JPH01503730A - 増幅発光分析 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 増幅発光分析 ［発明の技術分野］ 本発明は、増幅発光分析（ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　ａｓｓ ａｙ）（特に免疫分析）に関し、さらにこの分析を使用する診断用キットに関す るものである。本発明に関する発光分析は、化学発光反応（光を放出する化学反 応）に基づくものである。発光は、放出された光を検出し或いは測定することに より分析物の検出もしくは定量を行なうのに充分な持続時間を一般に有する。本 発明に関する化学発光反応は、２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン（ ＤＰＤ）、特にルミノールもしくはイソルミノールと酸化剤、特に過酸化水素と 触媒、特にペルオキシダーゼ酵素（これは酸化剤によるＤＰＤの酸化を触媒する ）との反応である。酸化は光の放出を伴う。

［従来技術の説明］ ＤＰＤの上記ペルオキシダーゼ触ｔｓ酸化を利用した発光分析には幾つかの主た る型式があり、その最も一般的なものは、西洋ワサビベルオキ、シダーゼをリガ ンドに結合させてこれを標識し、かつ発光反応を用いてこの標識を検出しまたは 定量する方法である。本発明は、専ら異なる種類の分析、すなわち化学発光性化 合物を直接使用してたとえば蛋白質、ホルモン、ハブテン、ステロイド、核酸、 代謝物、抗原および／または抗体のようなリガンドを標識する分析に関する。た とえばルミノールもしくはイソルミノールのような化学発光性ＤＰＤを一般にリ ガンドに結合させる。化学発光は、ペルオキシダーゼと酸化剤とを反応結合体に 添加して検出することができる。

発光分析の総説についてはＴ、Ｐ、ホワイトヘッド等によりクリニカル・ケミス トリー（Ｃｌ　１ｎｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）第２５巻。

第１５３１〜１５４６頁（１９７９）に記載されている。

試薬中に増幅剤（ｅｎｈａｎｃｅｒ）、すなわち６−ヒドロキシベンゾチアゾー ル（ＮＲＤＣ社に係るヨーロッパ特許第８７９５９Ｂ号）、限定した種類から選 択されたフェノール（ＮＲＤＣ社に係るヨーロッパ特許第１１６４５４Ｂ号また は米国特許第４，５９８，０４４号）或いは限定した種類から選択された芳香族 アミン（ＮＲＤＣ社に係る英国特許出願第２１６２９４６Ａ号またはヨーロッパ 特許公開第２１９３５２Ａ号（ミネソタ・マイニング・アンド・マニュファクヂ ャリング・カンパニー社）を含有させることによって、ペルオキシダーゼにより 触媒されるＤＰＤの化学発光酸化の感度を増幅することができる。

ヨーロッパ特許出願公開第２１０４４９Ａ号（モレキュラ・ダイアグノスティッ クス・インコーポレーション社）においては、アンモニアおよび水溶性有機アミ ン類が化学発光反応の増幅剤であると主張されている。特定的に開示されたアミ ン類は、たとえばスペルミン、スペルミジンおよびブチレンジアミンのような脂 肪族ポリアミン類、第三アルキルアミン、ピリジン、アゾール、チアジン、アリ ールアミンおよびベンジルアミンである。しかしながら、この特許の明細四には 殆んど増幅作用（ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ）の証明が与えられていない。

これら従来の開示にも拘らず、これらはいずれもＤＰＤによるリガンドの直接的 標識を用いる分析の増幅作用を例示しておらず、したがってこの種の分析を高レ ベルの光強度まで増幅させるアミン、及びＤＰＤ結合体を存在させた場合にこれ が存在しない場合よりも顕著に大きい光強度を与えるようなアミンを見出すこと が問題であった。

［発明の要点］ 今回、成る種の飽和複素環式アミンがＤＰＤの化学発光酸化を増幅することが見 出された。これらのアミンは、電子を容易に喪失して陽イオンを形成するという 特徴を有する。これらは、窒素に結合した水素原子が良好に遮蔽されているか或 いは立体障害を有する第三アミンまたは第三アミンのいずれかである。

