JPH11155597A - 細胞内成分の分析法 - Google Patents
細胞内成分の分析法Info
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- JPH11155597A JPH11155597A JP9347336A JP34733697A JPH11155597A JP H11155597 A JPH11155597 A JP H11155597A JP 9347336 A JP9347336 A JP 9347336A JP 34733697 A JP34733697 A JP 34733697A JP H11155597 A JPH11155597 A JP H11155597A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】細胞内成分を分析する方法において、抽出試薬
による分析工程の阻害を抑制することができ、且つ細胞
内成分の抽出効率を低下させることがない方法及びその
ための試薬キットの提供。 【解決手段】１.以下の工程を含むことを特徴とする細
胞内成分の分析法。 （１）細胞を含む試料に抽出試薬を加えて細胞内成分を
抽出する工程（２）抽出試薬を含む試料に分岐デキスト
リンまたはその誘導体を加える工程（３）抽出された細
胞内成分を分析する工程。 ２．以下の構成成分を含むことを特徴とする、試薬キッ
ト。 （ａ）抽出試薬（ｂ）分岐デキストリンまたはその誘導
体（ｃ）細胞内成分の分析用試薬
による分析工程の阻害を抑制することができ、且つ細胞
内成分の抽出効率を低下させることがない方法及びその
ための試薬キットの提供。 【解決手段】１.以下の工程を含むことを特徴とする細
胞内成分の分析法。 （１）細胞を含む試料に抽出試薬を加えて細胞内成分を
抽出する工程（２）抽出試薬を含む試料に分岐デキスト
リンまたはその誘導体を加える工程（３）抽出された細
胞内成分を分析する工程。 ２．以下の構成成分を含むことを特徴とする、試薬キッ
ト。 （ａ）抽出試薬（ｂ）分岐デキストリンまたはその誘導
体（ｃ）細胞内成分の分析用試薬
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、細胞内成分の分析法お
よび試薬キットに関する。
よび試薬キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】食品衛生、バイオ、臨床検査、医学、超
純水、環境などの分野では、試料中に含まれる細胞から
細胞内成分を抽出し、該成分を分析することが日常的に
行なわれている。
純水、環境などの分野では、試料中に含まれる細胞から
細胞内成分を抽出し、該成分を分析することが日常的に
行なわれている。
【０００３】細胞内成分を分析することの目的は、多種
多様であるが、例えば、細胞内成分の有無や含量・活性
の測定、核酸の増幅、試料中の微生物の測定（微生物の
有無や種類の判定、生菌数の測定等）等である。
多様であるが、例えば、細胞内成分の有無や含量・活性
の測定、核酸の増幅、試料中の微生物の測定（微生物の
有無や種類の判定、生菌数の測定等）等である。
【０００４】細胞内成分の抽出法としては、細胞を含む
試料に、細胞内成分を抽出するための試薬（以下「抽出
試薬」という）を添加する方法が知られている。抽出試
薬としては、界面活性剤、トリクロロ酢酸、リゾチーム
などの溶菌酵素、エタノール等を有効成分とするものが
使用されている。
試料に、細胞内成分を抽出するための試薬（以下「抽出
試薬」という）を添加する方法が知られている。抽出試
薬としては、界面活性剤、トリクロロ酢酸、リゾチーム
などの溶菌酵素、エタノール等を有効成分とするものが
使用されている。
【０００５】上記の抽出試薬のうち、比較的多用されて
いるのは、界面活性剤を有効成分とするものである。界
面活性剤を有効成分とする抽出試薬を使用する方法（以
下「界面活性剤法」という）において、界面活性剤とし
ては、アニオン界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナト
リウム（SDS）、ラウリル硫酸カリウム、モノラウロイ
ルリン酸ナトリウム、アルキルベンスルホン酸ナトリウ
ム等）、カチオン界面活性剤（例えば塩化ベンザルコニ
ウム（BAC）、塩化ベンゼトニウム（BZC）、塩化セチル
ピリジニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、塩
化ミリスチルジメチルベンジルアンモニウム等）、両性
界面活性剤（例えばTwittergent Detergent 3-08, 3-1
0, 3-12, 3-14, 3-16、Tego等）、非イオン界面活性剤
（例えば、Tween 20, 60, 80、Span 60, 80、 Triton X
-45, X-100, ポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシ
エチレンラウリルエーテル等）等が用いられている。
いるのは、界面活性剤を有効成分とするものである。界
面活性剤を有効成分とする抽出試薬を使用する方法（以
下「界面活性剤法」という）において、界面活性剤とし
ては、アニオン界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナト
リウム（SDS）、ラウリル硫酸カリウム、モノラウロイ
ルリン酸ナトリウム、アルキルベンスルホン酸ナトリウ
ム等）、カチオン界面活性剤（例えば塩化ベンザルコニ
ウム（BAC）、塩化ベンゼトニウム（BZC）、塩化セチル
ピリジニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、塩
化ミリスチルジメチルベンジルアンモニウム等）、両性
界面活性剤（例えばTwittergent Detergent 3-08, 3-1
0, 3-12, 3-14, 3-16、Tego等）、非イオン界面活性剤
（例えば、Tween 20, 60, 80、Span 60, 80、 Triton X
-45, X-100, ポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシ
エチレンラウリルエーテル等）等が用いられている。
【０００６】界面活性剤法では、抽出試薬中の界面活性
剤の濃度が高いほど細胞内成分の抽出効率は高まる。し
かしながら、界面活性剤の濃度が高いほど、界面活性剤
が細胞内成分の分析工程を阻害し、分析感度および精度
の低下を招くという問題があった。
剤の濃度が高いほど細胞内成分の抽出効率は高まる。し
かしながら、界面活性剤の濃度が高いほど、界面活性剤
が細胞内成分の分析工程を阻害し、分析感度および精度
の低下を招くという問題があった。
【０００７】微生物の測定法として、細胞中成分である
アデノシン３リン酸（ＡＴＰ）を生物発光法により測定
する方法が知られている。発光法によるＡＴＰの測定法
は、簡便で、測定時間が短く、さらに高感度であるため
に非常に有効な方法である。生物発光法としては、一般
に、ルシフェリン−ルシフェラーゼ発光反応法が使用さ
れている。
アデノシン３リン酸（ＡＴＰ）を生物発光法により測定
する方法が知られている。発光法によるＡＴＰの測定法
は、簡便で、測定時間が短く、さらに高感度であるため
に非常に有効な方法である。生物発光法としては、一般
に、ルシフェリン−ルシフェラーゼ発光反応法が使用さ
れている。
【０００８】ルシフェリン−ルシフェラーゼ発光反応法
を利用して細胞数を測定する方法において、ＡＴＰの抽
出法として界面活性剤法を採用した場合、界面活性剤の
濃度が高いほどＡＴＰの抽出効率は高まるが、発光反応
が阻害され、測定感度および精度の低下につながる。そ
の原因は、界面活性剤との接触により酵素ルシフェラー
ゼが失活し、発光が急激に減衰するためと考えられてい
る。一方、界面活性剤の濃度が低いと発光反応の阻害を
小さくできるが、ＡＴＰの抽出効率が不十分となる。
を利用して細胞数を測定する方法において、ＡＴＰの抽
出法として界面活性剤法を採用した場合、界面活性剤の
濃度が高いほどＡＴＰの抽出効率は高まるが、発光反応
が阻害され、測定感度および精度の低下につながる。そ
の原因は、界面活性剤との接触により酵素ルシフェラー
ゼが失活し、発光が急激に減衰するためと考えられてい
る。一方、界面活性剤の濃度が低いと発光反応の阻害を
小さくできるが、ＡＴＰの抽出効率が不十分となる。
【０００９】細胞内ＡＴＰの抽出は、細胞を含む試料に
抽出試薬を添加することにより成し遂げられ、通常、界
面活性剤の終濃度が０．００５％前後となるように、抽
出試薬が添加される。充分な抽出能力を発現させるため
には、界面活性剤の終濃度が高い程よい。しかし、界面
活性剤の終濃度が高い場合（例えば、終濃度が0.0１％
以上の場合）、界面活性剤が発光反応を著しく阻害する
ため、測定感度および精度が大きく低下するという問題
があった。
抽出試薬を添加することにより成し遂げられ、通常、界
面活性剤の終濃度が０．００５％前後となるように、抽
出試薬が添加される。充分な抽出能力を発現させるため
には、界面活性剤の終濃度が高い程よい。しかし、界面
活性剤の終濃度が高い場合（例えば、終濃度が0.0１％
以上の場合）、界面活性剤が発光反応を著しく阻害する
ため、測定感度および精度が大きく低下するという問題
があった。
【００１０】また、ＰＣＲ法により核酸を増幅する場
合、界面活性剤がＰＣＲ反応を阻害し、適当なＰＣＲ産
物が形成されないという問題があった。さらに、細胞内
成分が酵素である場合、界面活性剤が抽出された酵素を
変性あるいは失活させるという問題があった。
合、界面活性剤がＰＣＲ反応を阻害し、適当なＰＣＲ産
物が形成されないという問題があった。さらに、細胞内
成分が酵素である場合、界面活性剤が抽出された酵素を
変性あるいは失活させるという問題があった。
【００１１】界面活性剤による分析工程（例えば、生物
発光反応）の阻害を抑制する物質として、サイクロデキ
ストリンまたはその誘導体を使用する方法は公知である
