JP4526220B2 - 生物学的サンプル中の被検体を定量するための化学発光酸化還元アッセイ - Google Patents
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Description
(発明の背景)
1.発明の分野
本発明は、生物学的サンプル中の被検体の量を測定するための方法、より詳しくは、化学発光標識の不活性化を用いて生物学的サンプル中の被検体の量を測定するための方法を含む。
【0002】
2.技術分野の考察
血中アルコール濃度を測定するための現在のアッセイは、2つの酵素(酵母アルコールデヒドロゲナーゼおよびジアホラーゼ)により触媒される反応、およびそれに続く、発蛍光団により放出された光の減衰に基づくものである。これらのアッセイは、しばしば、「放射性エネルギー減衰(radiative energy attenuation)」アッセイまたはREAアッセイと称される。REAアッセイは発色反応を含む。それらの反応系は、色原体(未反応色素)を発色団(着色色素)に変換するために被検体を用いる。安定な蛍光物質(発蛍光団)も該反応混合物中に含まれる。生成した発色団の光吸収特性は、該発蛍光団から測定された蛍光強度の減少を引き起こす。REAアッセイは、測定蛍光強度の対数が発色団の存在量に反比例するという原理に基づいて特定の被検体を測定するために定量的に用いられる。発色団の生成は、被検体の消費に対する該反応系と関連づけられ、したがって、蛍光減衰の発生は、該サンプル中の被検体の濃度を測定するために検定されうる。生物学的サンプル中のエタノール濃度を測定するための反応は、以下のとおりに表されうる。
【0003】
【化1】
(式中、
yADHは、酵母アルコールデヒドロゲナーゼを表し、
NAD+は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを表し、
NADHは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの還元型を表し、
MTTは、3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−2,5−ジフェニル−2H−テトラゾリウムブロミドを表し、
MT−ホルマザンは、光吸収化合物(すなわち、発色団)を表す)。
【0004】
前記反応においては、反応生成物MT−ホルマザンは光の透過を遮断する。前記反応で形成されるMT−ホルマザンの量が多ければ多いほど、該サンプル中のエタノールの量は多い。前記反応は、Abbott Laboratoriesから商業的に入手可能なAxSYM(登録商標)装置を使用するアッセイによりエタノールの濃度を測定するために用いられる。エタノール濃度と測定される蛍光強度との関係は、検量線を作成することにより確立される。既知濃度のエタノール検定体を使用し、生じた減衰した蛍光シグナルを測定する。未知体を測定する場合には、記録された検量線からその濃度を計算する。エタノール濃度を測定するための測定装置を図1に図示する。
【0005】
生物学的サンプル中のエタノールのこれまでの定量的測定は、以下の一般的方法に基づくものである。
(1)種々の酸化剤の存在下でのエタノールの化学的酸化。
(2)アルコールデヒドロゲナーゼ酵素により触媒されるエタノールの生化学的酸化およびそれに続くNADHの比色測定。
(3)アルコールデヒドロゲナーゼ酵素により触媒されるエタノールの生化学的酸化、およびそれに続く、ジアホラーゼの存在下でのホルマザンの形成。ついでホルマザンは、該方法に決定的に重要な試薬である蛍光性化合物により放出される光を減衰する。
【0006】
これらの方法は種々の欠点を有する。エタノールの化学的酸化を用いるアッセイは、低い感度を示し、主としてアルコール中毒の予備評価を得るために用いられる。第2の方法を用いるアッセイも相当に低い感度を示し、サンプル中の他の光吸収性物質からの干渉を受けやすい。第3の方法を用いるアッセイは蛍光源および対応する検出系を要する。したがって、生物学的サンプル中のエタノールの定量測定のための、より強固かつ費用効果的な方法が必要とされている。
【0007】
米国特許第4,950,613号は、保護された標識(対応する未保護標識は加水分解などにより該標識が非化学発光体を生じるため不活性化を受けやすい)を使用して、標識された特異的結合相手(例えば、抗体またはオリゴヌクレオチドプローブの形態の生物学的プローブ)を作製する方法を開示している。該特異的結合相手は該標識に連結され、保護付加形成体を使用して該標識の付加体が作製され、これにより、保護された標識が得られ、そしてそれは不活性化をより受けにくい。特に好ましいのは、アクリジニウムおよびアクリダンである。該保護標識の形成は、好ましくは、該保護付加形成体の希釈または酸化などにより容易に逆反応が生じうる平衡反応である。
【0008】
