KR101716239B1

KR101716239B1 - 마이코박테리아의 성장 증진용 조성물 및 방법

Info

Publication number: KR101716239B1
Application number: KR1020150021826A
Authority: KR
Inventors: 류성원; 김희진; 이은희; 김하은; 정현주; 김혜진; 곽미리; 정용균; 유정헌; 박경옥; 김수연
Original assignee: 사단법인대한결핵협회; 주식회사 퀀타매트릭스
Priority date: 2015-02-12
Filing date: 2015-02-12
Publication date: 2017-03-28
Also published as: KR20160099789A

Abstract

본 발명은 마이코박테리아의 성장을 증진시키기 위한 성장증진용 조성물, 이의 제조방법 및 마이코박테리아의 성장 증진 방법에 관한 것이다. 본 발명의 마이코박테리아 성장 증진용 조성물, 배지 및 방법은 고가의 장비없이 기존의 결핵균 배양 배지에 BCG 추출물을 첨가함으로써 마이코박테리아의 성장을 효과적으로 증진시킬 수 있으므로, 결핵균 등의 신속한 진단 및 약제 감수성 검사에 유용하게 이용될 수 있고 궁극적으로 결핵의 예방 및 치료를 용이하게 할 수 있다.

Description

마이코박테리아의 성장 증진용 조성물 및 방법 {Composition and method for enhancing mycobacteria growth}

본 발명은 마이코박테리아의 성장을 증진시키기 위한 성장 증진용 조성물, 이의 제조방법 및 마이코박테리아의 성장증진 방법에 관한 것이다.

결핵균과 비결핵항산균을 포함하는 병원성 마이코박테리아(mycobacteria) 감염증은 현재까지 인류에게 심각한 피해를 주고 있는 세균성 질병 중 하나이다. 이 중 결핵은 세계 10대 사망 원인의 하나로 국제적인 중요성이 큰 감염성 질환이며 현재에도 전 세계 인구의 1/3인 약 20억명 정도가 이 균에 감염되어 있다. 우리나라는 OECD 가입 30개국 중 결핵사망률 1위로, 결핵으로 인해 매일 평균 7.4명이 사망하고 있다(2005년도 사망 통계). 또한 결핵 감염은 국내 전염병 발생 건수의 60%를 차지하고 있어 국민생명을 위협하는 질환이며, 보건복지부 보고에 따르면 2013년 인구 10만명 당 71명 꼴로 신환자가 관찰되며 OECD 가입국 중 결핵발생률 및 사망률에서 여전히 1위를 차지하고 있다.

일반적으로 1차 결핵의 경우 6개월간의 치료를 통해 정상적으로 치료되는 경우가 많으므로, 활동성 결핵 환자의 조기 발견과 신속한 항결핵제 내성검사는 매우 중요하다. 그러나 결핵은 재래식 고체 배지에서 배양 시 4 내지 8주의 시간이 필요하고, 액체 배지를 이용할 경우 고체 배지에 비해 빠른 2 내지 4주 이내에 배양되이 가능하지만, 고가의 장비와 시약을 사용하여야 하는 문제가 있다.

현재 정확하게 결핵을 확진할 수 있는 방법은 객담 등의 시료에서 분리된 결핵균(M. tuberculosis)을 배양하거나, PCR 법 등으로 검출하는 것이다. 하지만 결핵균은 배양조건이 좋은 상태에서도 배양에 필요한 시간이 약 4주 이상 소요된다. 또한 잠복결핵 (latent TB) 상태에서는 결핵균을 in vitro에서 배양하기가 거의 불가능하다. 현재 BD 회사에서 판매하고 있는 성장보조제로 OADC를 첨가하는 미들브룩 배지가 결핵균 배양에 널리 사용되고 있으나 이 배지는 고가이고 이 배지를 사용하더라도 4주 이상의 시간이 소요된다는 어려움이 있을 뿐만 아니라 이러한 배지들은 전량 수입에 의존하고 있다.

최근에는 BD 회사에서 MGIT (Mycobacterial Growth Indicator Tube)라는 자동화된 시스템을 개발하여 판매하고 있으나, 이는 배지에 의하여 결핵균의 배양을 촉진시킨 것이 아니라 검출하는 센스의 높은 민감도에 의존하는 방식이다. 이러한 MGIT 시스템은 매우 고가여서 모든 임상에 적용하기에 한계가 있다.

따라서 고가의 장비없이 결핵균을 포함하는 마이코박테리아를 빠르게 배양하여 신속한 진단을 할 수 있도록 하는 마이코박테리아 배양 방법 및 배양 배지에 대한 필요성이 절실하나 아직까지 마이코박테리아의 성장을 증진시킬 수 있는 배양 방법이나 배양물에 관한 연구는 여전히 부족하다.

