる。
【００２８】本発明のキレート剤は、検出すべき細胞に
は作用しないことが非常に重要である。また、生物発光
法（例えば、ルシフェリン／ルシフェラーゼを利用した
もの）にも影響しないキレート剤が好ましい。本発明で
特に優れていると判断されたキレート剤は、ニトリロ三
酢酸、エチレンジアミン四酢酸、及びＮ−（２−アセト
アミド）イミノ二酢酸である。
は作用しないことが非常に重要である。また、生物発光
法（例えば、ルシフェリン／ルシフェラーゼを利用した
もの）にも影響しないキレート剤が好ましい。本発明で
特に優れていると判断されたキレート剤は、ニトリロ三
酢酸、エチレンジアミン四酢酸、及びＮ−（２−アセト
アミド）イミノ二酢酸である。
【００２９】本発明で使用する非イオン界面活性剤は、
水溶液中でイオンに解離する基を持たない界面活性剤で
あり、非微生物細胞由来のＡＴＰの抽出剤として作用す
るものである。ミルク試料から非微生物細胞を分離除去
し、微生物細胞のみを分離濃縮するために、特に、微生
物細胞に作用することなく非微生物細胞よりＡＴＰを抽
出する薬剤である。したがってタンパク質への変性作用
が温和でかつ膜可溶化能に優れ、尚かつ凝集するミルク
成分の乳化分散化に寄与し、微生物細胞の分離濃縮を更
に容易にするような薬剤が好ましい。
水溶液中でイオンに解離する基を持たない界面活性剤で
あり、非微生物細胞由来のＡＴＰの抽出剤として作用す
るものである。ミルク試料から非微生物細胞を分離除去
し、微生物細胞のみを分離濃縮するために、特に、微生
物細胞に作用することなく非微生物細胞よりＡＴＰを抽
出する薬剤である。したがってタンパク質への変性作用
が温和でかつ膜可溶化能に優れ、尚かつ凝集するミルク
成分の乳化分散化に寄与し、微生物細胞の分離濃縮を更
に容易にするような薬剤が好ましい。
【００３０】非イオン界面活性剤は大別して３つのグル
ープに分類され、１）高級アルコール、アルキルフェノ
ール、脂肪酸などにエチレングリコールを親水基として
結合させたもの、２）多価アルコールの部分エステル、
高級脂肪酸グリセロールエステルであるモノグリセリ
ド、ソルビトールの脂肪酸エステル、３）ポリプロピレ
ングリコールとポリエチレングリコールの付加重合物な
どが挙げられる。以上の非イオン界面活性剤の中で、ポ
リオキシエチレングリコールオクチルフェニルエーテル
類であるＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００あるいはＮｏｎｉｄ
ｅｔ Ｐ−４０（ＮＰ−４０）が好ましく、特にＴｒｉ
ｔｏｎ Ｘ−１００は好ましい。とりわけ、このような
非イオン界面活性剤をキレート剤と共にミルク試料に加
えることが特に好ましい。大部分の体細胞は遠心分離の
前の処理で溶解され、遠心分離後には非微生物細胞由来
のＡＴＰの影響は軽減される。非イオン界面活性剤の添
加量は、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を使用した場合、ミ
ルク試料に対し０．１〜５％であり、好ましくは０．２
５〜２．５％である。また、キレート剤と非イオン界面
活性剤は、ミルク試料用の試薬キットを作製する場合、
両方の薬剤を溶解した溶液として提供することも可能で
ある。
ープに分類され、１）高級アルコール、アルキルフェノ
ール、脂肪酸などにエチレングリコールを親水基として
結合させたもの、２）多価アルコールの部分エステル、
高級脂肪酸グリセロールエステルであるモノグリセリ
ド、ソルビトールの脂肪酸エステル、３）ポリプロピレ
ングリコールとポリエチレングリコールの付加重合物な
どが挙げられる。以上の非イオン界面活性剤の中で、ポ
リオキシエチレングリコールオクチルフェニルエーテル
類であるＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００あるいはＮｏｎｉｄ
ｅｔ Ｐ−４０（ＮＰ−４０）が好ましく、特にＴｒｉ
ｔｏｎ Ｘ−１００は好ましい。とりわけ、このような
非イオン界面活性剤をキレート剤と共にミルク試料に加
えることが特に好ましい。大部分の体細胞は遠心分離の
前の処理で溶解され、遠心分離後には非微生物細胞由来
のＡＴＰの影響は軽減される。非イオン界面活性剤の添
加量は、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を使用した場合、ミ
ルク試料に対し０．１〜５％であり、好ましくは０．２
５〜２．５％である。また、キレート剤と非イオン界面
活性剤は、ミルク試料用の試薬キットを作製する場合、
両方の薬剤を溶解した溶液として提供することも可能で
ある。
【００３１】本明細書において、「微生物細胞ペレッ
ト」とは、遠心分離後に、主として微生物細胞が沈降し
て遠心分離容器の底に分離されたものをいう。微生物細
胞ペレットの大きさは、ミルク試料中の細胞数やキレー
ト剤及び／または非イオン界面活性剤の種類に依存す
る。微生物細胞ペレットには少量の細胞と会合した他の
ミルク成分を含んでもよい。ミルク試料１．０ｍｌより
得られる微生物細胞ペレットは１０〜４０μｌであり、
外観は白色または灰色がかった白色である。ミルク試料
中の細胞数が少ない場合、遠心分離後に形成される微生
物細胞ペレットの大きさが小さく、吸引操作で誤って除
去される恐れがある。そこで、微生物細胞ペレットの形
成を明確化するために、キレート剤及び非イオン界面活
性剤と共に、ミルク試料にポリスチレンラテックス等を
加えても良い。また、ミルク試料用の試薬キットを作製
する場合、キレート剤と非イオン界面活性剤を含む溶液
にポリスチレンラテックス等を加えても良い。
ト」とは、遠心分離後に、主として微生物細胞が沈降し
て遠心分離容器の底に分離されたものをいう。微生物細
胞ペレットの大きさは、ミルク試料中の細胞数やキレー
ト剤及び／または非イオン界面活性剤の種類に依存す
る。微生物細胞ペレットには少量の細胞と会合した他の
ミルク成分を含んでもよい。ミルク試料１．０ｍｌより
得られる微生物細胞ペレットは１０〜４０μｌであり、
外観は白色または灰色がかった白色である。ミルク試料
中の細胞数が少ない場合、遠心分離後に形成される微生
物細胞ペレットの大きさが小さく、吸引操作で誤って除
去される恐れがある。そこで、微生物細胞ペレットの形
成を明確化するために、キレート剤及び非イオン界面活
性剤と共に、ミルク試料にポリスチレンラテックス等を
加えても良い。また、ミルク試料用の試薬キットを作製
する場合、キレート剤と非イオン界面活性剤を含む溶液
にポリスチレンラテックス等を加えても良い。
【００３２】本発明で使用するＡＴＰ加水分解酵素と
は、ＡＴＰの末端リン酸基を切断し、ＡＤＰあるいはＡ
ＭＰと無機リン酸を生じさせるＡＴＰ加水分解酵素であ
る。例として、主にジャガイモより抽出・精製されるア
ピラーゼ、及びＡＴＰピロホスファターゼが挙げられる
が、市販品として入手が容易なアピラーゼを用いること
が好ましい。
は、ＡＴＰの末端リン酸基を切断し、ＡＤＰあるいはＡ
ＭＰと無機リン酸を生じさせるＡＴＰ加水分解酵素であ
る。例として、主にジャガイモより抽出・精製されるア
ピラーゼ、及びＡＴＰピロホスファターゼが挙げられる
が、市販品として入手が容易なアピラーゼを用いること
が好ましい。
【００３３】ＡＴＰ加水分解酵素は、ミルク試料中に存
在する非微生物細胞由来ＡＴＰを分解し、微生物細胞由
来ＡＴＰをより高感度に検出するための手段として使用
する。ミルク試料に対してキレート剤及び非イオン界面
活性剤含有溶液を添加し、遠心分離操作を加えることに
よって、ミルク試料から微生物細胞ペレットを分離濃縮
するが、体細胞などの非微生物細胞はもともと大量に存
在しており、遠心分離では非微生物細胞由来ＡＴＰは除
去しきれず大量に残存している。ＡＴＰ加水分解酵素含
有溶液を添加することで、バックグランドとなる非微生
物細胞由来ＡＴＰを完全に除去することが可能である。
従って、ＡＴＰ加水分解酵素を使用するに当たって、非
微生物細胞由来ＡＴＰを迅速に分解し得る活性を保有
し、かつ使用後に残存したＡＴＰ加水分解酵素の、続い
て検出しようとする微生物細胞ＡＴＰの分解への影響が
最小となるようにすることが望ましい。
在する非微生物細胞由来ＡＴＰを分解し、微生物細胞由
来ＡＴＰをより高感度に検出するための手段として使用
する。ミルク試料に対してキレート剤及び非イオン界面
活性剤含有溶液を添加し、遠心分離操作を加えることに
よって、ミルク試料から微生物細胞ペレットを分離濃縮
するが、体細胞などの非微生物細胞はもともと大量に存
在しており、遠心分離では非微生物細胞由来ＡＴＰは除
去しきれず大量に残存している。ＡＴＰ加水分解酵素含
有溶液を添加することで、バックグランドとなる非微生
物細胞由来ＡＴＰを完全に除去することが可能である。
従って、ＡＴＰ加水分解酵素を使用するに当たって、非
微生物細胞由来ＡＴＰを迅速に分解し得る活性を保有
し、かつ使用後に残存したＡＴＰ加水分解酵素の、続い
て検出しようとする微生物細胞ＡＴＰの分解への影響が
最小となるようにすることが望ましい。
【００３４】本発明の微生物細胞ペレットにＡＴＰ加水
分解酵素を加える工程では、ＡＴＰ加水分解酵素が最も
安定して作用するｐＨ＝６．０〜８．０、好ましくはｐ
Ｈ＝６．５〜７．８となるようにｐＨを調整する。ｐＨ
の調整は、ｐＨが中性領域を示す「蛋白質・酵素の基礎
実験法」（堀尾、山下編著：南江堂 (1981) ）４３２〜
４３５頁記載の緩衝液が使用できる。この中でも、グッ
ドの緩衝液で総括される以下の緩衝液、すなわち、ＭＥ
Ｓ（２−モルホリノエタンスルホン酸）緩衝液、Ｔｒｉ
ｓ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）系緩衝
液、ＢＥＳ（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−
２−アミノエタンスルホン酸）緩衝液、ＭＯＰＳ（３−
モルホリノプロパンスルホン酸）緩衝液、ＨＥＰＥＳ
（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ−２−エタ
ンスルホン酸）緩衝液、などを用いることが好ましい。
分解酵素を加える工程では、ＡＴＰ加水分解酵素が最も
安定して作用するｐＨ＝６．０〜８．０、好ましくはｐ
Ｈ＝６．５〜７．８となるようにｐＨを調整する。ｐＨ
の調整は、ｐＨが中性領域を示す「蛋白質・酵素の基礎
実験法」（堀尾、山下編著：南江堂 (1981) ）４３２〜
４３５頁記載の緩衝液が使用できる。この中でも、グッ
ドの緩衝液で総括される以下の緩衝液、すなわち、ＭＥ
Ｓ（２−モルホリノエタンスルホン酸）緩衝液、Ｔｒｉ
ｓ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）系緩衝