より明確には、興味あるアミン類は一方もしくは両方の橋頭位に窒素原子を有す る飽和二環式化合物または２−位および６−位（窒素に隣接する炭素原子）に４ 個の低級（Ｃ１−４）アルキル基を有するピペリジン環化合物である。本発明は 、利用しうるヘム基を有する触媒、好ましくはペルオキシダーゼ酵素、特に好ま しくはミクロペルオキシダーゼと酸化剤、好ましくは過酸化水素と分析すべき物 質に相関しうる分子状残基であるリガンドに結合した化学発光性ＤＰＤとの間で 化学発光反応を生ぜしめ、かつ発生した化学発光を検出しまたは測定することか らなる発光分析もしくは発光測定分析を提供し、反応をたとえば増幅剤としての アミンの存在下に行なうことを特徴とする。さらに本発明は、前記化学発光性Ｄ 　Ｉ）　Ｄ結合体とペルオキシダーゼ酵素とアミン増幅剤とからなることを特徴 とする、この分析を使用するためのキットをも包含する。

［好適具体例の説明］ アミン増幅剤は、環置換基を有することができ、或いは既に置換されたピペリジ ンの場合には他の環置換基、好ましくは低級（Ｃ１−４）アルキル、とドロキシ 、クロロ週もしくはブロモ基を有することができる。

本発明に使用するのに現在好適な増幅剤アミンは次の通りである： １．４−ジアザヒシクｏ　（２，２，２）オクタン：（略称「ＤへＢＣ○」）、 これは最良の増幅剤である。

キヌクリジン： ３−ギヌクリジノ、−ル： ２．２，６．６−チトラメチルビベリジンおよびその環置換された誘導体、特に ４−置換誘導体（ここで、Ａは置換基、好ましくはＨ３ 本発明の範囲に包含されない数種の他の立体障害アミンは、良好な増幅作用を与 えないことに興味が持たれる。たとえば１゜２−ビス王ルホリノエタンは、ＤＰ Ｄが存在してもしなくても高強度の発光を与えかつそのｒｉ（増幅作用）は比較 的小さい。これに対し、１．６−ビスピペリジノヘキサンおよびヘキサメチレン テトラミンは、中庸の増幅作用と低強度の発光を与える。

ＤＰＤと酸化剤とペルオキシダーゼと増幅剤との濃度、さらに反応温度およびｐ Ｈは全て発光の強度および増幅作用の程度に影響を及ぼしうる要因であり、最適 結果を得るには若干の調整が必要とされる。発光信号も、各試薬を反応させる時 間および発光の測定方法に依存する。

ＤＰＤに対する酸化剤および触媒の過剰量が大となる程、最大強度までの光の発 生が急速となる。一般に、それぞれ１０　〜１０６の過剰モルが適当であるが、 比較的低強度の長時間放出が許容されうると考えられる場合にはより低い濃度も 使用することができる。

本発明は、上記分析または英国特許第２１６２９４６Ａ号に記載された分析のい ずれにも用いうるが、特にＤＰＤが直接的標識であるような分析に用いられる。

この種の分析においては、ＤＰＤ標識が慣用の分析である放射性標識もしくは酵 素にとって代る。この種のＤＰＤ標識分析は周知である〔たとえばＧ、Ｊ。

パーナート等、ｒ　％Ａ　１ｔｅｒｎａ口ｖｅ　ｌ　１１ｍｕｎｏａｓｓａｙｓ ％Ｊ　、Ｗ、　Ｐ。

コリンズ編、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ社、英国。

チャイチェスター在（１９８４）　、第１２３〜１５２頁〕。この場合、ＤＰＤ 、好ましくはルミノールもしくはイソルミノール、を分析すべぎ物質にある種の 様式で係るたとえばハブテン、抗原もしくは抗体のようなリガンドに共有結合さ せる必要がある。リガンドは分析すべき物質と同一であるか或いは分析すべき物 質り間接的に係ることもでき、たとえば分析すべき物質が最初に受ける反応の生 成物とすることができる。

一般的に言って、Ｅ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａ法で知られる種類の分析を本発明に用いる ことができる。これらは主としてサンドイッチ分析、競合分析および置換分析を 包含する。本発明は、たとえばステロイドのようなハブテンの競合分析および直 換分析に対して特に有用である。通常の種類の競合分析もしくは置換分析におい て、ＤＰＤ−リガンド結合体は抗体上の有限数の結合部位に対する分析物（リガ ンドと類似した或いは同じ構造を有する分析すべき物質を含有する）と競合する 。競合程度は、抗体に対する結合体および分析物の相対的親和性、並びにその濃 度に依存する。結合体の濃度はＥＬＩＳＡと同様に調節しうるが、典型的には０ ．００１〜１ｏｏｏｙ　（ここでｙは分析物の最大予想濃度である）、好ましく は０．０２〜０．５ｙである。

