ES2718576T3

ES2718576T3 - Enriquecimiento y cultivo selectivo de micobacterias

Info

Publication number: ES2718576T3
Application number: ES16707181T
Authority: ES
Inventors: Sylvain Orenga; Audrey Perry; John Perry; Clair Preece
Original assignee: Biomerieux SA
Current assignee: Biomerieux SA
Priority date: 2015-02-06
Filing date: 2016-02-04
Publication date: 2019-07-02
Anticipated expiration: 2036-02-04
Also published as: FR3032448A1; CN114214243A; FR3032448B1; CN107208127B; US20180030500A1; EP3253885B1; PL3253885T3; CN107208127A; WO2016124863A1; US10597693B2; EP3253885A1; CN114214243B

Description

DESCRIPCIÓN

Enriquecimiento y cultivo selectivo de micobacterias

La presente invención se refiere a los métodos de cultivo y de aislamiento de las micobacterias. Más precisamente, se refiere a los métodos de microbiología y los medios de cultivo que pueden utilizarse para la detección, la identificación, el aislamiento y/o el estudio analítico de micobacterias, por ejemplo las presentes en las muestras y las extracciones biológicas.

Perteneciendo al orden de los actinomicetos, las micobacterias son unos bacilos finos, de forma recta o a veces ligeramente curvada. Debido a una pared rico en lípidos que limita la penetración de los colorantes, la coloración de las micobacterias por las técnicas y los colorantes tradicionales es difícil. Pero, una vez coloreadas, su coloración resiste a la decoloración tanto por el ácido como por el alcohol. Por esta razón, se clasifican como bacterias “ácidoalcohol-resistentes”.

Según una clasificación elemental, las diferentes especies de micobacterias está clasificadas según dos grandes categorías.

La primera categoría agrupa las micobacterias patógenas estrictas, que parasitan tanto los animales como el hombre. Estas micobacterias son responsables de la tuberculosos (Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium africanum, Mycobacterium microti et Mycobacterium canetti) o de la lepra (Mycobacterium leprae).

La segunda categoría agrupa las micobacterias saprofitos o comensales, que son habitualmente no patógenas. Se habla entonces de micobacterias “atípicas” o “no tuberculosas” (MNT). Ubicuas en nuestro entorno, estas últimas se encuentran diseminadas un poco en todas partes, en el suelo, los vegetales, el polvo, el agua y las redes de distribución, nuestra alimentación, etc. Generalmente inofensivas para el hombre, algunas micobacterias no tuberculosas pueden causar, en los sujetos inmunodepresivos, unas infecciones oportunistas que alcanzan principalmente los pulmones, la piel y el sistema linfático.

Así, en el plano clínico pero también sanitario, que sean patógenas o no tuberculosas, la detección y/o la identificación de las micobacterias revisten una importancia sustancial. Una detección precoz y específica de estas bacterias permite proponer una solución adaptada, en términos de tratamiento terapéutico, de descontaminación sanitaria, etc. Diferentes técnicas existen para ello, por ejemplo, la amplificación génica (por PCR) de secuencias nucleicas específicas, la inmuno-detección de antígenos, la espectrometría de masa, la detección microbiológica de actividades enzimáticas, etc.

Sean cuales sean, estos métodos de detección/identificación necesitan generalmente el cultivo de las micobacterias eventualmente presentes en las muestras/extracciones a analizar, para obtener una cantidad propicia para su detección. Sean cuales sean, estos métodos de detección/identificación sufren una misma desventaja: la lentitud de crecimiento y de desarrollo de las micobacterias.

En efecto, comparadas con otras bacterias, levaduras y hongos, las micobacterias, tanto patógenas como saprófitas, se caracterizan por un crecimiento y un desarrollo relativamente lentos. Por otro lado, en las muestras biológicas en las que se busca la presencia de micobacterias, las micobacterias se encuentran raramente aisladas; están habitualmente contaminadas por una flora acompañante cuyo crecimiento y desarrollo son mucho más rápidos. A medida que avanzan los ciclos de divisiones celulares, la proporción de las micobacterias en la muestra disminuye, y la dificultad de poder visualizarlas e identificarlas se encuentra acentuada.

Para remediar a esta lentitud de crecimiento y de desarrollo y/o esta contaminación por otros microorganismos, numerosos se han desarrollado medios de cultivo y caldos de enriquecimiento, más o menos selectivos para las micobacterias o para una especie particular de micobacteria.

Entre los utilizados más frecuentemente, el medio Lowenstein-Jensen es un medio de cultivo coagulado (no agar), que comprende un componente nutritivo a base de huevo entero, de fécula de patata, de asparagina, de glicerol y de minerales. Este medio contiene también verde de malaquita, para inhibir la flora acompañante (más particularmente, las bacterias Gram negativas). También se ha propuesto una adición de penicilina y/o de ácido nalidíxico para aumentar la selectividad frente a micobacterias.

De composición similar, el medio agar Coletsos contiene además, piruvato y glutamato, azul de girasol y gelatina. Más recientemente aparecido, los medios Middlebrook 7H9, 7H10 y 7H11 son unos medios semisintéticos que tienen un componente nutritivo a base de aminoácidos, de ácidos grasos, de piruvato y de sales minerales. Estos medios contienen también catalasa y albumina bovina (fracción V) que aportan a las micobacterias una protección contra diversos agentes nocivos (en particular unos peróxidos tóxicos) eventualmente presentes en las muestras y extracciones biológicas. El medio Middlebrook 7H10 difiere del medio Middlebrook 7H9 por la presencia de verde malaquita. El medio Middlebrook 7H11 difiere del medio Middlebrook 7H10 por que está enriquecido con una peptona pancreática de caseína. Se han considerado también numerosas variantes de estos tres medios Middlebrook, para aumentar la selectividad frente a micobacterias, por ejemplo añadiendo los agentes selectivos siguientes: polimixina, anfotericina B, ácido nalidíxico, trimetoprima, azlocilina y vancomicina.