液、ＢＥＳ（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−
２−アミノエタンスルホン酸）緩衝液、ＭＯＰＳ（３−
モルホリノプロパンスルホン酸）緩衝液、ＨＥＰＥＳ
（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ−２−エタ
ンスルホン酸）緩衝液、などを用いることが好ましい。
【００３５】微生物細胞ペレットにＡＴＰ加水分解酵素
を加える工程では、ＡＴＰ加水分解酵素を活性化し安定
化する目的でプロテアーゼフリーの可溶性タンパク質を
添加する。添加する可溶性タンパク質は、パパイン、ト
リプシン、キモトリプシン等のタンパク質に認められる
タンパク質分解活性を示さないものであれば、動物由
来、植物由来、微生物由来のいずれのタンパク質を用い
ることも可能であるが、アルブミンで総称される以下の
可溶性タンパク質、すなわち、オボアルブミン、ラクト
アルブミン、血清アルブミン、ロイコシン、レグメリ
ン、リシンから選ばれる一種類以上のタンパク質を用い
ることが好ましい。プロテアーゼフリーの可溶性タンパ
ク質の添加量は、ミルク試料１ｍｌに対し０．１０〜５
ｍｇが適当であり、好ましくは０．２５〜２．５ｍｇで
ある。さらに、微生物細胞ペレットにＡＴＰ加水分解酵
素を加える工程では、ＡＴＰ加水分解酵素活性化剤とし
てカルシウムイオン、マグネシウムイオンなどを加えて
もよい。その添加量は、ミルク試料１ｍｌに対し、カル
シウムイオンは０．１〜５０ｍＭ、好ましくは１〜２０
ｍＭであり、マグネシウムイオンはカルシウムイオンの
１００分の１〜１０分の１であるとよい。
を加える工程では、ＡＴＰ加水分解酵素を活性化し安定
化する目的でプロテアーゼフリーの可溶性タンパク質を
添加する。添加する可溶性タンパク質は、パパイン、ト
リプシン、キモトリプシン等のタンパク質に認められる
タンパク質分解活性を示さないものであれば、動物由
来、植物由来、微生物由来のいずれのタンパク質を用い
ることも可能であるが、アルブミンで総称される以下の
可溶性タンパク質、すなわち、オボアルブミン、ラクト
アルブミン、血清アルブミン、ロイコシン、レグメリ
ン、リシンから選ばれる一種類以上のタンパク質を用い
ることが好ましい。プロテアーゼフリーの可溶性タンパ
ク質の添加量は、ミルク試料１ｍｌに対し０．１０〜５
ｍｇが適当であり、好ましくは０．２５〜２．５ｍｇで
ある。さらに、微生物細胞ペレットにＡＴＰ加水分解酵
素を加える工程では、ＡＴＰ加水分解酵素活性化剤とし
てカルシウムイオン、マグネシウムイオンなどを加えて
もよい。その添加量は、ミルク試料１ｍｌに対し、カル
シウムイオンは０．１〜５０ｍＭ、好ましくは１〜２０
ｍＭであり、マグネシウムイオンはカルシウムイオンの
１００分の１〜１０分の１であるとよい。
【００３６】上述のＡＴＰ加水分解酵素を加える工程
で、ＡＴＰ加水分解活性値はΔｌｏｇＲＬＵ／分＝１．
０〜４．０が適当であり、好ましくはΔｌｏｇＲＬＵ／
分＝２．０〜３．０であり、反応温度は２０〜４０℃が
適当であり、好ましくは２５℃〜３５℃であり、反応時
間は１０分間以上が適当であり、好ましくは１０分〜３
０分である。この条件下では、バックグランドとなる非
微生物細胞由来ＡＴＰの分解は充分に行なわれ、かつル
シフェリン／ルシフェラーゼを含む発光試薬による生物
発光の際には、微生物細胞由来ＡＴＰの加水分解は短時
間では進行しない。従って、ＡＴＰ加水分解酵素の失活
処理操作が不要であることが本発明の特徴である。従来
から行われていた遠心分離操作の繰り返しも必要ない。
この方法によって、微生物細胞ペレット中の微生物細胞
数の定量操作を著しく簡略化できる。また、本条件下で
は測定バックグランドとなる非微生物細胞由来ＡＴＰの
分解は充分に進み、バックグランド値の低下および安定
化を図ることが可能となり、微生物細胞由来ＡＴＰの検
出感度を著しく向上させることができる。なお、ＡＴＰ
加水分解酵素、プロテアーゼフリーの可溶性タンパク
質、ＡＴＰ加水分解酵素活性化剤、ｐＨ調整用緩衝液を
混合し同一溶液として加えることも可能である。
で、ＡＴＰ加水分解活性値はΔｌｏｇＲＬＵ／分＝１．
０〜４．０が適当であり、好ましくはΔｌｏｇＲＬＵ／
分＝２．０〜３．０であり、反応温度は２０〜４０℃が
適当であり、好ましくは２５℃〜３５℃であり、反応時
間は１０分間以上が適当であり、好ましくは１０分〜３
０分である。この条件下では、バックグランドとなる非
微生物細胞由来ＡＴＰの分解は充分に行なわれ、かつル
シフェリン／ルシフェラーゼを含む発光試薬による生物
発光の際には、微生物細胞由来ＡＴＰの加水分解は短時
間では進行しない。従って、ＡＴＰ加水分解酵素の失活
処理操作が不要であることが本発明の特徴である。従来
から行われていた遠心分離操作の繰り返しも必要ない。
この方法によって、微生物細胞ペレット中の微生物細胞
数の定量操作を著しく簡略化できる。また、本条件下で
は測定バックグランドとなる非微生物細胞由来ＡＴＰの
分解は充分に進み、バックグランド値の低下および安定
化を図ることが可能となり、微生物細胞由来ＡＴＰの検
出感度を著しく向上させることができる。なお、ＡＴＰ
加水分解酵素、プロテアーゼフリーの可溶性タンパク
質、ＡＴＰ加水分解酵素活性化剤、ｐＨ調整用緩衝液を
混合し同一溶液として加えることも可能である。
【００３７】微生物細胞ペレットにＡＴＰ加水分解酵素
を加える工程では、防腐剤、キレート剤、タンパク質Ｓ
Ｈ基保護剤の添加も効果がある場合がある。防腐剤は測
定中に混入する微生物の影響を最小限にするために添加
するもので、ペニシリンＧ−Ｎａ塩、ペニシリンＧ−Ｋ
塩、アンピシリン、クロラムフェニコール、ストレプト
マイシン、カナマイシン、テトラサイクリン、オキシテ
トラサイクリンなどの抗生物質、アジ化ナトリウムなど
のアジ化物、クレゾールなどのフェノール化合物、乳
酸、クエン酸、安息香酸、プロピオン酸、デヒドロ酢
酸、オキシ安息香酸、ソルビン酸などの酸などが挙げら
れる。キレート剤は、非イオン界面活性剤を添加して非
微生物細胞中のＡＴＰを細胞外へ出す工程で用いるもの
とはその使用目的が異なり、主に重金属の捕捉剤として
使用するものであるが、前述のエチレンジアミン四酢酸
（ＥＤＴＡ、商品名Ｖｅｒｓｅｎｅ）、ビス−（Ｏ−ア
ミノフェノキシ）−エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢
酸（ＢＡＰＴＡ）、エチレングリコール−ビス−（β−
アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸
（ＥＧＴＡ）、ニトリロ三酢酸（トリグリシン、アンモ
ニア三酢酸塩、トリロンＡ）、トランス−１，２−ジア
ミノシクロヘキサン四酢酸（ＣＤＴＡ）、ジエチレント
リアミノペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、Ｎ−（２−アセトア
ミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、クエン酸塩、アルギニ
ン、ハイポザンチン、４，５−ジヒドリキシベンゼン−
１，３−ジスルホン酸、クラウンエーテルタイプ化合物
およびこれら分子の全ての誘導体および前駆体などを使
用することができる。この中では、とりわけエチレンジ
アミン四酢酸が検出するべき細胞に作用せず、生物発光
法にも影響がなく好ましい。タンパク質ＳＨ基保護剤
は、ＡＴＰ加水分解酵素を安定して作用させるために添
加するもので、グルタチオン、ジチオスレイトール（Ｄ
ＴＴ）、メルカプトエタノール、システイン、ジチオエ
リトリトールなどを使用できるが、ジチオスレイトール
が特に好ましい。
を加える工程では、防腐剤、キレート剤、タンパク質Ｓ
Ｈ基保護剤の添加も効果がある場合がある。防腐剤は測
定中に混入する微生物の影響を最小限にするために添加
するもので、ペニシリンＧ−Ｎａ塩、ペニシリンＧ−Ｋ
塩、アンピシリン、クロラムフェニコール、ストレプト
マイシン、カナマイシン、テトラサイクリン、オキシテ
トラサイクリンなどの抗生物質、アジ化ナトリウムなど
のアジ化物、クレゾールなどのフェノール化合物、乳
酸、クエン酸、安息香酸、プロピオン酸、デヒドロ酢
酸、オキシ安息香酸、ソルビン酸などの酸などが挙げら
れる。キレート剤は、非イオン界面活性剤を添加して非
微生物細胞中のＡＴＰを細胞外へ出す工程で用いるもの
とはその使用目的が異なり、主に重金属の捕捉剤として
使用するものであるが、前述のエチレンジアミン四酢酸
（ＥＤＴＡ、商品名Ｖｅｒｓｅｎｅ）、ビス−（Ｏ−ア
ミノフェノキシ）−エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢
酸（ＢＡＰＴＡ）、エチレングリコール−ビス−（β−
アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸
（ＥＧＴＡ）、ニトリロ三酢酸（トリグリシン、アンモ
ニア三酢酸塩、トリロンＡ）、トランス−１，２−ジア
ミノシクロヘキサン四酢酸（ＣＤＴＡ）、ジエチレント
リアミノペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、Ｎ−（２−アセトア
ミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、クエン酸塩、アルギニ
ン、ハイポザンチン、４，５−ジヒドリキシベンゼン−
１，３−ジスルホン酸、クラウンエーテルタイプ化合物
およびこれら分子の全ての誘導体および前駆体などを使
用することができる。この中では、とりわけエチレンジ
アミン四酢酸が検出するべき細胞に作用せず、生物発光
法にも影響がなく好ましい。タンパク質ＳＨ基保護剤
は、ＡＴＰ加水分解酵素を安定して作用させるために添
加するもので、グルタチオン、ジチオスレイトール（Ｄ
ＴＴ）、メルカプトエタノール、システイン、ジチオエ
リトリトールなどを使用できるが、ジチオスレイトール
が特に好ましい。
【００３８】微生物細胞ペレットにＡＴＰ加水分解酵素
を加える工程では、更に、ＡＴＰ加水分解酵素活性を保
持するために、グルコース、フルクトース、アラビノー
ス、キシロース、サッカロース、トレハロース、ラクト
ース、マルトース、キシロビオースなどの糖類、マンニ
トール、キシリトール、ズルシトール、ソルビトール、
リビトール、グルシトールなどの糖アルコール、ＰＥＧ
（ポリエチレングリコール）＃４００、ＰＥＧ＃６００
などの水溶性高分子、グリシン、セリン、プロリン、グ
ルタミン酸、アラニンなどのアミノ酸、トリメチルアミ
ンなどのアミン類、グリセロールなどの多価アルコール
などを添加することもできる。
を加える工程では、更に、ＡＴＰ加水分解酵素活性を保
持するために、グルコース、フルクトース、アラビノー
