CN107208127B

CN107208127B - 分枝杆菌的富集和选择性培养

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Publication number: CN107208127B
Application number: CN201680008539.9A
Authority: CN
Inventors: S·奥伦加; A·佩里; J·佩里; C·普里斯
Original assignee: Biomerieux SA
Current assignee: Biomerieux SA
Priority date: 2015-02-06
Filing date: 2016-02-04
Publication date: 2022-01-11
Anticipated expiration: 2036-02-04
Also published as: FR3032448A1; CN114214243A; WO2016124863A1; US10597693B2; FR3032448B1; CN107208127A; EP3253885B1; ES2718576T3; EP3253885A1; PL3253885T3; US20180030500A1

Abstract

本发明涉及一种富集和选择性培养生物学样品中包含的分枝杆菌的方法，其中将全部或部分所述样品接种于包含适于分枝杆菌发展和生长的营养成分的培养基之中/之上，特征在于所述培养基包含作为选择剂的至少9‑氯‑9‑(4’‑二乙氨基)苯基‑9,10‑二氢‑10‑苯基吖啶氢氯化物(或C‑390)及能抑制铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的物质。本发明还涉及适于实施这个方法以富集和选择性培养分枝杆菌的培养基。

Description

分枝杆菌的富集和选择性培养

本发明涉及培养和分离分枝杆菌的方法。更特别地，本发明涉及可用于检测、鉴别、分离和/或分析性研究分枝杆菌、例如存在于生物学标本和样品中的那些分枝杆菌的微生物学方法和培养基。

分枝杆菌属于放线菌目(Actinomycetales)，是直线或者有时略为弯曲形状的细小杆菌。由于其具有脂质富集的细胞壁限制染料渗透，因此难以通过常规技术和染料对分枝杆菌染色。然而，一旦染色，所述分枝杆菌的染色可以抵挡酸和醇二者的脱色。为此，其被描述为“酸-醇抗性”细菌。

根据一种基本分类法，根据两种主要类别列出不同的分枝杆菌种。

第一个类别是归并了严格病原性分枝杆菌，其寄生感染动物和人类。这些分枝杆菌是造成结核(结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、非洲分枝杆菌(Mycobacterium africanum)、田鼠分枝杆菌(Mycobacterium microti)和卡氏分枝杆菌(Mycobacterium canetti))或者麻风病(麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae))的原因。

第二个类别归并了腐生或共生分枝杆菌，其通常是非致病性的。由此使用的术语是“非典型”分枝杆菌或者“非结核性”分枝杆菌(NTM)。后者普遍存在于我们的环境中，发现其散播于土壤、植物、灰尘、水和分配网络、食物等中无处不在。一些非结核性分枝杆菌通常对人类无害，而在免疫抑制对象中可以导致机会性感染，主要影响肺、皮肤和淋巴系统。

因此，从临床观点及也从卫生观点出发，无论其是否是病原性或者非结核性的，分枝杆菌的检测和/或鉴别是相当重要的。早期及特异性检测这些细菌使得可以提出关于治疗性处理、卫生消毒等的合适方案。就此而言存在各种技术，例如基因扩增(通过PCR)特定的核酸序列、抗原的免疫检测、质谱分析、微生物检测酶活性等。

无论其是什么，这些检测/鉴别方法通常需要培养待分析样品/标本中可能存在的分枝杆菌，以获得适于检测其的量。无论其是什么，这些检测/鉴别方法具有相同的障碍：分枝杆菌生长(croissance)和发展(développement)缓慢。

事实上，与其它细菌、酵母和真菌相比，病原性和腐生性分枝杆菌特征均在于相对缓慢的生长和发展。此外，在存在待研究的分枝杆菌的生物学样品中，所述分枝杆菌很少被分离；其通常污染有生长和发展快得多的伴随菌群。由于细胞分裂周期进展，样品中分枝杆菌的比例降低，由此增加了能观测和鉴别其的难度。

为了克服这种生长和发展缓慢和/或其污染其它微生物的问题，已经开发了对于分枝杆菌或者对于分枝杆菌特定种具有或多或少选择性的许多富集培养基和肉汤。

在最常用的这些中，

培养基是凝聚的(非琼脂)培养基，包含基于全蛋、马铃薯淀粉、天冬酰胺、甘油和矿物质的营养成分。这种培养基还含有孔雀石绿，以抑制伴随菌群(特别是革兰氏阴性细菌)。也提议加入青霉素和/或萘啶酸以增加其对于分枝杆菌的选择性。