Últimamente, el medio BCSA (por “Burkholderia cepacia selective agar”) inicialmente desarrollado para el cultivo y la detección de Burkholderia cepacia, se ha descrito como siendo particularmente propicio al desarrollo y al crecimiento de las micobacterias, más particularmente unas micobacterias denominadas de crecimiento rápido (Esther et al. -Journal of Clinical Microbiology; 2011, 1421-1425). Se trata de un medio de cultivo agar, formulado a partir de un componente nutritivo que comprende peptona de caseína, azúcares (lactosa y sacarosa), un extracto de levadura, y unos agentes selectivos tales como la gentamicina, la vancomicina, el cristal violeta y la polimixina B.

La solicitud US20140199724 describe un medio de cultivo para el enriquecimiento y la detección de micobacterias. La presente invención tiene como objetivo mejorar los métodos y las técnicas utilizados para detectar, identificar y/o aislar las micobacterias presentes en una muestra biológica. Para hacer esto, la presente invención tiene como objetivo mejorar los medios de cultivo y caldos de enriquecimiento utilizados en estos métodos y técnicas, tanto a nivel de su fertilidad como de su selectividad frente a micobacterias. Asimismo, tiene como objetivo proponer nuevas composiciones de medio de cultivo y/o de caldo de enriquecimiento, aptos para permitir el cultivo y la multiplicación de las micobacterias, y que tienen unos rendimientos mejorados en términos de fertilidad y/o de selectividad frente a micobacterias.

Antes de presentar la invención, las definiciones siguientes se dan para permitir una mejor comprensión de la invención.

Por “medio de cultivo” se entiende un medio que comprende todos los elementos necesarios para la expresión de un metabolismo y/o para el crecimiento de microorganismos. El medio de cultivo puede ser sólido, semisólido o líquido. Por “medio sólido” se entiende por ejemplo un medio agar o un medio coagulado. El agar es el agente gelificante tradicional en microbiología, para el cultivo de los microorganismos, pero es posible utilizar gelatina, agarosa u otros gelificantes naturales o artificiales.

Por “caldo de enriquecimiento” se designa más específicamente un medio de cultivo líquido.

Un medio de cultivo se califica de medio mínimo, cuando su composición comprende únicamente los elementos químicos estrictamente necesarios para el crecimiento y la multiplicación de microorganismos a cultivar. Comprende clásicamente:

- agua (generalmente, agua destilada o desionizada);

- un componente nutritivo que comprende generalmente:

- una fuente carbonada y de energía (generalmente glucosa);

- una fuente de calcio (por ejemplo CaCb);

- una fuente de nitrógeno (por ejemplo (NH⁴)²SÜ⁴);

- una fuente de azufre (por ejemplo (NH⁴)²SÜ⁴);

- una fuente de magnesio (por ejemplo MgCl2);

- una fuente de hierro (por ejemplo citrato de hierro);

- una fuente de oligoelementos (por ejemplo sales de Cu, Zn, Co, Ni, B, Ti);

- eventualmente un tampón pH para mantener el medio a un pH apropiado; y

para los medios sólidos o semisólidos, eventualmente un agente gelificante (por ejemplo el agar, la gelatina o la agarosa).

La adición de factores de crecimiento particulares y/o de nutrimientos diversos permite reforzar los atributos de componente nutritivo e incrementar el poder fertilizante del medio. Se habla entonces de medio “enriquecido”. La adición de estos factores de crecimiento y/o de estos nutrimientos se puede realizar mediante compuestos o composiciones químicamente definidos, o bien mediante composiciones complejas (por ejemplo sangre fresca, sueros, extracto de levadura, huevo entero, yema de huevo, peptonas, etc.).

Un medio de cultivo se denomina selectivo cuando comprende al menos un agente selectivo que permite a dicho medio favorecer el crecimiento de un microorganismo diana o de un grupo diana de microorganismos, en lugar de el de la flora acompañante. Se trata esencialmente de compuestos con efectos antibióticos y/o antifúngicos, y que presentan una especificidad de toxicidad (toxicidad más baja para los microorganismos dianas que para la flora acompañante).

Por “muestra biológica” se entiende una muestra clínica procedente de una extracción de origen humano o animal, o una muestra alimentaria procedente de cualquier tipo de alimento. Esta muestra biológica puede ser líquida o sólida y se puede citar de manera no limitativa una muestra clínica de sangre, de plasma, de orina, de heces, extracciones de nariz, de garganta, de piel, de heridas, de líquido cefalorraquídeo, de líquido broncoalveolar, de expectoración, una muestra alimentaria de agua, de bebidas tales como la leche, un zumo de frutas, de yogur, de carne, de huevos, de verduras, de mahonesa, de queso, de pescado, etc., una muestra alimentaria procedente de una alimentación destinada a los animales, tal como especialmente una muestra procedente de harinas animales. Con fines de simplificación de vocabulario, se utilizará indiferentemente las expresiones “muestra biológica” y “extracción biológica”.

La presente invención se refiere así a un procedimiento (método) de enriquecimiento y de cultivo selectivo de micobacterias contenidas en una muestra biológica, en la que se inocula todo o parte de dicha muestra en/sobre un medio de cultivo que comprende un componente nutritivo propicio para el desarrollo y al crecimiento de micobacterias, caracterizado por que dicho medio de cultivo comprende también, a título de agentes selectivos, al menos el hidrocloruro de 9-cloro-9-(4’-dietilamino)fenil-9,10-dihidro-10-fenilacridina y un agente apto para inhibir unas bacterias Pseudomonas aeruginosa.