米国特許第5,294,540号は、テトラゾリウム塩、アルコールデヒドロゲナーゼ、NAD+および電子伝達剤を含む、エタノールを定量的にアッセイするための多層解析要素を開示している。該電子伝達剤を含む該層はまた、繰返し生じる負に荷電した基を有するポリマーを含み、該NAD+は、異なる層内に存在する。
【0009】
米国特許第5,624,813号は、NAD(P)に結合したデヒドロゲナーゼおよび酸化還元酵素または該補因子を検出または定量する、あるいは該酵素反応を発光生成系と共役させることによりこれらの酵素により触媒される基質、中間体または生成物を検出または定量する、化学発光に基づくアッセイを開示している。該アッセイは、補因子としてNAD(P)+/NAD(P)Hを要する酸化還元酵素により触媒される反応で生成したNAD(P)Hとペルオキシダーゼとを反応させ、ついでアミノ酸または糖のような被検体から化学発光を生成するために化学発光部分を加えて、それに基づいて、該酸化還元酵素またはNAD(P)+/NAD(P)被検体の活性を測定する工程を含む。
【0010】
現在のところ、エタノールに関するいずれのアッセイで、生物学的サンプル中に存在する基質からの干渉を有効に排除または減少させたものはない。そのような干渉の一例として、比色分析におけるバックグラウンド吸収がある。
【0011】
(発明の概要)
本発明は、生物学的サンプル中の被検体の濃度の測定方法であって、
(a)該生物学的サンプル、関心のある被検体に関する少なくとも1つの酸化酵素、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(以下、NAD+と称される)および化学発光標識を一緒にして、反応混合物を形成させ、
(b)該被検体を酸化−還元反応に付し、NAD+をニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの還元型(以下、NADHと称される)に変換し、さらに該化学発光標識をNADHと反応させ、
(c)放出された光の量をNADHの濃度と相関させることにより、該生物学的サンプル中の関心のある被検体の濃度を測定する工程を含む方法を提供する。
【0012】
該化学発光標識は、該生物学的サンプル、該酸化酵素および該NAD+と同時に導入することが可能であり、あるいは、例えばNADHの形成の開始後などに、別の工程でそれを導入することが可能である。エタノールが、関心のある被検体である場合には、該酸化剤は、好ましくは、酵母アルコールデヒドロゲナーゼである。
【0013】
ニコチンアデニンジヌクレオチド補酵素の還元型であるNADHは、被検体(例えば、エタノール)から生体酸化生成物(例えば、エタノールの場合にはアセトアルデヒド)への酵素触媒変換中に生成される。本発明の方法により他の被検体が測定されうるが、これらの被検体の生体酸化生成物はアセトアルデヒドではないかもしれない。良好な化学発光標識を与えるアクリジニウム誘導体に対するNADHまたはNADH類似体の反応性は、水素化物アニオンの伝達を含む、酵素によりモジュレーションされる還元反応のモデルとして研究されている。アクリジニウム誘導体とNADHとを混合すると、NADHは急速かつ不可逆的に水素化物アニオン(1個のプロトンおよび2個の電子)を該アクリジニウム誘導体に伝達する。得られる化合物であるアクリダンは、アルカリ性過酸化物(これはアクリジニウム誘導体の化学発光活性化に必要である)との反応を嫌い、その結果、該化学発光反応に重要な中間体を形成しない。そのため、該アクリジニウム誘導体の非化学発光形態であるアクリダンの生成量は、シグナルの減少に直接比例する。そのシグナルの減少は、被検体(例えば、エタノール)の化学量論的変換中に生成したNADHの量と直接的に相関されうる。該被検体の各分子から対応生体酸化生成物への変換は、厳密に1個のNADHを要するため、該シグナル減少は生物学的サンプル中の被検体の濃度と直接的に相関されうる。
【0014】
本発明の方法により検出されうる被検体の代表例には、エタノール、エチレングリコール、フェニトイン、グルコース、ケトン体、トリグリセリド、コレステロール、乳酸(ラクタート)、α−アミラーゼ、アンモニア、リンゴ酸(マラート)、アンドロステロンおよびテストステロンが含まれるが、これらに限定されるものではない。好ましい被検体には、エタノールおよびエチレングリコールが含まれる。本発明で使用しうる酸化酵素の代表例には、アルコールデヒドロゲナーゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、β−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、アンドロステロンデヒドロゲナーゼ、テストステロンデヒドロゲナーゼおよびリンゴ酸デヒドロゲナーゼが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【0015】