相似组成的Coletsos琼脂培养基另外含有丙酮酸和谷氨酸、向日葵蓝(bleu detournesol)和明胶。

最近出现的Middlebrook 7H9、7H10和7H11培养基是半合成培养基，其具有基于氨基酸、脂肪酸、丙酮酸和矿物质盐的营养成分。这些培养基还含有过氧化氢酶和牛白蛋白(级分V)，其为分枝杆菌提供对抗可能存在于生物学样品和标本中的各种有害物质(特别是毒性过氧化物)的保护作用。Middlebrook 7H10培养基存在孔雀石绿而与Middlebrook 7H9培养基不同。Middlebrook 7H11培养基与Middlebrook 7H10培养基不同在于其富集胰腺酪蛋白胨。也设计了这三种Middlebrook培养基的许多变化方式以增加其对于分枝杆菌的选择性，例如向其中加入如下选择剂：多粘菌素、两性霉素B、萘啶酸、甲氧苄啶、阿洛西林和万古霉素。

最后，最初为了培养和检测洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacian)而开发的BCSA(洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)选择性琼脂)培养基已经被描述为特别适于分枝杆菌的发展与生长，更特别是“快速生长”分枝杆菌(Esther et al.–Journalof Clinical Microbiology；2011,1421-1425)。这是从包含酪蛋白胨、糖(乳糖和蔗糖)、酵母提取物和选择剂如庆大霉素、万古霉素、结晶紫和多粘菌素B的营养成分配制的琼脂培养基。

本发明旨在改良用于检测、鉴别和/或分离生物学样品中存在的分枝杆菌的方法和技术。为此，本发明旨在改良用于这些方法和技术中的富集肉汤和培养基的繁殖力及其对于分枝杆菌的选择性这两个方面。同样，本发明旨在提供新的富集肉汤和/培养基成分，能允许分枝杆菌的培养和增殖，且在繁殖力和/或对于分枝杆菌的选择性方面具有改良的性能水平。

在陈述本发明之前，给出如下定义以更好地理解本发明。

术语“培养基”是指包含新陈代谢的表达和/或微生物生长所需的所有元素的基质。培养基可以是固体、半固体或者液体。术语“固体基质”是指例如胶凝的基质或者凝固的基质。琼脂在培养微生物的微生物学中是常规的胶凝剂，但是也可以是使用明胶、琼脂糖或者其它天然或人工胶凝剂。

术语“富集肉汤”更特别是指液体培养基。

当培养基成分仅包含被培养的微生物的生长和增殖严格要求的化学元素时，该培养基被描述为基本培养基。如下是在其中常见的：

-水(通常是蒸馏水或者去离子水)；

-营养成分，通常包含：

-基于碳的能量来源(通常是葡萄糖)；

-钙源(例如CaCl₂)；

-氮源(例如(NH₄)₂SO₄)；

-硫源(例如(NH₄)₂SO₄)；

-镁源(例如MgCl₂)；

-铁源(例如柠檬酸铁)；

-微量元素来源(例如Cu、Zn、Co、Ni、B、Ti的盐)；

-任选将培养基维持在合适pH的pH缓冲剂；及

对于固体或半固体培养基而言任选存在的胶凝剂(例如琼脂、明胶或琼脂糖)。

加入特定生长因子和/或不同营养素使得可以加强营养成分的特性及增加培养基的繁殖能力。然后使用术语“富集的”培养基。可以通过化学限定的化合物或组合物、或者通过复杂组合物(例如新鲜血液、血清、酵母提取物、全蛋、卵黄、蛋白胨等)进行加入这些生长因子和/或这些营养素。

当培养基包含使得所述培养基促进不是伴随菌群的靶向微生物或者靶微生物群的生长的至少一种选择剂时，称之为是选择性的。这些选择剂基本是具有抗生素和/或抗真菌作用的化合物，其具有毒性特异性(对于靶微生物比对于伴随菌群的毒性更低)。

术语“生物学样品”是指来自人或动物来源标本的临床样品，或者来自任何类型食物的食物样品。这种生物学样品可以是液体或固体，非限制性地可以提及的是临床血液、血浆、尿液或粪便样品，或者鼻、咽喉、皮肤、伤口、脑脊液、支气管肺泡液或者咳出样品，来自水、饮料如奶或果汁、酸奶、肉、蛋、蔬菜、蛋黄酱、奶酪、鱼等的食物样品，得自动物饲料的食物样品，如特别是得自动物膳食的样品。为了简便词汇使用，“生物学样品”与“生物学标本”的表述无差别。

本发明因此涉及富集和选择性培养生物学样品中包含的分枝杆菌的方法，其中将全部或部分所述样品接种于包含适于分枝杆菌发展和生长的营养成分的培养基之中/之上，特征在于所述培养基还包含作为选择剂的至少9-氯-9-(4’-二乙氨基)苯基-9,10-二氢-10-苯基吖啶氢氯化物及能抑制铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的物质。