국제공개번호 WO 2005/070430 KR 특허 공개 번호 제10-2010-0077817호

본 발명자들은 결핵균을 포함하는 마이코박테리아의 성장을 증진시키기 위한 배양방법에 관하여 연구하던 중, BCG(bacilli Calmette-Guerin) 추출물을 배지 첨가제로 이용하는 경우, 마이코박테리아의 성장을 효과적으로 증진시킬 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명은 마이코박테리아의 성장을 효과적으로 증진시킬 수 있는 조성물, 배지, 방법 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 제공하기 위하여, 본 발명은 BCG(bacilli Calmette-Guerin) 추출물을 포함하는 마이코박테리아(Mycobacterium) 성장 증진용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 BCG 추출물을 포함하는 마이코박테리아 성장 증진용 첨가제를 제공한다.

또한 본 발명은 BCG 추출물을 포함하는 마이코박테리아 성장 증진용 배지를 제공한다.

또한 본 발명은 BCG 추출물을 포함하는 마이코박테리아 성장 증진용 배지에서 마이코박테리아를 배양하는 단계;를 포함하는 마이코박테리아의 성장을 증진시키는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 a) 배양된 BCG 균체를 세척한 후 원심분리하는 단계; b) 원심분리된 균체를 냉동시키는 단계; c) 냉동된 균체를 해동하고 탈이온수 및 트윈 80을 첨가한 조성물을 제조하는 단계; d) 상기 조성물을 가열하는 단계; e) 가열된 조성물을 원심분리한 후 상층액을 회수하는 단계; 및 f) 회수한 상층액을 동결건조시킨 후 여과하는 단계;를 포함하는 마이코박테리아(Mycobacterium) 성장 증진용 BCG 추출물의 제조방법을 제공한다.

또한 본 발명은 BCG 추출물을 배지에 첨가하는 단계; 를 포함하는 마이코박테리아 성장 증진용 배지의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 마이코박테리아 성장 증진용 조성물, 배지 및 방법은 기존의 결핵균 배양 배지에 BCG 추출물을 첨가함으로써 마이코박테리아의 성장을 효과적으로 증진시킬 수 있으므로, 결핵균 등의 신속한 진단 및 약제 감수성 검사에 유용하게 이용될 수 있고 궁극적으로 결핵의 예방 및 치료를 용이하게 할 수 있다.

도 1은 BCG 추출물 첨가에 따른 M.tuberculosis 및 M. avium의 성장 증진 효과를 7H11 고체배지에서 현미경 이미징으로 확인한 결과를 나타낸 도이다 (con: BCG 추출물 미첨가 대조군, S1: 트윈 80 0.5% 첨가, S2: 트윈 80 0.1% 첨가).
도 2는 7H9 액체배지에서 BCG 추출물 첨가에 따른 M.tuberculosis 및 M. avium의 성장 증진 효과를 현미경 이미징으로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 7H9 액체배지에서 BCG 추출물 첨가에 따른 M.tuberculosis 및 M. avium 의 성장 증진 효과를 분광광도계 흡광도 측정을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 7H9 액체배지에서 BCG 추출물 첨가에 따른 M.tuberculosis, M. avium 및 Pan S (Pan Susceptible)의 성장 증진 효과를 REMA 실험법을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 7H9 액체배지에서 BCG 추출물 첨가에 따른 M.tuberculosis 및 M. avium의 성장 증진 효과를 미세유체 실험법을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.

본 발명은 BCG(bacilli Calmette-Guerin) 추출물을 포함하는 마이코박테리아(Mycobacterium) 성장 증진용 조성물을 제공한다.

본 발명의 BCG(bacilli Calmette-Guerin) 추출물은 액체 또는 고체 마이코박테리아 배지에 첨가되는 경우, 마이코박테리아의 성장을 효과적으로 증진시킴으로서 단시간 내에 효과적인 배양이 가능하도록 할 수 있다.

본 발명에서 상기 "BCG 추출물"은 BCG(bacilli Calmette-Guerin)의 배양을 통해 얻어진 물질로 특히 자연분해법을 이용하여 수득하는 것이 바람직하다. 본 발명의 BCG 추출물은 배양 배지에 단독으로 또는 다른 상용되는 성장보조제와 병용하여 배지에 첨가될 수 있으며, 순차적으로 또는 혼합하여 첨가될 수 있다.

상기 "성장 증진"은 결핵균을 포함하는 마이코박테리아 대사속도의 증가 등, 다양한 원인에 의하여 배지 내의 마이코박테리아 배양 속도가 효과적으로 증가하여, 콜로니의 개수 및 크기가 급격하게 증가되는 것을 의미하며, 단 시간 내에 많은 수의 균주를 수득할 수 있도록 함으로써, 단 시간 내에 마이코박테리아의 배양 양성 판단 일자를 앞당겨 진단을 용이하게 할 수 있도록 할 수 있다.