好ましい実施形態においては、本発明の方法は、バックグラウンド干渉を減少させるための固相の使用を含む。好ましい実施形態においては、該方法は、
(a)該生物学的サンプル、固相、関心のある被検体に関する少なくとも1つの酸化酵素、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD+)および化学発光標識を一緒にして、反応混合物を形成させ、
(b)該被検体を酸化−還元反応に付し、NAD+をニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの還元型(NADH)に変換し、さらに該化学発光標識をNADHと反応させ、
(c)該化学発光標識を該固相から分離し、
(d)放出された光の量をNADHの濃度と相関させることにより、該生物学的サンプル中の被検体の濃度を測定する工程を含む。
【0016】
該化学発光標識は、該生物学的サンプル、該酸化酵素および該NAD+と同時に導入することが可能であり、あるいは、例えばNADHの形成の開始後などに、別の工程でそれを導入することが可能である。
【0017】
化学発光標識(この場合には、発光は化学酸化工程により生じる)および生物発光標識(この場合には、発光のためのエネルギーは酵素−基質反応により生成される)は、本発明での使用に適した標識手段である。化学発光標識としては、ルミノール(C8H7N3O2)およびアクリジン(C13H9N)の誘導体を使用することができる。好ましい化学発光標識はアクリジニウム誘導体である。図2は、化学発光標識の不活性化のメカニズムを示す。
【0018】
該反応混合物が、約9以上のpHに維持された場合に、該方法は迅速に進行する。該反応混合物のpHを約9以上のレベルに維持するために、バッファーを使用することができる。トリス/グリシンバッファーは、この目的のための適当なバッファーである。本発明に適した他のバッファーは、望まれる緩衝範囲に基づいて選択することができ、そしてこれは、該酵素の活性に左右され、これは該反応混合物のpHに左右される。
【0019】
本発明の方法では、好ましくは、該化学発光標識を調整するための予備誘発剤を使用して、それが該誘発剤と反応しやすくさせる。本発明の方法では、好ましくは、該化学発光標識を求核剤と反応させて発光性化合物(例えば、アクリドン)の形成を可能にするために誘発剤を使用する。エタノールの測定の場合には、該予備誘発剤は、好ましくは、水素イオンと過酸化水素との混合物であり、該誘発剤は、好ましくは、水酸化物イオンである。該水素イオンは、好ましくは、硝酸により供給され、該水酸化物イオンは、好ましくは、水酸化ナトリウムにより供給される。
【0020】
本発明の方法の好ましい実施形態においては、該方法は、
(a)生物学的サンプル、固相、関心のある被検体に関する少なくとも1つの酸化酵素およびNAD+を一緒にして、反応混合物を形成させ、
(b)被検体(例えば、エタノール)を生体酸化生成物(例えば、エタノールの場合にはアセトアルデヒド)に変換し、NAD+をNADHに変換し、
(c)化学発光標識を該反応混合物に加え、
(d)該化学発光標識をNADHと反応させ、該固相で捕捉し、
(e)該反応混合物を洗浄し、
(f)該化学発光標識を遊離させ、
(g)放出された光の量をNADHの濃度と相関させることにより、被検体の濃度を測定する工程を含む。
【0021】
この実施形態においては、好ましい固相は、常磁性微粒子(好ましくは、ポリスチレンから構成されており、それに第1特異的結合メンバーが付着しているもの)を含む。該第1特異的結合メンバーは、該化学発光標識に結合した第2特異的結合メンバーに特異的に結合する。
【0022】
本発明の方法の利点には、バックグラウンド干渉の減少または除去、感度の増加およびコストの減少が含まれる。
【0023】
(図面の簡単な記載)
図1は、生物学的サンプル中のエタノールの濃度を測定するために先行技術において用いられている装置を例示する概要図である。
【0024】
図2は、アクリジニウム誘導体の還元的不活性化を例示する図である。
【0025】
図3A、3B、3C、3D、3Eおよび3Fは、それぞれグルコース、トリグリセリド、β−ヒドロキシ酪酸、L−乳酸、α−アミラーゼおよびアンモニアの生体酸化生成物を例示する概要図である。
【0026】
図4は、アクリジニウム誘導体の化学発光体の形成をもたらす反応を例示する。
【0027】
図5は、アクリジニウム誘導体の化学発光体の形成をもたらさない反応を例示する。
【0028】
図6は、米国特許第5,795,784号に記載の装置上で実施されうるエタノールに関するアッセイを例示する流れ図である。
【0029】
図7は、エタノールに関するアッセイの反応の概要を例示する概要図である。
【0030】
図8は、1mM当たりのNADHの濃度の関数としての相対光単位(Relative Light Units)(RLU)の検量線を例示するグラフである。