ス、キシロース、サッカロース、トレハロース、ラクト
ース、マルトース、キシロビオースなどの糖類、マンニ
トール、キシリトール、ズルシトール、ソルビトール、
リビトール、グルシトールなどの糖アルコール、ＰＥＧ
（ポリエチレングリコール）＃４００、ＰＥＧ＃６００
などの水溶性高分子、グリシン、セリン、プロリン、グ
ルタミン酸、アラニンなどのアミノ酸、トリメチルアミ
ンなどのアミン類、グリセロールなどの多価アルコール
などを添加することもできる。
【００３９】本発明で使用するＡＴＰ抽出剤とは、ミル
ク試料から分離濃縮された微生物細胞に作用し、微生物
細胞体内に存在するＡＴＰを微生物細胞体外へ放出させ
る目的で使用される薬剤で、微生物細胞の構造を変化あ
るいは破壊させる微生物細胞の溶解剤であって、界面活
性剤、酸、アルカリ、酵素、塩、キレート剤、有機溶媒
などの天然産あるいは合成起源のいかなる細胞膜可溶化
剤をも含む。
ク試料から分離濃縮された微生物細胞に作用し、微生物
細胞体内に存在するＡＴＰを微生物細胞体外へ放出させ
る目的で使用される薬剤で、微生物細胞の構造を変化あ
るいは破壊させる微生物細胞の溶解剤であって、界面活
性剤、酸、アルカリ、酵素、塩、キレート剤、有機溶媒
などの天然産あるいは合成起源のいかなる細胞膜可溶化
剤をも含む。
【００４０】本発明で使用するＡＴＰ抽出剤としては、
ルシフェラーゼに対する変性作用が温和で、かつ膜可溶
化能に優れ、発光の検出に著しい変化を与えないものが
好ましい。ＡＴＰ抽出剤として使用できるのは、セチル
トリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）、臭化ド
デシルトリメチルアンモニウム、塩化セチルピリジニウ
ム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウムなどの
第４級アンモニウム塩やクロルヘキシジングルコネート
などのカチオン性界面活性剤、ドデシル硫酸ナトリウム
などのアニオン性界面活性剤、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１０
０、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０（ＮＰ−４０）などの非
イオン界面活性剤である。この中で、第４級アンモニウ
ム塩やクロルヘキシジングルコネートは、抽出が速やか
であり、ルシフェラーゼ反応への阻害が少なく好まし
い。
ルシフェラーゼに対する変性作用が温和で、かつ膜可溶
化能に優れ、発光の検出に著しい変化を与えないものが
好ましい。ＡＴＰ抽出剤として使用できるのは、セチル
トリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）、臭化ド
デシルトリメチルアンモニウム、塩化セチルピリジニウ
ム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウムなどの
第４級アンモニウム塩やクロルヘキシジングルコネート
などのカチオン性界面活性剤、ドデシル硫酸ナトリウム
などのアニオン性界面活性剤、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１０
０、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０（ＮＰ−４０）などの非
イオン界面活性剤である。この中で、第４級アンモニウ
ム塩やクロルヘキシジングルコネートは、抽出が速やか
であり、ルシフェラーゼ反応への阻害が少なく好まし
い。
【００４１】微生物から放出されたＡＴＰは生物発光法
を用いて測定される。本発明では、ルシフェラーゼによ
るＡＴＰの定量方法（M. A. DeLuca, Advances in Enzy
mology, 44, 37-68 (1976)）を、ミルク試料中の微生物
細胞数の定量に利用することができる。このＡＴＰ定量
法は、真核あるいは原核細胞数のいずれの定量化にも適
用できる。試料中に存在する微生物細胞数の定量は、測
定された試料中のＡＴＰ量と微生物細胞に存在するＡＴ
Ｐの平均量との関係を用いて算出される。
を用いて測定される。本発明では、ルシフェラーゼによ
るＡＴＰの定量方法（M. A. DeLuca, Advances in Enzy
mology, 44, 37-68 (1976)）を、ミルク試料中の微生物
細胞数の定量に利用することができる。このＡＴＰ定量
法は、真核あるいは原核細胞数のいずれの定量化にも適
用できる。試料中に存在する微生物細胞数の定量は、測
定された試料中のＡＴＰ量と微生物細胞に存在するＡＴ
Ｐの平均量との関係を用いて算出される。
【００４２】ＡＴＰの検出手段として使用するルシフェ
ラーゼは温度に対して不安定であるために、測定時の室
温がその発光量すなわち測定値に反映し、被検液中に存
在するＡＴＰ量が同一であるにも関わらず測定値がばら
つく。すなわち、同一量のＡＴＰを測定した場合、２０
℃付近で発光量は最大であり、その前後では発光量が減
少する結果が得られている。従って、検出感度が最大で
あり、測定結果のバラツキが小さくかつ信頼性を増すた
めには、ルシフェラーゼ反応温度および測定時の室温を
３０℃以下、好ましくは１５〜２５℃とするとよい。
ラーゼは温度に対して不安定であるために、測定時の室
温がその発光量すなわち測定値に反映し、被検液中に存
在するＡＴＰ量が同一であるにも関わらず測定値がばら
つく。すなわち、同一量のＡＴＰを測定した場合、２０
℃付近で発光量は最大であり、その前後では発光量が減
少する結果が得られている。従って、検出感度が最大で
あり、測定結果のバラツキが小さくかつ信頼性を増すた
めには、ルシフェラーゼ反応温度および測定時の室温を
３０℃以下、好ましくは１５〜２５℃とするとよい。
【００４３】本発明では、ＡＴＰ加水分解酵素を失活処
理しないため、ＡＴＰ加水分解酵素添加後、微生物細胞
由来ＡＴＰは徐々に分解される。従って、ＡＴＰ抽出剤
の添加からルシフェリン／ルシフェラーゼからなる発光
試薬の添加までに要する時間は１０秒以上６０秒以内が
適当であり、とりわけ１０秒以内が好ましい。同様に発
光試薬添加から発光量測定までの時間も２０秒以内が適
当であり、とりわけ１０秒以内が好ましい。
理しないため、ＡＴＰ加水分解酵素添加後、微生物細胞
由来ＡＴＰは徐々に分解される。従って、ＡＴＰ抽出剤
の添加からルシフェリン／ルシフェラーゼからなる発光
試薬の添加までに要する時間は１０秒以上６０秒以内が
適当であり、とりわけ１０秒以内が好ましい。同様に発
光試薬添加から発光量測定までの時間も２０秒以内が適
当であり、とりわけ１０秒以内が好ましい。
【００４４】本発明の方法においては、試料に非イオン
界面活性剤を十分に添加し、非微生物細胞由来のＡＴＰ
を完全に抽出し、上澄み液として分離除去した後、ＡＴ
Ｐ加水分解酵素を添加することにより、微生物細胞ペレ
ットに混入した非微生物細胞由来のＡＴＰを完全に分解
することができる。特に、ミルク試料のような試料では
体細胞などの非微生物細胞の量が非常に多く、その分離
が大変重要である。従来の方法で検出感度が良好でなか
ったのは、遠心分離あるいはＡＴＰ加水分解酵素などの
単一の操作で、非微生物細胞由来のＡＴＰを分離あるい
は分解しようとしたことに原因がある。本発明は、遠心
分離による非微生物細胞由来ＡＴＰの分離だけでなく、
ＡＴＰ加水分解酵素が有効に作用する最適条件を見出し
たことにより、非微生物細胞由来ＡＴＰを分解し、微生
物細胞の選択的な高感度検出を可能にした。
界面活性剤を十分に添加し、非微生物細胞由来のＡＴＰ
を完全に抽出し、上澄み液として分離除去した後、ＡＴ
Ｐ加水分解酵素を添加することにより、微生物細胞ペレ
ットに混入した非微生物細胞由来のＡＴＰを完全に分解
することができる。特に、ミルク試料のような試料では
体細胞などの非微生物細胞の量が非常に多く、その分離
が大変重要である。従来の方法で検出感度が良好でなか
ったのは、遠心分離あるいはＡＴＰ加水分解酵素などの
単一の操作で、非微生物細胞由来のＡＴＰを分離あるい
は分解しようとしたことに原因がある。本発明は、遠心
分離による非微生物細胞由来ＡＴＰの分離だけでなく、
ＡＴＰ加水分解酵素が有効に作用する最適条件を見出し
たことにより、非微生物細胞由来ＡＴＰを分解し、微生
物細胞の選択的な高感度検出を可能にした。
【００４５】ＡＴＰ加水分解酵素を添加する工程におい
て、緩衝液を加えｐＨ＝６．０〜８．０とする他に、さ
らにプロテアーゼフリーの可溶性タンパク質を加えて、
ＡＴＰ加水分解酵素の活性レベルを最適とする。ＡＴＰ
加水分解酵素は非微生物細胞由来のＡＴＰを分解すると
きには良好に作用するが、イオン性界面活性剤で微生物
細胞由来のＡＴＰを抽出した後は、ＡＴＰ加水分解酵素
の作用は緩慢であり、素早く生物発光法で測定すれば、
微生物細胞由来のＡＴＰ量を選択的に検出することがで
きる。特に、ＡＴＰ加水分解酵素の作用条件を厳しく制
限することで、細胞ペレット中に残存している非微生物
細胞由来のＡＴＰは分解するが、微生物細胞由来のＡＴ
Ｐの分解は僅少に抑えることが可能である。更に、ＡＴ
Ｐ加水分解酵素による非微生物細胞由来のＡＴＰの分解
処理を行った後、微生物細胞からのＡＴＰ抽出、及びル
シフェリン／ルシフェラーゼを含む発光試薬による処理
の短時間化が、微生物細胞由来のＡＴＰの選択的検出に
有効であった。以上の一連の操作を組み合わせることに
より、検出感度を向上させ、測定値のバラツキを抑え、
その信頼性を高めることができた。
て、緩衝液を加えｐＨ＝６．０〜８．０とする他に、さ
らにプロテアーゼフリーの可溶性タンパク質を加えて、
ＡＴＰ加水分解酵素の活性レベルを最適とする。ＡＴＰ
加水分解酵素は非微生物細胞由来のＡＴＰを分解すると
きには良好に作用するが、イオン性界面活性剤で微生物
細胞由来のＡＴＰを抽出した後は、ＡＴＰ加水分解酵素
の作用は緩慢であり、素早く生物発光法で測定すれば、
微生物細胞由来のＡＴＰ量を選択的に検出することがで
きる。特に、ＡＴＰ加水分解酵素の作用条件を厳しく制
限することで、細胞ペレット中に残存している非微生物
細胞由来のＡＴＰは分解するが、微生物細胞由来のＡＴ
Ｐの分解は僅少に抑えることが可能である。更に、ＡＴ
Ｐ加水分解酵素による非微生物細胞由来のＡＴＰの分解
処理を行った後、微生物細胞からのＡＴＰ抽出、及びル
シフェリン／ルシフェラーゼを含む発光試薬による処理
の短時間化が、微生物細胞由来のＡＴＰの選択的検出に
有効であった。以上の一連の操作を組み合わせることに
より、検出感度を向上させ、測定値のバラツキを抑え、
その信頼性を高めることができた。
【００４６】以上、ミルク試料を例にとり、本発明の方
法を説明したが。本発明の方法は、これ以外にも、生
肉、生野菜、魚介類、加工食品、飲料（ビール、ジュー