（特表平６−５０４２００号）。また、細胞を含む試料
を界面活性剤と接触させて細胞内ＡＴＰを抽出し、次い
でルシフェリン−ルシフェラーゼ発光反応法により該Ａ
ＴＰを測定する方法において、ＡＴＰ抽出後の試料をサ
イクロデキストリンと接触させた後に発光反応法を適用
することを特徴とする細胞内ＡＴＰの測定方法も公知で
ある（特開平７−２０３９９５号）。しかし、サイクロ
デキストリンを使用する方法においては、 （１）サイクロデキストリンは、それ自身が発光を阻害
する。例えば、α-サイクロデキストリンは発光反応液
中に1% の濃度で存在すると25% 程度、2% の濃度で存在
すると50% 程度の強い発光阻害を示す。 （２）サイクロデキストリンは、高価である。最も中和
能の優れるα-サイクロデキストリンは１kgあたり20,00
0円程度である。という問題があった。
発光反応）の阻害を抑制する物質として、サイクロデキ
ストリンまたはその誘導体を使用する方法は公知である
（特表平６−５０４２００号）。また、細胞を含む試料
を界面活性剤と接触させて細胞内ＡＴＰを抽出し、次い
でルシフェリン−ルシフェラーゼ発光反応法により該Ａ
ＴＰを測定する方法において、ＡＴＰ抽出後の試料をサ
イクロデキストリンと接触させた後に発光反応法を適用
することを特徴とする細胞内ＡＴＰの測定方法も公知で
ある（特開平７−２０３９９５号）。しかし、サイクロ
デキストリンを使用する方法においては、 （１）サイクロデキストリンは、それ自身が発光を阻害
する。例えば、α-サイクロデキストリンは発光反応液
中に1% の濃度で存在すると25% 程度、2% の濃度で存在
すると50% 程度の強い発光阻害を示す。 （２）サイクロデキストリンは、高価である。最も中和
能の優れるα-サイクロデキストリンは１kgあたり20,00
0円程度である。という問題があった。
【００１２】上記の通り、界面活性剤を有効成分とする
抽出試薬を使用する方法においては、細胞内成分を分析
する工程（以下、単に「分析工程」という）を阻害せず
に、細胞内成分を効率よく抽出する方法の確立が急務で
あった。なお、ここでいう「分析工程」とは、細胞内成
分を分析する工程そのもの、及び該分析のための前処
理、さらには、細胞内成分を抽出する工程の後に実施さ
れる何らかの処理工程を意味する。
抽出試薬を使用する方法においては、細胞内成分を分析
する工程（以下、単に「分析工程」という）を阻害せず
に、細胞内成分を効率よく抽出する方法の確立が急務で
あった。なお、ここでいう「分析工程」とは、細胞内成
分を分析する工程そのもの、及び該分析のための前処
理、さらには、細胞内成分を抽出する工程の後に実施さ
れる何らかの処理工程を意味する。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、抽出
試薬を使用して細胞内成分を抽出し、ついで該細胞内成
分を分析する方法において、抽出試薬による分析工程の
阻害を抑制することができ、且つ細胞内成分の抽出効率
を低下させることがない方法を提供することである。ま
た、本発明の目的は、上記の方法に用いられる試薬キッ
トを提供することにある。なお、ここでいう「抑制」と
は、抽出試薬による分析工程の阻害を有意に低減するこ
と、及び該阻害を完全に排除することを意味する。
試薬を使用して細胞内成分を抽出し、ついで該細胞内成
分を分析する方法において、抽出試薬による分析工程の
阻害を抑制することができ、且つ細胞内成分の抽出効率
を低下させることがない方法を提供することである。ま
た、本発明の目的は、上記の方法に用いられる試薬キッ
トを提供することにある。なお、ここでいう「抑制」と
は、抽出試薬による分析工程の阻害を有意に低減するこ
と、及び該阻害を完全に排除することを意味する。
【００１４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、抽出試薬
による分析工程の阻害を抑制（以下「抽出試薬の中和」
または「中和」という）する物質として、分岐デキスト
リンが非常に優れていることを見いだし、その知見に基
づいて本発明を完成した。すなわち本発明は、以下の工
程を含むことを特徴とする細胞内成分の分析法である。 （１）細胞を含む試料に抽出試薬を加えて細胞内成分を
抽出する工程 （２）抽出試薬を含む試料に分岐デキストリンまたはそ
の誘導体を加える工程 （３）抽出された細胞内成分を分析する工程 また、本発明は、抽出試薬が界面活性剤を有効成分とす
るものである、上記に記載の細胞内成分の分析法であ
る。
による分析工程の阻害を抑制（以下「抽出試薬の中和」
または「中和」という）する物質として、分岐デキスト
リンが非常に優れていることを見いだし、その知見に基
づいて本発明を完成した。すなわち本発明は、以下の工
程を含むことを特徴とする細胞内成分の分析法である。 （１）細胞を含む試料に抽出試薬を加えて細胞内成分を
抽出する工程 （２）抽出試薬を含む試料に分岐デキストリンまたはそ
の誘導体を加える工程 （３）抽出された細胞内成分を分析する工程 また、本発明は、抽出試薬が界面活性剤を有効成分とす
るものである、上記に記載の細胞内成分の分析法であ
る。
【００１５】さらに、本発明は、以下の構成成分を含む
ことを特徴とする、試薬キットである。 （ａ）抽出試薬（他の成分と分離して保存） （ｂ）分岐デキストリンまたはその誘導体 （ｃ）細胞内成分の分析用試薬
ことを特徴とする、試薬キットである。 （ａ）抽出試薬（他の成分と分離して保存） （ｂ）分岐デキストリンまたはその誘導体 （ｃ）細胞内成分の分析用試薬
【００１６】
【発明の実施の形態】以下、本発明について詳述する。 <細胞内成分の分析法について> １．細胞を含む試料について 細胞とは、動物、植物、微生物（例えば、酵母、カビ、
キノコ、細菌、放線菌、単細胞藻類、ウイルス、原生動
物等）等を由来とする細胞を意味する。
キノコ、細菌、放線菌、単細胞藻類、ウイルス、原生動
物等）等を由来とする細胞を意味する。
【００１７】試料とは、上記の細胞を含むものであれば
特に限定されないが、例えば、飲食物、医薬、化粧品、
海水、河川水、工業用水、下水、土壌、尿、糞便、血
液、喀痰、膿汁、上記細胞の培養物等が挙げられる。ま
た、上記の試料を、適当な溶媒（例えば、蒸留水、生理
的食塩水、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸ナトリウ
ム緩衝液等）に懸濁した溶液を試料としてもよい。検体
液が固形分を含む場合には、該検体液を適当な溶媒に懸
濁するか、ミキサ−などでホモジナイズすれば溶液状の
ものと同様に扱うことができる。
特に限定されないが、例えば、飲食物、医薬、化粧品、
海水、河川水、工業用水、下水、土壌、尿、糞便、血
液、喀痰、膿汁、上記細胞の培養物等が挙げられる。ま
た、上記の試料を、適当な溶媒（例えば、蒸留水、生理
的食塩水、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸ナトリウ
ム緩衝液等）に懸濁した溶液を試料としてもよい。検体
液が固形分を含む場合には、該検体液を適当な溶媒に懸
濁するか、ミキサ−などでホモジナイズすれば溶液状の
ものと同様に扱うことができる。
【００１８】また、上記溶液状の試料を、親水性または
疎水性の濾過膜で濾過して細胞を捕捉した後に該濾過膜
を試料としてもよい。細胞を捕捉した濾過膜を試料とす
る場合、親水性濾過膜としては、例えば親水性ポリテト
ラフルオロエチレン、親水性ポリビニリデンフルオライ
ド、親水性ポリアミド、アセチルセルローズ、ニトロセ
ルローズ等を材料とするフィルム状又はシート状のもの
が使用できる。また、疎水性濾過膜としては、例えばＰ
ＶＤＦ（ポリビニリデンフルオライド）、ＰＴＦＥ（ポ
リトラフルオロエチレン）、ＰＥ（ポリエチレン）等を
材料とするものが使用できる。 ２．細胞内成分の抽出 本発明では、まず、細胞を含む試料に抽出試薬を加えて
細胞内成分を抽出する。
疎水性の濾過膜で濾過して細胞を捕捉した後に該濾過膜
を試料としてもよい。細胞を捕捉した濾過膜を試料とす
る場合、親水性濾過膜としては、例えば親水性ポリテト
ラフルオロエチレン、親水性ポリビニリデンフルオライ
ド、親水性ポリアミド、アセチルセルローズ、ニトロセ
ルローズ等を材料とするフィルム状又はシート状のもの
が使用できる。また、疎水性濾過膜としては、例えばＰ
ＶＤＦ（ポリビニリデンフルオライド）、ＰＴＦＥ（ポ
リトラフルオロエチレン）、ＰＥ（ポリエチレン）等を
材料とするものが使用できる。 ２．細胞内成分の抽出 本発明では、まず、細胞を含む試料に抽出試薬を加えて
細胞内成分を抽出する。
【００１９】細胞内成分とは、細胞内に含まれる物質及
び代謝産物であれば特に限定されないが、例えば、核
酸、タンパク質、脂質、ビタミン、多糖類等が挙げられ
る。核酸としてはＤＮＡ、ＲＮＡ、ＡＴＰ、ＡＤＰ、Ａ
ＭＰ、サイクリックＡＭＰ等が挙げられる。また、タン
パク質としては酵素、ホルモン、各種ペプチド等が挙げ
られる。
び代謝産物であれば特に限定されないが、例えば、核
酸、タンパク質、脂質、ビタミン、多糖類等が挙げられ
る。核酸としてはＤＮＡ、ＲＮＡ、ＡＴＰ、ＡＤＰ、Ａ
ＭＰ、サイクリックＡＭＰ等が挙げられる。また、タン
パク質としては酵素、ホルモン、各種ペプチド等が挙げ
られる。
【００２０】本発明の抽出試薬とは、以下の性質を有す
るものである。 （１）細胞内成分を抽出する機能を有するもの。 （２）分岐デキストリンまたはその誘導体により、中和
されるもの。 本発明で使用する抽出試薬としては、例えば、界面活性
剤を有効成分とするものが使用できる。界面活性剤とし
ては、アニオン界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナト
リウム（SDS）、ラウリル硫酸カリウム、モノラウロイ
ルリン酸ナトリウム、アルキルベンスルホン酸ナトリウ
ム等）、カチオン界面活性剤（例えば塩化ベンザルコニ
ウム（BAC）、塩化ベンゼトニウム（BZC）、塩化セチル
ピリジニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、塩
化ミリスチルジメチルベンジルアンモニウム等）、両性
界面活性剤（例えばTwittergent Detergent 3-08, 3-1
0,3-12, 3-14, 3-16、Tego等）、非イオン界面活性剤
（例えば、Tween 20, 60, 80、Span 60, 80、 Triton X
-45, X-100, ポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシ
エチレンラウリルエーテル等）等が使用できる。
るものである。 （１）細胞内成分を抽出する機能を有するもの。 （２）分岐デキストリンまたはその誘導体により、中和
されるもの。 本発明で使用する抽出試薬としては、例えば、界面活性
剤を有効成分とするものが使用できる。界面活性剤とし
ては、アニオン界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナト
リウム（SDS）、ラウリル硫酸カリウム、モノラウロイ
ルリン酸ナトリウム、アルキルベンスルホン酸ナトリウ
ム等）、カチオン界面活性剤（例えば塩化ベンザルコニ
ウム（BAC）、塩化ベンゼトニウム（BZC）、塩化セチル
ピリジニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、塩
化ミリスチルジメチルベンジルアンモニウム等）、両性
界面活性剤（例えばTwittergent Detergent 3-08, 3-1
0,3-12, 3-14, 3-16、Tego等）、非イオン界面活性剤
（例えば、Tween 20, 60, 80、Span 60, 80、 Triton X
-45, X-100, ポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシ
エチレンラウリルエーテル等）等が使用できる。
【００２１】試料に抽出試薬を加えるときの条件、すな
わち、抽出試薬の有効成分の種類や濃度、反応時間、温
度等は特に限定されず、分析する細胞内成分の種類、試
料や細胞の状態に応じて適宜設定すればよい。
わち、抽出試薬の有効成分の種類や濃度、反応時間、温
度等は特に限定されず、分析する細胞内成分の種類、試
料や細胞の状態に応じて適宜設定すればよい。
【００２２】３．分岐デキストリンまたはその誘導体の
添加 次いで、抽出試薬を含む試料に、分岐デキストリンまた
はその誘導体（以下、「分岐デキストリン」と総称す
る）を加える。本発明でいう分岐デキストリンは、分枝
デキストリンとも言い、デンプンをアミラーゼで加水分
解した際に生成される、分枝部分を含んだデキストリン
を意味する。
添加 次いで、抽出試薬を含む試料に、分岐デキストリンまた
はその誘導体（以下、「分岐デキストリン」と総称す
る）を加える。本発明でいう分岐デキストリンは、分枝
デキストリンとも言い、デンプンをアミラーゼで加水分
解した際に生成される、分枝部分を含んだデキストリン
を意味する。
【００２３】分岐デキストリンは、抽出試薬を中和でき
るものであれば、その種類、由来、分子量等は特に限定
されず、コーン、甘藷、タピオカおよび馬鈴薯などを由
来とするデンプンを原料として調製することが出来る。
また、分岐デキストリンとしては、市販品を使用するこ
ともできる。市販品としては、ＢＬＤ８、ＢＬＤ１２、
ＢＬＤ１６（いずれも参松工業（株））、SR-7（オルガ
ノ（株））、パインデックス#100（松谷化学工業
（株））あるいはNSD N0.510（日本資糧工業（株））等
が使用できる。
るものであれば、その種類、由来、分子量等は特に限定
されず、コーン、甘藷、タピオカおよび馬鈴薯などを由
来とするデンプンを原料として調製することが出来る。
また、分岐デキストリンとしては、市販品を使用するこ
ともできる。市販品としては、ＢＬＤ８、ＢＬＤ１２、
ＢＬＤ１６（いずれも参松工業（株））、SR-7（オルガ
ノ（株））、パインデックス#100（松谷化学工業
（株））あるいはNSD N0.510（日本資糧工業（株））等
が使用できる。
【００２４】分岐デキストリンは、界面活性剤と結合し
コンプレックスを形成することにより中和作用を発揮す
ると考えられている。そこで、使用する分岐デキストリ
ンの量は、形成されるコンプレックスの化学量論的量を
考慮したモル量に基づいて、抽出剤より過剰に用いるこ
とが望ましい。分岐デキストリンは、緩衝液または水に
溶解して使用すればよい。
コンプレックスを形成することにより中和作用を発揮す
ると考えられている。そこで、使用する分岐デキストリ
ンの量は、形成されるコンプレックスの化学量論的量を
考慮したモル量に基づいて、抽出剤より過剰に用いるこ
とが望ましい。分岐デキストリンは、緩衝液または水に
溶解して使用すればよい。
【００２５】抽出試薬を含む試料に分岐デキストリンを
加えるときの条件、すなわち、分岐デキストリンの種類
や濃度、反応時間、温度等）は特に限定されず、使用し
た抽出試薬の種類、分析する細胞内成分の種類、試料や
細胞の状態に応じて適宜設定すればよい。分析工程での
界面活性剤の終濃度が０．０１〜０．０５％程度である
場合は、通常、終濃度が０．１〜３０％、好ましくは１
〜１０％となるように分岐デキストリンを添加すればよ
い。分岐デキストリンを添加することにより、抽出試薬
が中和され、分析工程を高感度かつ高精度に実施するこ
とができる。
加えるときの条件、すなわち、分岐デキストリンの種類
や濃度、反応時間、温度等）は特に限定されず、使用し
た抽出試薬の種類、分析する細胞内成分の種類、試料や
細胞の状態に応じて適宜設定すればよい。分析工程での
界面活性剤の終濃度が０．０１〜０．０５％程度である
場合は、通常、終濃度が０．１〜３０％、好ましくは１
〜１０％となるように分岐デキストリンを添加すればよ
い。分岐デキストリンを添加することにより、抽出試薬
が中和され、分析工程を高感度かつ高精度に実施するこ
とができる。
【００２６】４．抽出された細胞内成分の分析 次いで、細胞内成分の分析用試薬を試料に添加し、抽出
された細胞内成分を分析する。細胞内成分を分析する方
法及び分析用試薬は特に限定されず、細胞内成分の有無
や含量・活性の測定、核酸の増幅、試料中の微生物の測
定（微生物の有無や種類の判定、生菌数の測定等）等の
ために用いられる方法及び分析用試薬であればどのよう
なものでもよい。
された細胞内成分を分析する。細胞内成分を分析する方
法及び分析用試薬は特に限定されず、細胞内成分の有無
や含量・活性の測定、核酸の増幅、試料中の微生物の測
定（微生物の有無や種類の判定、生菌数の測定等）等の
ために用いられる方法及び分析用試薬であればどのよう
なものでもよい。
【００２７】そのような方法としては、例えば、酵素を
用いる方法、具体的にはDNAポリメラーゼを用いたPCR反
応による核酸の増幅、ルシフェラーゼを用いた細胞内AT
Pの測定等があげられる。細胞内成分がＡＴＰである場
合、ＡＴＰの測定法としては、生物発光法に基づく方
法、例えば、ルシフェリン-ルシフェラーゼ発光反応法
が好適である。生物発光法は、簡便で、測定時間が短
く、高感度である点で優れている。
用いる方法、具体的にはDNAポリメラーゼを用いたPCR反
応による核酸の増幅、ルシフェラーゼを用いた細胞内AT
Pの測定等があげられる。細胞内成分がＡＴＰである場
合、ＡＴＰの測定法としては、生物発光法に基づく方
法、例えば、ルシフェリン-ルシフェラーゼ発光反応法
が好適である。生物発光法は、簡便で、測定時間が短
く、高感度である点で優れている。
【００２８】ルシフェリン-ルシフェラーゼ発光反応法
では、試料に分析用試薬を加えて発光させ、その発光量
を測定する。分析用試薬としては、ルシフェリン、ルシ
フェラーゼ、マグネシウムを含む生物発光試薬（以下
「ルシフェリン−ルシフェラーゼ発光試薬」という）が
使用できる。
では、試料に分析用試薬を加えて発光させ、その発光量
を測定する。分析用試薬としては、ルシフェリン、ルシ
フェラーゼ、マグネシウムを含む生物発光試薬（以下
「ルシフェリン−ルシフェラーゼ発光試薬」という）が
使用できる。
【００２９】発光量の測定では、ルミノメーター、例え
ばキッコーマン社製ルミテスターK-100、アロカ社製ル
ミネッセンスリーダーＢＬＲ−２０１（改良型）、ベル
トールド社製Lumat LB9501等が使用できる。また、細胞
を捕捉した濾過膜を試料とする場合、生物発光画像解析
システム装置、例えばＡＲＧＵＳー５０／ＣＬ〔テーパ
ーファイバー付：浜松ホトニクス（株）社製〕を用いて
濾過膜上の輝点を撮像することにより、細胞数を測定す
ることが可能である。ルシフェリン-ルシフェラーゼ発
光反応法を用いることにより、細胞内のＡＴＰ量の測
定、試料中の細胞数の測定等が可能となる。
ばキッコーマン社製ルミテスターK-100、アロカ社製ル
ミネッセンスリーダーＢＬＲ−２０１（改良型）、ベル
トールド社製Lumat LB9501等が使用できる。また、細胞
を捕捉した濾過膜を試料とする場合、生物発光画像解析
システム装置、例えばＡＲＧＵＳー５０／ＣＬ〔テーパ
ーファイバー付：浜松ホトニクス（株）社製〕を用いて
濾過膜上の輝点を撮像することにより、細胞数を測定す
ることが可能である。ルシフェリン-ルシフェラーゼ発
光反応法を用いることにより、細胞内のＡＴＰ量の測
定、試料中の細胞数の測定等が可能となる。
【００３０】本発明のルシフェリンおよびルシフェラー
ゼとしては、例えば、昆虫（ゲンジボタル、ヘイケボタ
ル、北米産ホタル、ロシアボタル、ヒカリコメツキム
シ、ツチボタル等）を由来とするものが使用できる。ル
シフェラーゼは、上記生物の発光組織から精製した天然
型ルシフェラーゼや、遺伝子工学的手法により調製した
天然型ルシフェラーゼ、さらには天然型ルシフェラーゼ
のアミノ酸配列中の１または複数のアミノ酸に付加、欠
失、置換等の変異を導入した変異型ルシフェラーゼを使
用することができる。ルシフェリン−ルシフェラーゼ発
光試薬としては、市販の試薬キット、例えば、「ルシフ