【0031】
図9Aおよび9Bは、エタノールからアセトアルデヒドへの変換に対するpHおよびバッファーの影響を例示するグラフである。
【0032】
図10は、エタノールからアセトアルデヒドへの変換に対するpHおよびバッファーの影響を例示するグラフである。
【0033】
図11は、REAアッセイにより測定したエタノール濃度を、本発明のアッセイにより測定したエタノール濃度と比較するグラフである。
【0034】
図12は、REAアッセイにより測定したエタノール濃度と本発明のアッセイにより測定したエタノール濃度との間の相関性を例示するグラフである。
【0035】
図13は、エタノールに関するアッセイの別法を例示する流れ図である。
【0036】
図14は、エタノールに関するアッセイの別法を例示する流れ図である。
【0037】
図15は、エタノールに関するアッセイの別法を例示する流れ図である。
【0038】
図16は、エタノールに関するアッセイの別法を例示する流れ図である。
【0039】
(詳細な記載)
本発明で用いる「化学発光」なる語は、周囲温度における化学反応の結果として光を放出する化合物の性質を意味する。「標識」なる語は、抗体または被検体もしくは被検体類似体に結合しており該抗体と該被検体または被検体類似体との間の反応を検出可能にする基を意味する。標識の代表例には、酵素、放射能標識、発蛍光団、および光を生成する化合物が含まれる。標識は、視覚的または機械的手段により検出可能なシグナルを生成しうる及び適当な分子に結合されうる任意の物質である。種々の標識には、触媒、酵素、リポソームおよび他の小胞のうち色原体、触媒、蛍光性化合物、化学発光性化合物、酵素などのシグナル生成物質を含有するものが含まれる。本発明においては、好ましい標識は化学発光性化合物である。「トレーサー」なる語は、標識なる語と同義である。「固相」なる語は、特異的結合メンバーを有する複数の微粒子を意味し、この場合、該特異的結合メンバーはそれに化学的または物理的に結合している。本発明で使用しうる微粒子は、好ましくは、高分子材料から構成され、より好ましくは、スチレン単位を有する高分子またはアクリル酸エステル単位を有する高分子に由来する微粒子を含む。該微粒子は、好ましくは、実質的に球状であり、好ましくは、半径約1μm〜約10μmの範囲のものである。これらの微粒子を試験サンプルから分離するための好ましい方法は、磁界を用いた該微粒子の捕捉を含む。この好ましい方法においては、該固相は、特異的結合メンバーを有する磁化されうる微粒子(該特異的結合メンバーは化学的または物理的にそれに結合している)の混合物を含む。本発明において有用な磁化されうる微粒子は、好ましくは、酸化第二鉄または酸化クロムをコアとし、高分子コーティングを有する。そのようなコーティングは、好ましくは、スチレン単位を有するホモポリマーおよびコポリマー、カルボキシル化スチレン単位を有するホモポリマーおよびコポリマー、またはアクリル酸エステルもしくはメタクリル酸エステル単位を有するホモポリマーおよびコポリマーから構成される。当業者に公知の他の固相には、ウェルまたは反応トレイの壁、チューブ、高分子ビーズ、ニトロセルロース小片、メンブレンなどが含まれる。
【0040】
本発明で用いる「DS研究」なる語は、「ARCHITECT」Development System上でのアッセイの性能の評価を意味する。該「ARCHITECT」Development Systemは、米国特許第5,795,784号に記載されている。「バッファー」なる語は、弱酸とその共役塩基とを含む水溶液を意味する。バッファーは、少量の酸または塩基の添加の際のpHの変化を阻止する。「捕捉剤」なる語は、酵素触媒反応の生成物と化学的に反応する化合物を意味する。これらの生成物は、捕捉剤により該反応混合物から取り出され、それにより、該酵素反応がその完了まで駆動される。エタノールの酵素触媒反応の場合、取り出される反応生成物はアセトアルデヒドである。「用量応答比」なる語は、該被検体(すなわち、試験される物質)の濃度と該応答(すなわち、検出されるシグナル)との間の相関性を意味する。
【0041】
「サンプル」、「生物学的サンプル」などの用語は、該被検体を含有すると疑われる物質を意味する。該試験サンプルは、その起源から得られたままの状態で直接的に、あるいは該サンプルの特性を修飾するために前処理した後に使用することができる。該サンプルは、任意の生物学的起源、例えば生理的流体、例えば血液、唾液、涙液、脳脊髄液、汗、尿、乳、腹水液、滑液、腹膜液、羊水などに由来しうる。該サンプルは、使用前に、例えば、血液からの血漿の調製、粘性流体の希釈などにより処理されうる。処理方法は、濾過、蒸留、抽出、濃縮、干渉性化合物の不活性化、試薬の添加などを含みうる。環境または食品の分析を実施する場合には、生理的流体以外の他の液体サンプル、例えば、水、食品などを使用することができる。