本发明基于将9-氯-9-(4’-二乙氨基)苯基-9,10-二氢-10-苯基吖啶掺入预计培养分枝杆菌的培养基组成成分中以增加所述培养基对于分枝杆菌的选择性的一般原理。也已知这种选择剂的通用名称是C-390(CAS77769-31-4)。迄今为止基本用于铜绿假单胞菌的选择性培养(US 4 263 398和Campbell et al.–Journal of Clinical Microbiology；1988,1910-1912)或者洋葱伯克霍尔德菌复合物的基因型的分离的目的(Vermis et al.,–Systematic and Applied Microbiology；2003(26)595-600)，本发明人证实在培养基中使用这种化合物也可以获得分枝杆菌的良好分离及伴随菌群的良好消除，特别是属于如下菌属的微生物：假单胞菌属(Pseudomonas)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、链球菌属(Streptococcus)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、狭长平胞属(Stenotrophomonas)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、无色杆菌属(Achromobacter)、不动杆菌属(Acinetobacter)、Pandoraea、芽孢杆菌属(Bacillus)、Elizabethkingiamiricola、嗜血菌属(Haemophilus)、摩拉克氏菌属(Moraxella)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、曲霉菌属(Aspergillus)、丝孢菌属(Scedosporium)、念珠菌属(Candida)和Geosmithia。

本发明人还注意到C-390还赋予培养基轻微的附加蓝色，其可显著改良在这些培养基上生长的菌落的显示及目视检测。

有利地及根据本发明，用于进行本发明的富集和选择性培养过程的培养基的C-390浓度为2mg/l-1000mg/l，优选为大约4mg/l-大约256mg/l、更优选为大约8mg/l-大约128mg/l。

能抑制铜绿假单胞菌的物质可以特别提及的例子由甲磺酸多粘菌素E、磷霉素、萘啶酸、氨曲南、头孢磺啶和mangrolide A组成。

有利地及根据本发明，在所述培养基中还可以使用能抑制洋葱伯克霍尔德菌的物质，优选选自磷霉素、氨曲南和mangrolide A的物质。

根据本发明一个优选的实施方案，所述培养基还包含选自如下的至少一种另外的选择剂：

-两性霉素B，特别是浓度优选为1mg/l-200mg/l，更优选为2mg/l-50mg/l；

-萘啶酸，特别是浓度优选为5mg/l-200mg/l，更优选为15mg/l-100mg/l；

-万古霉素，特别是浓度优选为1mg/l-50mg/l，更优选为2mg/l-20mg/l；

-甲磺酸多粘菌素E，特别是浓度优选为10mg/l-200mg/l，更优选为15mg/l-150mg/l；

-磷霉素，特别是浓度优选为100mg/l-3000mg/l，更优选为200mg/l-2000mg/l；及

-孔雀石绿，特别是浓度优选为0.05mg/l-2mg/l，更优选为0.2mg/l-1mg/l。

根据本发明的一个优选方面，所述培养基包含作为另外的选择剂的如下物质：

-两性霉素B，浓度为2mg/l-50mg/l，

-甲磺酸多粘菌素E，浓度为15mg/l-150mg/l，

-磷霉素，浓度为200mg/l-2000mg/l。

根据本发明的一个优选方面，除了磷霉素之外，所述培养基还有利地包含葡萄糖-6-磷酸，特别是浓度优选为10mg/l-50mg/l。

根据一个特定方面，本发明旨在改良目前使用的培养和/或分离分枝杆菌的方法，通过干预常用培养基(如Middlebrook培养基、

培养基、Columbia培养基、BCSA培养基)的组成以通过抑制非分枝杆菌而增加其选择性进行。为此，本发明提议通过导入C-390及任选如前所述其它选择剂以完善这些培养基的组成。同样，本发明也提议通过供给如下各种营养素而改良其繁殖力，如：甘油，基于油酸、基于白蛋白、葡萄糖及基于过氧化氢酶的补充剂(或者OADC补充剂)，活性炭，新鲜血液，酵母提取物，α酮戊二酸，酪蛋白，丙酮酸，蛋白胨，苋菜红(amarante)，卵黄，RNA，聚氧化乙烯硬脂酸酯或者泰洛沙泊。

