JPH03251199A

JPH03251199A - バクテリア・ルシフェラーゼの増感発光法

Info

Publication number: JPH03251199A
Application number: JP4882790A
Authority: JP
Inventors: Akinari Erikado; 江利角　晃也; Shuhei Yoshino; 修平善野; Satoshi Inoue; 敏井上
Original assignee: Chisso Corp
Current assignee: JNC Corp
Priority date: 1990-02-28
Filing date: 1990-02-28
Publication date: 1991-11-08

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は、水溶性高分子化合物、界面活性剤もしくは蛍
光物質を共存させることを特徴とするバクテリア・ルシ
フェラーゼの増感発光法に関する。

［従来の技術とその問題点］発光細菌は、表１に示すような種類が同定されており、
その代表的なものは、海水から単離された。

発光細菌は２〜３％の食塩を含む液体培地で比較的容易
に大量培養することができる０食塩濃度を１％程度に下
げても十分生育はするが、発光はきわめて微弱となり、
また、細胞内のルシフェラーゼ含量も減少する。

よく発光するような条件で培養された菌体をいったん凍
結したのち、低濃度の緩衝液中で融解すると浸透圧によ
る膨張で菌体は壊れ、これを遠心すると粗抽出液が得ら
れる。粗抽出液を硫安分画、ＤＥＡＥ−セファデックス
などのイオン交換体を用いたクロマトグラフィー、ゲル
濾過、および硬々のアフィニティクロマトグラフィーを
用いて精製すると純粋な標品を得ることができる。

現在、Ｖ、ｈａｒｖｅｙｉ、　Ｖ、ｆｉｓｃｈａｒｉ、
Ｐ、ｐｈｏｓｐｈｏｒｅｕｍ。

Ｐ、ｌｅｉｏｇｎａｔｈｉなどのルシフェラーゼが精製
され、種々の研究に用いられている。

いずれの起源のルシフェラーゼも類似の分子量をもち、
α、βの２個の異なるサブユニットからできている。最
もよく研究されているＶ、ｈａｒｖｅｙｉのルシフェラ
ーゼではαサブユニット、βサブユニットの分子量はそ
れぞれ４２，０００と３７，０００で他の成分を含まな
い単純蛋白質である。

発光細菌における（１　ｖｆｖｏでの発光系にはルシフ
ェラーゼ以外にＦＭＮを通光するＮＡＤ　（Ｐ）　Ｈ：
ＦＭＮ還元酵素（Ｅ、）および長鎖アルデヒドを合成す
るための酵素群（Ｅ、）が含まれる。

ルシフェラーゼは生合成できるが長鎖アルデヒドは合成
できないので廃光しないが、アルデヒドを外から与える
と発光するような変異株が種々の発光細菌で知られてお
り、アルデヒド変異株と命名されている。　Ｖ、ｈａｒ
ｖｅｙｉのアルデヒド変異株の１株、Ｍ−１７が通常発
光しないのはアルデヒド合成系に欠陥があるためである
。ト１７に炭素数ｌＯ〜２０程度の種々の飽和脂肪族ア
ルデヒドを与えると発光が見られ、一方、種々の鎖長の
飽和脂肪酸を与えると炭素数１４のミリスチン酸を与え
た場合に特異的に強い発光が見られる。すなわち、１）
ｆｉ々の鎖長のアルデヒドがルシフェラーゼの基質とな
りうる。　２）ｉｎ　ｖｊｖｏではアルデヒドの前駆体
は脂肪酸でかつその炭素数は１４と考えられる。

アルデヒド合成には最低５つの段階があることが分かフ
でいる。

このうち最後の段階はミリスチン酸のテトラデカナール
への還元反応である。ミリスチン酸還元酵素はＰ、ｐｈ
ｏｓｐｈｏｒａｕｍではＪＩＬＩｍ！精製されており、
３つの異なるサブユニットからできている２５．２８１
　　　すなわち、５０，０００のミリスチル−ＣｏＡ合
成酵素、ｓａ、ｏｏｏのミリスチル−Ｃｏ＾還元酵素お
よび３４．０００の蛋白質で、最後の蛋白質はエステル
の加水分解活性があり２７＋、脂肪酸の供給に関係して
いると思われる０反応はまず、＾ＴＰを使ってミリスチ
ン酸をミリスチル−Ｃｏ八とし、つぎにこれをＮＡＤＰ
Ｈを消費してテトラデカナールに還元する。