상기 "성장보조제(growth supplement)"는 배지에서 결핵균을 포함하는 마이코박테리아의 성장을 촉진시켜주는 인자를 말하며, 당 분야에서 상용되는 것을 제한없이 포함할 수 있다. 구체적으로 소듐올레이트(sodium oleate), 알부민, 덱스트로오스, 카탈라아제 등을 포함할 수 있으며, 보다 구체적으로 OADC (Oleic Albumin Dextrose Catalase), ADC (Albumin Dextrose Catalase) 및 FBS (Fetal bovine serum)인 것이 바람직하다. 상기 성장보조제 중 올레익산은 결핵균의 대사 작용에 이용될 수 있고, 알부민은 독성물질로부터 결핵균을 보호하고, 덱스트로오스는 에너지원으로 작용하며, 카탈라아제는 배지의 독성을 분해하는 역할을 할 수 있다.

상기 성장보조제는 단독으로 또는 조합으로 본 발명의 BCG 추출물과 병용하여 함께, 또는 순차적으로 배지에 첨가될 수 있다.

상기 BCG 추출물이 고체 배지에 첨가되는 경우 1μg/ml 내지 20μg/ml로 첨가될 수 있으며, 바람직하게는 3μg/ml 내지 10μg/ml 농도, 더욱 바람직하게는 4μg/ml 또는 8μg/ml의 농도로 첨가될 수 있다.

또한 상기 BCG 추출물이 액체 배지에 첨가되는 경우 1μg/ml 내지 10μg/ml으로 첨가될 수 있으며, 바람직하게는 1μg/ml 내지 7μg/ml 농도, 더욱 바람직하게는 2μg/ml 또는 4μg/ml의 농도로 첨가될 수 있다.

상기 성장보조제는 이에 제한되는 것은 아니나, 1 내지 20%, 바람직하게는 5 내지 15%, 더욱 바람직하게는 10%로 첨가될 수 있다.

상기 "마이코박테리아"는 마이코박테리움 속에 속하는 세균으로 나병균(M. leprae), 결핵균(Mycobacterium tuberculosis) 및 비결핵항산균(nontuberculous mycobacteria, NTM)을 제한없이 포함할 수 있으나 바람직하게는 결핵균(Mycobacterium tuberculosis) 및 비결핵항산균(nontuberculous mycobacteria, NTM), 더욱 바람직하게는 마이코박테리움 튜버큐로시스, 마이코박테리움 파라튜버큐로시스, 마이코박테리움 레프라에, 비정형 결핵균(MOTT), 마이코박테리움 칸사시, 마이코박테리움 고도네, 마이코박테리움 에비움, 마이코박테리움 시미애, 마이코박테리움 인트라셀룰라, 마이코박테리움 마리늄, 마이코박테리움 아프리카늄, 마이코박박테리움 레프레, 마이코박테리움 얼서란, 마이코박테리움 앱서수스, 마이코박테리움 스메그마티스, 마이코박테리움 보비스 등 일 수 있다.

상기 "첨가제"는 상용되는 마이코박테리아 배양 배지에 성장 증진을 목적으로 첨가되는 첨가제를 말하며, 이를 첨가하는 경우 미첨가한 배양과 비교하여 마이코박테리아의 성장이 효과적으로 증가될 수 있도록 하는 증강제를 의미한다. 상기 첨가제는 단독으로 첨가될 수 있으나, 기타 상용되는 배양을 위한 첨가제, 보충물 등과 병용하여 첨가될 수 있다.

상기 성장 증진용 배지는 BCG 추출물을 포함하지 않는 배지와 비교하여 배양되는 마이코박테리아의 성장이 현저히 증가되는 것을 특징으로 한다.

상기 성장 증진용 배지는 BCG 추출물 외에도 당 분야의 통상의 기술자가 인지하고 있는 일반적인 마이코박테리아 성장에 필요한 기초적인 성분을 제한없이 포함하고 있으며, 보다 바람직하게는 결핵균 또는 비결핵성 마이코박테리아의 성장에 필요한 기초적인 성분을 포함하는 것이 바람직하다.

또한 상기 배지는 마이코박테리아의 성장을 더욱 증진시키기 위하여, OADC(Oleic Albumin Dextrose Catalase), ADC(Albumin Dextrose Catalase) 및 FBS(Fetal bovine serum)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 성장보조제를 더 포함하는 것일 수 있다.