また、被検体を含有すると疑われる固体物質をサンプルとして使用することができる。場合によっては、液体培地を形成するように又は被検体を遊離するように固体サンプルを修飾するのが有益かもしれない。「アクリジニウム共役体」なる語は、アクリジニウム誘導体が特異的結合メンバーに結合した物質を意味する。例えば、アクリジニウム共役体の作製に適したアクリジニウム誘導体としては、10−スルホプロピル−アクリジニウム−9−(N−スルホニルカルボキサミド)の塩が挙げられ、アクリジニウム共役体の作製に適した特異的結合メンバーとしてはビオチンが挙げられる。「アクリジニウム誘導体」なる表現は、アクリジニウム基を含有する物質を意味する。アクリジニウム誘導体は、P.G.Mattingly,“Chemiluminescent 10−Methyl−Acridinium−9−(N−Sulphonylcarboxamide)Salts.Synthesis and Kinetics of Light Eission”,Journal of Bioluminescence and Chemiluminescence,Vol.6,107(1991)およびI.Weeksら,“Acridinium Esters as High−Specific−activity Labels in Immunoassay”,Clin.Chem.28/8,1474−1479(1983)(それらを共に参照により本明細書に組み入れることとする)に、より詳しく記載されている。「予備誘発剤」なる語は、次の反応物との反応のために化学発光標識を良好な状態にする物質を意味する。「誘発剤」なる語は、該化学発光標識を求核剤と反応させて発光性化合物の形成を可能にする物質を意味する。
【0042】
本発明は、生物学的サンプル中の被検体の濃度の測定方法であって、
(a)該生物学的サンプル、関心のある被検体に関する少なくとも1つの酸化酵素、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(以下、NAD+と称される)および化学発光標識を一緒にして、反応混合物を形成させ、
(b)該被検体を酸化−還元反応に付し、NAD+をニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの還元型(以下、NADHと称される)に変換し、さらに該化学発光標識をNADHと反応させ、
(c)放出された光の量をNADHの濃度と相関させることにより、該生物学的サンプル中の目的とする被検体の濃度を測定する工程を含む方法を提供する。
【0043】
該化学発光標識は、該生物学的サンプル、該酸化酵素および該NAD+と同時に導入することが可能であり、あるいは、例えばNADHの形成の開始後などに、別の工程でそれを導入することが可能である。
【0044】
本発明の方法により濃度が測定されうる被検体の代表例には、エタノール、エチレングリコール、フェニトイン、グルコース、ケトン体、トリグリセリド、β−ヒドロキシ酪酸、コレステロール、乳酸(ラクタート)、α−アミラーゼ、アンモニア、リンゴ酸(マラート)、アンドロステロン、アンモニアおよびテストステロンが含まれるが、これらに限定されるものではない。好ましい被検体には、エタノールおよびエチレングリコールが含まれる。本発明で使用しうる酸化酵素の代表例には、アルコールデヒドロゲナーゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、β−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼ、アンドロステロンデヒドロゲナーゼ、テストステロンデヒドロゲナーゼおよびリンゴ酸デヒドロゲナーゼが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【0045】
前記の被検体のいくつかに関する具体的な反応スキームを、図3A〜3Fに、グルコース(図3A)、トリグリセリド(図3B)、β−ヒドロキシ酪酸(図3C)、L−乳酸(図3D)、α−アミラーゼ(図3E)、アンモニア(図3F)に関して記載する。
【0046】
参照により本明細書に組み入れる米国特許第5,795,784号は、本発明の測定を行なうための方法および装置を開示している。好ましい実施形態は、米国特許第5,795,784号、特に、第14欄49行〜第20欄51行に記載されている。
【0047】
本発明のアッセイは、化学発光標識、例えばアクリジニウム誘導体の還元的不活性化に基づくものである。図4および5を参照されたい。図4は、アクリジニウム誘導体の化学発光体の形成をもたらす反応を示す。図5は、アクリジニウム誘導体の化学発光体を形成しない反応を示す。図4および5においては、該アクリジニウム誘導体は、R1がスルホプロピル基を表しR2がn−ブチル基を表しTsがp−トルエンスルホニル基を表す10−スルホプロピル−アクリジニウム−9−(N−スルホニルカルボキサミド)である。該アッセイでは、競合アッセイ形を用いる。該被検体の濃度が低い場合には、該標識の少数が不活性化され、それにより比較的高い光出力が生じる。該被検体の濃度が高い場合には、該標識の多数が不活性化され、それにより比較的低い光出力が生じる。