発光系を形成する３つ目の酵素、ＮＡＤ　（Ｐ）　Ｈ：
　ＦＭＮ還元酵素は８＾Ｄ１）．ＮＡＤＰ）ｌまたはそ
の両方を基質とする３　ｆｌがあり、Ｖ、ｈａｒｖｅｙ
ｉではアフィニティクロマトグラフィーによりおのおの
の酵素が分Ｉｌｌ精製されている。

表２に示すように、本酵素とルシフェラーゼを組み合わ
せるとＮＡＤ　（Ｐ）　Ｈおよびこれに酵素的に導かれ
る種々の物ｆｆ（（ＮＡＤ　（Ｐ）　）ｌ依存性還元酵
素の基質）の極微量定量、もしくは関連する種々の酵素
の特異的かつ鋭敏な活性測定などが可能で応用上重要で
ある。すでに数社からこの酵素が発売されている。

本発明は、水溶性高分子化合物、界面活性剤もしくは蛍
光物質を共存させることを特徴とするバクテリア・ルシ
フェラーゼの増感発光法に関する報告である。

ところで、バクテリア・ルシフェラーゼの有用性は当業
者に周知であり、表２に示すように、バクテリア・ルシ
フェラーゼの発光を利用して、各種物質を検出すること
ができる。さらに、免疫測定法やＤＮＡプローブ、バイ
オセンサーなどのあらゆる測定検出系に応用できるもの
であり、上述した機能から診断薬等の検査薬として有用
であることが予測される。

本発明者等は、上述の技術的事情にかんがみ、研究の結
果、水溶性高分子化合物、界面活性剤もしくは蛍光物質
を共存させることを特徴とするバクテリア・ルシフェラ
ーゼの増感発光法を開発することができた６以上の説明
から明かなように、本発明の目的はバクテリア・ルシフ
ェラーゼをより超高感度な検出測定法に応用するための
発光増感技術を提供することである。

ｃ問題を解決するための手段］本発明は下記（１）　−（４）の構成を有する。

（１）測定対象に対しバクテリア・ルシフェラーゼを用
いる発光法において、水溶性高分子化合物、界面活性剤
もしくは蛍光物質を共存させることを特徴とする増感発
光法。

（２）水溶性高分子化合物として合成高分子化合物、天
然高分子化合物もしくは修飾高分子化合物を用いる前記
第１項に記載の増感発光法。

（３）界面活性剤として陰イオン活性剤、陽イオン活性
剤、両性活性剤、非イオン活性剤、天然系活性剤、高分
子活性剤もしくは特殊活性剤を用いる前記第１項に記載
の増感発光法。

（４）バクテリア・ルシフェラーゼが変異、融合、欠失
、修飾、結合若しくは固定化処理を施された酵素である
前記第１項に記載の増感発光法。

本発明の構成と効果につぎ以下に詳述する０本発明は水
溶性高分子化合物、界面活性剤もしくは蛍光物質の増幅
効果によるバクテリア・ルシフェラーゼの増感発光法で
あり、たとえば後述の実施例に示す方法で行うことがで
きる。

本発明の方法において、水溶性高分子化合物としては表
３に示す化合物などが、界面活性剤としては表４に示す
物質などが、蛍光物質としては表５に示す物質などが考
えられる。

表３水化”　の表５・蛍　物質の代表例本発明を添付図および表にて説明すると、第１図はバク
テリア・ルシフェラーゼの発光機構を示す。結果的にＦ
ＭＮ）１２　とテトラデカナールを基買として、４９０
ｎｍの光を発する０表１は発光細菌の分注　ＮＢＤニア
−ニトロベンゾフラザン話導体、ＳＢＤニア−スルホニ
ルベンゾフラザンお導体Ｒ皿■旦担のルシフェラーゼが
よく研究されている。