ェ−ルＬＵ」（キッコ−マン社製）を使用することも可
能である。
ゼとしては、例えば、昆虫（ゲンジボタル、ヘイケボタ
ル、北米産ホタル、ロシアボタル、ヒカリコメツキム
シ、ツチボタル等）を由来とするものが使用できる。ル
シフェラーゼは、上記生物の発光組織から精製した天然
型ルシフェラーゼや、遺伝子工学的手法により調製した
天然型ルシフェラーゼ、さらには天然型ルシフェラーゼ
のアミノ酸配列中の１または複数のアミノ酸に付加、欠
失、置換等の変異を導入した変異型ルシフェラーゼを使
用することができる。ルシフェリン−ルシフェラーゼ発
光試薬としては、市販の試薬キット、例えば、「ルシフ
ェ−ルＬＵ」（キッコ−マン社製）を使用することも可
能である。
【００３１】なお、本発明では、試料に分岐デキストリ
ンを加える工程と、分析工程との順序は特に限定されな
い。すなわち、分岐デキストリンを加える工程の次に分
析工程を実施してもよく、また、操作の簡便化のために
両工程を同時に実施してもよい。両工程を同時に実施す
る場合は、分析用試薬に分岐デキストリンを加えた混合
試薬を調製し、これを、抽出試薬を含む試料に添加すれ
ればよい。
ンを加える工程と、分析工程との順序は特に限定されな
い。すなわち、分岐デキストリンを加える工程の次に分
析工程を実施してもよく、また、操作の簡便化のために
両工程を同時に実施してもよい。両工程を同時に実施す
る場合は、分析用試薬に分岐デキストリンを加えた混合
試薬を調製し、これを、抽出試薬を含む試料に添加すれ
ればよい。
【００３２】<本発明の試薬キットについて>本発明の試
薬キットは、以下の構成成分を含むものである。 （ａ）抽出試薬（他の成分と分離して保存） （ｂ）分岐デキストリンまたはその誘導体 （ｃ）細胞内成分の分析用試薬 上記成分のうち、成分（ａ）は、他の成分と分離して保
存される。また、（ｂ）と（ｃ）とは別々にしてもよ
く、また両者を混合してもよい。操作の簡便化のため、
各成分は適当な緩衝液に溶解されていることが好まし
い。また、各成分には、試薬のｐＨ調製や保存性向上に
関与する物質を添加してもよい。そのような物質として
は、例えば、ＥＤＴＡ ２Ｎａ、ジチオスレイトール、
硫酸アンモニウム、シュークロース、２−メルカプトエ
タノール、HEPES、Tricine、Tris等が挙げられる。これ
らの物質は、上記（ａ）〜（ｃ）とは別個の成分として
試薬キットに加えてもよい。
薬キットは、以下の構成成分を含むものである。 （ａ）抽出試薬（他の成分と分離して保存） （ｂ）分岐デキストリンまたはその誘導体 （ｃ）細胞内成分の分析用試薬 上記成分のうち、成分（ａ）は、他の成分と分離して保
存される。また、（ｂ）と（ｃ）とは別々にしてもよ
く、また両者を混合してもよい。操作の簡便化のため、
各成分は適当な緩衝液に溶解されていることが好まし
い。また、各成分には、試薬のｐＨ調製や保存性向上に
関与する物質を添加してもよい。そのような物質として
は、例えば、ＥＤＴＡ ２Ｎａ、ジチオスレイトール、
硫酸アンモニウム、シュークロース、２−メルカプトエ
タノール、HEPES、Tricine、Tris等が挙げられる。これ
らの物質は、上記（ａ）〜（ｃ）とは別個の成分として
試薬キットに加えてもよい。
【００３３】成分（ｃ）は、分析すべき細胞内成分に応
じて適時選択される。細胞内ＡＴＰを分析する場合、成
分（ｃ）としては、例えば、生物発光試薬、具体的に
は、ルシフェリン-ルシフェラーゼ発光試薬が使用でき
る。発光試薬としては、市販の試薬キット、例えば、
「ルシフェ−ルＬＵ」（キッコ−マン社製）を使用する
ことも可能である。本発明の試薬キットを使用する場合
は、上記細胞内成分の分析法に従い、各成分を試料に添
加すればよい。
じて適時選択される。細胞内ＡＴＰを分析する場合、成
分（ｃ）としては、例えば、生物発光試薬、具体的に
は、ルシフェリン-ルシフェラーゼ発光試薬が使用でき
る。発光試薬としては、市販の試薬キット、例えば、
「ルシフェ−ルＬＵ」（キッコ−マン社製）を使用する
ことも可能である。本発明の試薬キットを使用する場合
は、上記細胞内成分の分析法に従い、各成分を試料に添
加すればよい。
【００３４】
【実施例】以下、実施例により本発明を具体的に説明す
る。 ＜実施例１＞ （各種分岐デキストリンによる界面活性剤の中和） １．分岐デキストリンについて 様々な原料から得られた各種分岐デキストリンの界面活
性剤中和能を検討した。使用した１２種の分岐デキスト
リンを表１に示す。これらのうちＢＬＤ８は参松工業
（株）製の市販品であるが、その他のサンプルは、表中
に示した各種デンプン原料をアミラーゼ処理することに
より試験的に製造された。表中のＤＥとはデンプンの分
解率を表す指標で、ＤＥが低いほど粘度が高くなる。各
種分岐デキストリンは10% (w/v)の濃度で25 mM Tricine
(pH 7.75) に溶解して使用した。また、対照の中和剤
として、α-サイクロデキストリン（αCD、メルシャン
社製）を使用した。
る。 ＜実施例１＞ （各種分岐デキストリンによる界面活性剤の中和） １．分岐デキストリンについて 様々な原料から得られた各種分岐デキストリンの界面活
性剤中和能を検討した。使用した１２種の分岐デキスト
リンを表１に示す。これらのうちＢＬＤ８は参松工業
（株）製の市販品であるが、その他のサンプルは、表中
に示した各種デンプン原料をアミラーゼ処理することに
より試験的に製造された。表中のＤＥとはデンプンの分
解率を表す指標で、ＤＥが低いほど粘度が高くなる。各
種分岐デキストリンは10% (w/v)の濃度で25 mM Tricine
(pH 7.75) に溶解して使用した。また、対照の中和剤
として、α-サイクロデキストリン（αCD、メルシャン
社製）を使用した。
【００３５】
【表１】
【００３６】２．界面活性剤について 界面活性剤として、塩化ヘ゛ンサ゛ルコニウム（BAC、日本薬局方
のオズバン液）を0.1%の濃度で25 mM Tricine (pH 7.7
5)に溶解したものを使用した。 ３．ＡＴＰの測定法 100 μl のATP溶液（2x10-8 M）に、50 μl の0.1% BAC
を添加し、さらに50 μlの分岐デキストリン溶液を添加
した。その後、「ルシフェールLU」（キッコーマン社
製）に付属の発光試薬50μl を添加し、生じた発光量を
Berthold社製LumatLB-9501を用い、１秒ごとに１分間に
渡って経時的に測定した。
のオズバン液）を0.1%の濃度で25 mM Tricine (pH 7.7
5)に溶解したものを使用した。 ３．ＡＴＰの測定法 100 μl のATP溶液（2x10-8 M）に、50 μl の0.1% BAC
を添加し、さらに50 μlの分岐デキストリン溶液を添加
した。その後、「ルシフェールLU」（キッコーマン社
製）に付属の発光試薬50μl を添加し、生じた発光量を
Berthold社製LumatLB-9501を用い、１秒ごとに１分間に
渡って経時的に測定した。
【００３７】４．結果 測定結果を図１〜２に示す。なお、0.1% BACの代わりに
25 mM Tricine（pH 7.75）を用いた場合を「BACな
し」、分岐デキストリン溶液の代わりに25 mM Tricine
（pH 7.75）を用いた場合を「BACのみ」の結果として示
した。図中、縦軸には発光量を、横軸には生物発光試薬
添加後の経過時間を示す。
25 mM Tricine（pH 7.75）を用いた場合を「BACな
し」、分岐デキストリン溶液の代わりに25 mM Tricine
（pH 7.75）を用いた場合を「BACのみ」の結果として示
した。図中、縦軸には発光量を、横軸には生物発光試薬
添加後の経過時間を示す。
【００３８】「BACのみ」の場合、BACにより生物発光試
薬中のルシフェラーゼが失活し、BACなしの結果と比べ
て初発発光量の低下および発光量の急激な減衰が認めら
れた。界面活性剤の中和物質として知られるαCDを添加
すると、初発発光量は低下するものの発光量の減衰が大
幅に抑制された。各種分岐デキストリンはいずれもαCD
と同様に発光の減衰を抑制し、特にサンプルＡ、Ｄ、
Ｆ、Ｇ、ＩおよびＢＬＤ８は強い抑制効果を示した。以
上により、分岐デキストリンは、αCDと同様に界面活性
剤によるルシフェラーゼの失活を中和し、発光の阻害を
抑制する効果があることが認められた。
薬中のルシフェラーゼが失活し、BACなしの結果と比べ
て初発発光量の低下および発光量の急激な減衰が認めら
れた。界面活性剤の中和物質として知られるαCDを添加
すると、初発発光量は低下するものの発光量の減衰が大
幅に抑制された。各種分岐デキストリンはいずれもαCD
と同様に発光の減衰を抑制し、特にサンプルＡ、Ｄ、
Ｆ、Ｇ、ＩおよびＢＬＤ８は強い抑制効果を示した。以
上により、分岐デキストリンは、αCDと同様に界面活性
剤によるルシフェラーゼの失活を中和し、発光の阻害を
抑制する効果があることが認められた。
【００３９】＜実施例２＞ （各種中和剤自身による生物発光の阻害）界面活性剤の
中和剤として知られるサイクロデキストリンは、それ自
身が発光阻害を示し、感度および精度の低下を引き起こ
す。そこで、分岐デキストリンの生物発光阻害を検討し
た。
中和剤として知られるサイクロデキストリンは、それ自
身が発光阻害を示し、感度および精度の低下を引き起こ
す。そこで、分岐デキストリンの生物発光阻害を検討し
た。
【００４０】１．使用した分岐デキストリン 分岐デキストリンとして、BLD8、BLD12およびBLD16（い
ずれも参松工業（株）製）を、また対照としてα-サイ
クロデキストリン（αCD、メルシャン社製）を使用し
た。
ずれも参松工業（株）製）を、また対照としてα-サイ
クロデキストリン（αCD、メルシャン社製）を使用し
た。
【００４１】２．ＡＴＰの測定法 100 μl のATP溶液（2x10-8 M）に50 μl の25 mM Tric
ine（pH 7.75）を添加し、さらに50 μlの5% および10%
の中和剤溶液（分岐デキストリンおよびαCD溶液）を
添加した。その後、「ルシフェールLU」（キッコーマン
社製）に付属の発光試薬50μlを添加し、生じた発光量