ス等）、飲料水、産業用水（例えば、製紙業における白
水、印刷業における湿し水等）などの試料についても適
用できる。例えば、飲料、飲料水、産業用水などの試料
中に存在する微生物細胞由来のＡＴＰを検出及び／また
は測定する場合には、非イオン界面活性剤を添加して非
微生物細胞中のＡＴＰを細胞外へ出す工程を省略するこ
とができる。
法を説明したが。本発明の方法は、これ以外にも、生
肉、生野菜、魚介類、加工食品、飲料（ビール、ジュー
ス等）、飲料水、産業用水（例えば、製紙業における白
水、印刷業における湿し水等）などの試料についても適
用できる。例えば、飲料、飲料水、産業用水などの試料
中に存在する微生物細胞由来のＡＴＰを検出及び／また
は測定する場合には、非イオン界面活性剤を添加して非
微生物細胞中のＡＴＰを細胞外へ出す工程を省略するこ
とができる。
【００４７】更に、本発明は、ｐＨを６．０〜８．０に
調整しうる緩衝液、プロテアーゼフリーの可溶性タンパ
ク質及びＡＴＰ加水分解酵素を含む試薬、ＡＴＰ抽出剤
を含む試薬、並びに生物発光試薬を含むことを特徴とす
る、微生物細胞に由来するＡＴＰを検出及び／または測
定するための試薬キットを包含する。この試薬キット
は、さらに非イオン界面活性剤を含む試薬を含んでもよ
い。ｐＨを６．０〜８．０に調整しうる緩衝液、プロテ
アーゼフリーの可溶性タンパク質及びＡＴＰ加水分解酵
素を含む試薬は。上記のような緩衝液、プロテアーゼフ
リーの可溶性タンパク質及びＡＴＰ加水分解酵素を含む
が、この他に、ＡＴＰ加水分解酵素活性化剤、防腐剤、
キレート剤、タンパク質ＳＨ基保護剤、糖、多価アルコ
ール、水溶性高分子、アミノ酸、アミン類、有機溶媒な
どを含んでもよい。また、この試薬は、凍結乾燥等によ
って一旦粉末化してもよい。その場合には、使用の直前
に、アジ化ナトリウムなどの防腐剤、キレート剤などを
含む緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝
液などのグッドの緩衝液など）を加えて溶解させるとよ
い。ＡＴＰ抽出剤を含む試薬は、上記のような非イオン
界面活性剤を含むが、この他に、トリクロロ酢酸などの
酸、アルカリ、リゾチームなどの酵素、キレート剤、有
機溶媒などを含んでもよい。生物発光試薬は、生物発光
によりＡＴＰを検出することができる試薬であればよ
く、例えば、生物発光反応の酵素（ルシフェラーゼな
ど）とその基質（ルシフェリンなど）などを含む。例と
して、ホタル、ヒカリコメツキ、ホタルモドキなどに由
来する酵素と基質が挙げられる。その他に、緩衝液、キ
レート剤、カルシウムやマグネシウムなどの２価のカチ
オン、タンパク質ＳＨ基保護剤、プロテアーゼフリーの
可溶性タンパク質、防腐剤、多価アルコール、水溶性高
分子、アミノ酸、アミン類、有機溶媒などを含んでもよ
い。使用の際。このキットの各試薬は、最初に混合して
から使用するか、あるいは、各試薬を各工程における使
用の直前に混合して使用してもよい。本発明の試薬キッ
トは、各々の試薬を充填したバイアル、チューブなどの
ような１つまたはそれ以上の容器がひとまとめにして納
めされるための区画化された収納部材に納めされる形態
であってもよい。各試薬は各容器に充填される前に、滅
菌されるとよい。更に、酵素を含む液体状の各試薬は、
保存性を高めるために、凍結乾燥等の手段によって脱水
して粉末状にして密栓してもよい。密栓した容器中は、
例えば、真空あるいは／または窒素ガス等で封入するな
どして、酸素が存在しない状態である方が望ましい。こ
のようにして凍結乾燥等の手段によって粉末化した場合
には、使用の直前に滅菌した水あるいは緩衝液などを加
えて溶解して水溶液としてから使用することが望まし
い。
調整しうる緩衝液、プロテアーゼフリーの可溶性タンパ
ク質及びＡＴＰ加水分解酵素を含む試薬、ＡＴＰ抽出剤
を含む試薬、並びに生物発光試薬を含むことを特徴とす
る、微生物細胞に由来するＡＴＰを検出及び／または測
定するための試薬キットを包含する。この試薬キット
は、さらに非イオン界面活性剤を含む試薬を含んでもよ
い。ｐＨを６．０〜８．０に調整しうる緩衝液、プロテ
アーゼフリーの可溶性タンパク質及びＡＴＰ加水分解酵
素を含む試薬は。上記のような緩衝液、プロテアーゼフ
リーの可溶性タンパク質及びＡＴＰ加水分解酵素を含む
が、この他に、ＡＴＰ加水分解酵素活性化剤、防腐剤、
キレート剤、タンパク質ＳＨ基保護剤、糖、多価アルコ
ール、水溶性高分子、アミノ酸、アミン類、有機溶媒な
どを含んでもよい。また、この試薬は、凍結乾燥等によ
って一旦粉末化してもよい。その場合には、使用の直前
に、アジ化ナトリウムなどの防腐剤、キレート剤などを
含む緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝
液などのグッドの緩衝液など）を加えて溶解させるとよ
い。ＡＴＰ抽出剤を含む試薬は、上記のような非イオン
界面活性剤を含むが、この他に、トリクロロ酢酸などの
酸、アルカリ、リゾチームなどの酵素、キレート剤、有
機溶媒などを含んでもよい。生物発光試薬は、生物発光
によりＡＴＰを検出することができる試薬であればよ
く、例えば、生物発光反応の酵素（ルシフェラーゼな
ど）とその基質（ルシフェリンなど）などを含む。例と
して、ホタル、ヒカリコメツキ、ホタルモドキなどに由
来する酵素と基質が挙げられる。その他に、緩衝液、キ
レート剤、カルシウムやマグネシウムなどの２価のカチ
オン、タンパク質ＳＨ基保護剤、プロテアーゼフリーの
可溶性タンパク質、防腐剤、多価アルコール、水溶性高
分子、アミノ酸、アミン類、有機溶媒などを含んでもよ
い。使用の際。このキットの各試薬は、最初に混合して
から使用するか、あるいは、各試薬を各工程における使
用の直前に混合して使用してもよい。本発明の試薬キッ
トは、各々の試薬を充填したバイアル、チューブなどの
ような１つまたはそれ以上の容器がひとまとめにして納
めされるための区画化された収納部材に納めされる形態
であってもよい。各試薬は各容器に充填される前に、滅
菌されるとよい。更に、酵素を含む液体状の各試薬は、
保存性を高めるために、凍結乾燥等の手段によって脱水
して粉末状にして密栓してもよい。密栓した容器中は、
例えば、真空あるいは／または窒素ガス等で封入するな
どして、酸素が存在しない状態である方が望ましい。こ
のようにして凍結乾燥等の手段によって粉末化した場合
には、使用の直前に滅菌した水あるいは緩衝液などを加
えて溶解して水溶液としてから使用することが望まし
い。
【００４８】
【実施例】以下、実施例によって本発明を説明するが、
本発明の範囲がこれらの実施例にのみ限定されるもので
はない。
本発明の範囲がこれらの実施例にのみ限定されるもので
はない。
【００４９】（実施例１） １）Neutrient Broth （ＮＢ）液体培地５ｍｌにて３０
℃で一晩振盪培養した以下の５種類の微生物を、滅菌水
で１０倍毎に段階希釈した。 Serattia liquefaciens PB 1707 Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 Enterobacter spp. Bacillus subtilis ATCC 6633 Staphylococcus aureus ATCC 6538 ２）１．５ｍｌ容の蓋付き遠心分離用チューブに、以下
に示すミルク試料１ｍｌを加えた。 ミルク試料；市販の超高温殺菌牛乳 ３）１）の希釈液の各濃度から１０μｌを採取し、２）
のミルク試料に接種して、室温に１０分程度放置した。 ４）以下に示すキレート剤および非イオン界面活性剤含
有水溶液５００μｌを添加し、遠心分離用チューブの蓋
をした。 キレート剤及び非イオン界面活性剤含水有溶液組成； ポリスチレンラテックス ０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ０．５％ ＥＤＴＡ ０．１５Ｍ
℃で一晩振盪培養した以下の５種類の微生物を、滅菌水
で１０倍毎に段階希釈した。 Serattia liquefaciens PB 1707 Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 Enterobacter spp. Bacillus subtilis ATCC 6633 Staphylococcus aureus ATCC 6538 ２）１．５ｍｌ容の蓋付き遠心分離用チューブに、以下
に示すミルク試料１ｍｌを加えた。 ミルク試料；市販の超高温殺菌牛乳 ３）１）の希釈液の各濃度から１０μｌを採取し、２）
のミルク試料に接種して、室温に１０分程度放置した。 ４）以下に示すキレート剤および非イオン界面活性剤含
有水溶液５００μｌを添加し、遠心分離用チューブの蓋
をした。 キレート剤及び非イオン界面活性剤含水有溶液組成； ポリスチレンラテックス ０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ０．５％ ＥＤＴＡ ０．１５Ｍ
【００５０】５）混和後、１２，０００×ｇで５分間の
遠心分離を行ない、微生物細胞ペレットと他のミルク成
分とを分離した。 ６）分離した微生物細胞ペレットから、ペレット以外の
他のミルク成分をアスピレーターで吸引除去した。 ７）遠心分離用チューブの底部に残存した微生物細胞ペ
レットに、以下に示すＡＴＰ加水分解酵素含有水溶液１
００μｌを加えて撹拌・懸濁させ、２５℃で３０分間イ
ンキュベートして、非微生物由来ＡＴＰを分解した。 ＡＴＰ加水分解酵素含有水溶液組成； アピラーゼ（ジャガイモ由来、Ｓｉｇｍａ社製ＧｒａｄｅＶＩ） 酵素活性（ΔｌｏｇＲＬＵ）＝２．０ オボアルブミン（ニワトリ卵由来、Ｓｉｇｍａ社製ＧｒａｄｅＶＩ） １ｍｇ／ｍｌ ＣａＣｌ２ ２ｍＭ ＭｇＣｌ２ ０．０５ｍＭ ペニシリンＧ−Ｎａ塩（Ｓｉｇｍａ社製） ０．１％ ＥＤＴＡ ０．１ｍＭ ＤＴＴ １ｍＭ ＭＯＰＳ／ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０） ２５ｍＭ
遠心分離を行ない、微生物細胞ペレットと他のミルク成
分とを分離した。 ６）分離した微生物細胞ペレットから、ペレット以外の
他のミルク成分をアスピレーターで吸引除去した。 ７）遠心分離用チューブの底部に残存した微生物細胞ペ
レットに、以下に示すＡＴＰ加水分解酵素含有水溶液１
００μｌを加えて撹拌・懸濁させ、２５℃で３０分間イ
ンキュベートして、非微生物由来ＡＴＰを分解した。 ＡＴＰ加水分解酵素含有水溶液組成； アピラーゼ（ジャガイモ由来、Ｓｉｇｍａ社製ＧｒａｄｅＶＩ） 酵素活性（ΔｌｏｇＲＬＵ）＝２．０ オボアルブミン（ニワトリ卵由来、Ｓｉｇｍａ社製ＧｒａｄｅＶＩ） １ｍｇ／ｍｌ ＣａＣｌ２ ２ｍＭ ＭｇＣｌ２ ０．０５ｍＭ ペニシリンＧ−Ｎａ塩（Ｓｉｇｍａ社製） ０．１％ ＥＤＴＡ ０．１ｍＭ ＤＴＴ １ｍＭ ＭＯＰＳ／ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０） ２５ｍＭ