表２はバクテリア・ルシフェラーゼを利用した分析法の
例を示す、高感度であることがわかる。

表３は水溶性高分子化合物の分類を示す０表４は界面活
性剤の分類を示す１表５は蛍光物質の例を示す１表６．
７．８は共存物質によるバクテリア・ルシフェラーゼの
増幅効果を示す。

本発明の方法の実施法について、より具体的に説明する
と次のとおりである。

すなわち、後述第１図の反応を本発明所定の増感剤の適
量の存在下に行う、測定対象物（表２参照）は、その所
要量を適量の反応媒体（ＩＩ衝液）中に本発明に係るバ
クテリア・ルシフェラーゼその他必要な添加剤と共に溶
解させる。

該緩衝液としては、燐酸カリウム緩衝液（ρｈ　７．５
）を例示することができる。他の添加剤としては、発光
用酵素であるルシフェラーゼ、ＦＭＮリダクターゼ、ミ
リスチンアルデヒド、牛血清アルブミン、（Ｗ／Ｖ）Ｔ
ｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００および本発明に係る水溶性高分
子化合物、界面活性剤もしくは蛍光物質である。

長鎖アルデヒド２５μＭに対する他の薬剤の適量は、＆
ｌｌＴ液ｌＯ〜１，０００ｍＭ好ましくは５０〜５００
５Ｍ、　ジチオスレイトール０．Ｏ２Ｎ２．ｈＭ、ルシ
フェラーゼｌＯ〜１００μｇ／ａ＋ｊ２．フラビンモノ
ヌクレアーゼ１０〜１００μ鯖、フラビンモノヌクレア
ーゼリダクターゼ１〜１００ｍＶ／　ｓｉ、牛血清アル
ブミン　（Ｗ／Ｖ）丁ｒｉｔｏｎ　Ｘおよび水溶性高分
子化合物・界面活性剤は、最終の測定液２００μｌに対
して０１〜１％、蛍光物質は０．００１〜０．０００１
％および上述の緩衝液に対する各種の薬剤の順序は限定
されないが、上述の分散溶解から後述の発光量測定まで
の間に適正な反応時間（注、反応工程については、後述
４、図面の簡単な説明を参照）が紅遇するように配慮す
る。

所定時間経過後、上述のように調製した発光液の所定量
をルミフォトメーターの透明キュベツト（注、例えば、
ポリスチレン製（外径１０ｗｍｘ高さ６５■））に取り
、ルミフォトメーターに装着して所定時間（例えば１０
〜６０秒）発光量を測定する（測定値１）。

次に、上記測定液にＮＡＤＨ標準液の適量（例えば５０
μｉ）を加え、直ちにその発光量を最大のシグナルに達
するまで測定する（測定値２）０次に、測定値ｌと測定
値２の最大のシグナルに達するまでの時間からブランク
値を求め測定値２の値からブランクの値を差引いた値を
真の発光量とする。

また、標準の発光量（注、対照）としては、上述の測定
液の調製において水溶性高分子化合物等を含まないもの
を用いる以外は同様にして発光量を求める０両者の差が
増感効果となる。

増感効果は、水溶性高分子化合物等の濃度によって差異
を生じるが、蛍光物質については濃度よりも物質の種類
による差異が大きい。

上述のようにして得られた本発明の増感発光法を用いる
ことにより、極微量な物質を高感度に検出及び測定する
ことが可能になると考えられる。

［発明の効果］本発明のバクテリア・ルシフェラーゼの増感発光に関す
る方法の有用性は、当業者に自明である。また、適当な
水溶性高分子化合物、界面活性剤、蛍光物質を共存させ
ることにより、バクテリア・ルシフェラーゼの発光を増
幅できる。このような物質は、当業者に周知である。

上記の開示により、当業者は特許請求された本発明を実
施できる。しかし、この技術の理解を増すために、本発
明に重要なバクテリア・ルシフェラーゼの増感発光に使
われる手順を以下に示す。

［実施例］実施例１［水溶性高分子化合物の共存下に於けるバクテ
リア・ルシフェラーゼの増感効果］燐酸カリウム緩衝液
（ｐＨ７，５）３１．２５ｍＭ　、ジチオスレイトール
（以下ＤＴＴと略す）　０．１２５ｍＭ　。