ＤＰＤ標識をこの種の分子に結合させる任意の公知方法を使用することができる 。具体例として、後記実施例に用いた２種の結合体はエストラジオール／イソル ミノールおよびニストロ式（５）および（６）を有する： 好適ＤＰＤは英国特許第２１６２９４６Ａ号明細書に記載されたようなものであ るが、これらは、ＤＰＤを直接的標識のために使用すべき場合は、架橋性アーム をハブテンなどに結合させうる基を備えねばならないことが了解されよう。好適 であるルミノールおよびイソルミノールは環置換基としてアミン基を有し、これ により架橋性アームは式（７）： （式中、Ｒは非立体障害性基１ｆｌｌ、好ましくはＣ１−４アルキル基でありか つｎは２〜６、好ましくは４〜６である）のように結合することができる。ＤＰ Ｄの離間したアミン基は、たとえばステロイドのようなりガントに存在するカル ボニル基或いはここに導入されたカルボニル基にアミド結合を介して結合するこ とができる。イソルミノールがルミノールよりも好適である。

好適酸化剤は過酸化水素であるが、化学発光反応体の増幅に関与する公知の酸化 剤も使用することができる。その具体例は℃−ブチルーヒドロペルオキシドであ る。過ａａイオンも使用することができる。他方、たとえば過硫酸カリウムのよ うな化学発光ＤＰＤ反応において、有効でなく或いは効果が低いことが知られて いる酸化剤を避けねばならないことは勿論である。

好ましくは、触媒はペルオキシダーゼ酵素、特に好ましくはミクロペルオキシダ ーゼである。たとえばヘマチンもしくはヘモグロビンのような他のヘム含有分子 もペルオキシダーゼの代りに使用することができる。

発光反応は分析過程の生成物に対して行なわれる。たとえば慣用の不均一系にお いては、標識が抗原−抗体結合の結果結合した担体材料を洗浄して、溶液中に存 在する残留標識を除去する。次いで、標識、この場合ＤＰＤ、を発光反応の開始 により検出しまたは定量する。各反応体は任意の順序で添加しうるが、酸化剤も しくは触媒を最後に添加することにより、できるだけ不要の反応を最小化するこ とが好ましい。

発光反応は水媒体中にて中性（ｐＨ７）から強アルカリ性（ｐＨ１３，８）に至 る任意のｐＨで行ないうるが、極めて高いｐＨでは若干のＤＰＤが分解すると思 われるので、しばしば１２．５を越えないことが最良である。ｐＨ９もしくはそ れ以上、特に９〜１０．５の範囲のｔ）Ｈが最良の結果を与える。

発光反応は１５〜３０℃の範囲の全ての空温範囲で良好に生ずる。

本発明における格別の利点は、充分な光強度を生ぜしめるため結合しているリガ ンドからＤＰＤを分離させる必要がないことである。したがって、従来技術によ る約６０℃までの加熱操作は省略することができる。

本発明による分析の主たる用途は臨床実験である。この種の実験には、所与の分 析手順に用いる材料を分析キットの形態で入手するのが一般的である。ＤＰＤ結 合体、アミン増幅剤および触媒の他に、キットはさらに酸化剤をも含有するが、 多くの場合この材料は別途に供給することができる。

好ましくは、触媒と酸化剤と増幅剤と化学発光性ＤＰＤはそれぞれ、本発明の分 析に使用するのに好適なものとして上記したような物質の一種である。本発明に □よる分析キットにおいて、化学発光性ＤＰＤは適当なリガンド、たとえば分析 すべき物質に対する抗体に結合される。好ましくは、キットはＤＰＤとハブテン 、抗原もしくは抗体との結合体、ＤＰＤの酸化に対する触媒およびアミン増幅剤 とを含み、これらをそれぞれ別々の容器に含有させる。

必要に応じ、分析キットはそれぞれ既知員の分析すべき物質を含有する１種もし くはそれ以上の標準溶液および／または好適緩衝溶液の１種もしくはそれ以上お よび／または酸化剤をも含有することができる。便宜的には、分析キットは、さ らに分析を実施する過程で発する光を測定するために使用される装置と組合せて 使用するのに適した反応容器をも含むことができる。