在这方面，本发明的富集和选择性培养分枝杆菌的方法有利地使用其营养成分再现选自如下培养基营养成分的培养基进行：

-Middlebrook培养基(特别是Middlebrook培养基7H9、7H10和7H11之一)，任选补加了甘油和/或OADC补充剂；

-

培养基；

-Columbia培养基，任选补加OADC补充剂和/或新鲜血液，特别是马血；及

-BCSA培养基。

根据本发明的一个更优选方面，本发明的富集和选择性培养分枝杆菌的方法使用包含再现Middlebrook培养基的营养成分的培养基进行，补加：

-甘油，特别是浓度优选为2ml/l-20ml/l，

-OADC补充剂，特别是浓度优选为50ml/l-200ml/l，及任选

-一或多种选自如下的营养素：新鲜血液、酵母提取物、α酮戊二酸、酪蛋白、丙酮酸、蛋白胨、苋菜红、卵黄、RNA、聚氧化乙烯硬脂酸酯和泰洛沙泊。

有利地及根据本发明，所述OADC补充剂是水相组合物，包含50g/l牛白蛋白、20g/l葡萄糖、0.04g/l过氧化氢酶和0.5g/l油酸。

有利地及根据本发明的这个优选方面，本发明的富集和选择性培养分枝杆菌的方法使用包含再现Middlebrook培养基的营养成分的培养基进行，补加：

-甘油，特别是浓度优选为2ml/l-20ml/l，

-OADC补充剂，特别是浓度优选为50ml/l-200ml/l，及

-酵母提取物，特别是浓度优选为0.1g/l-20g/l。

有利地及根据本发明，所述方法更特别适于富集和选择性培养属于如下菌种的分枝杆菌：脓肿分枝杆菌(M.abscessus)、M.bolletii、M.massiliense、龟分枝杆菌(M.chelonae)、M.immunogenum、M.salmoniphilum、鸟分枝杆菌(M.avium)、结核分枝杆菌、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、玛尔摩分枝杆菌(M.malmoense)、戈登分枝杆菌(M.gordonae)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)和偶发分枝杆菌(M.fortuitum)。

有利地及根据本发明，在所述培养基上发展的分枝杆菌的菌落使用特异于待检测的分枝杆菌表达的酶活性的生色和/或荧光合成底物目测定位。为此，可以提及的是4-甲基伞形基-β-D-葡糖苷，其可以标记表达β-葡糖苷酶活性的菌落。

本发明还扩展至适于进行本发明的富集和选择性培养分枝杆菌的方法的培养基。在这一点上，本发明的培养基包含适于分枝杆菌发展和生长的营养成分，特征在于其还包含作为选择剂的9-氯-9-(4’-二乙氨基)苯基-9,10-二氢-10-苯基吖啶氢氯化物及能抑制铜绿假单胞菌的物质。

根据一个特定的实施方案，所述培养基不含结晶紫。

有利地及根据本发明，所述培养基包含适于分枝杆菌发展和生长的营养成分，及作为选择剂的9-氯-9-(4’-二乙氨基)苯基-9,10-二氢-10-苯基吖啶氢氯化物以及能抑制铜绿假单胞菌的物质。所述培养基特征还在于如下所有或一些技术特征：

-C-390浓度为2mg/l-1000mg/l，优选为大约4mg/l-大约256mg/l，更优选为大约8mg/l-大约128mg/l；

-所述培养基包含至少一种另外的选择剂(除了C-390及选择用于抑制铜绿假单胞菌的物质之外)，选自：

-甲磺酸多粘菌素E，特别是浓度优选为10mg/l-200mg/l，更优选为15mg/l-150mg/l；及

-磷霉素，特别是浓度优选为100mg/l-3000mg/l，更优选为200mg/l-2000mg/l，及任选存在的葡萄糖-6-磷酸，特别是浓度优选为10mg/l-50mg/l；