【００５１】８）反応後、懸濁液を測定用セルに移し換
え、ＡＴＰ抽出剤１００μｌを加えて１０秒間反応させ
て、微生物細胞からＡＴＰを放出させた。 ＡＴＰ抽出剤組成； ＣＴＡＢ ０．００７５％ ９）微生物から放出されたＡＴＰを、ルシフェリン／ホ
タルルシフェラーゼを含有する発光試薬（東洋インキ製
造（株）製 商品名：菌士郎）１００μｌを添加し、添
加後１０秒間の発光量の積算値を測定した。これを人工
汚染牛乳である試料Ａの相対発光量（ｌｏｇＲＬＵ）と
した。 １０）一方、陽性対照として１）の希釈液の各濃度か
ら、試料Ａに加えたのと同量の１０μｌ、すなわち試料
Ａに含まれる菌数と等量の菌数をルミノメーター用測定
セルに採取してＡＴＰ抽出剤１００μｌを加え、１０秒
間溶菌後、発光試薬（東洋インキ製造（株）製 商品
名：菌士郎）１００μｌを加えて１０秒間の発光量の積
算値を測定した。これを試料Ｂの相対発光量（ｌｏｇＲ
ＬＵ）とした。 １１）試料Ａおよび試料Ｂの菌数は等量である。従っ
て、１）の各濃度の希釈液１００μｌを標準寒天培地に
塗布後、３０℃・４８時間の培養で生育したコロニー数
を計数して、各希釈液の１０μｌ当たりに含まれる菌数
を算出して、これを試料Ａおよび試料Ｂの菌数（ｌｏｇ
ＣＦＵ）とした。
え、ＡＴＰ抽出剤１００μｌを加えて１０秒間反応させ
て、微生物細胞からＡＴＰを放出させた。 ＡＴＰ抽出剤組成； ＣＴＡＢ ０．００７５％ ９）微生物から放出されたＡＴＰを、ルシフェリン／ホ
タルルシフェラーゼを含有する発光試薬（東洋インキ製
造（株）製 商品名：菌士郎）１００μｌを添加し、添
加後１０秒間の発光量の積算値を測定した。これを人工
汚染牛乳である試料Ａの相対発光量（ｌｏｇＲＬＵ）と
した。 １０）一方、陽性対照として１）の希釈液の各濃度か
ら、試料Ａに加えたのと同量の１０μｌ、すなわち試料
Ａに含まれる菌数と等量の菌数をルミノメーター用測定
セルに採取してＡＴＰ抽出剤１００μｌを加え、１０秒
間溶菌後、発光試薬（東洋インキ製造（株）製 商品
名：菌士郎）１００μｌを加えて１０秒間の発光量の積
算値を測定した。これを試料Ｂの相対発光量（ｌｏｇＲ
ＬＵ）とした。 １１）試料Ａおよび試料Ｂの菌数は等量である。従っ
て、１）の各濃度の希釈液１００μｌを標準寒天培地に
塗布後、３０℃・４８時間の培養で生育したコロニー数
を計数して、各希釈液の１０μｌ当たりに含まれる菌数
を算出して、これを試料Ａおよび試料Ｂの菌数（ｌｏｇ
ＣＦＵ）とした。
【００５２】各微生物について求めた菌数（ｌｏｇＣＦ
Ｕ）と相対発光量（ｌｏｇＲＬＵ）の関係を図１・図２
・図３・図４・図５に示した。試料Ａ（□）及び試料Ｂ
（◇）でともに、菌数（ｌｏｇＣＦＵ）が３から８の範
囲で相対発光量との間に直線性があり、相対発光量（ｌ
ｏｇＲＬＵ）より菌数（ｌｏｇＣＦＵ）の定量が可能で
あった。また、人工汚染牛乳である試料Ａと牛乳を含ま
ない試料Ｂの相対発光量（ｌｏｇＲＬＵ）と菌数（ｌｏ
ｇＣＦＵ）の間には良好な相関が認められ、微生物細胞
及び非微生物細胞混合物を含む典型的な試料である牛乳
から、微生物細胞からのＡＴＰのみが殆ど損なわれるこ
となく測定され、更に菌数（ｌｏｇＣＦＵ）で３から８
の範囲で、相対発光量の値から菌数（ｌｏｇＣＦＵ）が
定量できることが示された。
Ｕ）と相対発光量（ｌｏｇＲＬＵ）の関係を図１・図２
・図３・図４・図５に示した。試料Ａ（□）及び試料Ｂ
（◇）でともに、菌数（ｌｏｇＣＦＵ）が３から８の範
囲で相対発光量との間に直線性があり、相対発光量（ｌ
ｏｇＲＬＵ）より菌数（ｌｏｇＣＦＵ）の定量が可能で
あった。また、人工汚染牛乳である試料Ａと牛乳を含ま
ない試料Ｂの相対発光量（ｌｏｇＲＬＵ）と菌数（ｌｏ
ｇＣＦＵ）の間には良好な相関が認められ、微生物細胞
及び非微生物細胞混合物を含む典型的な試料である牛乳
から、微生物細胞からのＡＴＰのみが殆ど損なわれるこ
となく測定され、更に菌数（ｌｏｇＣＦＵ）で３から８
の範囲で、相対発光量の値から菌数（ｌｏｇＣＦＵ）が
定量できることが示された。
【００５３】（実施例２）以下、実施例２〜７には、代
表的なミルク試料汚染微生物である Staphylococcus au
reus ATCC 6538を供試した結果を示した。実施例１の
７）に示されたＡＴＰ加水分解酵素含有水溶液におい
て、プロテアーゼフリーの可溶性タンパク質として用い
たオボアルブミンの代わりに血清アルブミン（ウシ由
来、ＩＮＴＥＲＧＥＮ社製）を同濃度含む水溶液を用
い、試料Ａを対象として、その他の操作は実施例１と全
く同様に行なって、菌数（ｌｏｇＣＦＵ）と相対発光量
（ｌｏｇＲＬＵ）との関係を求めた。結果を図６に示し
た。図６中、○は実施例２の結果を、□は実施例１の試
料Ａの結果を示したものである。ウシ血清アルブミンを
用いた場合も、菌数（ｌｏｇＣＦＵ）が３から８の範囲
で相対発光量との間に直線性があり、また、実施例１の
試料Ａとの間にも良好な相関が認められ、菌数（ｌｏｇ
ＣＦＵ）で３から８の間で、相対発光量の値から菌数
（ｌｏｇＣＦＵ）が定量できることが示された。
表的なミルク試料汚染微生物である Staphylococcus au
reus ATCC 6538を供試した結果を示した。実施例１の
７）に示されたＡＴＰ加水分解酵素含有水溶液におい
て、プロテアーゼフリーの可溶性タンパク質として用い
たオボアルブミンの代わりに血清アルブミン（ウシ由
来、ＩＮＴＥＲＧＥＮ社製）を同濃度含む水溶液を用
い、試料Ａを対象として、その他の操作は実施例１と全
く同様に行なって、菌数（ｌｏｇＣＦＵ）と相対発光量
（ｌｏｇＲＬＵ）との関係を求めた。結果を図６に示し
た。図６中、○は実施例２の結果を、□は実施例１の試
料Ａの結果を示したものである。ウシ血清アルブミンを
用いた場合も、菌数（ｌｏｇＣＦＵ）が３から８の範囲
で相対発光量との間に直線性があり、また、実施例１の
試料Ａとの間にも良好な相関が認められ、菌数（ｌｏｇ
ＣＦＵ）で３から８の間で、相対発光量の値から菌数
（ｌｏｇＣＦＵ）が定量できることが示された。
【００５４】（実施例３）実施例１の７）に示されたＡ
ＴＰ加水分解酵素含有水溶液において、プロテアーゼフ
リーの可溶性タンパク質として用いたオボアルブミンの
代わりに血清アルブミン（ブタ由来、Ｓｉｇｍａ社製）
を同濃度含む水溶液を用い、試料Ａを対象として、その
他の操作は実施例１と全く同様に行なって、菌数（ｌｏ
ｇＣＦＵ）と相対発光量（ｌｏｇＲＬＵ）との関係を求
めた。結果を図７に示した。図７中、○は実施例３の結
果を、□は実施例１の試料Ａの結果を示したものであ
る。ブタ血清アルブミンを用いた場合も、菌数（ｌｏｇ
ＣＦＵ）が３から８の範囲で相対発光量との間に直線性
があり、また、実施例１の試料Ａとの間にも良好な相関
が認められ、菌数（ｌｏｇＣＦＵ）で３から８の間で、
相対発光量の値から菌数（ｌｏｇＣＦＵ）が定量できる
ことが示された。
ＴＰ加水分解酵素含有水溶液において、プロテアーゼフ
リーの可溶性タンパク質として用いたオボアルブミンの
代わりに血清アルブミン（ブタ由来、Ｓｉｇｍａ社製）
を同濃度含む水溶液を用い、試料Ａを対象として、その
他の操作は実施例１と全く同様に行なって、菌数（ｌｏ
ｇＣＦＵ）と相対発光量（ｌｏｇＲＬＵ）との関係を求
めた。結果を図７に示した。図７中、○は実施例３の結
果を、□は実施例１の試料Ａの結果を示したものであ
る。ブタ血清アルブミンを用いた場合も、菌数（ｌｏｇ
ＣＦＵ）が３から８の範囲で相対発光量との間に直線性
があり、また、実施例１の試料Ａとの間にも良好な相関
が認められ、菌数（ｌｏｇＣＦＵ）で３から８の間で、
相対発光量の値から菌数（ｌｏｇＣＦＵ）が定量できる
ことが示された。
【００５５】（実施例４）実施例１の７）に示されたＡ
ＴＰ加水分解酵素含有水溶液において、プロテアーゼフ
リーの可溶性タンパク質として用いたオボアルブミンの
代わりにラクトフェリン（ウシ乳由来、Ｓｉｇｍａ社
製）を同濃度含む水溶液を用い、試料Ａを対象として、
その他の操作は実施例１と全く同様に行なって、菌数
（ｌｏｇＣＦＵ）と相対発光量（ｌｏｇＲＬＵ）との関
係を求めた。結果を図８にしたす。図８中、○は実施例
４の結果を、□は実施例１の試料Ａの結果を示したもの
である。ラクトフェリンを用いた場合も、菌数（ｌｏｇ
ＣＦＵ）が３から８の範囲で相対発光量との間に直線性
があり、また、実施例１の試料Ａとの間にも良好な相関
が認められ、菌数（ｌｏｇＣＦＵ）で３から８の間で、
相対発光量の値から菌数（ｌｏｇＣＦＵ）が定量できる
ことが示された。
ＴＰ加水分解酵素含有水溶液において、プロテアーゼフ
リーの可溶性タンパク質として用いたオボアルブミンの
代わりにラクトフェリン（ウシ乳由来、Ｓｉｇｍａ社
製）を同濃度含む水溶液を用い、試料Ａを対象として、
その他の操作は実施例１と全く同様に行なって、菌数
（ｌｏｇＣＦＵ）と相対発光量（ｌｏｇＲＬＵ）との関
係を求めた。結果を図８にしたす。図８中、○は実施例
４の結果を、□は実施例１の試料Ａの結果を示したもの
である。ラクトフェリンを用いた場合も、菌数（ｌｏｇ
ＣＦＵ）が３から８の範囲で相対発光量との間に直線性
があり、また、実施例１の試料Ａとの間にも良好な相関
が認められ、菌数（ｌｏｇＣＦＵ）で３から８の間で、
相対発光量の値から菌数（ｌｏｇＣＦＵ）が定量できる
ことが示された。
【００５６】（実施例５）実施例１の７）に示されたＡ
ＴＰ加水分解酵素含有水溶液において、防腐剤として添
加したペニシリンＧ−Ｎａ塩の代わりにアジ化ナトリウ
ム、またはクレゾールを同濃度含む水溶液を用い、試料
Ａを対象として、その他の操作は実施例１と全く同様に
行なって、菌数（ｌｏｇＣＦＵ）と相対発光量（ｌｏｇ
ＲＬＵ）との関係を求めた。結果を図９に示した。図９
中、○はアジ化ナトリウムを用いた場合の結果を、△は
クレゾールを用いた場合の結果を、また、□は実施例１
の試料Ａの結果を示したものである。防腐剤としてアジ
化ナトリウム、またはクレゾールを用いた場合も、菌数
（ｌｏｇＣＦＵ）が３から８の範囲で相対発光量との間
に直線性があり、また、実施例１の試料Ａとの間にも良
好な相関が認められ、菌数（ｌｏｇＣＦＵ）で３から８
の間で、相対発光量の値から菌数（ｌｏｇＣＦＵ）が定
量できることが示された。
ＴＰ加水分解酵素含有水溶液において、防腐剤として添
加したペニシリンＧ−Ｎａ塩の代わりにアジ化ナトリウ
ム、またはクレゾールを同濃度含む水溶液を用い、試料
Ａを対象として、その他の操作は実施例１と全く同様に
行なって、菌数（ｌｏｇＣＦＵ）と相対発光量（ｌｏｇ
ＲＬＵ）との関係を求めた。結果を図９に示した。図９
中、○はアジ化ナトリウムを用いた場合の結果を、△は
クレゾールを用いた場合の結果を、また、□は実施例１