さらに、各試薬の充分な混合を確保するのに使用する混合装置を分析キットに含 ませることもできる。

以下の実施例により本発明を説明する。

実施例　１ 下記の実験において、式（５）のエストラジオール−イソルミノール結合体の化 学発光を測定した。これらの実験は、エストラジオールを標識するための、並び に患者の体液試料中の遊離エストラジオールと標識されたエストラジオールとが 所定量の不溶性の〆抗１ストラジオールに対して競合し、かつ固相に結合した標 識の量を測定するような競合分析または置換分析を行なうためのイソルミノール の使用の代表例である。試料中の遊離エストラジオールの役は、固相−Ｆで測定 される標識の聞に反比例する。

次の溶液の混合物を蒸留水（２回蒸留）中で１ｉｌｖシて実験を行なった。

エストラジオール−イソルミノール結合体（１ｎＱ／　ｒｔｌ　）　：　１００ ．ｃｚ　Ａ英国、ドルセット、ブーレ在、シグマ・ケミカル・カンパニー社から のミクロペルオキシダーゼ（２０μ９／ｒｄ＞　：　１００μｐ 過酸化水素（０，３％Ｗ／Ｖ　、すなわち３ｍ！Ｊ／ｍＡ＞　：　１００．ｃｚ Ｊ）最後にミクロペルオキシダーゼを分析チューブ内の他の成分の混合物に添加 した。混合物のｐＨを測定した。これは結合体の非存在により大して影響されな かった。しＫＢ−ワラツク１２５０型ルミノメータで発光を測定した。培養時間 を設けず、かつ最大ピーク高族での発光強度を記録した。それらの結果を第１表 に示す。

増幅剤として試験した添加剤と組合せてルミノール標識の効果を比較するため、 一連の「バックグランド」試験を行なった。

これらの試験においては、結合体を省略し、各成分はペルオキシダーゼと過酸化 水素とアミン増幅剤とで構成し、４００ｄに調製した。結合体とペルオキシダー ゼと過酸化水素と増幅剤（それぞれ１００μｇ）とが全て存在する［増幅剤を用 いたときの信号」試験と「バックグランド試験」との比較はこの分析の有用性を 示した。

増幅剤の代りに　１００μｐの蒸留水（２回蒸留）を用いた他の試験において、 信号は極めて低く、すなわら２．９３であった（増幅剤を用いないときの信号は 、各反応体を発光測定前に培養することにより改善することもできたが、培養に 伴う遅延は必らずしも望ましくない）。

試験した全てのアミンは良好な増幅作用を与えたことが判るであろう。

増幅剤を用いないときの信号は、各反応体を発光測定前に培養させることにより 改善しうるが、培養に伴う遅延は必らずしも望ましくない。

第　１　表 エストラジオール−イソルミノール結合体からの化学発光に対するアミン添加剤 の効果（結合体の培養なし）バックグランド　増幅剤を用いたときの　混合物Ｄ ＡＢＣＯ３４，９７６５，８３１０，７キヌクリジノール　９．９６　３４．８ ３　１１．６４−ヒドロキシ−２，２，６，６− チトラメチルビベリジン　２．３７　２２．４９　１１．１キヌクリジン　５． ８７　２２．０１　１２．６４−アミノ−２，２，６，６−チト ラメチルーピペリジン　１６．９６　１９．４０　１２．７実施例　２ この実施例は、遊離ルミノールとミクロペルオキシダーゼと過酸化水素とのＤＡ ＢＣＯによる反応の増幅作用を示している。

これは特に実施例１におけると同様の分析の代表例であって、遊離ルミノールと 結合ルミノールとが化学発光反応に関与する発光能において同様に挙動する（定 量的差を有する）ことが知られていることを考慮した。

容量４００μｍの溶液を、特別に蒸留した水を用いて調製した。

使用した各試薬の濃度および容量は次の通りである：ミクロペルオキシダーゼ　 ２０μｇ／ａｔ！　−１００μｐＤＡＢＣＯ５０もしくは２５■／　ｍｅ　−１ ００〃ト１　２　０　２　ｏ、３　％　Ｗ／Ｖ　−１００＃ルミノール　種々の 濃度　−１００〃 Ｈ２Ｏ２／ミクロペルオキシダーゼ並びに　１ｍ９／ｒｄのルミノール溶液の１ ０，１０　および１０−１１希釈物からの発光を、ＤＡＢＣＯの存在下および非 存在下で測定した。５０■／ＨＩｌのＤＡＢＣＯを用いた典型的な結果を下記第 ２表に示す。ＤＡＢＣＯの添加はｐＨをそれぞれ３．１から１０．８．１０．７ および１０．６まで上昇させた。