La presente invención se refiere al principio general de incorporar, en composiciones de medios de cultivo considerados para el cultivo de micobacterias, del 9-cloro-9-(4’-dietilamino)fenil-9,10-dihidro-10-fenilacridina, para incrementar la selectividad frente a micobacterias. Este agente selectivo se conoce también bajo la denominación genérica C-390 (CAS 77769-31-4). Hasta ahora esencialmente utilizado con fines de cultivo selectivo de Pseudomonas aeruginosa (US 4,263,398 y Campbell et al. - Journal of Clinical Microbiology; 1988, 1910-1912) o de aislamiento de genomovars del complejo Burkholderia cepacia (Vermis et al., - Systematic and Applied Microbiology, 2003 (26) 595-600), los inventores han demostrado que la utilización de tal compuesto en los medios de cultivo podían también conducir a un buen aislamiento de las micobacterias y una buena eliminación de la flora acompañante, especialmente de los microorganismos que pertenecen a los géneros Pseudomonas, Enterobacteriaceae, Streptococcus, Burkholderia, Stenotrophomonas, Staphylococcus, Enterococcus, Achromobacter, Acinetobacter, Pandoraea, Bacillus, Elizabethkingia miricola, Haemophilus, Moraxella, Neisseria, Aspergillus, Scedosporium, Candida y Geosmithia.

Asimismo, los inventores han constatado que el C-390 confería al medio de cultivo un ligero color azulado suplementario que puede mejorar notablemente la visualización y la detección visual de las colonias que crecen en estos medios.

Ventajosamente, y según la invención, la concentración en C-390 del medio de cultivo utilizado para realizar el procedimiento de enriquecimiento y de cultivo selectivo según la invención está comprendida entre 2 mg/l y 1000 mg/l, preferiblemente entre, del orden de 4 mg/l y del orden de 256 mg/l, y más preferiblemente entre, del orden de 8 mg/l y del orden de 128 mg/l.

A título de ejemplos de agentes aptos para inhibir unas bacterias Pseudomonas aeruginosa, se puede citar especialmente el metanosulfonato de colistina, la fosfomicina, el ácido nalidíxico, el aztreonam, la cefsulodina y el mangrolido A.

Ventajosamente, y según la invención, se puede utilizar también en dicho medio de cultivo, un agente apto para inhibir las bacterias Burkholderia cepacia, preferiblemente un agente seleccionado entre la fosfomicina, el aztreonamo y el mangrolido A.

Según un modo preferido de realización de la invención, dicho medio de cultivo comprende además al menos un agente selectivo seleccionado entre:

- la amfotericina B, especialmente a una concentración preferiblemente comprendida entre 1 mg/l y 200 mg/l, y más preferiblemente aún entre 2 mg/l y 50 mg/l;

- el ácido nalidíxico, especialmente a una concentración preferiblemente comprendida entre 5 mg/l y 200 mg/l, y más preferiblemente aún entre 15 mg/l y 100 mg/l;

- la vancomicina, especialmente a una concentración preferiblemente comprendida entre 1 mg/l y 50 mg/l, y más preferiblemente aún entre 2 mg/l y 20 mg/l;

- el metanosulfonato de colistina, especialmente a una concentración preferiblemente comprendida entre 10 mg/l y 200 mg/l, y más preferiblemente aún entre 15 mg/l y 150 mg/l;

- la fosfomicina, especialmente a una concentración preferiblemente comprendida entre 100 mg/l y 3000 mg/l, y más preferiblemente aún entre 200 mg/l y 2000 mg/l; et

- el verde de malaquita, especialmente a una concentración preferiblemente comprendida entre 0,05 mg/l y 2 mg/l, y más preferiblemente aún entre 0,2 mg/l y 1 mg/l.

Según un modo preferido de la invención, dicho medio de cultivo comprende, a título de agentes selectivos adicionales:

- la amfotericina B, a una concentración comprendida entre 2 mg/l y 50 mg/l,

- el metanosulfonato de colistina, a una concentración comprendida entre 15 mg/l y 150 mg/l,

- la fosfomicina, a una concentración comprendida entre 200 mg/l y 2000 mg/l.

Según un modo preferido de la invención, en complemento a la fosfomicina, dicho medio de cultivo comprende ventajosamente glucosa-6-fosfato, en particular a una concentración preferiblemente comprendida entre 10 mg/l y 50 mg/l.

Según un aspecto particular, la presente invención tiene como objetivo mejorar los métodos de cultivo y/o de aislamiento de micobacteria que actualmente en curso, interviniendo sobre la composición de los medios de cultivos habituales (tales como unos medios Middlebrook, el medio Lowenstein-Jensen, el medio Columbia, el medio BCSA) para incrementar la selectividad inhibiendo las no-micobacterias. A este respecto, la presente invención propone perfeccionar la composición de estos medios de cultivo con una aportación de C-390, y eventualmente otros agentes selectivos como enunciados anteriormente. Asimismo, la presente invención propone mejorar la fertilidad gracias a la aportación de diversos nutrimientos tales como: el glicerol, un suplemento a base de ácido oleico, de albumina, de dextrosa y de catalasa (o suplemento OADC), el carbón activo, la sangre fresca, un extracto de levadura, el alfacetoglutarato, la caseína, el piruvato, unas peptonas, el amaranto, la yema de huevo, ARN, estearato de polioxietileno, tiloxapol.

En este contexto, el procedimiento de enriquecimiento y de cultivo selectivo de micobacterias según la invención se realiza ventajosamente con un medio de cultivo cuyo componente nutritivo recoge el de un medio de cultivo seleccionado entre:

- un medio Middlebrook (en particular uno de los medios Middlebrook 7H9, 7H10 y 7H11) eventualmente complementado con glicerol y/o un suplemento OADC;

- un medio Lowenstein-Jensen;

- un medio Columbia, eventualmente complementado con un suplemento OADC y/o sangre fresca, especialmente sangre de caballo; y

- un medio BCSA.

Según un modo aún más preferido, el procedimiento de enriquecimiento y de cultivo selectivo de micobacterias según la invención se lleva a cabo con un medio de cultivo que comprende un componente nutritivo que recoge el de un medio Middlebrook, complementado con:

- glicerol, especialmente a una concentración preferiblemente comprendida entre 2 ml/l y 20 ml/l,

- un suplemento OADC, especialmente a una concentración preferiblemente comprendida entre 50 ml/l y 200 ml/l, y eventualmente

- uno o varios nutrimientos seleccionados entre: la sangre fresca, un extracto de levadura, el alfa-cetoglutarato, la caseína, el piruvato, unas peptonas, el amaranto, la yema de huevo, ARN, el estearato de polioxietileno, el tiloxapol. Ventajosamente y según la invención, dicho suplemento OADC es una composición acuosa que comprende 50 g/l de albumina bovina, 20 g/l de glucosa, 0,04 g/l de catalasa y 0,5 g/l de ácido oleico.