-所述培养基包含作为另外的选择剂的如下物质：

-两性霉素B，浓度为2mg/l-50mg/l；

-甲磺酸多粘菌素E，浓度为15mg/l-150mg/l；

-磷霉素，浓度为200mg/l-2000mg/l，及葡萄糖-6-磷酸，特别是浓度优选为10mg/l-50mg/l；

-所述培养基包含再现选自如下培养基的营养成分的营养成分：

-Middlebrook培养基，任选补加甘油和/或OADC补充剂；

-

培养基；

-BCSA培养基；

-所述培养基包含再现Middlebrook培养基的营养成分的营养成分，补加：

-甘油，特别是浓度优选为2ml/l-20ml/l，

-OADC补充剂，特别是浓度优选为50ml/l-200ml/l，及任选

-选自如下的一或多种营养素：新鲜血液，酵母提取物，α酮戊二酸，酪蛋白，丙酮酸，蛋白胨，苋菜红，卵黄，RNA，聚氧化乙烯硬脂酸酯和泰洛沙泊。

有利地，本发明涉及包含由Middlebrook 7H9培养基组成的营养成分的培养基，补加：

-甘油，浓度为2ml/l-20ml/l，

-OADC补充剂，浓度为50ml/l-200ml/l，及

-酵母提取物，浓度为0.1g/l-20g/l；

及包含作为选择剂的如下物质：

-C-390，浓度为2mg/l-50mg/l，

-两性霉素B，浓度为2mg/l-50mg/l，

-甲磺酸多粘菌素E，浓度为15mg/l-150mg/l，

-磷霉素，浓度为200mg/l-2000mg/l，连同葡萄糖-6-磷酸，浓度为10mg/l-50mg/l。

根据本发明的一个有利的实施方案，所述培养基的成分可包含能允许检测和/或目视鉴别在所述培养基中或之上发展的分枝杆菌的一或多个标记。其可特别是具有生色和/或荧光性质的合成的酶底物。

本发明还涉及富集和选择性培养分枝杆菌的方法、过程，涉及C-390在培养和/或分离分枝杆菌中的应用，及涉及特征在于上述和下述全部或一些技术特征的培养基。

本发明的其它目的、特征和优势根据如下实施例的描述将显现，所述实施例的目的是便于理解本发明及其应用。这些实施例只是阐述本发明而不限制本发明的范围。

实施例：本发明的选择性培养基的产生和评估

1/-选择培养分枝杆菌的“基本”成分

检测从文献中已知能繁殖分枝杆菌的培养基的各个成分并对比其使得分枝杆菌生长的能力。一些成分是预先富集的。检测的培养基如下所示：

-培养基A：Middlebrook琼脂，

-培养基B：Middlebrook琼脂，富含甘油(4ml/l)，

-培养基C：Middlebrook琼脂，具有Tween 80(1g/l)，

-培养基D：Middlebrook琼脂，富含甘油(4ml/l)和OADC补充剂(100ml/l)，

-培养基E：Middlebrook琼脂，补加/富含Tween 80和OADC补充剂，

-培养基F：Columbia琼脂(oxoid)，

-培养基G：Columbia琼脂(oxoid)，富含OADC补充剂，

-培养基H：Columbia琼脂，具有血液，

-培养基I：BCSA培养基(bioMérieux,France)。

a)培养基A-E的制备

从由10倍浓缩的Middlebrook 7H9培养肉汤(10×Middlebrook 7H9)组成的原液制备培养基A-E，具有如下成分：

硫酸铵(5g/l)，

L-谷氨酸(5g/l)，

磷酸二钠(25g/l)，

磷酸一钾(10g/l)，

柠檬酸钠(1g/l)，

硫酸镁(0.5g/l)，

氯化钙(0.005g/l)，

硫酸锌(0.01g/l)，

硫酸铜(0.01g/l)，

柠檬酸铁铵(0.4g/l)，

吡多辛(0.01g/l)，及

生物素(0.005g/l)。

将这个肉汤的pH调节为6.6±0.2。然后将肉汤在116℃高压灭菌10分钟。将其贮存在冰箱中直至使用。

为了获得培养基A，将50ml肉汤加入450ml去离子水中。将5g细菌学琼脂加入整个混合物中以获得Middlebrook琼脂。然后将整个混合物在116℃高压灭菌10分钟。

与制备培养基A相似地制备培养基B、C、D和E，其另外含有：

-甘油(4ml/l)，及任选存在的基于油酸、白蛋白、葡萄糖和过氧化氢酶的补充剂(OADC补充剂，100ml/l)，

或者：

-Tween 80(1g/l)及任选存在的OADC补充剂(100ml/l)。

b)培养基F-I

培养基F、H和I是可商购的培养基。

培养基G与培养基F相似制备，另外含有OADC补充剂(100ml/l)。

c)评估培养基A-I关于分枝杆菌的繁殖力

利用如下20个分枝杆菌菌株评估A-I每一培养基的繁殖力：

12株脓肿分枝杆菌菌株

3株Mycobacterium bolletii菌株，

5株Mycobacterium massiliense菌株。

将最初在-20℃贮存在甘油中的这些菌株首先在具有马血(5％)的Columbia琼脂上解冻并培养。然后将每株菌株悬浮于1ml盐水溶液(0.85％)中直至其达到等于McFarland0.5标准的浊度(等于大约1.5×10⁸CFU/ml)。