次のように結論された： （１）ＤＡＢＣＯはミクロペルオキシダーゼ／ルミノール／Ｈ２Ｏ２反応からの 発光を増幅した（５〜１５倍以上）。

（２）ＤＡＢＧＯはルミノールの非存在下でミクロペルオキシダーゼ／Ｈ２Ｏ２ 反応からの発光を僅かに増大させた（２０倍以上）。

（３）　Ｄ　Ａ　Ｂ　ＣＯによって増幅されたＭＰ／ルミノール／Ｈ２Ｏ２反応 からの発光の速度は迅速かつ閃光的であったが、開始後に僅かに遅延した。

（４）ＤＡＢＣＯは相乗的にルミノールと反応すると思われる。

実施例　３ この実施例は、エストラジオールの代謝物である尿エストロンー３−グルクロニ ド（Ｅｌ−３−Ｇ）を測定するための分析例を示している。この分析は、試験管 内の上首尾の妊娠処置に必須である排卵時期を予測するため、女性における小胞 発現を測定するのに有用である。二重−抗体固相競合免疫分析を用いた。

第二抗体、すなわちロバ抗−ウサギＩＱＧをポリスチレンチューブの壁部に吸着 した。イソルミノール標識した結合体（Ｅｌ−３−Ｇ−アミンへキシル−エチル −イソルミノール）と−次抗体（ウサギ抗−Ｅ１−３−　Ｇ−ＢＳＡ）とを尿試 料と共に培養した。液相を除去しかつチューブを充分洗浄した後、チューブに結 合したイソルミノールの量を分析し、その際ＤＡＢＣＯおよびミクロペルオキシ ダーゼの水酸化ナトリウム溶液を添加しかつ生じた化学発光を測定した。

試　薬 標準Ｅ１−３−Ｇはクートールド・インスティチュート・オブ・バイオケミスト リー〔ロンドン、ミドルセックス・ホスピタル・メゾカル・スクール〕のＷ、ク ールンン博士により寄贈された。ＤＡＢＣＯ，ミクロペルオキシダーゼ（ＭＰｌ ｌ）、牛血清アルブミン（ＢＳＡフラクション■）およびセファロ−スープロチ インＡはシグマ・ケミカル・カンパニー・リミテッド社〔英国、ドルセント、ブ ーレ在〕から購入した。Ｅｌ−３−Ｇ−６−牛血清アルブミンに対するポリクロ ーナル抗血清（ウサギ）はバーミンガム・ホスピタル・フォー・ラーマン〔英国 、バーミンガム在〕のＷ、バット博士により寄贈された。ロバ抗−ウサギ抗血清 のＩＯＧフラクシジンは、プロティンＡ−セファロースＣＬ−４Ｂに対する親和 性クロマトグラフィーにより調製した。他の試薬は全て、ＢＤＨ（ロンドン）リ ミテッド社〔英国。

ロンドン、エンフィールド、ベアード・ロード在〕から入手した。

分析緩衝液は（）、ＩＭ燐酸塩ｌｓ函液とした：すなわち０．１％のゼラチンと ０．９％の塩化ナトリウムとを含有するＩＩｌの蒸留水（２回蒸留）に溶解した ２、５ｇのオルトｗｉ！二水素ナトリウム・　２Ｈ２０−１−１１，９ｇのオル ト燐酸水素二ナトリウム（ｐＨ７，４）。

ミクロペルオキシダーゼをｖＡＩ！１ｌｉｉ液に溶解し、かつ保存溶液（１１１ ＋９／ｍｌりを４℃にて保存した。処理溶液は２０μ’ｊ／ｍＱ（１：５０、Ｖ ／Ｖ）とした。さらに、バルビタール緩衝液を次のように調製した〜０．１％の ＢＳＡと０．９％の塩化ナトリウムとを含有する１ｐの蒸留水（２回蒸留）に溶 解した１４．４９のナトリウムバルビタール（ｐＨ８，６）。酸化剤溶液は、１ ００μｐの３０％Ｗ／Ｖ過酸化水素溶液を１０ｄの蒸留水（２回蒸留）に添加し て調製した。