フラビンそノヌクレアーゼ（以下ＦＭＮと略す）３．１
２５　μＭ、ルシフェラーゼ６．２５μｇ　／　ｒａｉ
ｌ、ＦＭＮ　リダクターゼ５０ＩＩＵ／鳳１、ミリスチ
ンアルデヒド２５μＭ、牛血清アルブミン０．０２５％
（１！／Ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１０００，００５％　
（Ｗ／Ｖ）及びＩ々の水溶性高分子化合物を１％〜０．
１％含む溶液２００μ互をルミフォトメーターＴＯ−４
０００（ラボサイエンス社）用のポリスチレンキュベツ
ト（外径１０ｘ　６５ｍｍ）に取り、ルミフォトメータ
ーＴＤ−４０００で１０秒間、発光量（測定値１）を測
定した。このと台、水溶性高分子化合物としては、ポリ
エチレングリコール（平均分子量１５００．３０００及
び７５００の３ｆり　、でんぷん、デキストリン、デキ
ストラン、ゼラチン、ポリビニルアルコール、カルボキ
シメチルセルロース、エチルセルロース及びヒドロキシ
プロピルセルロースを用いた。

次に、ＮＡＤＨｆｉ準液５０μｋを加えた後、すぐにそ
の発光量（測定値２）を最大のシグナルに達するまで測
定した。さらに、測定値１の値と測定値２の最大のシグ
ナルに達するまでの時間よりブランクを求め、測定値２
の値からブランクの値を差し引いた値を真の発光量とし
た。

また、水溶性高分子化合物を含まないものを標準として
、水溶性高分子化合物による増感効果を求めたものが、
第６表である。

その結果、水溶性高分子化合物濃度０．１％に於いては
、あまり大ぎな増感効果は見られなかったが、濃度１％
では、はとんどの水溶性高分子化合物で０．１％の時よ
りも増感効果が犬ぎくなり、特にでんぷん、デキストラ
ン及びカルボキシメチルセルロースに於いて著しい効果
を示した。

実施例２［界面活性剤の共存下に於けるバクテリア・ル
シフェラーゼの増感効果］燐酸カリウム１）衝液（ｐ）ｌ　７．５）３１．２５ｍ
Ｍ　、ジチオスレイトール０．１２５ｍＭ　、フラビン
モノヌクレアーゼ３．１２５μＭ、ルシフェラーゼ６．
２５μｇ／ＩＩＩＩｌ、ＦＭＮＩＪダクターゼＳ　ＯＩ
ＩＵ　／　＋ａ　１、ミリスチンアルデヒド２５μ輌、
牛血清アルブミン０．０２５％（Ｗ／Ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ
　Ｘ−１０００，００５％　（Ｗ／Ｖ）及び種々の界面
活性剤を１％〜０．１％含む溶液２００μ℃をルミフォ
トメーターＴＯ−４０００（ラボサイエンス社）用のポ
リスチレンキュベツト（外径ｆｏｘ　６５＋＋ｖ）に取
り、ルミフォトメーターＴＤ−４０００で１０秒間、発
光量（測定値１）を測定した。このとき、界面活性剤と
しては、ドデシル硫酸ナトリウム（以下ＳＤＳと略す）
　、　Ｔｗｅｅｎ系界面活性剤（２０，４０，６０，８
５）を用いた。

次に、ＮＡＤＨ標準液５０μｌを加えた後、すぐにその
発光量（測定値２）を最大のシグナルに達するまで測定
した。さらに、測定値１の値と測定値２の最大のシグナ
ルに達するまでの時間よりブランクを求め、測定値２の
値からブランクの値を差し引いた値を真の発光量とした
。

また、界面活性剤を含まないものを標準として、界面活
性剤による増感効果を求めたものが、表７である。

その結果、界面活性側濃度０．１％、に於いては、増感
効果はほとんど見られなかったが、濃度１％では全ての
界面活性剤に於いて増感効果が見られ、特にドデシル硫
酸ナトリウムに於いて顕著であフた。