【0048】
図6は、本発明の方法によりエタノールに関するアッセイを行なうための工程を示す流れ図である。エタノール以外の被検体の場合には、酵母アルコールデヒドロゲナーゼを適当な酵素で置換する。該アッセイの好ましい実施形態を行なうためには、固相、生物学的サンプル、NADおよび酵母アルコールデヒドロゲナーゼ(yADH)を容器内に調製する。該固相は、好ましくは、特異的結合メンバーが結合している微粒子の形態である。好ましい微粒子はポリスチレンを含む。該微粒子に結合している特異的結合メンバーは、化学発光標識に結合した特異的結合メンバーに特異的に結合する。該微粒子に結合している特異的結合メンバーは、好ましくは、ウサギモノクローナル抗ビオチン抗体である。該微粒子の直径は、好ましくは、約4.0〜約5.0μmであり、該微粒子の鉄含量は、好ましくは、約9.5〜約12.5%であり、液体担体中の微粒子の懸濁液の固体含量は、約4.4〜約5.2%である。
【0049】
得られた混合物を、適当な時間(典型的には約18分間)にわたりインキュベートする。ついで、特異的結合メンバーに結合した化学発光標識を含む共役体を該インキュベーション混合物に加える。該共役体は、好ましくは、ビオチン化アクリジニウム誘導体を含む。しかし、アクリジニウム誘導体の代わりに他の化学発光誘導体を使用することが可能であり、ビオチンの代わりに他の特異的結合メンバーを使用することが可能である。ついで、得られた混合物を、適当な時間(典型的には約4分間)にわたりインキュベートする。この時間中、該被検体(エタノール)の酵素変換から生じた酵素的に生成したNADHは、該アクリジニウム誘導体と反応する。該NADHは該アクリジニウム誘導体を不活性化する。ついで、微粒子と該アクリジニウム誘導体とを含む複合体だけが残るように、該混合物を洗浄する。予備誘発剤を該反応混合物に加えて、該化学発光標識を調整して、それが誘発剤と反応しやすくする。該予備誘発剤は、好ましくは、硝酸、過酸化水素および界面活性剤、例えば「TRITON X−100」(t−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール)の混合物を含む。該硝酸の濃度は、好ましくは、8.3mmol/Lである。ついで、誘発剤を該反応混合物に加えて、該化学発光標識を求核剤と反応させて発光性化合物の形成を可能にする。該誘発剤は、好ましくは、水酸化ナトリウムを含む。水酸化ナトリウムの濃度は、好ましくは、0.35mol/Lである。該アクリジニウム誘導体をアルカリ性過酸化水素により活性化する。該予備誘発剤および誘発剤を加えた後、活性なアクリジニウム誘導体の残存集団だけが発光する。図6は、米国特許第5,795,784号に記載の装置上で実施されうるエタノールに関するアッセイを例示する流れ図である。図13、14、15および16は、それぞれ、エタノールに関するアッセイを行なうための別法を例示する流れ図である。該アクリジニウム誘導体に結合した特異的結合メンバーは、常磁性粒子の表面に付着した抗体に結合する。図7は、エタノールに関するアッセイの反応の概要を図式的に示す。
【0050】
該活性アクリジニウム誘導体、すなわち、NADHとは反応しなかったアクリジニウム誘導体の集団は、光の放出または生成を可能にする。該不活性化アクリジニウム誘導体、すなわち、NADHと反応したアクリジニウム誘導体の集団は、光を放出も生成もしない。ついで該シグナルを読取り、測定したシグナルを被検体の濃度に変換する。
【0051】
特筆すべきは、該共役体が該アッセイ中の任意の時点で該反応混合物に加えられうることである。例えば、該共役体は、該生物学的サンプル、該酸化酵素および該固相を一緒にして反応混合物を形成させる際に該反応混合物に導入されうる。該共役体は、該生物学的サンプル、該酸化酵素および該固相を一緒にする工程の後の時点で該反応混合物に導入されうる。
【0052】
該固相は、以下の方法に従い作製することができる:
(a)カルボキシル化常磁性微粒子(4.0μmの粒子、2.5mL、5% w/v)を磁気的にペレット化し、該上清を吸引し、該ペレットをリン酸緩衝食塩水で2回洗浄する;
(b)該微粒子を2−[N−モルホリノ]エタンスルホン酸(MES)バッファー(5mL、50mM、pH6.1)で更に2回洗浄する;
(c)該ペレットをMESバッファー(3.5mL、50mM、pH6.1)に再懸濁させ、1−(3−ジメチルアミノプロピル)−3−エチルカルボジイミド塩酸を加え(15mg)、得られた混合物を室温で10分間混合する;