Ventajosamente y según este modo preferido de la invención, el procedimiento de enriquecimiento y de cultivo selectivo de micobacterias según la invención se lleva a cabo con un medio de cultivo que comprende un componente nutritivo que recoge el de un medio Middlebrook, complementado con:

- un suplemento OADC, especialmente a una concentración preferiblemente comprendida entre 50 ml/l y 200 ml/l, y

- un extracto de levadura, especialmente a una concentración preferiblemente comprendida entre 0,1 g/l y 20 g/l.

Ventajosamente y según la invención, dicho procedimiento se aplica más particularmente al enriquecimiento y al cultivo selectivo de las micobacterias que pertenecen a las especies M. abscessus, M. bolletii, M. massiliense, M. chelonae, M. immunogenum, M. salmoniphilum, M. avium, M. tuberculosis, M. intracellulare, gordonae, M. kansasii y M. fortuitum.

Ventajosamente y según la invención, las colonias de micobacterias que se desarrollan sobre dicho medio de cultivo se localizan visualmente utilizando unos sustratos sintéticos cromogénicos y/o fluorogénicos específicos de actividades enzimáticas expresadas por las micobacterias buscadas. A este respecto, se puede citar el 4-metilumbeliferil-beta-D-glucósido que permite el marcado de las colonias que expresan una actividad beta-glucosidasa.

La presente invención se extiende también a un medio de cultivo adaptado para la realización de un procedimiento de enriquecimiento y de cultivo selectivo de micobacterias según la invención. En este caso, un medio de cultivo según la invención comprende un componente nutritivo propicio para el desarrollo y al crecimiento de micobacterias, y se caracteriza por que comprende también, a título de agentes selectivos, hidrocloruro de 9-cloro-9-(4'-dietilamino)fenil-9,10-dihidro-10-fenilacridina y un agente apto para inhibir unas bacterias Pseudomonas aeruginosa, y a título de agentes selectivos adicionales:

- la amfotericina B, a una concentración comprendida entre 2 mg/l y 50 mg/l;

- el metanosulfonato de colistina, a una concentración comprendida entre 15 mg/l y 150 mg/l;

- la fosfomicina, a una concentración comprendida entre 200 mg/l y 2000 mg/l, y du glucosa-6-fosfato, a una concentración comprendida entre 10 mg/l y 50 mg/l.

Según un modo particular de realización, dicho medio de cultivo está libre de cristal violeta.

Se describe también un medio de cultivo que comprende un componente nutritivo propicio para el desarrollo y el crecimiento de micobacterias y, a título de agentes selectivos, hidrocloruro de 9-cloro-9-(4'-dietilamino)fenil-9,10-dihidro-10-fenilacridina y un agente apto para inhibir unas bacterias Pseudomonas aeruginosa. Dicho medio de cultivo se caracteriza también por todo o parte de las características técnicas siguientes:

- la concentración en C-390 está comprendida entre 2 mg/l y 1000 mg/l, preferentemente entre del orden de 4 mg/l y del orden de 256 mg/l, y más preferiblemente aún entre del orden de 8 mg/l y del orden de 128 mg/l;

- dicho medio de cultivo comprende al menos un agente selectivo adicional (diferente de C-390 y el agente seleccionado para inhibir Pseudomonas aeruginosa), seleccionado entre:

- el metanosulfonato de colistina, especialmente a una concentración preferiblemente comprendida entre 10 mg/l y

200 mg/l, y más preferiblemente aún entre 15 mg/l y 150 mg/l; y

- la fosfomicina, especialmente a una concentración preferiblemente comprendida entre 100 mg/l y 3000 mg/l, más preferiblemente aún entre 200 mg/l y 2000 mg/l, y eventualmente du glucosa-6-fosfato, especialmente a una concentración preferiblemente comprendida entre 10 mg/l y 50 mg/l;

dicho medio de cultivo comprende a título de agentes selectivos adicionales:

- la amfotericina B, a una concentración comprendida entre 2 mg/l y 50 mg/l;

- la fosfomicina, a una concentración comprendida entre 200 mg/l y 2000 mg/l, y la glucosa-6-fosfato, especialmente a una concentración preferiblemente comprendida entre 10 mg/l y 50 mg/l;

dicho medio de cultivo comprende un componente nutritivo que recoge el de un medio de cultivo seleccionado entre: - un medio Middlebrook, eventualmente complementado con glicerol y/o un suplemento OADC;

- un medio Lowenstein-Jensen;

un medio Columbia, eventualmente complementado con un suplemento OADC y/o sangre fresca, especialmente sangre de caballo; y

- un medio BCSA;

dicho medio de cultivo comprende un componente nutritivo que recoge el de un medio Middlebrook, complementado con:

- uno o varios nutrimientos seleccionados entre: la sangre fresca, un extracto de levadura, el alfa-cetoglutarato, la caseína, el piruvato, unas peptonas, el amaranto, la yema de huevo, ARN, el estearato de polioxietileno, el tiloxapol. Ventajosamente, la presente invención se refiere a un medio de cultivo que comprende un componente nutritivo que consiste en un medio Middlebrook 7H9, complementado con:

- glicerol, a una concentración comprendida entre 2 ml/l y 20 ml/l,

- un suplemento OADC, a una concentración comprendida entre 50 ml/l y 200 ml/l, y

- un extracto de levadura, a una concentración comprendida entre 0,1 g/l y 20 g/l;

y que comprende a título de agentes selectivos:

- C-390, a una concentración comprendida entre 2 mg/l y 50 mg/l,

- amfotericina B, a una concentración comprendida entre 2 mg/l y 50 mg/l,

- metanosulfonato de colistina, a una concentración comprendida entre 15 mg/l y 150 mg/l,

- fosfomicina, a una concentración comprendida entre 200 mg/l y 2000 mg/l, acompañada de glucosa-6-fosfato, a una concentración comprendida entre 10 mg/l y 50 mg/l.