상기 배지는 당 분야에서 마이코박테리아의 배양을 위하여 널리 사용되는 통상적인 배지일 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니나 7H9, 7H10, 7H11, 7H12B, Sauton's 배지, Dubos 배지, mWR 배지 또는 Lowenstein-Jensen 배지와 같은 계란기초배지 (egg-based media)일 수 있고, 바람직하게는 7H9 또는 7H11 일 수 있다.

또한 본 발명은 상기 마이코박테리아 성장 증진용 배지에서 마이코박테리아를 배양하는 단계; 를 포함하는, 마이코박테리아의 성장을 증진시키는 방법을 제공한다.

상기 방법에 따르면, 별도의 고가의 장비 또는 유해한 화학물질 없이도 마이코박테리아의 성장이 효과적으로 촉진되어 단시간 내에 많은 마이코박테리아의 콜로니를 수득할 수 있다.

상기 배양은 일반적인 마이코박테리아 배양 조건과 동일한 조건에서 제한없이 실시될 수 있다.

또한 본 발명은 a) 배양된 BCG 균체를 세척한 후 원심분리하는 단계; b) 원심분리된 균체를 냉동시키는 단계; c) 냉동된 균체를 해동하고 탈이온수 및 트윈 80을 첨가한 조성물을 제조하는 단계; d) 상기 조성물을 가열하는 단계; e) 가열된 조성물을 원심분리한 후 상층액을 회수하는 단계; 및 f) 회수한 상층액을 동결건조시킨 후 여과하는 단계; 를 포함하는 마이코박테리아(Mycobacterium) 성장 증진용 BCG 추출물의 제조방법을 제공한다.

상기 BCG 추출물은 BCG의 자연분해(Autolysis)에 의해 얻어지는 것이며, 여기에서 '자연분해'란 효모 추출물을 제조할 때 이용하는 방법을 변형한 것으로 균체에 따로 리소자임과 같은 효소를 처리하거나 음파처리(sonication)와 같은 물리적 방법을 가하지 않고, 균체 내에 존재하는 내생 효소(endogenous enzyme)에 의하여 균체를 분해하는 것을 말한다. 따라서 본 발명의 BCG 추출물은 BCG 균에 외부적인 분해 효소나 음파처리를 하지 않고도 BCG 균으로부터 얻어질 수 있다.

상기 BCG 추출물은 마이코박테리아 배양 배지에 첨가됨으로써 마이코박테리아의 성장을 효과적으로 증진시킬 수 있으며, 단독으로 또는 당 분야에서 널리 상용되는 OADC(Oleic Albumin Dextrose Catalase), ADC(Albumin Dextrose Catalase) 및 FBS(Fetal bovine serum)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 성장보조제와 병용하여 사용될 수 있다.

상기 b) 단계의 냉동은 이에 제한되는 것은 아니나 -120 내지 -60℃의 저온 냉동고에서 4시간 내지 7일 동안 수행될 수 있으며, 바람직하게는 -80℃의 저온 냉동고에서 냉동될 수 있다.

상기 c) 단계에서는 결핵균의 분리를 도와주는 계면활성제가 첨가될 수 있으며, 바람직하게는 비이온성 계면활성제인 트윈(Tween) 80(폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올리에이트, polyoxyethylene sorbitan mono-oleate) 이 첨가될 수 있다. 상기 트윈 80은 20% 용액으로 조성물의 0.2 내지 3부피% 농도로 첨가될 수 있으며, 바람직하게는 조성물의 최종 농도의 0.5% 또는 1%로 첨가될 수 있다.

상기 d) 단계의 가열은 1차 가열과 2차 가열로 나뉠 수 있으며, 72시간동안 37℃ 내지 65℃로 가열하는 1차 가열 및 72시간 후 90℃ 내지 120℃로 가열하는 2차 가열을 포함할 수 있고, 바람직하게는 72시간 동안 45℃ 내지 55℃ 로 가열하는 1차 가열 및 72시간 후 100℃ 내지 110℃로 10분 동안 가열하는 2차 가열을 포함할 수 있다.

또한 본 발명은 BCG 추출물을 배지에 첨가하는 단계;를 포함하는 마이코박테리아 성장 증진용 배지의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 마이코박테리아 성장 증진용 배지 제조방법은 마이코박테리아를 배양하는 일반 배지에 BCG 추출물을 첨가하는 단계를 통해 제조되며, 이와 같은 간단한 공정을 통해 일반 배지와 비교하여 마이코박테리아의 성장을 효과적으로 증진시킬 수 있는 배양 배지를 제조할 수 있다.