(d)ついで抗ビオチンモノクローナル抗体(MESバッファー(1.5mL、50mM、pH6.1)中、1.5mg)を加え、得られた混合物を室温で120分間混合する;
(e)該微粒子をリン酸緩衝食塩水で5回洗浄して、溶液中に残存する未結合抗体を除去する;
(f)該微粒子を、100mM NaClおよび400mMショ糖を含有するTris(2.5% w/v、50mM、pH8.0)に再懸濁させる;
(g)使用前に、該微粒子を更に、1%ウシ血清アルブミンを含有するリン酸緩衝食塩水中で0.1% w/vに希釈する。
【0053】
該アクリジニウム共役体は、以下の方法に従い作製することができる:
(a)ビオチンヒドラジドをアクリジニウムヒドロキシスクシンイミドエステルに共役させ、当業者に公知の方法(例えば、Methods Enzymol.1990;184,123を参照されたい)を用いて逆相HPLCにより精製し、
(b)その精製したアクリジニウム−ビオチン標識を、使用前に、pH3.4の50mM Tris/グリシンバッファー中、0.2nmolに希釈する。
【0054】
被検体(例えば、エタノール)の定量的測定のための本発明のアプローチは、低分子量を有する被検体の臨床的/生化学的診断のための以下の2つの非常に望ましい概念を組合せることを含む:(1)迅速な酵素触媒、および(2)化学発光イムノアッセイ。このアッセイの設計は、該化学発光標識(例えば、アクリジニウム誘導体)の化学発光形態と非化学発光形態との比の測定を可能にし、その比は該生物学的サンプル中の被検体(例えば、エタノール)の量に比例する。均一アッセイ形態(すなわち、すべての試薬が溶液中に存在するアッセイ)に適応させるために、該洗浄工程を含む好ましい形態に要求されるいずれかの固相を除くことが可能である。本発明の方法は以下の利点をもたらす:
経費の削減、
プラットフォームの柔軟性および使い易さ、
正確さ、
良好な精度、
適当なダイナミックレンジ、
感度の増加、
他のアッセイへの適応性。
【0055】
本発明の方法は、該アッセイのために僅か1つの酵素を要するにすぎない。AxSYM(登録商標)エタノールアッセイ(放射エネルギー減衰)は2つの酵素を要する。エタノールに関する該アッセイに要する唯一の酵素は、安価な試薬である酵母アルコールデヒドロゲナーゼである。本発明の方法の場合、比色検出法で一般に用いられる第2の酵素であるジアホラーゼに伴う経費がかからない。この単一酵素アプローチは、測定される化学発光シグナルに直接的に影響を及ぼし、REA型のアッセイより明らかに効率的である。
【0056】
エタノールの酵素変換の短い反応時間および後続の該化学発光標識の不活性化は装置プラットフォームの信頼しうる自動化と共に、ハイスループットおよびロースループットの両方の実験室的試験に関する多数の要件を満足させる。所望により固相を除くことは、非専門家による試験における及び小さな実験室における被検体の濃度の測定のための手段を提供する。
【0057】
固相(例えば、常磁性微粒子)を使用するイムノアッセイ技術は、測定前に、修飾された化学発光標識を含む免疫化学複合体の十分な洗浄を可能にする。該洗浄工程は、エタノールに関する他のアッセイにおいて通常見出される内因性干渉をほぼ排除する。
【0058】
該自動化装置上の条件(すなわち、温度、サンプルと試薬との混合)の厳密な制御および良好な機械的精度(すなわち、試薬およびサンプルの調製の容積および速度)はNADHの存在下での該アクリジニウム誘導体の迅速な不活性化と共に、結果の、優れた再現性をもたらす。
【0059】
化学発光に基づく検出系は、比色系またはNADH吸収測定より有意に高感度である。化学発光系においては、その他の系において一般的であるバックグラウンド蛍光または消光作用からの干渉は存在しない。また、化学発光シグナル(濃いものから薄いものの生成)の性質はその優れた量子収率に加えて、より低レベルの被検体の検出を可能にする。より低レベルの被検体が検出されうることにより、正確に測定されうるダイナミックレンジの全体的な増加がもたらされうる。アクリジニウム誘導体に基づく標識の還元的不活性化は、アクリジンの非化学発光形態であるアクリダンの形成に基づく。適当なデヒドロゲナーゼ酵素の存在下、種々の被検体を修飾することが可能であり、それに伴いNADHが生成し、ついでそれは該アクリジニウム誘導体の化学発光のアンタゴニストとして作用する。ついで、固相に結合した共通の抗体を使用して、被検体とは無関係に化学発光標識を捕捉することができる。なぜなら、該アッセイは、該アクリジニウム誘導体の不活性化分子に対する活性分子の比率を測定するからである。
【0060】
以下の非限定的な実施例により、本発明を更に詳しく説明することとする。
【0061】
(実施例)
実施例1
この実施例では、アクリジニウム誘導体の特性を例示する。図2、4および5は、アクリジニウム誘導体に特徴的な化学反応を例示する。NADHが該アクリジニウム誘導体と反応した場合、NADHと該アクリジニウムとの反応生成物が予備誘発剤(H2O2,H+)および誘発剤(OH−)と更に反応する場合には、反応が生じないことが、図2から理解されうる。