をBerthold社製Lumat LB-9501を用い、待ち時間５秒、
積算時間３秒の測定条件で発光量を測定した。
ine（pH 7.75）を添加し、さらに50 μlの5% および10%
の中和剤溶液（分岐デキストリンおよびαCD溶液）を
添加した。その後、「ルシフェールLU」（キッコーマン
社製）に付属の発光試薬50μlを添加し、生じた発光量
をBerthold社製Lumat LB-9501を用い、待ち時間５秒、
積算時間３秒の測定条件で発光量を測定した。
【００４２】測定値と共に、中和剤なし、すなわち中和
剤溶液の代わりに25 mM Tricine（pH 7.75）を用いた場
合の発光量を100%とした際の、各中和剤使用時の発光量
の相対比を表２に示した。
剤溶液の代わりに25 mM Tricine（pH 7.75）を用いた場
合の発光量を100%とした際の、各中和剤使用時の発光量
の相対比を表２に示した。
【００４３】
【表２】
【００４４】３．結果 αCDは5%溶液使用時（発光反応時の濃度1%）で25% 程
度、10%溶液使用時（発光反応時の濃度2%）で50% 程度
の強い発光阻害を示した。一方、分岐デキストリン３種
はほとんど発光阻害を示さず、10%溶液使用時でも数％
程度の阻害にとどまった。従って、分岐デキストリン
は、中和剤として同様に用いられるαCDより発光阻害が
少なく、測定感度および精度面で有利であることが示さ
れた。
度、10%溶液使用時（発光反応時の濃度2%）で50% 程度
の強い発光阻害を示した。一方、分岐デキストリン３種
はほとんど発光阻害を示さず、10%溶液使用時でも数％
程度の阻害にとどまった。従って、分岐デキストリン
は、中和剤として同様に用いられるαCDより発光阻害が
少なく、測定感度および精度面で有利であることが示さ
れた。
【００４５】＜実施例３＞ （分岐デキストリンによる各種界面活性剤の中和）各種
界面活性剤に対する分岐デキストリンの中和作用につい
て検討した。 １．使用した分岐デキストリン 分岐デキストリンとしてBLD8、BLD12およびBLD16を使用
した。また、対照としてα-サイクロデキストリン（αC
D、メルシャン社製）を使用した。分岐デキストリンま
たはαCD を、10% (w/v)で25 mM Tricine（pH 7.75）に
溶解し、中和剤溶液として使用した。 １．使用した界面活性剤 界面活性剤として塩化ベンザルコニウム（BAC、日本薬
局方のオスバン液）、塩化ベンゼトニウム（BZC、日本
薬局方のハイアミン液）、Twittergent 3-16（Calbioch
em社製）、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS、和光純薬社
製）、Triton X-100（和光純薬社製）を使用した。上記
の界面活性剤を、0.1%または0.01%の濃度で25 mM Trici
ne (pH 7.75)に溶解したものを界面活性剤溶液とした。
界面活性剤に対する分岐デキストリンの中和作用につい
て検討した。 １．使用した分岐デキストリン 分岐デキストリンとしてBLD8、BLD12およびBLD16を使用
した。また、対照としてα-サイクロデキストリン（αC
D、メルシャン社製）を使用した。分岐デキストリンま
たはαCD を、10% (w/v)で25 mM Tricine（pH 7.75）に
溶解し、中和剤溶液として使用した。 １．使用した界面活性剤 界面活性剤として塩化ベンザルコニウム（BAC、日本薬
局方のオスバン液）、塩化ベンゼトニウム（BZC、日本
薬局方のハイアミン液）、Twittergent 3-16（Calbioch
em社製）、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS、和光純薬社
製）、Triton X-100（和光純薬社製）を使用した。上記
の界面活性剤を、0.1%または0.01%の濃度で25 mM Trici
ne (pH 7.75)に溶解したものを界面活性剤溶液とした。
【００４６】３．ＡＴＰの測定法 実施例１と同様、100 μl のATP溶液（2x10-8 M）に50
μl の界面活性剤溶液を添加し、さらに50 μlの中和剤
溶液を添加した。その後、「ルシフェールLU」（キッコ
ーマン社製）に付属の発光試薬50μlを添加し、生じた
発光量をBerthold社製Lumat LB-9501を用い、１秒ごと
に30秒間に渡って経時的に測定した。
μl の界面活性剤溶液を添加し、さらに50 μlの中和剤
溶液を添加した。その後、「ルシフェールLU」（キッコ
ーマン社製）に付属の発光試薬50μlを添加し、生じた
発光量をBerthold社製Lumat LB-9501を用い、１秒ごと
に30秒間に渡って経時的に測定した。
【００４７】４．結果 （１）界面活性剤として、0.1% 塩化ベンザルコニウム
（BAC）を用いた結果を図３に示す。BACの場合、BACの
みの初発発光量はBACなしと比べるとやや低く、また、
発光量の急激な減衰が認められた。これは、BACの影響
により発光試薬中のルシフェラーゼが失活したためであ
ると考えられた。中和剤としてαCDを用いた場合、発光
量の経時的な減衰が抑制された。分岐デキストリンを用
いた場合も、αCDと同様に経時的な発光量の減衰を抑制
することができた。従って、分岐デキストリンはαCDと
同様にBACに対する中和作用を示すことが明らかとなっ
た。
（BAC）を用いた結果を図３に示す。BACの場合、BACの
みの初発発光量はBACなしと比べるとやや低く、また、
発光量の急激な減衰が認められた。これは、BACの影響
により発光試薬中のルシフェラーゼが失活したためであ
ると考えられた。中和剤としてαCDを用いた場合、発光
量の経時的な減衰が抑制された。分岐デキストリンを用
いた場合も、αCDと同様に経時的な発光量の減衰を抑制
することができた。従って、分岐デキストリンはαCDと
同様にBACに対する中和作用を示すことが明らかとなっ
た。
【００４８】また、いずれの分岐デキストリンを用いて
もαCDより初発発光量が高く、経時的に得られる発光量
は常にαCDより高かった。従って、BACに対しては中和
剤として分岐デキストリンを用いた方が高い発光量が得
られるため、中和作用は分岐デキストリンの方がαCDよ
り優れていることが示された。 （２）界面活性剤として、0.1% 塩化ベンゼトニウム（B
ZC）を用いた結果を図４に示す。
もαCDより初発発光量が高く、経時的に得られる発光量
は常にαCDより高かった。従って、BACに対しては中和
剤として分岐デキストリンを用いた方が高い発光量が得
られるため、中和作用は分岐デキストリンの方がαCDよ
り優れていることが示された。 （２）界面活性剤として、0.1% 塩化ベンゼトニウム（B
ZC）を用いた結果を図４に示す。
【００４９】BZCのみの発光経過は、初発発光量がBZCな
しの場合と比べて低く、また発光の減衰も急激であっ
た。中和剤としてαCDを用いた場合、経時的な発光の減
衰が抑制された。分岐デキストリンを用いた場合も、経
時的な発光量の減衰を抑制することができた。従って、
分岐デキストリンはαCDと同様にBZCに対する中和作用
を示すことが明らかとなった。また、いずれの分岐デキ
ストリンを用いてもαCDより初発発光量が高く、経時的
に得られる発光量は常にαCDより高かった。従って、BZ
Cに対しては中和剤として分岐デキストリンを用いた方
が高い発光量が得られるため、中和作用は分岐デキスト
リンの方がαCDより優れていることが示された。
しの場合と比べて低く、また発光の減衰も急激であっ
た。中和剤としてαCDを用いた場合、経時的な発光の減
衰が抑制された。分岐デキストリンを用いた場合も、経
時的な発光量の減衰を抑制することができた。従って、
分岐デキストリンはαCDと同様にBZCに対する中和作用
を示すことが明らかとなった。また、いずれの分岐デキ
ストリンを用いてもαCDより初発発光量が高く、経時的
に得られる発光量は常にαCDより高かった。従って、BZ
Cに対しては中和剤として分岐デキストリンを用いた方
が高い発光量が得られるため、中和作用は分岐デキスト
リンの方がαCDより優れていることが示された。
【００５０】（３）界面活性剤として、0.1% Twitterge
nt 3-16を用いた結果を図５に示す。Twittergent 3-16
のみの場合の発光経過は、初発発光量がTwittergent 3-
16なしの時の１／３と極めて低く、また発光の減衰も急
激であった。中和剤としてαCDを用いた場合、初発発光
量および発光の減衰共に大幅に改善された。一方、分岐
デキストリンを用いた場合、初発発光量および発光の減
衰共にαCDの場合より更に改善され、特にBLD8およびBL
D12は優れた中和能を示した。
nt 3-16を用いた結果を図５に示す。Twittergent 3-16
のみの場合の発光経過は、初発発光量がTwittergent 3-
16なしの時の１／３と極めて低く、また発光の減衰も急
激であった。中和剤としてαCDを用いた場合、初発発光
量および発光の減衰共に大幅に改善された。一方、分岐
デキストリンを用いた場合、初発発光量および発光の減
衰共にαCDの場合より更に改善され、特にBLD8およびBL
D12は優れた中和能を示した。
【００５１】従って、Twittergent 3-16に対しては中和
剤として分岐デキストリンを用いた方が高い発光量が得
られるため、中和作用は分岐デキストリンの方がαCDよ
り優れていることが示された。
剤として分岐デキストリンを用いた方が高い発光量が得
られるため、中和作用は分岐デキストリンの方がαCDよ
り優れていることが示された。
【００５２】（４）界面活性剤として、0.01% ドデシル
硫酸ナトリウム（SDS）を用いた結果を図６に示す。SDS
のみの発光経過はSDSなしに比べ著しく低い発光量で推
移した。これは、生物発光試薬中のルシフェラーゼがSD
Sにより阻害を受け、発光量が全体的に低下するためで
ある。中和剤としてαCDを用いた場合、発光経過は中和