の試料Ａの結果を示したものである。防腐剤としてアジ
化ナトリウム、またはクレゾールを用いた場合も、菌数
（ｌｏｇＣＦＵ）が３から８の範囲で相対発光量との間
に直線性があり、また、実施例１の試料Ａとの間にも良
好な相関が認められ、菌数（ｌｏｇＣＦＵ）で３から８
の間で、相対発光量の値から菌数（ｌｏｇＣＦＵ）が定
量できることが示された。
【００５７】（実施例６）実施例１の７）に示されたＡ
ＴＰ加水分解酵素含有水溶液において、ＭＯＰＳ−Ｎａ
ＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）の代わりに同濃度のＭＥＳ−
ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５）、またはＨＥＰＥＳ−Ｎ
ａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）、またはＴｒｉｓ−塩酸緩
衝液（ｐＨ７．５）を用いた水溶液を用い、試料Ａを対
象として、その他の操作は実施例１と全く同様に行なっ
て、菌数（ｌｏｇＣＦＵ）と相対発光量（ｌｏｇＲＬ
Ｕ）との関係を求めた。結果を図１０に示した。図１０
中、○はＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液を用いた場合の結果
を、△はＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液を用いた場合の結
果を、▽はＴｒｉｓ−塩酸緩衝液を用いた場合の結果
を、また、□は実施例１の試料Ａの結果を示したもので
ある。緩衝液としてＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液、またはＨ
ＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液、またはＴｒｉｓ−塩酸緩衝
液を用いた場合も、菌数（ｌｏｇＣＦＵ）が３から８の
範囲で相対発光量との間に直線性があり、また、実施例
１の試料Ａとの間にも良好な相関が認められ、菌数（ｌ
ｏｇＣＦＵ）で３から８の間で、相対発光量の値から菌
数（ｌｏｇＣＦＵ）が定量できることが示された。
ＴＰ加水分解酵素含有水溶液において、ＭＯＰＳ−Ｎａ
ＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）の代わりに同濃度のＭＥＳ−
ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５）、またはＨＥＰＥＳ−Ｎ
ａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）、またはＴｒｉｓ−塩酸緩
衝液（ｐＨ７．５）を用いた水溶液を用い、試料Ａを対
象として、その他の操作は実施例１と全く同様に行なっ
て、菌数（ｌｏｇＣＦＵ）と相対発光量（ｌｏｇＲＬ
Ｕ）との関係を求めた。結果を図１０に示した。図１０
中、○はＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液を用いた場合の結果
を、△はＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液を用いた場合の結
果を、▽はＴｒｉｓ−塩酸緩衝液を用いた場合の結果
を、また、□は実施例１の試料Ａの結果を示したもので
ある。緩衝液としてＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液、またはＨ
ＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液、またはＴｒｉｓ−塩酸緩衝
液を用いた場合も、菌数（ｌｏｇＣＦＵ）が３から８の
範囲で相対発光量との間に直線性があり、また、実施例
１の試料Ａとの間にも良好な相関が認められ、菌数（ｌ
ｏｇＣＦＵ）で３から８の間で、相対発光量の値から菌
数（ｌｏｇＣＦＵ）が定量できることが示された。
【００５８】（実施例７）以下のようにして、試薬Ａ、
試薬Ｂ、試薬Ｃ、生物発光試薬、ＡＴＰ標準液と、それ
らの溶解液よりなる試薬キットを調製した。 試薬Ａの調製：キレート剤として１．５Ｍ ＡＤＡ溶液
（ｐＨ６．８）を、また、非イオン界面活性剤として１
０％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００溶液を調製した。なお、
ＡＤＡ水溶液のｐＨ調整には、１０Ｎ ＮａＯＨ溶液を
用いた。５００ｍｌ容メスシリンダーに１０％Ｔｒｉｔ
ｏｎ Ｘ−１００溶液１５ｍｌをとり、これに滅菌超純
水を加えて１５０ｍｌとして溶解した。これに、１．５
Ｍ ＡＤＡ溶液３０ｍｌを加え、十分に攪拌して溶解し
た後、全容を３００ｍｌとした。得られた溶液を０．２
μｍのフィルターで濾過して滅菌した後、１０％ポリス
チレンラテックス（積水化学工業（株）製Ｌａｔｅｘソ
ープフリータイプＮ−８００（粒径０．７８μｍ））３
００μｌを無菌的に添加した。得られた溶液を、滅菌済
みの６０ｍｌ容ＰＥＴＧ製容器に５０ｍｌずつ分注後密
栓をして、試薬Ａとした。 試薬Ｂの調製：２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．
０）に、血清アルブミン（ウシ由来、ＩＮＴＥＲＧＥＮ
Ｅ社製）、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、及びＥ
ＤＴＡを、それぞれ１２ｍｇ／ｍｌ、２４ｍＭ、０．６
ｍＭ、及び１．２ｍＭとなるように溶解し、さらに、ア
ピラーゼ（ジャガイモ由来、Ｓｉｇｍａ社製Ｇｒａｄｅ
ＶＩ）を、酵素活性（ΔｌｏｇＲＬＵ／分）が２４とな
るように添加した。これを、０．４５μｍのフィルター
で濾過して滅菌した後、真空凍結乾燥用の褐色ガラス瓶
に１ｍｌずつ分注し、−４０℃で２４時間凍結乾燥し、
真空状態でゴム栓をして密栓した。測定時には、これに
０．１％アジ化ナトリウムを含む２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ
緩衝液（ｐＨ７．０）１２ｍｌを加えて溶解させ、これ
を試薬Ｂとして用いた。 試薬Ｃの調製：５００ｍｌ容フラスコに滅菌超純水１９
７．２５ｍｌ、クロルヘキシジンジグルコネート（２０
％溶液、Ａｌｄｒｉｃｈ社製）０．７５ｍｌ、及び０．
７５％ＣＴＡＢ溶液２ｍｌを加え、良く攪拌して混合し
た。これを０．２μｍのフィルターで濾過して滅菌した
後、滅菌済みの１５ｍｌ容ＨＤＰＥ製遮光性容器に１２
ｍｌずつ分注後密栓をして、試薬Ｃとした。 生物発光試薬の調製：１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−酢酸緩衝
液（ｐＨ７．７５）に、ＥＤＴＡ、酢酸マグネシウム、
ＤＴＴ、血清アルブミン（ウシ由来、ＩＮＴＥＲＧＥＮ
社製）、及びＤ−ルシフェリンを、それぞれ、０．６ｍ
Ｍ、３００ｍＭ、３ｍＭ、９ｍｇ／ｍｌ、及び４．５ｍ
Ｍとなるように溶解し、さらに精製したホタルルシフェ
ラーゼを添加した。この際、この溶液の一部を採取して
滅菌超純水で６倍に希釈したとき、１０-12 ｍｏｌｅ
のＡＴＰに対して２×１０6 ＲＬＵ程度の発光が得られ
るようにルシフェラーゼ量を調整した。これを、０．４
５μｍのフィルターで濾過して滅菌した後、真空凍結乾
燥用の褐色ガラス瓶に２ｍｌずつ分注し、−２０℃で２
４時間凍結乾燥し、真空状態でゴム栓をして密栓した。
測定時には、これにＡＴＰフリーの滅菌超純水１２ｍｌ
を加えて溶解させ、これを生物発光試薬とした。また、
測定に際しては、以下に示すＡＴＰ標準液を用いて前述
の発光と同程度の発光が得られることを確認した。 ＡＴＰ標準液の調製：１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐ
Ｈ７．７５）に、ＡＴＰを２×１０9 Ｍとなるように溶
解して調製した。得られた試薬キットを用いて、試料Ａ
を対象として、その他の操作は実施例１と全く同様に行
って、菌数（ｌｏｇＣＦＵ）と相対発光量（ｌｏｇＲＬ
Ｕ）との関係を求めた。すなわち、実施例１における
「キレート剤及び非イオン界面活性剤含有水溶液」の代
わりに試薬Ａを、「ＡＴＰ加水分解酵素含有水溶液」の
代わりに試薬Ｂを、「ＡＴＰ抽出剤」の代わりに試薬Ｃ
を、そして、「発光試薬（東洋インキ製造（株）製 商
品名：菌士郎）」の代わりに生物発光試薬を用いて測定
を行った。結果を図１１に示した。図１１中、○は実施
例７の結果を、□は実施例１の試料Ａに結果を示した。
上記試薬キットを用いた場合も、菌数（ｌｏｇＣＦＵ）
が３から８の範囲で相対発光量との間に直線性があり、
また、実施例１の試料Ａとの間にも良好な相関が認めら
れ、菌数（ｌｏｇＣＦＵ）が３から８の範囲で、相対発
光量から菌数（ｌｏｇＣＦＵ）が定量できることが示さ
れた。
試薬Ｂ、試薬Ｃ、生物発光試薬、ＡＴＰ標準液と、それ
らの溶解液よりなる試薬キットを調製した。 試薬Ａの調製：キレート剤として１．５Ｍ ＡＤＡ溶液
（ｐＨ６．８）を、また、非イオン界面活性剤として１
０％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００溶液を調製した。なお、
ＡＤＡ水溶液のｐＨ調整には、１０Ｎ ＮａＯＨ溶液を
用いた。５００ｍｌ容メスシリンダーに１０％Ｔｒｉｔ
ｏｎ Ｘ−１００溶液１５ｍｌをとり、これに滅菌超純
水を加えて１５０ｍｌとして溶解した。これに、１．５
Ｍ ＡＤＡ溶液３０ｍｌを加え、十分に攪拌して溶解し
た後、全容を３００ｍｌとした。得られた溶液を０．２
μｍのフィルターで濾過して滅菌した後、１０％ポリス
チレンラテックス（積水化学工業（株）製Ｌａｔｅｘソ
ープフリータイプＮ−８００（粒径０．７８μｍ））３
００μｌを無菌的に添加した。得られた溶液を、滅菌済
みの６０ｍｌ容ＰＥＴＧ製容器に５０ｍｌずつ分注後密
栓をして、試薬Ａとした。 試薬Ｂの調製：２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．
０）に、血清アルブミン（ウシ由来、ＩＮＴＥＲＧＥＮ
Ｅ社製）、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、及びＥ
ＤＴＡを、それぞれ１２ｍｇ／ｍｌ、２４ｍＭ、０．６
ｍＭ、及び１．２ｍＭとなるように溶解し、さらに、ア
ピラーゼ（ジャガイモ由来、Ｓｉｇｍａ社製Ｇｒａｄｅ
ＶＩ）を、酵素活性（ΔｌｏｇＲＬＵ／分）が２４とな
るように添加した。これを、０．４５μｍのフィルター
で濾過して滅菌した後、真空凍結乾燥用の褐色ガラス瓶
に１ｍｌずつ分注し、−４０℃で２４時間凍結乾燥し、
真空状態でゴム栓をして密栓した。測定時には、これに