実施例３［蛍光物質の共存下に於けるバクテリア・ルシ
フェラーゼの増感効果］燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，５）　３１．２５膳Ｍ１
　ジチオスレイトール０．１２５ｍＭ　、フラビンモノ
ヌクレアーゼ３．１２５μＭ、ルシフェラーゼ６．２５
　ｐ　ｇ／　ｗａｆｔ　、ＦＭＮリダクターゼ５０ｍＵ
／ｍｆｌ、ミリスチンアルデヒド２５μＭ、牛血清アル
ブミン０．０２５％　（ｗ／ν）ＴｒｉｔｏｎＸ−１０
００，００５％　（Ｗ／Ｖ）及び種々＋７）水溶性高分
子化合物を０．００１％〜０．０００１％含む溶液２０
０μｍをルミフォトメーターＴＤ−４０００（ラボサイ
エンス社）用のポリスチレンキュベツト（外径１０ｘ　
６５ｍｍ）に取り、ルミフォトメーターＴＤ−４０００
で１０秒間、発光量（測定値１）を測定した。

このとき、蛍光物質としては、ローズベンガル、エオシ
ンエローイッシュ、ブリリアントスルホフラビン、フル
オレセインナトリウム及びローダミンＢを用いた。

次に、ＮＡＤＨ標準液５０μｋを加えた後、すぐにその
発光量（測定値２）を最大のシグナルに達するまで測定
した。さらに、測定値ｌの値と測定値２の最大のシグナ
ルに達するまでの時間よりブランクを求め、測定値２の
値からブランクの値を差し引いた値を真の発光量とした
。

また、蛍光物質を含まないものを標準として、蛍光物質
による増感効果を求めたものが、表８である。

その結果、濃度に関係なくブリリアントスルホフラビン
、フルオレセインナトリウム及びローダミンＢよりもロ
ーズベンガル及びエオシンエローイッシュの方が相対的
に増感効果が高く、特に蛍光物質濃度０．００１％の時
が、最も大きな効果を示した。

以上の結果を総合すると、水溶性高分子化合物・界面活
性剤あるいは蛍光物質を共存せしめることによって、バ
クテリア・ルシフェラーゼの発光を増感させることがで
きた。さらに、これらの水溶性高分子化合物・界面活性
剤あるいは蛍光物質を１ｆ！類だけではなく、複数共存
させることによりさらなる増感効果が得られることは、
自明である。

表　　６＊４　増感効果なし表７注。

増感効果なし

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の説明図であり、バクテリア・ルシフ
ェラーゼの発光機構を示し、現在考えられている発光細
菌の発光系を示す。同図において、ＮＡＤ　（Ｐ）　Ｈ−ＦＭＮ還元酵素（
Ｅ２）でＦＭＮがＦＭＮ）１２に還元され、ルシフェラ
ーゼ（Ｅ＋１と結合し、分子状酸素と反応するとＦＭＮ
４ａ−ヒドロペルオキシド中間体（中間体（Ｉ））が生
ずる。一方、ミリスチン酸は還元酵素（Ｅ３）で還元されテト
ラデカナールとなり、中間体（Ｉ）と反応して励起４ａ
−水酸化物（中間体（２））が生ずる。励起中間体が基
底状態（中間体（３））に戻るときに差のエネルギーが
光として放出される。中間体（Ｉ）はアルデヒドが存在
しない場合には酵素、酸化型ＦＭＮ、過酸化水素に分解
する。以　　　上

Claims

【特許請求の範囲】

（１）測定対象に対しバクテリア・ルシフェラーゼを用
いる発光法において、水溶性高分子化合物、界面活性剤
もしくは蛍光物質を共存させることを特徴とする増感発
光法。
（２）水溶性高分子化合物として合成高分子化合物、天
然高分子化合物もしくは修飾高分子化合物を用いる特許
請求の範囲第１項に記載の増感発光法。
（３）界面活性剤として陰イオン活性剤、陽イオン活性
剤、両性活性剤、非イオン活性剤、天然系活性剤、高分
子活性剤もしくは特殊活性剤を用いる特許請求の範囲第
１項に記載の増感発光法。
（４）バクテリア・ルシフェラーゼが変異、融合、欠失
、修飾、結合若しくは固定化処理を施された酵素である
特許請求の範囲第１項に記載の増感発光法。