剤なしの場合より高い発光量で推移した。一方分岐デキ
ストリンを用いた場合も、αCDの場合と同様に発光経過
は高い発光量で推移した。
硫酸ナトリウム（SDS）を用いた結果を図６に示す。SDS
のみの発光経過はSDSなしに比べ著しく低い発光量で推
移した。これは、生物発光試薬中のルシフェラーゼがSD
Sにより阻害を受け、発光量が全体的に低下するためで
ある。中和剤としてαCDを用いた場合、発光経過は中和
剤なしの場合より高い発光量で推移した。一方分岐デキ
ストリンを用いた場合も、αCDの場合と同様に発光経過
は高い発光量で推移した。
【００５３】従って、分岐デキストリンはSDSに対して
もαCDと同様の中和作用を示すことが明らかとなった。
特にBLD8およびBLD12を用いた場合はαCDより高い発光
量が得られるため、これら分岐デキストリンの中和作用
はαCDより優れていることが示された。
もαCDと同様の中和作用を示すことが明らかとなった。
特にBLD8およびBLD12を用いた場合はαCDより高い発光
量が得られるため、これら分岐デキストリンの中和作用
はαCDより優れていることが示された。
【００５４】（５）界面活性剤として、0.01% Triton X
-100を用いた結果を図７に示す。Triton X-100は、 Tri
ton X-100のみの発光経過がTriton X-100なしの場合よ
り若干低い発光量を示す程度で、ほとんど発光反応に悪
影響を及ぼさなかった。中和剤としてαCDを用いた場
合、αCD自身の発光阻害によって発光経過は低い発光量
で推移した。一方、分岐デキストリンを用いた場合の発
光経過はいずれもTriton X-100なしとほぼ同じか、若干
低い発光量で推移した。
-100を用いた結果を図７に示す。Triton X-100は、 Tri
ton X-100のみの発光経過がTriton X-100なしの場合よ
り若干低い発光量を示す程度で、ほとんど発光反応に悪
影響を及ぼさなかった。中和剤としてαCDを用いた場
合、αCD自身の発光阻害によって発光経過は低い発光量
で推移した。一方、分岐デキストリンを用いた場合の発
光経過はいずれもTriton X-100なしとほぼ同じか、若干
低い発光量で推移した。
【００５５】従って、Triton X-100に対しては中和剤と
して分岐デキストリンを用いた方が高い発光量が得られ
るため、中和作用は分岐デキストリンの方がαCDより優
れていることが示された。
して分岐デキストリンを用いた方が高い発光量が得られ
るため、中和作用は分岐デキストリンの方がαCDより優
れていることが示された。
【００５６】＜実施例４＞ （細胞内ATPの測定）次に、本発明法による微生物細胞
内ATPの測定を、従来法３種による測定と比較して示
す。従来法１として、トリクロロ酢酸（TCA）を用いるT
CA抽出法により細胞内ATPを抽出し、抽出されたATP量を
ルシフェリン-ルシフェラーゼ反応により測定する方法
を採用した。TCA抽出法は、ATPの抽出効率が非常に優れ
ている。しかしTCAはルシフェリン-ルシフェラーゼ反応
は強く阻害するため、反応液を大きく希釈する必要があ
る。このため、この方法は操作が煩雑であり、希釈によ
り測定感度の低下が起こるという問題がある。
内ATPの測定を、従来法３種による測定と比較して示
す。従来法１として、トリクロロ酢酸（TCA）を用いるT
CA抽出法により細胞内ATPを抽出し、抽出されたATP量を
ルシフェリン-ルシフェラーゼ反応により測定する方法
を採用した。TCA抽出法は、ATPの抽出効率が非常に優れ
ている。しかしTCAはルシフェリン-ルシフェラーゼ反応
は強く阻害するため、反応液を大きく希釈する必要があ
る。このため、この方法は操作が煩雑であり、希釈によ
り測定感度の低下が起こるという問題がある。
【００５７】従来法２として、界面活性剤によりATPを
抽出し、抽出されたATP量を中和剤なしでルシフェリン-
ルシフェラーゼ反応により測定する方法を採用した。従
来法３として、界面活性剤によりATPを抽出し、その作
用をサイクロデキストリンで中和した後に抽出されたAT
P量をルシフェリン-ルシフェラーゼ反応により測定する
方法を採用した（特表平6-504200、特開平7-203995）。
抽出し、抽出されたATP量を中和剤なしでルシフェリン-
ルシフェラーゼ反応により測定する方法を採用した。従
来法３として、界面活性剤によりATPを抽出し、その作
用をサイクロデキストリンで中和した後に抽出されたAT
P量をルシフェリン-ルシフェラーゼ反応により測定する
方法を採用した（特表平6-504200、特開平7-203995）。
【００５８】１．使用した分岐デキストリン 分岐デキストリンとしてBLD8を使用した。また、対照と
してα-サイクロデキストリン（αCD、メルシャン社
製）を使用した。 ２．使用した界面活性剤 界面活性剤として、塩化ベンザルコニウム（BAC、日本
薬局方のオスバン液）、塩化ベンゼトニウム（BZC、日
本薬局方のハイアミン液）を使用した。上記界面活性剤
を0.1%の濃度で25 mM Tricine (pH 7.75)に溶解したも
のを、界面活性剤溶液とした。 ３．使用した微生物 微生物として、Escherichia coli （ATCC 25922）、Sta
phylococcus aureus（ATCC 25923）およびBacillus sub
tilis （ATCC 9372）の３菌種を用いた。上記微生物を
普通ブイヨン培地（栄研化学（株）製）で一晩３５℃で
培養した培養液を測定試料として用いた。
してα-サイクロデキストリン（αCD、メルシャン社
製）を使用した。 ２．使用した界面活性剤 界面活性剤として、塩化ベンザルコニウム（BAC、日本
薬局方のオスバン液）、塩化ベンゼトニウム（BZC、日
本薬局方のハイアミン液）を使用した。上記界面活性剤
を0.1%の濃度で25 mM Tricine (pH 7.75)に溶解したも
のを、界面活性剤溶液とした。 ３．使用した微生物 微生物として、Escherichia coli （ATCC 25922）、Sta
phylococcus aureus（ATCC 25923）およびBacillus sub
tilis （ATCC 9372）の３菌種を用いた。上記微生物を
普通ブイヨン培地（栄研化学（株）製）で一晩３５℃で
培養した培養液を測定試料として用いた。
【００５９】なお、従来法１ではTCAによる発光の阻害
を避けるため、抽出したATP量を測定する前に試料を100
倍に希釈する必要がある。そこで、従来法１では一晩培
養液原液を試料として用い、その他の測定法ではその１
００倍希釈液を試料として用いた。
を避けるため、抽出したATP量を測定する前に試料を100
倍に希釈する必要がある。そこで、従来法１では一晩培
養液原液を試料として用い、その他の測定法ではその１
００倍希釈液を試料として用いた。
【００６０】４．細胞内ＡＴＰの測定法について （１）本発明法について 測定試料100 μl に50 μl の界面活性剤溶液を添加し
て２０秒間放置し、微生物よりATPを抽出した。次い
で、50 μl の10% 分岐デキストリン溶液を添加した。
さらに50 μl の生物発光試薬を添加後、直ちに発光量
を測定した。
て２０秒間放置し、微生物よりATPを抽出した。次い
で、50 μl の10% 分岐デキストリン溶液を添加した。
さらに50 μl の生物発光試薬を添加後、直ちに発光量
を測定した。
【００６１】（２）従来法１ 測定試料100 μl に等量の5% トリクロロ酢酸溶液を加
えて１分間放置し、微生物よりATPを抽出した。その抽
出液に9.8 mlの25 mM Tricine (pH 7.75) を添加してよ
く撹拌した。この試料100 μl を発光測定用チューブに
取り、100 μlの25 mM Tricine (pH 7.75) および「ル
シフェールLU」（キッコーマン社製）に付属の発光試薬
100 μl を添加、直ちに発光量を測定した。
えて１分間放置し、微生物よりATPを抽出した。その抽
出液に9.8 mlの25 mM Tricine (pH 7.75) を添加してよ
く撹拌した。この試料100 μl を発光測定用チューブに
取り、100 μlの25 mM Tricine (pH 7.75) および「ル
シフェールLU」（キッコーマン社製）に付属の発光試薬
100 μl を添加、直ちに発光量を測定した。
【００６２】（３）従来法２ 測定試料100 μl に50 μl の界面活性剤溶液を添加し
て２０秒間放置し、微生物よりATPを抽出した。次い
で、50 μl の25 mM Tricine (pH 7.75)を添加した。さ
らに50 μl の生物発光試薬を添加後、直ちに発光量を
測定した。 （４）従来法３ 測定試料100 μl に50 μl の界面活性剤溶液を添加し
て２０秒間放置し、微生物よりATPを抽出した。次い
で、50 μl の10% α-サイクロデキストリン（αCD）溶
液を添加した。さらに50 μl の生物発光試薬を添加
後、直ちに発光量を測定した。
て２０秒間放置し、微生物よりATPを抽出した。次い
で、50 μl の25 mM Tricine (pH 7.75)を添加した。さ
らに50 μl の生物発光試薬を添加後、直ちに発光量を
測定した。 （４）従来法３ 測定試料100 μl に50 μl の界面活性剤溶液を添加し
て２０秒間放置し、微生物よりATPを抽出した。次い
で、50 μl の10% α-サイクロデキストリン（αCD）溶
液を添加した。さらに50 μl の生物発光試薬を添加
後、直ちに発光量を測定した。
【００６３】５．結果 界面活性剤として塩化ベンザルコニウム（BAC）を用い
た場合に各測定法により得られた発光量を表３に示す。
また、TCA抽出法である従来法１で得られた発光量を100
%とした際の、各測定法で得られた発光量の相対比も表
中に示した。
た場合に各測定法により得られた発光量を表３に示す。
また、TCA抽出法である従来法１で得られた発光量を100
%とした際の、各測定法で得られた発光量の相対比も表
中に示した。
【００６４】
【表３】