본 발명에 따른 마이코박테리아 성장 증진용 조성물 및 성장 증진용 배지, 성장 증진용 첨가제, 이를 이용한 마이코박테리아의 성장을 증진시키는 방법에 따르면 4주 이상 소요되는 결핵균 등 마이코박테리아의 배양 기간을 매우 효과적으로 단축시킬 수 있으므로, 감염을 조속히 진단할 수 있어 결핵 등 감염성 질환의 치료를 신속하고 용이하게 할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실험예 및 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실험예 및 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실험예 및 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실험예 1. BCG-Korea 균주 배양 및 추출물 획득

BCG-korea 1168P균주 (Pubmed accession number: CP003900 소유주: KIT(대한결핵협회)) 를 배양 수득하기 위하여, Sauton 배지가 첨가된 Roux 튜브의 감자배지 사면에 BCG-Korea 주 계대 1 스톡을 도포하고 충분히 균이 성장할 때까지 배양하였다. 이후, 발육한 균막을 루프를 이용해 새로운 sauton 배지에 계대하였다. 10 내지 15일간 배양한 후, 균막이 배지의 전체 표면을 감싸고 발육이 왕성한 배양병을 선정하고, 발육한 균체를 각각 50ml 코니칼 튜브에 분주하여 원심분리기에서 6000xg 15분간 원심분리 후 상층액은 버리고 균체만 회수하였다.

BCG 균주로부터 BCG 추출물을 얻기 위하여 자연분해법을 이용하였다. 구체적으로 배양된 BCG-Korea 균체를 멸균된 탈이온수(DW)로 회수한 후, 50ml 튜브에 모아서 다시 한 번 세척하고 원심분리기에서 6000xg 15분간 원심분리하였다. 탈이온수를 완전히 제거한 후 균체만 -80℃의 저온 냉동고에서 최소 4시간에서 최대 일주일까지 얼렸다. 균체를 해동시킨 후 멸균된 탈이온수 (pH 5.4)를 균체와 동일 부피로 첨가하고 트윈(Tween) 80 20% 용액을 각각 최종 농도 0.5%와 1%가 되도록 첨가하여 온도가 조절된 가열 블록(heating block)에서 52℃로 72시간 동안 반응시켰다. 72시간 후 100℃에서 10분간 가열시킨 후, 6000xg에서 15분간 원심분리 시키고 상층액을 회수하였다. 균체에 다시 한 번 동일한 양의 멸균된 DW (pH 5.4)를 첨가한 후 5분간 세차게 흔들어 준 후, 6000xg에서 15분간 원심분리하여 상층액을 회수하였다. 회수한 상층액을 25℃에서 72시간 동안 동결건조시킨 후 PBS로 회수하고 0.8시린지 필터를 이용하여 여과한 후 각각의 농도를 측정하였으며, 이하 이를 "BCG 추출물"로 하였다.

실험예 2. BCG 추출물 첨가 배지의 제조

2.1 BCG 추출물 첨가 7H11 고체 배지의 제조

7H11 아가 플레이트(Difco™ Mycobacteria 7H11 아가 (BD, Cat no. 283810))에 성장보조제인 OADC나 ADC (트윈 80 0.5%) 또는 FBS를 최종 부피의 10%(v/v) 부피로 첨가한 후 실험예 1에서 제조된 BCG 추출물을 4μg/ml 또는 8μg/ml의 농도로 첨가하여 마이코박테리아 고체 배양 배지를 제조하였다.

2.2 BCG 추출물 첨가 7H9 액체 배지의 제조

7H9 액체 배지(Difco™ Mycobacteria 7H9 Broth (BD, Cat no. 271310))에 OADC나 ADC (트윈 80 0.5%) 또는 FBS를 최종 부피의 10%(v/v) 부피로 첨가한 후 실험예 1에서 제조된 BCG 추출물을 2μg/ml 또는 4μg/ml 의 농도로 첨가하여 마이코박테리아 액체 배양 배지를 제조하였다.

BCG 추출물 첨가 배지에서의 마이코박테리아 성장 확인

상기 실험예 2.1 에서 제조된 BCG 추출물 첨가 7H11 고체 배지에 표준 균액 2x10³ CFU/ml로 준비된 M.tuberculosis H37Rv 와 M.avium을 스파이럴 플레이팅하고 37℃에서 약 20일 배양 후 균의 성장을 확인하였다.

또한 상기 실험예 2.2.에서 제조된 BCG 추출물 첨가 7H9 액체 배지에 M.tuberculosis H37Rv 와 M.avium 각각의 균액을 10²~10⁶ CFU/ml로 분주한 후 균의 성장을 현미경 관찰법과 OD 값 및 REMA (Resazurin Microtiter Assay) 실험법을 이용하여 관찰하였다.