对于具有凝集倾向的分枝杆菌，将细胞在含有3个直径为3mm的玻璃珠的试管中涡旋分散10分钟。

将1μl等份的每一分枝杆菌悬浮液接种于每一待评估的培养基上，铺板以获得分离的菌落。将培养物在30℃保温。观察7天菌落的生长。

获得的结果在下表1中示出。

表1

2/-评估各种营养素对于分枝杆菌生长的作用

基于先前检测的培养基D的配方，评估各种营养素对于分枝杆菌培养的作用：活性炭、马血、酵母提取物、α酮戊二酸、酪蛋白、丙酮酸、蛋白胨、苋菜红、卵黄乳状液、RNA(Sigma,ref.R6625-25G)、聚氧化乙烯硬脂酸酯、泰洛沙泊。

以与制备培养基D极为相似的方式，制备如下培养基(标示为J-V)：

-培养基J：培养基D+活性炭(2g/l)，

-培养基K：培养基D+5％马血(50ml/l)，

-培养基L：培养基D+酵母提取物(4g/l)，

-培养基M：培养基D+α酮戊二酸(15g/l)，

-培养基N：培养基D+酪蛋白(1g/l)，

-培养基O：培养基D+丙酮酸钠(7g/l)，

-培养基P：培养基D+蛋白胨(10g/l)，

-培养基K：培养基D+苋菜红(0.04g/l)，

-培养基R：培养基D+卵黄乳状液(33ml/l)，

-培养基S：培养基D+RNA(0.05g/l)，

-培养基T：培养基D+聚氧化乙烯硬脂酸酯(0.1g/l)，

-培养基U：培养基D+泰洛沙泊(5ml/l)，

-培养基V：培养基D+卵黄乳状液(33ml/l)+活性炭(4g/l)。

这些培养基的繁殖力通过使用在先前描述的检测中使用的相同的20株分枝杆菌菌株评估，及在接种之前相同处理。

将培养物在30℃保温。监测7天菌落的生长。下表2示出在培养第3天和第7天的观测结果。

表2

3/-评估对于分枝杆菌具有选择性的各种物质的作用

基于先前开发和检测的培养基L的配方，评估不同浓度的各种选择剂对于分枝杆菌的选择性水平的作用：两性霉素B(抗真菌剂)，萘啶酸，万古霉素，甲磺酸多粘菌素E，C-390(Biosynth,Switzerland)，磷霉素及孔雀石绿。

下表3示出对先前所述检测中使用的20株分枝杆菌菌株及对于不属于分枝杆菌属的95株微生物菌株在保温7天后进行的这个评估结果。所述95株菌株是：

-50株铜绿假单胞菌菌株，

-10株其它非发酵性细菌菌株：

-1株氧化木糖无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)菌株，

-1株不动杆菌属(Acinetobacter sp.)菌株，

-1株多噬伯克霍尔德氏菌(Burkholderia multivorans)菌株，

-1株Burkholderia cenocepacia菌株，

-1株洋葱伯克霍尔德氏菌菌株，

-1株污染伯克霍尔德氏菌(Burkholderia contaminans)菌株，

-1株Pandoraea apista菌株，

-1株Pandoraea pnomenusa菌株，

-2株嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)菌株，

-7株肠杆菌菌株：

-1株大肠杆菌(Escherichia coli)菌株，

-1株肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)菌株，

-1株Providentia rettgeri菌株，

-1株阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)菌株，

-1株产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)菌株，

-1株粘质沙雷菌(Serratia marcescens)菌株，

-1株弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)菌株，

-10株革兰氏阳性菌菌株：

-2株金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)菌株，

-1株表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)菌株，

-1株酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)菌株，

-1株肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)菌株，

-1株唾液链球菌(Streptococcus salivarius)菌株，

-1株格氏链球菌(Streptococcus gordonii)菌株，

-1株屎肠球菌(Enterococcus faecium)菌株，

-1株粪肠球菌(Enterococcus faecalis)菌株，及

-1株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株。

-8株真菌/酵母株：

-1株白色念珠菌(Candida albicans)菌株，

-1株光滑念珠菌(Candida glabrata)菌株，

-2株烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus)菌株，

-1株土曲霉(Aspergillus terreus)菌株，

-1株尖端赛多孢子菌(Scedosporium apiospermum)菌株,

-1株Scedosporium prolificans菌株，

-1株Rasamsonia(Geosmithia)argillacea菌株。

在这个表3中，结果以在培养7天后在讨论的培养基上示出生长的菌株的数目和百分比表示。符号NS和NT分别是指“不显著”(两性霉素B对细菌的抑制作用)和“未检测”(抗细菌剂对于酵母和真菌的作用)。

表3

4/-优化本发明的分枝杆菌选择性培养基

根据前文数据，开发两个进一步的选择性培养基，称作培养基W和培养基X。这些培养基根据培养基L的成分开发，L是如前所述富集培养基，其中加入了特定的选择剂组合。所述选择性培养基的组成如下所述：