Según un modo ventajoso de realización de la invención, la composición de dicho medio de cultivo puede incluir uno o varios marcadores aptos para permitir una detección y/o identificación visual de las micobacterias que se desarrollan en o sobre dicho medio. Puede tratarse especialmente de sustratos enzimáticos sintéticos, con propiedades cromogénicas y/o fluorogénicas.

Este documento se refiere también a un método, a un procedimiento de enriquecimiento y de cultivo selectivo de microbacterias, a una utilización del C-390 con fines de cultivo y/o de aislamiento de micobacterias, así como a un medio de cultivo, caracterizados por todo o parte de las características técnicas expuestas anteriormente o a continuación.

Otros objetivos, características y ventajas de la invención aparecerán a la vista de la descripción siguiente y de los ejemplos desarrollados a continuación, que tienen como objetivo facilitar la comprensión de la invención y su realización. Estos ejemplos se dan a título explicativo y no limitan el alcance de la invención.

Ejemplos: Elaboración y evaluación de medios selectivos según la invención

1/ - Selección de una composición “de base” para el cultivo de las micobacterias

Se han ensayado y comparado diferentes composiciones de medios de cultivo, conocidas de la bibliografía como fértiles para las micobacterias, por su capacidad para hacer crecer las micobacterias. Algunos fueron enriquecidos previamente. Los medios ensayados son los siguientes:

- medio A: agar Middlebrook,

- medio B: agar Midllebrook enriquecido en glicerol (4 ml/l),

- medio C: agar Middlebook con Tween 80 (1 g/l),

- medio D: agar Midllebrook enriquecido al mismo tiempo con glicerol (4 ml/l) y un suplemento OADC (100 ml/l), - medio E: agar Midllebrook complementado/enriquecido al mismo tiempo con Tween 80 y le suplemento OADC, - medio F: gelosa Columbia (Oxoid),

- medio G: gelosa Columbia (Oxoid), enriquecido con el suplemento OADC,

- medio H: agar Columbia con sangre,

- medio I: medio BCSA (bioMérieux, Francia).

a) Preparación de los medios A a E

se han preparado los medios referenciados A a E a partir de una solución madre que consiste en un caldo de cultivo Middlebrook 7H9 diez veces concentrado (Middlebrook 7H910X), que tiene por composición:

- sulfato de amonio (5 g/l),

- ácido L-glutámico (5 g/l),

- fosfato disódico (25 g/l),

- fosfato monopotásico (10 g/l),

- citrato de sodio (1 g/l),

- sulfato de magnesio (0,5 g/l),

- cloruro de calcio (0,005 g/l),

- sulfato de zinc (0,01 g/l),

- sulfato de cobre (0,01 g/l),

- amonio férrico citrato (0,4 g/l),

- piridoxina (0,01 g/l), y

- biotina (0,005 g/l).

El pH de este caldo se ha ajustado a 6,6 ± 0,2. El caldo se ha esterilizado después en autoclave a 116°C durante 10 minutos. Se conserva en refrigerador hasta su utilización.

Para obtener el medio A, se han añadido 50 ml de caldo a 450 ml de agua desionizada. Se añaden 5 g de agar bacteriológico al conjunto para obtener un agar Middlebrook. El conjunto se ha esterilizado después en autoclave a 116°C, durante 10 minutos.

Los medios B, C, D y E se han preparado de manera similar al medio A, y contienen además:

- glicerol (4 ml/l) y eventualmente un suplemento a base de ácido oleico, de albumina, de dextrosa y de catalasa (suplemento OADC; 100 ml/l),

o bien:

- Tween 80 (1 g/l) y eventualmente un suplemento OADC (100 ml/l).

b) Medios F a I

Los medios F, H y I son unos medios disponibles en el comercio.

El medio G se ha preparado de manera similar al medio F, y contiene además el suplemento OADC (100 ml/l). c) Evaluación de la fertilidad de los medios A a I frente a micobacterias

La fertilidad de los medios A a I se ha evaluado mediante 20 cepas de micobacteria:

- 12 cepas de Mycobacterium abscessus,

- 3 cepas de Mycobacterium bolletii,

- 5 cepas de Mycobacterium massiliense.

Estas cepas, inicialmente conservadas a -20°C en glicerol, se descongelan y cultivan, en un primer tiempo sobre gelosa Columbia con sangre de caballo (5%). Cada cepa se pone en suspensión entonces en 1 ml de solución salina (0,85%) hasta alcanzar una turbiedad equivalente al estándar McFarland 0,5 (equivalente a aproximadamente 1,5.108 CFU/ml).

Para las micobacterias que tienden a aglutinarse, las células se dispersan en vórtice, en un tubo que contiene 3 bolas de vidrio de 3 mm de diámetro, durante 10 minutos.

Se inocula un alícuota de 1 pl de cada suspensión de micobacterias sobre cada uno de los medios de cultivo a evaluar, y extendidas a fin de obtener unas colonias aisladas. Los cultivos se incuban a 30°C. El crecimiento de las colonias se observa durante 7 días.

Los resultados obtenidos se resumen en la tabla 1 siguiente.

Tabla 1

2/ - Evaluación del efecto de diversos nutrimientos sobre el crecimiento de las micobacterias

En base a la formulación del medio D anteriormente ensayado, se han evaluado los efectos de diversos nutrimientos sobre el cultivo de las micobacterias: carbón activo, sangre de caballo, extracto de levadura, alfa-cetoglutarato, caseína, piruvato, peptonas, amaranto, emulsión de yema de huevo, ARN (SIGMA, ref. R6625-25G), estearato de polioxietileno, tiloxapol.