보다 구체적으로 96 웰 플레이트에 각각의 세포를 10³ CFU/ml 균액으로 제조하고 10μl를 취한 후, 90μl의 다양한 조합의 배양배지에 분주하여 8일째 400 배율로 균을 이미징하여 균의 성장을 관찰하였다. 또한 같은 방법으로 10²~10⁶ CFU/ml의 균액 10μl와 90μl의 배지를 분주한 후, OD 600nm에서 흡광도를 측정하여 14일째 균의 성장을 관찰하였다. 더욱 정확하고 민감한 결과를 도출하기 위해서 REMA 시험법을 수행하였는데 레자주린(Resazurin)을 PBS에 희석한 0.02% 용액을 30μl첨가하고 트윈 80 20%용액을 12.5μl첨가하여 다양한 시간대에서 형광 밀도를 측정하였다. 단일 세포 추적이 가능한 새로운 형태의 결핵 진단 구조물인 DAC 시스템을 이용하여 결핵균 10²~10⁶ CFU/ml 균액을 제조 후에 단일세포를 만들기 위해 5μm시린지 필터로 여과하였다. 여과된 균액을 1% 아가로오스와 섞은 후 DAC 칩에 분주하였으며, 단일 세포의 성장을 확인하기 위해 7일, 14일, 20일 간격으로 이미지를 수행하였다.

각 확인 방법에 따른 마이코박테리아 성장 증진 효과는 하기 실시예와 같다.

실시예

고체배지에서 마이코박테리아 성장증진 효과

BCG 추출물 첨가에 의한 마이코박테리아 성장 증진 효과를 확인하기 위하여 7H11 아가 플레이트에 먼저 10%의 OADC, ADC (트윈 80 0.5%) 및 FBS 성장보조제를 각각 최종 부피의 10%(v/v) 부피로 첨가하고 여기에 BCG 추출물을 4μg/ml 또는 8μg/ml 첨가하였다. BCG 추출물은 제조시 첨가된 트윈 80에 따라 트윈 80이 0.5% 첨가된 것을 S1, 트윈 80이 0.1% 첨가된 것을 S2로 하였다. 대조군으로 BCG 추출물 없이 성장보조제 OADC, ADC (트윈 80 0.5%), FBS만을 단독으로 첨가한 배지를 사용하였다. 제조된 배지에 NTM (nontuberculosis mycobacteria)의 대표적인 균주인 M.avium과 결핵균의 대표균주인 M. tuberculosis H37Rv의 표준균액 2x10³ CFU/ml 을 스파이럴 플레이팅하여 20일 동안 배양하였다. 배양 후 대표적으로 가장 큰 콜로니 5개를 임의로 선정하고 사이즈를 측정하였으며, 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타낸 바와 같이, BCG 추출물을 포함하는 배지에서 배양된 M.tuberculosis H37Rv와 M.avium 모두 BCG 추출물을 넣지 않은 대조군과 비교했을 때 콜로니 크기가 증가한 것으로 확인되었다.

액체배지에서 마이코박테리아 성장증진 효과

현미경 관찰법에 의한 마이코박테리아 성장증진 효과 확인

액체 배지인 7H9 브로쓰(broth)에서도 BCG 추출물이 결핵균을 포함한 마이코박테리아의 성장 증진 효과를 나타내는지 확인하기 위하여, 7H9 브로쓰에 10%의 성장보조제 ADC 또는 FBS를 최종 부피의 10%(v/v) 부피로 첨가하고 BCG 추출물 S1과 S2를 각각 4μg/ml의 농도로 첨가하였다. 결핵균 M.tuberculosis H37Rv와 M.Avium을 10⁴CFU/ml 의 농도로 준비하고 각각 10μl에 7H9 브로쓰 90μl를 첨가한 후 약 8일 동안 배양하였다. 각각의 웰을 현미경 관찰법을 통하여 관찰하고 이미지를 얻었으며, 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, M.tuberculosis H37Rv와 M.Avium 모두 BCG 추출물이 첨가된 배지에서 대조군과 비교하여 더욱 성장이 증가된 것이 확인되었다. 이를 통해 BCG 추출물이 액체 배지에서도 마이코박테리아의 성장을 더욱 촉진할 수 있음을 알 수 있다.

흡광도 측정을 통한 마이코박테리아 성장 증진 효과 확인

BCG 추출물의 마이코박테리아 성장 증진 효과를 검증하기 위해서 흡광도 측정을 이용한 성장 증진 효과를 확인하였다. 효과 확인을 위한 성장 배지는 액체 배지인 7H9 브로쓰를 이용하였으며, 성장보조제로 OADC, ADC, FBS가 10% 첨가된 배지에 BCG 추출물 S1 또는 S2를 2 또는 4μg/ml씩 첨가하였다.