０．１％アジ化ナトリウムを含む２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ
緩衝液（ｐＨ７．０）１２ｍｌを加えて溶解させ、これ
を試薬Ｂとして用いた。 試薬Ｃの調製：５００ｍｌ容フラスコに滅菌超純水１９
７．２５ｍｌ、クロルヘキシジンジグルコネート（２０
％溶液、Ａｌｄｒｉｃｈ社製）０．７５ｍｌ、及び０．
７５％ＣＴＡＢ溶液２ｍｌを加え、良く攪拌して混合し
た。これを０．２μｍのフィルターで濾過して滅菌した
後、滅菌済みの１５ｍｌ容ＨＤＰＥ製遮光性容器に１２
ｍｌずつ分注後密栓をして、試薬Ｃとした。 生物発光試薬の調製：１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−酢酸緩衝
液（ｐＨ７．７５）に、ＥＤＴＡ、酢酸マグネシウム、
ＤＴＴ、血清アルブミン（ウシ由来、ＩＮＴＥＲＧＥＮ
社製）、及びＤ−ルシフェリンを、それぞれ、０．６ｍ
Ｍ、３００ｍＭ、３ｍＭ、９ｍｇ／ｍｌ、及び４．５ｍ
Ｍとなるように溶解し、さらに精製したホタルルシフェ
ラーゼを添加した。この際、この溶液の一部を採取して
滅菌超純水で６倍に希釈したとき、１０-12 ｍｏｌｅ
のＡＴＰに対して２×１０6 ＲＬＵ程度の発光が得られ
るようにルシフェラーゼ量を調整した。これを、０．４
５μｍのフィルターで濾過して滅菌した後、真空凍結乾
燥用の褐色ガラス瓶に２ｍｌずつ分注し、−２０℃で２
４時間凍結乾燥し、真空状態でゴム栓をして密栓した。
測定時には、これにＡＴＰフリーの滅菌超純水１２ｍｌ
を加えて溶解させ、これを生物発光試薬とした。また、
測定に際しては、以下に示すＡＴＰ標準液を用いて前述
の発光と同程度の発光が得られることを確認した。 ＡＴＰ標準液の調製：１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐ
Ｈ７．７５）に、ＡＴＰを２×１０9 Ｍとなるように溶
解して調製した。得られた試薬キットを用いて、試料Ａ
を対象として、その他の操作は実施例１と全く同様に行
って、菌数（ｌｏｇＣＦＵ）と相対発光量（ｌｏｇＲＬ
Ｕ）との関係を求めた。すなわち、実施例１における
「キレート剤及び非イオン界面活性剤含有水溶液」の代
わりに試薬Ａを、「ＡＴＰ加水分解酵素含有水溶液」の
代わりに試薬Ｂを、「ＡＴＰ抽出剤」の代わりに試薬Ｃ
を、そして、「発光試薬（東洋インキ製造（株）製 商
品名：菌士郎）」の代わりに生物発光試薬を用いて測定
を行った。結果を図１１に示した。図１１中、○は実施
例７の結果を、□は実施例１の試料Ａに結果を示した。
上記試薬キットを用いた場合も、菌数（ｌｏｇＣＦＵ）
が３から８の範囲で相対発光量との間に直線性があり、
また、実施例１の試料Ａとの間にも良好な相関が認めら
れ、菌数（ｌｏｇＣＦＵ）が３から８の範囲で、相対発
光量から菌数（ｌｏｇＣＦＵ）が定量できることが示さ
れた。
【００５９】（比較例１）以下、比較例１〜３には、代
表的なミルク試料汚染微生物である Staphylococcus au
reus ATCC 6538を供試した結果を示した。実施例１の
７）に示されたＡＴＰ加水分解酵素含有水溶液よりアピ
ラーゼを除いた組成の水溶液を用い、試料Ａを対象とし
て、その他の操作は実施例１と全く同様に行い、菌数
（ｌｏｇＣＦＵ）と相対発光量（ｌｏｇＲＬＵ）の関係
を求めた。結果を図１２に示した。図１２中、○は比較
例１の結果を、□は実施例１の試料Ａの結果を示したも
のである。図１２に示されたように、アピラーゼを用い
ない測定方法では、菌数（ｌｏｇＣＦＵ）が５以下では
相対発光量（ｌｏｇＲＬＵ）は低下せず、実施例１の試
料Ａとの間にも良好な相関が認められないため、測定法
としては不適切であった。
表的なミルク試料汚染微生物である Staphylococcus au
reus ATCC 6538を供試した結果を示した。実施例１の
７）に示されたＡＴＰ加水分解酵素含有水溶液よりアピ
ラーゼを除いた組成の水溶液を用い、試料Ａを対象とし
て、その他の操作は実施例１と全く同様に行い、菌数
（ｌｏｇＣＦＵ）と相対発光量（ｌｏｇＲＬＵ）の関係
を求めた。結果を図１２に示した。図１２中、○は比較
例１の結果を、□は実施例１の試料Ａの結果を示したも
のである。図１２に示されたように、アピラーゼを用い
ない測定方法では、菌数（ｌｏｇＣＦＵ）が５以下では
相対発光量（ｌｏｇＲＬＵ）は低下せず、実施例１の試
料Ａとの間にも良好な相関が認められないため、測定法
としては不適切であった。
【００６０】（比較例２）実施例１の７）に示されたＡ
ＴＰ加水分解酵素含有水溶液より、プロテアーゼフリー
の可溶性タンパク質として用いたオボアルブミンを除い
た組成の水溶液を用い、試料Ａを対象として、その他の
操作は実施例１と全く同様に行い、菌数（ｌｏｇＣＦ
Ｕ）と相対発光量（ｌｏｇＲＬＵ）の関係を求めた。結
果を図１３に示した。図１３中、○は比較例２の結果
を、□は実施例１の試料Ａの結果を示したものである。
図１３に示されたように、オボアルブミンを用いない測
定方法では、菌数（ｌｏｇＣＦＵ）が５以下では相対発
光量（ｌｏｇＲＬＵ）は低下せず、実施例１の試料Ａと
の間にも良好な相関が認められないため、測定法として
は不適切であった。
ＴＰ加水分解酵素含有水溶液より、プロテアーゼフリー
の可溶性タンパク質として用いたオボアルブミンを除い
た組成の水溶液を用い、試料Ａを対象として、その他の
操作は実施例１と全く同様に行い、菌数（ｌｏｇＣＦ
Ｕ）と相対発光量（ｌｏｇＲＬＵ）の関係を求めた。結
果を図１３に示した。図１３中、○は比較例２の結果
を、□は実施例１の試料Ａの結果を示したものである。
図１３に示されたように、オボアルブミンを用いない測
定方法では、菌数（ｌｏｇＣＦＵ）が５以下では相対発
光量（ｌｏｇＲＬＵ）は低下せず、実施例１の試料Ａと
の間にも良好な相関が認められないため、測定法として
は不適切であった。
【００６１】（比較例３）実施例１の７）に示されたＡ
ＴＰ加水分解酵素含有水溶液において、ＭＯＰＳ−Ｎａ
ＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）の代わりに同濃度のコハク酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）、またはＧＴＡ緩衝液
（ｐＨ９．０）（「蛋白質・酵素の基礎実験法」４３５
頁記載）を用い、試料Ａを対象として、その他の操作は
実施例と全く同様に行い、菌数（ｌｏｇＣＦＵ）と相対
発光量（ｌｏｇＲＬＵ）の関係を求めた。結果を図１４
に示した。図１４中、○はコハク酸ナトリウム緩衝液を
用いた結果を、△はＧＴＡ緩衝液を用いた結果を、ま
た、□は実施例１の試料Ａの結果を示したものである。
図１４に示されたように、ｐＨ領域が酸性側あるいはア
ルカリ性側にある緩衝液を用いた測定方法では、菌数
（ｌｏｇＣＦＵ）が５以下では相対発光量（ｌｏｇＲＬ
Ｕ）は低下せず、実施例１の試料Ａとの間にも良好な相
関が認められないため、測定法としては不適切であっ
た。
ＴＰ加水分解酵素含有水溶液において、ＭＯＰＳ−Ｎａ
ＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）の代わりに同濃度のコハク酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）、またはＧＴＡ緩衝液
（ｐＨ９．０）（「蛋白質・酵素の基礎実験法」４３５
頁記載）を用い、試料Ａを対象として、その他の操作は
実施例と全く同様に行い、菌数（ｌｏｇＣＦＵ）と相対
発光量（ｌｏｇＲＬＵ）の関係を求めた。結果を図１４
に示した。図１４中、○はコハク酸ナトリウム緩衝液を
用いた結果を、△はＧＴＡ緩衝液を用いた結果を、ま
た、□は実施例１の試料Ａの結果を示したものである。
図１４に示されたように、ｐＨ領域が酸性側あるいはア
ルカリ性側にある緩衝液を用いた測定方法では、菌数
（ｌｏｇＣＦＵ）が５以下では相対発光量（ｌｏｇＲＬ
Ｕ）は低下せず、実施例１の試料Ａとの間にも良好な相
関が認められないため、測定法としては不適切であっ
た。
【００６２】
【発明の効果】本発明により、試料、特にミルク試料中
に存在する微生物細胞に由来するＡＴＰを選択的に検出
及び／または測定する方法の検出感度が大幅に改善され
た。非イオン界面活性剤によって非微生物細胞由来ＡＴ
Ｐを抽出し、ＡＴＰ加水分解酵素で分解した後、ＡＴＰ
抽出剤で微生物細胞からＡＴＰを抽出し、生物発光法で
検出するという一連の操作の中で、ＡＴＰ加水分解酵素
の活性を最適化したことにより、微生物細胞由来のＡＴ
Ｐを損なうことなく非微生物細胞由来のＡＴＰを分解で
きるようになり、非微生物細胞由来ＡＴＰによるノイズ
を最小にすることができた。遠心分離操作の併用によ
り、ミルク試料中の微生物の検出感度は１０ 2 〜１０3
ＣＦＵ／ｍｌとなった。遠心分離を伴う従来の方法で
は、非微生物細胞由来のＡＴＰを除くために遠心分離を
繰り返す必要があったが、本発明の方法では、１回の遠
心分離で良好な結果が得られるようになり、測定時間が
短縮できた。
に存在する微生物細胞に由来するＡＴＰを選択的に検出
及び／または測定する方法の検出感度が大幅に改善され
た。非イオン界面活性剤によって非微生物細胞由来ＡＴ
Ｐを抽出し、ＡＴＰ加水分解酵素で分解した後、ＡＴＰ
抽出剤で微生物細胞からＡＴＰを抽出し、生物発光法で
検出するという一連の操作の中で、ＡＴＰ加水分解酵素
の活性を最適化したことにより、微生物細胞由来のＡＴ
Ｐを損なうことなく非微生物細胞由来のＡＴＰを分解で
きるようになり、非微生物細胞由来ＡＴＰによるノイズ
を最小にすることができた。遠心分離操作の併用によ
り、ミルク試料中の微生物の検出感度は１０ 2 〜１０3
ＣＦＵ／ｍｌとなった。遠心分離を伴う従来の方法で
は、非微生物細胞由来のＡＴＰを除くために遠心分離を
繰り返す必要があったが、本発明の方法では、１回の遠
心分離で良好な結果が得られるようになり、測定時間が
短縮できた。
【００６３】
【図１】Serattia liquefacience PB 1707を添加した試
料における菌数（ｌｏｇＣＦＵ）と相対発光量（ｌｏｇ
ＲＬＵ）との関係を示す。
料における菌数（ｌｏｇＣＦＵ）と相対発光量（ｌｏｇ
ＲＬＵ）との関係を示す。
【図２】Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027を添加した
試料における菌数（ｌｏｇＣＦＵ）と相対発光量（ｌｏ
ｇＲＬＵ）との関係を示す。
試料における菌数（ｌｏｇＣＦＵ）と相対発光量（ｌｏ
ｇＲＬＵ）との関係を示す。
【図３】Enterobacter spp. を添加した試料における菌
数（ｌｏｇＣＦＵ）と相対発光量（ｌｏｇＲＬＵ）との
関係を示す。
数（ｌｏｇＣＦＵ）と相対発光量（ｌｏｇＲＬＵ）との