De manera muy similar al medio D, se han preparado los medios siguientes (anotados J a V):

- Medio J: Medio D carbón activo (2 g/l),

- Medio K: Medio D sangre de caballo 5% (50 ml/l),

- Medio L: Medio D extracto de levadura (4 g/l),

- Medio M: Medio D alfa-cetoglutarato (15 g/l),

- Medio N: Medio D caseína (1 g/l),

- Medio O: Medio D piruvato de sodio (7 g/l),

- Medio P: Medio D peptona (10 g/l),

- Medio K: Medio D amaranto (0,04 g/l),

- Medio R: Medio D emulsión de yema de huevo (33 ml/l),

- Medio S: Medio D ARN (0,05 g/l),

- Medio T: Medio D estearato de polioxietileno (0,1 g/l)

- Medio U: Medio D tiloxapol (5 ml/l)

- Medio V: Medio D emulsión de yema de huevo (33 ml/l) carbón activo (4 g/l)

La fertilidad de estos medios se evalúa mediante unas 20 mismas cepas de micobacterias utilizadas en el ensayo anteriormente descrito, y tratada de manera idéntica antes de la inoculación.

Los cultivos se incuban a 30°C. El crecimiento de las colonias se sigue durante 7 días. La tabla 2 siguiente resume las constataciones realizadas en los días 3 y 7 de cultivo.

Tabla 2

3/ - Evaluación del efecto de diferentes agentes selectivos frente a micobacterias

En base a la formulación del medio L anteriormente desarrollada y ensayada, los efectos de diferentes agentes selectivos se han evaluado por su nivel de selectividad frente a micobacterias: anfotericina B (un antifúngico), ácido nalidíxico, vancomicina, metanosulfonato de colistina, C-390 (BIOSYNTH, Suiza), fosfomicina y verde malaquita, a diferentes concentraciones.

La tabla 3 siguiente resume los resultados de esta evaluación, realizada sobre las 20 cepas de micobacteria utilizadas en los ensayos anteriormente descritos, y sobre 95 cepas de microorganismos que no pertenecen al género Mycobacterium, después de 7 días de incubación. Entre las 95 cepas evocadas, se cuentan:

- 50 cepas de Pseudomonas aeruginosa,

- 10 otras cepas de bacterias no-fermentarias:

- 1 cepa de Achromobacter xylosoxidans,

- 1 cepa de Acinetobacter sp.,

- 1 cepa de Burkholderia multivorans,

- 1 cepa de Burkholderia cenocepacia,

- 1 cepa de Burkholderia cepacia,

- 1 cepa de Burkholderia contaminans,

- 1 cepa de Pandoraea apista,

- 1 cepa de Pandoraea pnomenusa,

2 cepas de Stenotrophomonas maltophilia,

- 7 cepas de entérobacterias:

- 1 cepa de Escherichia coli,

- 1 cepa de Klebsiella pneumoniae,

- 1 cepa de Providentia rettgeri,

- 1 cepa de Enterobacter cloacae,

- 1 cepa de Enterobacter aerogenes,

- 1 cepa de Serratia marcescens,

- 1 cepa de Citrobacterfreundii,

- 10 cepas de especies de bacteria Gram positiva:

- 2 cepas de Staphylococcus aureus,

- 1 cepa de Staphylococcus epidermidis,

- 1 cepa de Streptococcus pyogenes,

- 1 cepa de Streptococcus pneumoniae,

- 1 cepa de Streptococcus salivarius,

- 1 cepa de Streptococcus gordonii,

- 1 cepa de Enterococcus faecium,

- 1 cepa de Enterococcus faecalis, y

- 1 cepa de Bacillus subtilis.

- 8 cepas de hongos/levaduras:

- 1 cepa de Candida albicans,

- 1 cepa de Candida glabrata,

- 2 cepas de Aspergillus fumigatus,

- 1 cepa de Aspergillus terreus,

- 1 cepa de Scedosporium apiospermum,

- 1 cepa de Scedosporium prolificans,

- 1 cepa de Rasamsonia (Geosmithia) argillacea.

En esta tabla 3, los resultados se presentan en número y en porcentaje de cepas que han demostrado un crecimiento sobre el medio considerado después de 7 días de cultivo. Las menciones NS y NT significan respectivamente “no significativo” (inhibición de bacterias por la enfotericina B) y “no ensayado” (acción de los antibacterianos sobre las levaduras y hongos).

Tabla 3

4/ - Optimización de los medios selectivos para micobacterias

A la vista de los datos anteriores, se han elaborado dos nuevos medios de cultivo selectivos, anotados medio W y medio X. Estos medios se desarrollaron a partir de la composición del medio L, un medio de cultivo enriquecido tal como se ha descrito anteriormente, a la cual una combinación particular de agentes selectivos se ha añadido. La composición de dichos medios selectivos se resume de la siguiente manera:

Estos dos medios se han ensayado sobre 188 cepas de microorganismos:

- 98 cepas de micobacterias no-tuberculosas:

- 52 cepas de Mycobacterium abscessus,

- 3 cepas de Mycobacterium bolletii,

- 34 cepas de Mycobacterium chelonae,

- 1 cepa de Mycobacterium immunogenum,

- 6 cepas de Mycobacterium massiliense,

- 2 cepas de Mycobacterium salmoniphilum,

- 94 cepas de microorganismos que no pertenecen al género Mycobacterium:

- 54 cepas de Pseudomonas aeruginosa,

- otras 15 cepas de bacterias no-fermentarias:

- 1 cepa de Achromobacter sp1,

- 1 cepa de Achromobacter xylosoxidans,

- 1 cepa de Acinetobacter sp.,

- 1 cepa de Acinetobacter baumannii,

- 1 cepa de Burkholderia cepacia,

- 1 cepa de Burkholderia contaminans,

- 1 cepa de Burkholderia multivorans,

- 1 cepa de Burkholderia stabilis,

- 1 cepa de Elizabethkingia miricola,

- 1 cepa de Pandoraea apista,

- 1 cepa de Pandoraea pnomenusa,

- 4 cepas de Stenotrophomonas maltophilia,

- 7 cepas de entérobacterias (las mismas que las anteriormente citadas),

- 10 cepas de bacterias a Gram positivo (las mismas que las anteriormente citadas),

- 8 cepas de hongos/levaduras (las mismas que las anteriormente citadas).