M.tuberculosis H37Rv 균주와 M.avium균주를 이용하여 각각 10³ CFU/ml의 균액을 제조한 후 상기와 같이 제조된 90μl의 배지에 10μl씩 분주하였다. 약 14일간 배양 후에 분광광도계를 이용해 OD600에서 흡광도를 측정하였으며, 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, BCG 추출물이 첨가된 M. Avium 배양 실험군에서 전체적으로 OD 값이 증가하였다. 특히 ADC에 BCG 추출물을 첨가한 배지에서 배양된 실험군에서는 성장보조제 단독 첨가군과 비교하여 2 배 이상의 흡광도 증가가 확인되었으며, 나머지 성장보조제 OADC, FBS에 BCG를 처리한 실시예에서도 흡광도 증가가 확인되었다. M.tuberculosis H37Rv 균주 역시 OADC, ADC, FBS 성장보조제에 BCG 추출물을 추가한 모든 실시예에서 균의 성장이 더욱 증가하는 것이 확인되었다. 특히 ADC 또는 FBS 에 BCG 추출물을 첨가한 배지에서는 BCG 미첨가 비교예와 비교하여 1.5 배 이상의 매우 뛰어난 성장 증가 효과가 확인되었다.

REMA 실험법을 통한 마이코박테리아 성장 증진 효과 확인

BCG 추출물의 마이코박테리아 성장 촉진 효과를 세포 대사를 통해 확인하기 위하여, 레자주린(Resazurin)을 사용하였다. 마이코박테리아로 결핵균인 M. tuberculosis H37Rv와 비결핵균인 M.avium 및 Pan S (Pan Susceptible)를 임상균주로 사용하였으며, 이를 10⁵CFU/ml 균액으로 만든 후, 각각 10μl씩 분주하고 7H9 브로쓰에 성장보조제 OADC 또는 FBS를 10% 넣고 BCG 추출물 S1과 S2가 각각 1, 2, 4μg 씩 첨가된 배지를 제조하여 90μl씩 분주하였다.

결핵균 배양 시작 7일 후 각각의 웰에 레자주린 0.02%용액을 30μl씩 첨가하고, 트윈 80 20% 용액을 각각 12.5μl 첨가한다. 결핵균의 증식이 활발한 경우에 파란 색에서 분홍색으로 색변화가 단시간에 일어나므로, 37℃ 배양기에서 약 한 두 시간 반응 시킨 후 530/580nm에서 형광을 측정하였다. 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 모든 결핵균에서 BCG 추출물을 첨가한 실험군이 더 우수한 성장을 나타내는 것이 확인되었으며, OADC가 첨가된 실험군에서는 트윈 80이 0.5% 첨가된 S1이 더욱 성장 촉진 효과가 우수한 것으로 나타났고, FBS가 첨가된 실험군에서는 트윈 80이 0.1% 첨가된 S2가 상대적으로 우수한 성장 촉진 효과를 나타내는 것으로 확인되었다. 이와 같은 결과를 통해, 분자적 수준에서 BCG 추출물이 결핵균의 성장을 촉진한다는 효과를 확인할 수 있었다.

미세유체 실험법을 통한 마이코박테리아 성장 증진 효과 확인

(주) 퀀타매트릭스와 결핵연구원이 공동연구를 수행중인 DAC 칩을 이용하는 아가로오스를 이용한 3D 세포 배양 시스템을 통해 마이코박테리아 성장을 확인하였다. DAC 칩을 이용하면 단일 세포 추적을 통하여 칩 안에 있는 콜로니 수를 확인할 수 있는 장점이 있다. 먼저 M.avium과 M.tuberculosis H37Rv 균주를 10³ CFU/ml의 농도로 준비하고 이를 아가로오스 1% 용액과 1:1로 섞은 후 DAC 칩에 36μl 분주하였다. 7H9 브로쓰에 성장보조제인 OADC, ADC, FBS를 10%씩 각각 첨가하고 S1과 S2를 각각 2μg 또는 4μg로 섞어서 제조한 배지 800μl를 DAC 칩에 첨가하였으며, 현미경으로 이미징하여 결핵균을 포함한 마이코박테리아의 성장을 7일, 14일, 21일째에 각각 이미징을 수행하여 확인하였다. 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, M. avium에서는 S2 2μg와 S2 4μg를 첨가한 배지의 균의 성장이 BCG 추출물을 첨가하지 않은 대조군에 비해 더욱 증가됨을 확인하였고 M.tuberculosis H37Rv에서는 BCG 추출물 S1을 2μg로 첨가한 실험군에서 가장 균의 성장이 우수하게 증가하였음을 확인하였다.