関係を示す。
【図４】Bacillus subtilis ATCC 6633 を添加した試料
における菌数（ｌｏｇＣＦＵ）と相対発光量（ｌｏｇＲ
ＬＵ）との関係を示す。
における菌数（ｌｏｇＣＦＵ）と相対発光量（ｌｏｇＲ
ＬＵ）との関係を示す。
【図５】Staphylococcus aureus ATCC 6538 を添加した
試料における菌数（ｌｏｇＣＦＵ）と相対発光量（ｌｏ
ｇＲＬＵ）との関係を示す。
試料における菌数（ｌｏｇＣＦＵ）と相対発光量（ｌｏ
ｇＲＬＵ）との関係を示す。
【図６】Staphylococcus aureus ATCC 6538 を添加した
試料における菌数（ｌｏｇＣＦＵ）と相対発光量（ｌｏ
ｇＲＬＵ）との関係を示す。
試料における菌数（ｌｏｇＣＦＵ）と相対発光量（ｌｏ
ｇＲＬＵ）との関係を示す。
【図７】Staphylococcus aureus ATCC 6538 を添加した
試料における菌数（ｌｏｇＣＦＵ）と相対発光量（ｌｏ
ｇＲＬＵ）との関係を示す。
試料における菌数（ｌｏｇＣＦＵ）と相対発光量（ｌｏ
ｇＲＬＵ）との関係を示す。
【図８】Staphylococcus aureus ATCC 6538 を添加した
試料における菌数（ｌｏｇＣＦＵ）と相対発光量（ｌｏ
ｇＲＬＵ）との関係を示す。
試料における菌数（ｌｏｇＣＦＵ）と相対発光量（ｌｏ
ｇＲＬＵ）との関係を示す。
【図９】Staphylococcus aureus ATCC 6538 を添加した
試料における菌数（ｌｏｇＣＦＵ）と相対発光量（ｌｏ
ｇＲＬＵ）との関係を示す。
試料における菌数（ｌｏｇＣＦＵ）と相対発光量（ｌｏ
ｇＲＬＵ）との関係を示す。
【図１０】Staphylococcus aureus ATCC 6538 を添加し
た試料における菌数（ｌｏｇＣＦＵ）と相対発光量（ｌ
ｏｇＲＬＵ）との関係を示す。
た試料における菌数（ｌｏｇＣＦＵ）と相対発光量（ｌ
ｏｇＲＬＵ）との関係を示す。
【図１１】Staphylococcus aureus ATCC 6538 を添加し
た試料における菌数（ｌｏｇＣＦＵ）と相対発光量（ｌ
ｏｇＲＬＵ）との関係を示す。
た試料における菌数（ｌｏｇＣＦＵ）と相対発光量（ｌ
ｏｇＲＬＵ）との関係を示す。
【図１２】Staphylococcus aureus ATCC 6538 を添加し
た試料における菌数（ｌｏｇＣＦＵ）と相対発光量（ｌ
ｏｇＲＬＵ）との関係を示す。
た試料における菌数（ｌｏｇＣＦＵ）と相対発光量（ｌ
ｏｇＲＬＵ）との関係を示す。
【図１３】Staphylococcus aureus ATCC 6538 を添加し
た試料における菌数（ｌｏｇＣＦＵ）と相対発光量（ｌ
ｏｇＲＬＵ）との関係を示す。
た試料における菌数（ｌｏｇＣＦＵ）と相対発光量（ｌ
ｏｇＲＬＵ）との関係を示す。
【図１４】Staphylococcus aureus ATCC 6538 を添加し
た試料における菌数（ｌｏｇＣＦＵ）と相対発光量（ｌ
ｏｇＲＬＵ）との関係を示す。
た試料における菌数（ｌｏｇＣＦＵ）と相対発光量（ｌ
ｏｇＲＬＵ）との関係を示す。
Claims (10)
- 【請求項１】 試料中に存在する微生物細胞に由来する
ＡＴＰを検出及び／または測定する方法であって、試料
を遠心分離して上澄み液を除去し微生物細胞ペレットを
形成する工程、微生物細胞ペレットにプロテアーゼフリ
ーの可溶性タンパク質とＡＴＰ加水分解酵素を含む緩衝
液を加えてｐＨ＝６．０〜８．０の条件下でインキュベ
ートする工程、ＡＴＰ抽出剤を添加し微生物細胞からＡ
ＴＰを抽出する工程、及び微生物細胞から放出されたＡ
ＴＰを生物発光法を用いて検出及び／または測定する工
程を含むことを特徴とする前記の方法。 - 【請求項２】 試料を遠心分離する前に非イオン界面活
性剤を添加して、試料中に存在する非微生物細胞中のＡ
ＴＰを細胞外へ出す工程をさらに含む請求項１記載の測
定方法。 - 【請求項３】 非イオン界面活性剤を添加して非微生物
細胞中のＡＴＰを細胞外へ出す工程において、キレート
剤を添加する請求項２記載の測定方法 - 【請求項４】 微生物細胞ペレットにプロテアーゼフリ
ーの可溶性タンパク質とＡＴＰ加水分解酵素を含む緩衝
液を加えてｐＨ＝６．０〜８．０の条件下でインキュベ
ートする工程において、ＡＴＰ加水分解酵素活性化剤を
添加する請求項１〜３いずれか記載の測定方法。 - 【請求項５】 微生物細胞ペレットにプロテアーゼフリ
ーの可溶性タンパク質とＡＴＰ加水分解酵素を含む緩衝
液を加えてｐＨ＝６．０〜８．０の条件下でインキュベ
ートする工程において、防腐剤を添加する請求項１〜４
いずれか記載の測定方法。 - 【請求項６】 微生物細胞ペレットにプロテアーゼフリ
ーの可溶性タンパク質とＡＴＰ加水分解酵素を含む緩衝
液を加えてｐＨ＝６．０〜８．０の条件下でインキュベ
ートする工程において、キレート剤を添加する請求項１
〜５いずれか記載の測定方法。 - 【請求項７】 微生物細胞ペレットにプロテアーゼフリ
ーの可溶性タンパク質とＡＴＰ加水分解酵素を含む緩衝
液を加えてｐＨ＝６．０〜８．０の条件下でインキュベ
ートする工程において、タンパク質ＳＨ基保護剤を添加
する請求項１〜６いずれか記載の測定方法。 - 【請求項８】 生物発光法がルシフェリン及びルシフェ
ラーゼを含む請求項１〜７いずれか記載の測定方法。 - 【請求項９】 ｐＨを６．０〜８．０に調整しうる緩衝
液、プロテアーゼフリーの可溶性タンパク質及びＡＴＰ
加水分解酵素を含む試薬、ＡＴＰ抽出剤を含む試薬、並
びに生物発光試薬を含むことを特徴とする、微生物細胞
に由来するＡＴＰを検出及び／または測定するための試
薬キット。 - 【請求項１０】 生物発光試薬がルシフェリン及びルシ
フェラーゼを含む請求項９記載の試薬キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10286297A JPH1028599A (ja) | 1996-04-26 | 1997-04-21 | 試料中に存在する微生物細胞に由来するａｔｐを検出及び／または測定する方法、及びその試薬キット |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10744496 | 1996-04-26 | ||
| JP8-107444 | 1996-04-26 | ||
| JP10286297A JPH1028599A (ja) | 1996-04-26 | 1997-04-21 | 試料中に存在する微生物細胞に由来するａｔｐを検出及び／または測定する方法、及びその試薬キット |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1028599A true JPH1028599A (ja) | 1998-02-03 |
Family
ID=26443546
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10286297A Withdrawn JPH1028599A (ja) | 1996-04-26 | 1997-04-21 | 試料中に存在する微生物細胞に由来するａｔｐを検出及び／または測定する方法、及びその試薬キット |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1028599A (ja) |
Cited By (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999011766A1 (fr) * | 1997-09-01 | 1999-03-11 | Toyo Ink Mfg. Co., Ltd. | Procede de luminescence pour systeme de luciferine/luciferase et reactif luminescent |
| WO2000031292A1 (fr) * | 1998-11-25 | 2000-06-02 | Kikkoman Corporation | Procede de comptage de cellules vivantes |
| WO2006095697A1 (ja) * | 2005-03-10 | 2006-09-14 | Bussan Nanotech Research Institute, Inc. | 微生物検出方法及び溶菌試薬 |
| JP2007222166A (ja) * | 2006-02-24 | 2007-09-06 | Millipore Corp | 高速微生物学的解析方法 |
| JP2008504841A (ja) * | 2004-07-02 | 2008-02-21 | プロメガ コーポレイション | 微生物ａｔｐの抽出及び検出システム |
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| US8642321B2 (en) | 2007-04-26 | 2014-02-04 | Emd Millipore Corporation | Microbiological analysis assembly and method |
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| CN116087165A (zh) * | 2022-12-22 | 2023-05-09 | 南京林业大学 | 一种简单快速检测mtc和/或otc和/或tc的方法 |
-
1997
- 1997-04-21 JP JP10286297A patent/JPH1028599A/ja not_active Withdrawn
Cited By (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| JP4608507B2 (ja) * | 2006-02-24 | 2011-01-12 | ミリポア・コーポレイション | 高速微生物学的解析方法 |
| JP2007222166A (ja) * | 2006-02-24 | 2007-09-06 | Millipore Corp | 高速微生物学的解析方法 |
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| WO2022239867A1 (ja) * | 2021-05-14 | 2022-11-17 | 株式会社堀場アドバンスドテクノ | 微生物検出装置及び微生物検出方法 |
| CN116087165A (zh) * | 2022-12-22 | 2023-05-09 | 南京林业大学 | 一种简单快速检测mtc和/或otc和/或tc的方法 |
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