学発光性標識結合体の調製 式（１）の６−　（Ｎ−４−アミノへキシル）−Ｎ−エチルコアミノ−２，３− ジヒドロフタラジン−１，４−ジオン（ＡＨＥＩ）を、従来報告されている方法 で合成した。Ｅｌ−３−Ｇに対するＡＩ−ＩＥＩの結合およびこの生成物の精製 は、エストリオール−１６−α−グルクロニド−ＡＢＥＴ結合体に関しＦ、コー エン等により記載された方法〔ステロイド（Ｓ　ｔｅｒｏｉｄｓ）７第３６巻、 第４０５〜４１９頁（１９８０）　）と同様に行った。

試料の採取および希釈 ２４時間にわたって排出された全尿の試料を、健康な妊娠していない女性志願者 から、その完全な月経周期の期間中に毎日採取した。尿の全容昂を毎日の採取に つき記録した。

ロバ抗−ウサギＩｏＧを被覆用緩衝液にて適当に希釈した（過剰）。各ポリスチ レン分析チューブ（ルナ主１ベット）〔ラボラトリ−・インペックス・リミテッ ド社、英国、ミドルセックスＴＷ１　４ＪＦ、　ドイツケンハム、ライオンロー ド、インペックス・ハウス在〕に前記希釈液３００μｇを添加した。４℃にて１ 晩培養した後、被覆用緩衝液を吸引廃棄し、かつ４００μ」の分析緩衝液を各チ ューブに添加した。２２℃にて３０分間培養した後、これらチューブを４℃にて 必要とされるまで貯蔵した。これらの条件下で貯蔵した場合、被覆チューブは数 ケ月にわたり完全に安定であった。

免疫分析法 ２０μｍの尿または２０ｔｉ、１）の標準（０〜１１２０μｍｏ　ｌ　／　４１ の範囲の分析緩衝液〉を第二蔦抗体被覆チューブに２回繰返し添加した。

２００μＪのＥｌ−３−Ｇ−八ＨＥＩ（Ｉｎｏ：約１００．０００カウント７１ ０ｓｅｃ、　）および１００μｇの適当に希釈したポリクローナル抗−Ｅ１−３ −Ｇ抗血清（１：　１０，０ＯＯｖ／Ｖ）を添加し、更にこの混合物を２２℃に て３０分間培養した。次いで、チューブの内容物を吸引除去した。５００μｐの 分析緩衝液を各チューブに添加し、次いで吸引除去した。この洗浄工程を２回繰 返した。

次いで各チューブに、２５ｇ／ｆＪの濃度でＤＡＢＣＯを含有する０、　２Ｍ水 酸化ナトリウム溶液２００μｇを添加し、次いで１００μｇのミクロペルオキシ ダーゼ希釈液を添加した。最終混合物のｐｌ＋は１３．１であった。次いでチュ ーブをルミノメータ（ビオルマット；ラボラトリ−・インペックス・リミテッド 社）に入れた。１００μｇの０．３％Ｗ／Ｖ過酸化水素溶液を自動ディスペンサ により急速注入して化学発光反応を開始させた。ペルオキシダーゼを添加した後 に信号を１０秒間にわたり積算しかつその数値を記録した。

第３表に示した結果は、分析用の検量曲線を作成すべく得たものである。Ｅ　１ −３−　Ｇの８種の濃度を用いた。

第　３　表 Ｅｌ−３−Ｇ標準溶液の濃度　カウント数、ｍＶ／ｓｎｍｏ　ｌ　／Ω　（２回 の実験の平均（ａ　）実施例　４ この実施例はエストロン−３−グルクロニド（Ｅｌ−３−Ｇ）に関する他の分析 を示し、ここで発光反応は異なるｐＨで行ない、かつ試薬を６０℃にて１時間培 養し、発光の測定前に標識を分離させる慣用のイソルミノール標識分析と比較し た。