En esta tabla 4, los resultados se presentan en número y en porcentaje de cepas que han demostrado un crecimiento sobre el medio considerado y después de 7 días de cultivo.

Tabla 4

5/ - Validación de la composición del medio X para el cultivo y la selección de Mycobacterium tuberculosis

En base a la composición del medio X anterior, se ha formulado un medio de cultivo selectivo líquido. Este medio X líquido (sin agar) se ha ensayado para la detección de micobacterias, en particular de Mycobacterium tuberculosis, en el ámbito de un análisis de muestras de esputo que proviene de 32 pacientes que no padecen mucoviscidosis, y de 56 pacientes que padecen mucoviscidosis.

Para hacer esto, se ha utilizado el sistema de detección microbiana automatizado BacT/ALTER® 3D (bioMérieux, Francia). Se incubaron unos frascos que contienen el medio X líquido (o caldo X) en el dispositivo automatizado de detección durante al menos 28 días, y comparado con el reactivo BacT/ALERT® MP clásicamente preconizado para la detección de micobacterias.

La composición de este reactivo corresponde esquemáticamente a un medio Middlebrook 7H9 suplementado de ácido oleico, de glicerol, de suero albuminobovino, de amaranto y de un cóctel de antibióticos (anfotericina B, azlocilina, ácido nalidíxico, polimixina B, trimetoprima y vancomicina).

Mediante un examen con microscopio y una coloración con auramina, se ha puesto en evidencia la presencia de bacilos ácido-alcohol-resistentes en las 32 muestras de esputo recogidas de los pacientes que no padecen mucoviscidosis. Previamente a su inoculación en los frascos BacT/ALERT®, que contienen el caldo BacT/ALERT® MP o bien el Caldo X, estas 32 muestras se trataron con sosa a fin de eliminar unas especies no micobacterianas presentes en las muestras, o al menos reducir la viabilidad, conforme a los métodos estándares británicos. Se prepararon así 64 frascos BacT/ALERT® y después se pusieron a incubar a 35°C en un dispositivo automatizado BacT/ALERT®.

Tratándose de las 56 muestras recogidas de los pacientes que padecen mucoviscidosis, éstas se han sometido a dos protocolos de descontaminación distintos, un tratamiento con ácido y un tratamiento con sosa, conforme a los métodos estándares británicos, antes de su inoculación en los frascos de BacT/ALERT®. Se han preparado así 224 frascos:

- 56 frascos que contienen el caldo BacT/ALERT® MP, en el que se inocula una muestra previamente tratada con ácido,

- 56 frascos que contienen el caldo BacT/ALERT® MP, en el que se inocula una muestra previamente tratada con sosa,

- 56 frascos que contienen el Caldo X, en el que se inocula una muestra previamente tratada con ácido,

- 56 frascos que contienen el Caldo X, en el que se inocula una muestra previamente tratada con sosa.

Los resultados de estos diferentes cultivos se resumen en las tablas 5, 6 y 7 siguientes.

Las tablas 5 y 6 dan información sobre la naturaleza de las micobacterias identificadas en las muestras (recogidas respectivamente de los pacientes que no padecen mucoviscidosis y de los pacientes que padecen mucoviscidosis), y el número de frascos en los que se han detectado.

La tabla 7 presenta los tiempos medios de detección (en días) para cada una de las especies de micobacterias detectadas e identificadas, en función del medio de cultivo utilizado.

Tabla 5

Tabla 6

Tabla 7

En totral, se han recuperado 39 aislados de micobacterias a partir de las 88 extracciones iniciales. Se han recuperado 34 aislados mediante unos frascos de reactivo “estándar” BacT/ALERT® MP (es decir una sensibilidad del 87%), frente a 38 con los frascos de caldo X según la invención (es decir una sensibilidad del 97%). Estos datos muestran que el medio selectivo propuesto por la presente invención es relativamente eficaz para el cultivo, el enriquecimiento y el aislamiento de las micobacterias.

6/ - Preparación y validación de un medio selectivo, medio Y

a) composición y preparación del medio Y

La composición del medio Y es la siguiente (para aproximadamente 1600 ml de composición):

- almidón de patata (30 g),

- asparagina (3,6 g),

- fosfato monopotásico (2,4 g),

- citrato de magnesio (0,6 g),

- sulfato de magnesio (0,24 g),

- homogenizado de huevos enteros (11),

- glicerol (12 ml), y

- C-390 (51,2 mg).

Esta composición corresponde a la de un medio Lowenstein-Jensen, a la cual se añade C-390, para obtener una concentración final de 32 mg/l. A partir de ésta, se prepara el medio Y siguiendo un procedimiento idéntico a aquel de un medio Lowenstein-Jensen (véase Handbook of Microbiological Media, Ronald M. Atlas, 4a edición, 2010).

b) Evaluación breve de la fertilidad y de la selectividad del medio Y frente a micobacterias

El Medio Y, formulado en tubos inclinados, se ha ensayado para el cultivo de diversas cepas bacterianas:

- 1 cepa de Mycobacterium fortuitum (inóculo calibrado a 0,5 McFarland y diluido al 1/10000),

- 4 cepas de Staphylococcus aureus (inóculo calibrado a 0,5 McFarland y diluido al 1/100), y

- 3 cepas de Pseudomonas aeruginosa (inóculo calibrado a 0,5 McFarland y diluido al 1/100).

El crecimiento de estas cepas, incubadas a 37°C, se ha seguido día tras día. Los resultados obtenidos, presentados en porcentaje de recubrimiento de la pendiente, son compilados en la tabla 8 siguiente.