이와 같은 결과에 따라 BCG 추출물은 결핵균을 포함한 마이코박테리아의 성장을 고체 배지와 액체 배지 모두에서 효과적으로 증진시킬 수 있음을 확인하였다. 또한 NTM (nontuberculosis mycobacteria)의 대표적인 균주인 M.avium과 결핵균의 대표 균주인 M. tuberculosis H37Rv 두 균주 모두에서 성장 촉진능이 확인됨에 따라 대표적인 결핵균뿐만 아니라 다양한 마이코박테리아의 배양증진을 효과적으로 달성할 수 있음을 확인할 수 있었다. 따라서 BCG 추출물을 이용하여 결핵균 배양 진단에 한층 더 효과적인 개량형 배지를 개발하였으며 이를 통해 결핵균 양성 판정을 단축하여 한발 빠른 결핵치료가 가능해 질 것이 기대된다.

Claims

BCG에 자연분해법(autolysis)을 수행하여 추출한 물질인 BCG (bacilli Calmette-Guerin) 추출물을 유효성분으로 포함하는 마이코박테리움 튜버큐로시스(Mycobacterium tuberculosis) 또는 마이코박테리움 에비움(Mycobacterium avium) 성장 증진용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 OADC(Oleic Albumin Dextrose Catalase), ADC(Albumin Dextrose Catalase) 및 FBS(Fetal bovine serum)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 성장보조제를 더 포함하는 것인, 마이코박테리움 튜버큐로시스 또는 마이코박테리움 에비움 성장 증진용 조성물.
삭제
BCG에 자연분해법을 수행하여 추출한 물질인 BCG 추출물을 포함하는 마이코박테리움 튜버큐로시스 또는 마이코박테리움 에비움 성장 증진용 첨가제.
BCG에 자연분해법을 수행하여 추출한 물질인 BCG 추출물을 포함하는 마이코박테리움 튜버큐로시스 또는 마이코박테리움 에비움 성장 증진용 배지.
제5항에 있어서, 상기 배지는 OADC(Oleic Albumin Dextrose Catalase), ADC(Albumin Dextrose Catalase) 및 FBS(Fetal bovine serum)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 성장보조제를 더 포함하는 것인, 마이코박테리움 튜버큐로시스 또는 마이코박테리움 에비움 성장 증진용 배지.
제5항에 있어서, 상기 배지는 7H9, 7H10, 7H11, 7H12B, Sauton's 배지, Dubos 배지, mWR 배지 및 Lowenstein-Jensen 배지로 이루어진 군에서 선택된 1종인 것인, 마이코박테리움 튜버큐로시스 또는 마이코박테리움 에비움 성장 증진용 배지.
제5항 내지 제7항 중 어느 한 항의 배지에서 마이코박테리움 튜버큐로시스 또는 마이코박테리움 에비움을 배양하는 단계;를 포함하는, 마이코박테리움 튜버큐로시스 또는 마이코박테리움 에비움의 성장을 증진시키는 방법.
a) 배양된 BCG 균체를 세척한 후 원심분리하는 단계;
b) 원심분리된 균체를 냉동시키는 단계;
c) 냉동된 균체를 해동하고 탈이온수 및 트윈 80을 첨가한 조성물을 제조하는 단계;
d) 상기 조성물을 가열하는 단계;
e) 가열된 조성물을 원심분리한 후 상층액을 회수하는 단계; 및
f) 회수한 상층액을 동결건조시킨 후 여과하는 단계;를 포함하고,
마이코박테리움 튜버큐로시스 또는 마이코박테리움 에비움 성장 증진용 BCG 추출물의 제조방법으로서, 상기 BCG 추출물은 BCG에 자연분해법을 수행하여 추출한 물질인 것을 특징으로 하는, BCG 추출물의 제조방법.
제9항에 있어서, 상기 b) 단계의 냉동은 4시간 내지 7일 동안 수행하는 것인, 마이코박테리움 튜버큐로시스 또는 마이코박테리움 에비움의 성장 증진용 BCG 추출물의 제조방법.
제9항에 있어서, 상기 c) 단계의 트윈 80은 조성물의 0.2 내지 3부피% 농도로 첨가되는 것인, BCG 마이코박테리움 튜버큐로시스 또는 마이코박테리움 에비움의 성장 증진용 BCG 추출물의 제조방법.
제9항에 있어서, 상기 d) 단계의 가열은 37 내지 65℃로 가열하는 1차 가열 및 90 내지 120℃로 가열하는 2차 가열을 포함하는 것인, 마이코박테리움 튜버큐로시스 또는 마이코박테리움 에비움의 성장 증진용 BCG 추출물의 제조방법.
BCG에 자연분해법을 수행하여 추출한 물질인 BCG 추출물을 배지에 첨가하는 단계; 를 포함하는 마이코박테리움 튜버큐로시스 또는 마이코박테리움 에비움 성장 증진용 배지의 제조방법.