試　薬 用いた試験は、ポリクローナル抗体の代りに２ｌ−３−Ｇに対するモノクローナ ル抗体を用いた以外は実施例３と同様にした。

ポリスチレンチューブに抗−Ｅｌ−３−Ｇを付着させるべく用いた被覆用１１！ ｌｉ液は０．１Ｍ炭酸塩Ｉａ衝液（ＤＨＩＯ）とした。分析緩衝液は１ｇ／４１ のゼラチンを含有する燐酸塩緩衝塩水（ＰＢＳ　Ｇ　）　（０，１Ｍ　、　ｐＨ ７，４）とした。ミクロペルオキシダーゼ（ＭＰ−１１）を０．０５Ｍ燐酸塩緩 衝液に溶解させて１■／ｄＰＢｓの保存溶液をｖＡ製した。２．６μＭ酵素（１ ：　５０希釈）の処理溶液を分析に用いた。酸化剤である過酸化水素は０．３％ Ｗ／ＶとしたＥｌ−３−Ｇに対するモノクローナル抗血清（ＩＩＩｇ／ｄ）を被 覆用緩衝液にて５００倍希釈し、かつ３００μｇを抜取って各チューブに添加し た。４℃にて１晩培養した後、各チューブを吸引しかつ４００μｐの分析緩衝液 （０，１Ｍ　、　ｐＨ７，４）Ｐ　Ｂ　Ｓ　Ｇを添加した。

これらのチューブを再び室温にて３０分間培養した後に吸引した。

４０〜Ｏｎｇ／１ｒｔｆｌ　Ｐ　Ｂ　Ｓ　Ｇの範囲のＥｌ−３−Ｇの標準を作成 した。

１００　ｎｇ／ｄの濃度におけるＥｌ−３−Ｇ−ＡＨＥ　Ｉの保存溶液をＰＢＳ Ｇで１００倍希釈した。１ｏｏμｐ　ノＥ１−３−　Ｇ−ＡＨＥ　Ｉを室温で１ 時間培養し、次いでこれらチューブを吸引しかつ蒸留水（２回蒸留）で３回洗浄 した。

この時点で３種の異なるモル濃度の１種におけるＮａＯＨ中のＤＡＢＣＯ（７） １０Ｒｇ／ｄｌ液１０（ｌμＮ　ヲ、ミクロペルオキシダーゼと共に各チューブ に添加し、かつ　１００μρの過酸化水素を添加して化学発光を開始した。

比較の目的で、ＤＡＢＣＯの代りに水酸化ナトリウム（２Ｍ）を用いた実験を行 なった。これらチューブを洗浄した後、水酸化ナトリウム（３００μｐ）を添加 しかつチューブをさらに６０℃にて１時間培養した。チューブを室温まで冷却し た後、ミクロペルオキシダーゼと過酸化水素とを前記と同様に添加した。実施例 ３におけると同様のルミノメータで光を測定し、かつ発生した光信号を１０秒間 にわたり積算した。

その結果を下記第４表に示す。水酸化ナトリウムの２Ｍ１度において、４０ｎＱ ／　ｄとＯ標準との信号の差は約３２　、　ＯＯＯｍＶ／　ｓであり、これは６ ０℃にて加熱する従来技術の方法による３７．　ＯＯＯｍＶ／Ｓの差とほぼ同程 度であることが判るであろう。

光強度、　ｍＶ／３ｅｃ　比　較 ＰＢｓＧ中、）　ＤＡＢＣＯ（１０＃ｌ！？／に）（ｐＨ１１，８）　（ｐＨ１ ２，８）　（ｐＨ１３，６）　ＮａＯＨｐＨ１３，７）４０１１ｇ／ｎｌ！　１ ０，２７５　１６，８６５　１２，７７０　８．９３０２０　／／　１２，０３ ０　２０，７４５　１６，３００　９．７７５１０　＃　１４，６００　２４， ７１５　１８，６８５　１５．１３５５　〃１５．．７９５　２５，２０５　２ ９，３８５　２２．２６０２．５＃　１７，４３０　２６，５９０　３６，０４ ５　３２，０５０１．２５＃　２０，４２５　３２，７３５　４２，９３０　３ ９．０１５Ｏｎ　２２，３７０　３６，８８０　４４，８５０　４６．１９ＯＮ ＳＢ＊ｎ　４，３９０　４，２９ｏ１０，５９５　２．６３ＯＮＳＢ　（非特異 性結合）を未被覆の チューブ十Ｅ　−３−Ｇ−ＡＨＥ　Ｉ　（１００ＩｉＪ）　）　＋４０ｎｇ／Ｉ ｎＩＥ１−３−　Ｇ（１００μＮ　）から得た。