Los resultados de estos primeros ensayos concuerdan relativamente bien con los resultados constatados con el medio X, formulado en base a una composición Middlebrook, a saber un buen crecimiento de la cepa micobacteriana, una inhibición total de las cepas de S. aureus, y una inhibición parcial con una selectividad diferencial frente a las cepas de P. aeruginosa.

Tabla 8

El medio Y, formulado en tubos inclinados, también se ha ensayado para el cultivo de cepas micobacterianas de crecimiento lento:

- 1 cepa de Mycobacterium tuberculosis,

- 1 cepa de Mycobacterium bovis, y

- 1 cepa de Mycobacterium gordonae.

Estas pruebas se realizaron con unos inóculos calibrados a 0,5 McFarland y diluidos al 1/10000.

Los resultados obtenidos, presentados en porcentajes de recubrimiento de la pendiente, se compilaron en la tabla 9 siguiente, y se compararon con los de un cultivo sobre el medio Lowenstein-Jensen.

Tabla 9

7/ - Datos complementarios: Sensibilidad de diferentes bacterias y de diferentes especies fúngicas frente a C-390 Se ha efectuado una evaluación de la sensibilidad a C-390 de diferentes organismos susceptibles de infectar las vías respiratorias. Esta evaluación se ha realizado utilizando el medio W del ejemplo 4, que contiene una concentración variable de C-390. La tabla 10 siguiente reúne las observaciones recogidas sobre la intensidad de crecimiento de las cepas ensayadas en función de la concentración en C-390 del medio. Las abreviaturas NG (“no growth”) y (Tr (“traces”) significan que no se ha constatado ningún crecimiento o solamente algunas trazas poco significativas.

Tabla 10

Claims

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento de enriquecimiento y de cultivo selectivo de micobacterias contenidas en una muestra biológica, en el que se inocula todo o parte de dicha muestra en/sobre un medio de cultivo que comprende un componente nutritivo propicio para el desarrollo y el crecimiento de micobacterias,

caracterizado por que dicho medio de cultivo comprende también, a título de agentes selectivos, al menos el hidrochloruro de 9-cloro-9-(4'-dietilamino)fenil-9,10-dihidro-10-fenilacridina (o C-390) y un agente apto para inhibir unas bacterias Pseudomonas aeruginosa.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por que la concentración en C-390 de dicho medio de cultivo está comprendida entre 2 mg/l y 1000 mg/l.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 o 2, caracterizado por que dicho agente apto para inhibir unas bacterias Pseudomonas aeruginosa se selecciona entre: el metanosulfonato de colistina, la fosfomicina, el ácido nalidíxico, el aztreonamo, la cefsulodina y el mangrolido A.

4. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que dicho medio de cultivo comprende también un agente apto para inhibir las bacterias Burkholderia cepacia, preferiblemente seleccionado entre la fosfomicina, el aztreonamo el mangrolido A.

5. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que dicho medio de cultivo comprende además al menos un agente selectivo adicional seleccionado entre: la anfotericina B, el ácido nalidíxico, la vancomicina, el metanosulfonato de colistina, la fosfomicina y el verde de malaquita.

6. Procedimiento según la reivindicación 5, caracterizado por que dicho medio de cultivo comprende a título de agentes selectivos adicionales:

- la anfotericina B, a una concentración comprendida entre 2 mg/l y 50 mg/l;

- la fosfomicina, a una concentración comprendida entre 200 mg/l y 2000 mg/l.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, caracterizado por que dicho medio de cultivo comprende también, en complemento de la fosfomicina, la glucosa-6-fosfato, a una concentración comprendida entre 10 mg/l y 50 mg/l.

8. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado por que dicho medio de cultivo comprende un componente nutritivo que recoge el de un medio de cultivo seleccionado entre:

- un medio de cultivo Middlebrook,

- un medio Lowenstein-Jensen,

- un medio Columbia,

- un medio BCSA.

9. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado por que dicho medio de cultivo comprende un componente nutritivo que recoge el de un medio Middlebrook, complementado con:

- glicerol,

- un suplemento OADC,

- uno o varios nutrimientos seleccionados entre: la sangre fresca, un extracto de levadura, el alfa-cetoglutarato, la caseína, el piruvato, unas peptonas, el amaranto, la yema de huevo, ARN, el estearato de polioxietileno, el tiloxapol.

10. Procedimiento según la reivindicación 9, caracterizado por que dicho medio de cultivo comprende un componente nutritivo que recoge el de un medio Middlebrook, complementado con:

- glicerol, a una concentración comprendida entre 2 ml/l y 20 ml/l,

- un extracto de levadura, a una concentración comprendida entre 0,1 g/l y 20 g/l.

11. Medio de cultivo que comprende un componente nutritivo propicio para el desarrollo y el crecimiento de micobacterias y, a título de agentes selectivos, el hidrocloruro de 9-cloro-9-(4'-dietilamino)fenil-9,10-dihidro-10-fenilacridina (o C-390), un agente apto para inhibir unas bacterias Pseudomonas aeruginos, y a título de agentes selectivos adicionales:

- la anfotericina B, a una concentración comprendida entre 2 mg/l y 50 mg/l;

- la fosfomicina, a una concentración comprendida entre 200 mg/l y 2000 mg/l, y glucosa-6-fosfato, a una concentración comprendida entre 10 mg/l y 50 mg/l.

12. Medio de cultivo según la reivindicación 11, caracterizado por que comprende un componente nutritivo que recoge el de un medio de cultivo seleccionado entre:

- un medio Middlebrook,

- un medio Lowenstein-Jensen,

- un medio Columbia,

- un medio BCSA.

13. Medio de cultivo según la reivindicación 11 en el que, el hidrocloruro de 9-cloro-9-(4'-dietilamino)fenil-9,10-dihidro-10-fenilacridina está en una concentración comprendida entre 2 mg/l y 1 000 mg/l, y dicho componente nutritivo propicio para el desarrollo y el crecimiento de micobacterias consiste en un medio Middlebrook 7H9, complementado con:

- glicerol, a una concentración comprendida entre 2 ml/l y 20 ml/l,