-培养基W：培养基L+甲磺酸多粘菌素E(32mg/l)

+磷霉素(400mg/l)+葡萄糖-6-磷酸(25mg/l)

+两性霉素B(5mg/l)

-培养基X：培养基L+甲磺酸多粘菌素E(32mg/l)

+磷霉素(400mg/l)+葡萄糖-6-磷酸(25mg/l)

+两性霉素B(5mg/l)

+C-390(32mg/l)。

在188株微生物检测这两个培养基：

-98株非结核性分枝杆菌：

-52株脓肿分枝杆菌，

-3株Mycobacterium bolletii，

-34株龟分枝杆菌，

-1株Mycobacterium immunogenum，

-6株Mycobacterium massiliense，

-2株Mycobacterium salmoniphilum，

-94株不属于分枝杆菌属的微生物：

-54株铜绿假单胞菌，

-15株其它非发酵性细菌：

-1株无色杆菌(Achromobacter)sp1菌株,

-1株氧化木糖无色杆菌,

-1株不动杆菌属菌株,

-1株鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii),

-1株洋葱伯克霍尔德氏菌,

-1株污染伯克霍尔德氏菌,

-1株多噬伯克霍尔德氏菌,

-1株Burkholderia stabilis,

-1株Elizabethkingia miricola,

-1株Pandoraea apista,

-1株Pandoraea pnomenusa,

-4株嗜麦芽窄食单胞菌,

-7株肠杆菌(与先前提及的那些相同),

-10株革兰氏阳性细菌(与先前提及的那些相同)，

-8株真菌/酵母菌株(与先前提及的那些相同)。

在这株表4中，结果以在讨论的培养基上在培养7天后示出生长的菌株的数目和百分比表示。

表4

5/-校验培养和选择结核分枝杆菌的培养基X的组成

基于上述培养基X的组成，配制液态选择性培养基。测试这种液态培养基X(无琼脂)在分析源自未患有囊性纤维化的32名患者及患有囊性纤维化的56名患者的痰液样品的情况中检测分枝杆菌、特别是结核分枝杆菌。

为此，使用

3D自动微生物检测系统(bioMérieux,France)。将含有液态培养基X(或者肉汤X)的培养瓶在自动检测装置中保温至少28天，并与常规推荐用于检测分枝杆菌的

MP试剂对比。

这种试剂的组成相应于Middlebrook 7H9培养基，补加了油酸、甘油、牛血清白蛋白、苋菜红和抗生素混合物(两性霉素B、阿洛西林、萘啶酸、多粘菌素B、甲氧苄啶和万古霉素)。

通过在显微镜下检验及金胺染色，在从未患有囊性纤维化的患者收集的32个痰液样品中证实存在酸-醇抗性杆菌。在将其接种于含有

MP肉汤或者肉汤X的

培养瓶中之前，根据标准British方法将这32个样品用氢氧化钠处理以除去样品中存在的非分枝杆菌菌种，或者至少降低其存活性。因此制备64个

培养瓶，然后在35℃在

自动装置中保温。

至于从患者囊性纤维化的患者收集的56个样品，对其进行两个不同的去污染方案，根据标准British方法用酸处理及用氢氧化钠处理，之后接种于

培养瓶中。因此制备了224个培养瓶：

-56个含有

MP肉汤的培养瓶，其中接种用酸预处理的样品，

-56个含有

MP肉汤的培养瓶，其中接种用氢氧化钠预处理的样品，

-56个含有肉汤X的培养瓶，其中接种用酸预处理的样品，

-56个含有肉汤X的培养瓶，其中接种用氢氧化钠预处理的样品。

这些各种培养的结果在下表5、6和7中示出。

表5和6示出关于在样品(分别从未患有囊性纤维化患者和患有囊性纤维化患者收集)中鉴别的分枝杆菌的性质及在其中检测出其的培养瓶数目的信息。

表7示出检测和鉴别的每一分枝杆菌菌种的平均检测时间(天)，作为使用的培养基的函数。

表5

表6

表7

总之，从88个最初标本中回收39株分枝杆菌分离株。使用

MP“标准”试剂培养瓶回收34株分离株(即敏感性87％)，相比之下使用本发明的肉汤X的培养瓶回收38株分离株(即敏感性97％)。这些数据示出本发明提议的选择性培养基在分枝杆菌的培养、富集和分离方面相对有效。