実施例　５ シクロベルオキシターゼの代りに、蒸留水（２回蒸留）で１：５０希釈したヘマ チンの１ｍ９／ｄ　Ｏ，２Ｍ　Ｎ　ａ　ＯＨ溶液１００μＮを用い、カッ濃度１ ０ηおよび２０Ｉｒｒｇ／　ａｔ！のＤＡＢＣＯ溶液を用いた以外は実施例４の 手順を繰返した。

ヘマチンは良好な増幅作用をもたらし、すなわちゼロＥ１−３−Ｇに対する光カ ウント数は７．０９０から６９．９７０ｍＶ／　ｓまで上昇し、かツ４０ｎｃ＋ ／ｄ（７）Ｅｌ−３−Ｇ１．；：、ツイテハ７，３８０カラ３８，５２０ｍＶ／ Ｓまで上昇した。

ヘマチンを触媒として用いることにより、良好な検量曲線が得られた。その結果 を第５表に要約して示す。ＤＡＢＧＯを用いずかつ２Ｍ　ＮａＯＨ中にて６０℃ でチューブを１時間培養する従来技術の方法は、検量曲線を与えなかった。これ は恐らくイソルミノール標識をＡＨＥ　Ｉから分離させる際に使用するための触 媒としてヘマチンが鋭敏過ぎるためである。

第　５　表 光強度、ｍＶ７３ｅｃ。

（ｐＨ１３，１）　（ｐＨ１３，１）　（ｐＨ１３，６＞４０ｎＭＩｄ３８，５ ２０　２４，８５５　３２，９６５２０　〃４２，７６０　２９，６７０　３８ ．３６０１Ｏｎ　４７．５２５　３５，２２５　４０，５００５　〃５２，７１ ５　３９．９７５　４４，３６５２．５　ｎ　５Ｂ、２７０　４４，２１０　５ ４，８９０１．２５１１６３，４４５　４９．１１５６４，４７５Ｏｎ　６９． ９７０　５３，２２５　７４．４９０−　ＮＳＢ　（非特異性結合）を第４表に 示したようにして得た。

国際調査報告 Ｉ吻判ｌｌ１１−＾９両峰−ＩＩＮＯＰＣＴ／ＧＢ　８７１００６１７国際調査 報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．利用しうるヘム基を有する触媒と酸化剤と分析すべき物質に相関しうる分子 状残基に結合した化学発光性ジヒドロフタラジンジオン（ＤＰＤ）との間にて化 学発光反応を生ぜしめ、発生した化学発光を検出しまたは測定することからなる 発光分析もしくは発光測定分析において、一方または両方の橋頭位に窒素原子を 有する飽和二環式化合物または２−位および６−位に４個のＣ１−４アルキル基 を有するピペリジン環化合物からなる増幅剤の存在下に前記反応を行なうことを 特徴とする発光分析もしくは発光測定分析。 ２．ＤＰＤがイソルミノールもしくはルミノールであることを特徴とする請求の 範囲第１項記載の分析。 ３．増幅剤が１，４−ジアザビシクロ〔２．２．２〕オクタンであることを特徴 とする請求の範囲第１項または第２項記載の分析。 ４．触媒がミクロペルオキシダーゼであることを特徴とする請求の範囲第１項、 第２項または第３項記載の分析。 ５．競合分析を水溶液中でハブテンに関して行ない、これによりＤＰＤ−結合体 を担体に結合させ、担体を洗浄し、酸化剤と触媒と増幅剤とを添加し、さらに室 温かつｐＨ９〜１０．５にて発光を検出しまたは測定することを特徴とする請求 の範囲第１項、第２項、第３項または第４項記載の分析。 ６．別々の容器にて、 （１）利用しうるヘム基を有する触媒 （２）酸化剤、および （３）分子状残基に結合した化学発光性ジヒドロフタラジンジオン（ＤＰＤ） を含む発光分析もしくは発光測定分析を実施するキットにおいて、一方または両 方の橋頭位に窒素原子を有する飽和二環式化合物または２−位および６−位に４ 個のＣ１−４アルキル基を有するピペリジン環化合物からなる増幅剤をさらに含 むことを特徴とするキット。 ７．ＤＰＤがイソルミノールもしくはルミノールであることを特徴とする請求の 範囲第６項記載のキット。 ８．触媒がミクロペルオキシダーゼであることを特徴とする請求の範囲第６項ま たは第７項記載のキット。 ９．ＤＰＤがハブテンに結合していることを特徴とする請求の範囲第６項、第７ 項または第８項記載のキット。