【００６５】従来法２、すなわち中和剤なしの時の発光
量はTCA抽出法である従来法１の３〜４割程度であり、
著しく発光の阻害を受けているのがわかる。従来法３、
すなわち中和剤としてαCDを用いた場合、発光量は中和
剤なしの従来法２より大きくなるものの、TCA抽出法で
ある従来法１の５割程度にとどまった。
量はTCA抽出法である従来法１の３〜４割程度であり、
著しく発光の阻害を受けているのがわかる。従来法３、
すなわち中和剤としてαCDを用いた場合、発光量は中和
剤なしの従来法２より大きくなるものの、TCA抽出法で
ある従来法１の５割程度にとどまった。
【００６６】一方、本発明法、すなわち中和剤として分
岐デキストリンを用いた場合、発光量はTCA抽出法であ
る従来法１で得られる発光量の６〜８割と中和剤なしの
従来法２の倍程度にまで増加し、従って感度および精度
面での大幅な改善が認められた。その発光量は中和剤と
してαCDを用いる従来法２を上回り、従ってBACを用い
た微生物ATPの測定において、分岐デキストリンの中和
作用はαCDより優れていることが示された。
岐デキストリンを用いた場合、発光量はTCA抽出法であ
る従来法１で得られる発光量の６〜８割と中和剤なしの
従来法２の倍程度にまで増加し、従って感度および精度
面での大幅な改善が認められた。その発光量は中和剤と
してαCDを用いる従来法２を上回り、従ってBACを用い
た微生物ATPの測定において、分岐デキストリンの中和
作用はαCDより優れていることが示された。
【００６７】（２）界面活性剤として塩化ベンゼトニウ
ム（BZC）を用いた場合に各測定法により得られた発光
量を表４に示す。また、TCA抽出法である従来法１で得
られた発光量を100%とした際の、各測定法で得られた発
光量の相対比も表中に示した。
ム（BZC）を用いた場合に各測定法により得られた発光
量を表４に示す。また、TCA抽出法である従来法１で得
られた発光量を100%とした際の、各測定法で得られた発
光量の相対比も表中に示した。
【００６８】
【表４】
【００６９】従来法２、すなわち中和剤なしの時の発光
量はTCA抽出法である従来法１の３割前後であり、BACの
時と同様に著しく発光の阻害を受けているのがわかる。
従来法３、すなわち中和剤としてαCDを用いても、発光
量は中和剤なしの時より若干大きくなるにとどまった。
量はTCA抽出法である従来法１の３割前後であり、BACの
時と同様に著しく発光の阻害を受けているのがわかる。
従来法３、すなわち中和剤としてαCDを用いても、発光
量は中和剤なしの時より若干大きくなるにとどまった。
【００７０】一方、本発明法、すなわち中和剤として分
岐デキストリンを用いた場合、発光量はTCA抽出法であ
る従来法１で得られる発光量の５〜６割と中和剤なしの
従来法２の倍程度にまで増加し、従って感度および精度
面での大幅な改善が認められた。その発光量は中和剤と
してαCDを用いる従来法２を上回り、従って分岐デキス
トリンの中和剤としての特性は、BZCを用いた微生物ATP
の測定においてもαCDより優れていることが示された
岐デキストリンを用いた場合、発光量はTCA抽出法であ
る従来法１で得られる発光量の５〜６割と中和剤なしの
従来法２の倍程度にまで増加し、従って感度および精度
面での大幅な改善が認められた。その発光量は中和剤と
してαCDを用いる従来法２を上回り、従って分岐デキス
トリンの中和剤としての特性は、BZCを用いた微生物ATP
の測定においてもαCDより優れていることが示された
【００７１】
【本発明の効果】分岐デキストリンは、抽出試薬による
分析工程の阻害を抑制する物質として非常に優れてい
る。また、分岐デキストリンは、以下のような利点も有
する。 （１）分岐デキストリンは、サイクロデキストリンに比
べて生物発光反応に対する阻害活性が弱い（α-サイク
ロデキストリンは発光反応液中に1% の濃度で存在する
と25% 程度、2% の濃度で存在すると50% 程度の強い発
光阻害を示す。一方、分岐デキストリンはほとんど発光
阻害を示さず、発光反応液中に2% の濃度で存在しても
数％程度しか阻害しない）。
分析工程の阻害を抑制する物質として非常に優れてい
る。また、分岐デキストリンは、以下のような利点も有
する。 （１）分岐デキストリンは、サイクロデキストリンに比
べて生物発光反応に対する阻害活性が弱い（α-サイク
ロデキストリンは発光反応液中に1% の濃度で存在する
と25% 程度、2% の濃度で存在すると50% 程度の強い発
光阻害を示す。一方、分岐デキストリンはほとんど発光
阻害を示さず、発光反応液中に2% の濃度で存在しても
数％程度しか阻害しない）。
【００７２】（２）分岐デキストリンは経済的である
（サイクロデキストリンのうち最も中和能の優れるα-
サイクロデキストリンは１kgあたり20,000円程度であ
る。一方、分岐デキストリンは200円程度であり、α-サ
イクロデキストリンの１／１００程度の価格である）。
（サイクロデキストリンのうち最も中和能の優れるα-
サイクロデキストリンは１kgあたり20,000円程度であ
る。一方、分岐デキストリンは200円程度であり、α-サ
イクロデキストリンの１／１００程度の価格である）。
【００７３】本発明は、界面活性剤を有効成分とする抽
出試薬を使用する場合において特に好適に使用できるの
で、細胞内ＡＴＰをはじめとする、各種の細胞内成分の
分析法として好適である。
出試薬を使用する場合において特に好適に使用できるの
で、細胞内ＡＴＰをはじめとする、各種の細胞内成分の
分析法として好適である。
【図１】図１は、各種分岐デキストリンによる、発光阻
害の中和効果を示す。
害の中和効果を示す。
【図２】図２は、各種分岐デキストリンによる、発光阻
害の中和効果を示す。
害の中和効果を示す。
【図３】図３は、分岐デキストリンによる、ＢＡＣの中
和効果を示す。
和効果を示す。
【図４】図４は、分岐デキストリンによる、ＢＺＣの中
和効果を示す。
和効果を示す。
【図５】図５は、分岐デキストリンによる、Twintterge
nt3-16の中和効果を示す。
nt3-16の中和効果を示す。
【図６】図６は、分岐デキストリンによる、ＳＤＳの中
和効果を示す。
和効果を示す。
【図７】図７は、分岐デキストリンによる、Triton X-1
00の中和効果を示す。
00の中和効果を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 村上 成治 千葉県野田市野田339番地キッコーマン株 式会社内
Claims (10)
- 【請求項１】以下の工程を含むことを特徴とする細胞内
成分の分析法。 （１）細胞を含む試料に抽出試薬を加えて細胞内成分を
抽出する工程 （２）抽出試薬を含む試料に分岐デキストリンまたはそ
の誘導体を加える工程 （３）抽出された細胞内成分を分析する工程 - 【請求項２】抽出試薬が界面活性剤を有効成分とするも
のである、請求項１に記載の分析法。 - 【請求項３】細胞内成分が、核酸、タンパク質、脂質、
ビタミン、多糖類のいずれかである、請求項１または２
に記載の分析法。 - 【請求項４】細胞内成分がＡＴＰである、請求項１また
は２に記載の分析法。 - 【請求項５】抽出された細胞内成分を分析する方法が、
核酸の増幅、微生物の有無の測定、生菌数の測定のいず
れかを目的とする方法である、請求項１〜４のいずれか
に記載の分析法。 - 【請求項６】抽出された細胞内成分を分析する方法が、
酵素を用いる方法である、請求項１〜５のいずれかに記
載の分析法。 - 【請求項７】酵素を用いる方法が、ルシフェリン−ルシ
フェラーゼ発光反応法である、請求項６に記載の分析
法。 - 【請求項８】下記の構成成分を含む試薬キット。 （ａ）抽出試薬 （ｂ）分岐デキストリンまたはその誘導体 （ｃ）細胞内成分の分析用試薬
- 【請求項９】抽出試薬が界面活性剤を有効成分とするも
のである、請求項８記載の試薬キット。 - 【請求項１０】細胞内成分の分析用試薬が、ルシフェリ
ン-ルシフェラーゼ生物発光試薬である、請求項８また
は９に記載の試薬キット。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP34733697A JP3773151B2 (ja) | 1997-12-03 | 1997-12-03 | 細胞内成分の分析法 |
| PCT/JP1998/005407 WO1999028495A1 (fr) | 1997-12-03 | 1998-12-01 | Methode d'analyse de composants intracellulaires |
| AU12632/99A AU1263299A (en) | 1997-12-03 | 1998-12-01 | Method for analyzing intracellular components |
| EP98956015A EP1048739B1 (en) | 1997-12-03 | 1998-12-01 | Method for analyzing intracellular components |
| DE69831508T DE69831508T2 (de) | 1997-12-03 | 1998-12-01 | Verfahren zur analyse intrazellulärer substanzen |
| US09/555,682 US6238857B1 (en) | 1997-12-03 | 1998-12-01 | Method for analyzing intracellular components |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP34733697A JP3773151B2 (ja) | 1997-12-03 | 1997-12-03 | 細胞内成分の分析法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11155597A true JPH11155597A (ja) | 1999-06-15 |