6/-本发明的选择性培养基-培养基Y-的制备和验证

a)培养基Y的组成和制备

培养基Y的组成如下所示(大约1600ml组合物)：

马铃薯淀粉(30g)，

天冬酰胺(3.6g)，

磷酸一钾(2.4g)，

柠檬酸镁(0.6g)，

硫酸镁(0.24g)，

全蛋匀浆(1l)，

甘油(12ml)，及

C-390(51.2mg)。

这种组成相应于

培养基，其中加入了C-390，以获得终浓度32mg/l。根据与制备

培养基相同的方法从中制备培养基Y(cf.Handbook of Microbiological Media,Ronald M.Atlas,4th edition,2010)。

b)培养基Y对于分枝杆菌的繁殖力和选择性的评估概况

检测在斜管中配制的培养基Y对不同的细菌菌株的培养：

1株偶发分枝杆菌菌株(在0.5McFarland校准的接种物并稀释为1/10,000),

4株金黄色葡萄球菌菌株(在0.5McFarland校准的接种物并稀释为1/100)，及

3株铜绿假单胞菌菌株(在0.5McFarland校准的接种物并稀释为1/100)。

这些菌株在37℃保温，一天天生长。获得的结果在下表8中示出，以斜面覆盖百分比表示。

第一个检测的结果与使用基于Middlebrook组成配制的培养基X的结果相对一致，即：分枝杆菌菌株良好生长，金黄色葡萄球菌菌株全部抑制，及对于铜绿假单胞菌菌株具有不同选择性的部分抑制。

表8

还检测在斜管中配制的培养基Y对缓慢生长的分枝杆菌菌株的培养：

-1株结核分枝杆菌，

-1株牛分枝杆菌，及

-1株戈登分枝杆菌。

使用在0.5McFarland校准并稀释为1/10,000的接种物进行这些检测。

获得的结果在下表9中示出，以斜面覆盖百分比表示，并与在

培养基上培养的结果对比。

表9

7/-补充数据：各个细菌和各个真菌菌种对于C-390的敏感性

进行能感染呼吸道的各个微生物对于C-390敏感性的评估。这个评估使用实施例4的含有不同浓度C-390的培养基W进行。下表10示出关于作为培养基中C-390浓度的函数而检测的菌株生长强度收集的观测结果。缩写NG(无生长)和Tr(微量)表示观测到无生长或者仅极少非常不显著的量。

Claims

1.一种富集和选择性培养生物学样品中包含的分枝杆菌的方法，其中所述方法不是疾病的诊断方法，以及其中将全部或部分所述样品接种于培养基之中/之上，所述培养基包含：

-适于分枝杆菌发展和生长的营养成分，

-作为选择剂的9-氯-9-(4’-二乙氨基)苯基-9,10-二氢-10-苯基吖啶氢氯化物；

其中所述营养成分再现选自如下的培养基的营养成分：

-Middlebrook培养基，

-

-Jensen培养基，

-Columbia培养基，

-BCSA培养基；以及

9-氯-9-(4’-二乙氨基)苯基-9,10-二氢-10-苯基吖啶氢氯化物在所述培养基中存在的浓度为8mg/l-128mg/l。

2.权利要求1的方法，特征在于所述培养基还包含能抑制铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的物质，选自：甲磺酸多粘菌素E、磷霉素、萘啶酸、氨曲南、头孢磺啶和mangrolide A。

3.权利要求1的方法，特征在于所述培养基还包含能抑制洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacian)的物质，选自磷霉素、氨曲南和mangrolide A。

4.权利要求1的方法，特征在于所述培养基还包含至少一种选自两性霉素B、萘啶酸、万古霉素、甲磺酸多粘菌素E、磷霉素和孔雀石绿的另外的选择剂。

5.权利要求4的方法，特征在于所述培养基包含作为另外的选择剂的如下物质：

-两性霉素B，浓度为2mg/l-50mg/l；

-甲磺酸多粘菌素E，浓度为15mg/l-150mg/l；

-磷霉素，浓度为200mg/l-2000mg/l。

6.权利要求5的方法，特征在于所述培养基除了磷霉素之外还包含葡萄糖-6-磷酸，浓度为10mg/l-50mg/l。

7.权利要求1的方法，特征在于所述培养基包含再现Middlebrook培养基的营养成分的营养成分，补加：

-甘油，

-OADC补充剂，

-选自如下的一或多种营养素：新鲜血液、酵母提取物、α-酮戊二酸、酪蛋白、丙酮酸、蛋白胨、苋菜红、卵黄、RNA、聚氧乙烯硬脂酸酯和泰洛沙泊。

8.权利要求7的方法，特征在于所述培养基包含再现Middlebrook培养基的营养成分的营养成分，补加：

-甘油，浓度为2ml/l-20ml/l，

-OADC补充剂，浓度为50ml/l-200ml/l，及

-酵母提取物，浓度为0.1g/l-20g/l。