| JP3773151B2 JP3773151B2 (ja) | 2006-05-10 |
Family
ID=18389542
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP34733697A Expired - Lifetime JP3773151B2 (ja) | 1997-12-03 | 1997-12-03 | 細胞内成分の分析法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6238857B1 (ja) |
| EP (1) | EP1048739B1 (ja) |
| JP (1) | JP3773151B2 (ja) |
| AU (1) | AU1263299A (ja) |
| DE (1) | DE69831508T2 (ja) |
| WO (1) | WO1999028495A1 (ja) |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2345899A2 (en) | 2010-01-19 | 2011-07-20 | Hitachi Plant Technologies, Ltd. | Reagent splitting/dispensing method based on reagent dispensing nozzle and reagent splitting/dispensing mechanism |
| WO2011093218A1 (ja) | 2010-01-26 | 2011-08-04 | 株式会社日立プラントテクノロジー | 発光測定装置の配管洗浄方法、発光測定装置の配管洗浄機構 |
| EP2354241A1 (en) | 2010-01-12 | 2011-08-10 | Hitachi Plant Technologies, Ltd. | Mechanism and method of preventing suction air from leaking during filtration of a capturing carrier solution |
| WO2011118256A1 (ja) | 2010-03-26 | 2011-09-29 | 株式会社日立プラントテクノロジー | 捕集ユニット |
| DE102010063439A1 (de) | 2009-12-21 | 2011-12-15 | Hitachi Plant Technologies, Ltd. | Reagenz-Öffnungsmechanismus eines Lumineszenzmesssystems und Steuerverfahren für eine Öffnungsnadel in einem Reagenzöffnungsmechanismus |
| WO2014061785A1 (ja) | 2012-10-19 | 2014-04-24 | 株式会社日立製作所 | 生体物質回収方法及び生体物質回収装置 |
| JP2016530878A (ja) * | 2013-07-26 | 2016-10-06 | ゼネラル・エレクトリック・カンパニイ | 循環核酸の回収及び増幅のための方法及び装置 |
| WO2024019165A1 (ja) * | 2022-07-22 | 2024-01-25 | キッコーマン株式会社 | 微生物若しくは細胞又は微生物関連物質若しくは細胞関連物質を検出する方法及びキット |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6444100B1 (en) * | 2000-02-11 | 2002-09-03 | Seagate Technology Llc | Hollow cathode sputter source |
| US6660489B2 (en) * | 2000-12-01 | 2003-12-09 | Becton, Dickinson And Company | ATP extraction method |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63130139A (ja) | 1986-11-20 | 1988-06-02 | Sanmatsu Kogyo Kk | 分枝デキストリンから成る吸着剤 |
| JPH03251199A (ja) | 1990-02-28 | 1991-11-08 | Chisso Corp | バクテリア・ルシフェラーゼの増感発光法 |
| GB9100551D0 (en) | 1991-01-10 | 1991-02-20 | Amersham Int Plc | Method and reagent for eliminating analytical interference in enzymatic analysis from substances used for extraction of intracellular metabolites |
| JPH07203995A (ja) * | 1994-01-26 | 1995-08-08 | Toa Denpa Kogyo Kk | 細胞内ａｔｐの測定方法 |
| GB9417793D0 (en) * | 1994-09-05 | 1994-10-26 | Celsis Ltd | Bioluminescence and assay reagents |
-
1997
- 1997-12-03 JP JP34733697A patent/JP3773151B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-12-01 US US09/555,682 patent/US6238857B1/en not_active Expired - Lifetime
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- 1998-12-01 EP EP98956015A patent/EP1048739B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-12-01 AU AU12632/99A patent/AU1263299A/en not_active Abandoned
- 1998-12-01 WO PCT/JP1998/005407 patent/WO1999028495A1/ja active IP Right Grant
Cited By (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8337779B2 (en) | 2009-12-21 | 2012-12-25 | Hitachi Plant Technologies, Ltd. | Reagent open mechanism of luminescence measurement system and open needle control method in reagent open mechanism |
| DE102010063439A1 (de) | 2009-12-21 | 2011-12-15 | Hitachi Plant Technologies, Ltd. | Reagenz-Öffnungsmechanismus eines Lumineszenzmesssystems und Steuerverfahren für eine Öffnungsnadel in einem Reagenzöffnungsmechanismus |
| EP2354241A1 (en) | 2010-01-12 | 2011-08-10 | Hitachi Plant Technologies, Ltd. | Mechanism and method of preventing suction air from leaking during filtration of a capturing carrier solution |
| EP2345899A2 (en) | 2010-01-19 | 2011-07-20 | Hitachi Plant Technologies, Ltd. | Reagent splitting/dispensing method based on reagent dispensing nozzle and reagent splitting/dispensing mechanism |
| US8333936B2 (en) | 2010-01-19 | 2012-12-18 | Hitachi Plant Technologies, Ltd. | Reagent splitting/dispensing method based on reagent dispensing nozzle and reagent splitting/dispensing mechanism |
| WO2011093218A1 (ja) | 2010-01-26 | 2011-08-04 | 株式会社日立プラントテクノロジー | 発光測定装置の配管洗浄方法、発光測定装置の配管洗浄機構 |
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| US9988663B2 (en) | 2012-10-19 | 2018-06-05 | Hitachi, Ltd. | Method for collecting biological material and device for collecting biological material |
| JP2016530878A (ja) * | 2013-07-26 | 2016-10-06 | ゼネラル・エレクトリック・カンパニイ | 循環核酸の回収及び増幅のための方法及び装置 |
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