【0062】
実施例2
この実施例では、DS研究を例示する。この研究の目的は、被検体(この場合はエタノール)の濃度を測定するためのNADHとアクリジニウム誘導体との反応の使用の実施可能性を実証することにあった。この研究においては、該方法は、以下の点以外は図6に示すとおりに行なった:(1)生物学的サンプルを使用しなかった;(2)NAD+を使用しなかった。NADHを固相と18分間インキュベートした。ついでNADHをアクリジニウム誘導体と反応させた。NADHと該アクリジニウム誘導体とを含有する混合物のインキュベーション時間は4分間であった。残りの工程、すなわち、洗浄工程、予備誘発工程、誘発工程および読取り工程は、図6に示すのと同じである。該研究の結果を図8に示す。該データは、該アクリジニウム誘導体とNADHとのインキュベーションに際して相対光単位(Relative Light Units)(RLU)の有意な減少が生じることを示している。検量線はNADHに関して3桁の量を包含することが理解されうる。
【0063】
実施例3
この実施例では、エタノールからアセトアルデヒドへの変換に対するバッファーのpHの効果、およびエタノールからアセトアルデヒドへの変換に対する捕捉剤の効果を例示する。この実施例においては、エタノール、NAD+、酵母アルコールデヒドロゲナーゼおよびバッファーを混合し、得られた反応を、紫外可視分光光度計によりモニターした。図9Aは、pH8.8のピロリン酸バッファーを使用した場合の、時間の関数としての変換を示す。図9Bは、pH9.6のトリス/グリシンバッファーを使用した場合の、時間の関数としての変換を示す。これらの図から、pH8.8を有するピロリン酸バッファーを使用した場合のエタノールの変換は遅く不完全であることが理解され、pH9.6を有するトリス/グリシンバッファーを使用した場合のエタノールの変換は速く完全であることが理解されうる。したがって、該バッファーのpHは9より大きいことが好ましい。トリス/グリシンバッファーはまた、アセトアルデヒドの捕捉剤として機能する。アセトアルデヒドの捕捉剤は、該反応がNADHの形成に向けて進行するために必要である。図10は、捕捉剤としてのトリス/グリシンバッファーの効果を示す。該反応の持続時間は1分未満であった。
【0064】
実施例4
この実施例では、エタノールアッセイに関する用量−応答相関性を例示する。図13は、この実施例で用いる方法の工程を例示する流れ図である。図11は、REA技術により行なったエタノールアッセイ(菱形のデータ点)および本発明の化学発光技術により行なったエタノールアッセイ(正方形のデータ点および三角形のデータ点)のエタノール濃度の関数としてのシグナルを示す。該データは、本発明のアッセイがREA技術で行なったアッセイより高感度でありうることを示している。
【0065】
この実施例は、本発明の方法により測定したエタノール濃度が、REA技術により測定したエタノール濃度と良く相関したことを例示している。図12は、それらの2つの異なる方法のR2が0.9551であったことを示しており、これは優れた相関性を示している。
【0066】
本発明の範囲および趣旨から逸脱しない本発明の種々の修飾および改変が当業者に明らかとなるであろう。本発明は、本明細書に記載の例示的実施形態に不当に限定されものではないと理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【図1】 図1は、生物学的サンプル中のエタノールの濃度を測定するために先行技術において用いられている装置を例示する概要図である。
【図2】 図2は、アクリジニウム誘導体の還元的不活性化を例示する図である。
【図3A】 図3Aは、グルコース、トリグリセリド、β−ヒドロキシ酪酸、L−乳酸、α−アミラーゼおよびアンモニアの生体酸化生成物を例示する概要図である。
【図3B】 図3Bは、グルコース、トリグリセリド、β−ヒドロキシ酪酸、L−乳酸、α−アミラーゼおよびアンモニアの生体酸化生成物を例示する概要図である。
【図3C】 図3Cは、グルコース、トリグリセリド、β−ヒドロキシ酪酸、L−乳酸、α−アミラーゼおよびアンモニアの生体酸化生成物を例示する概要図である。
【図3D】 図3Dは、グルコース、トリグリセリド、β−ヒドロキシ酪酸、L−乳酸、α−アミラーゼおよびアンモニアの生体酸化生成物を例示する概要図である。
【図3E】 図3Eは、グルコース、トリグリセリド、β−ヒドロキシ酪酸、L−乳酸、α−アミラーゼおよびアンモニアの生体酸化生成物を例示する概要図である。
【図3F】 図3Fは、グルコース、トリグリセリド、β−ヒドロキシ酪酸、L−乳酸、α−アミラーゼおよびアンモニアの生体酸化生成物を例示する概要図である。
【図4】 図4は、アクリジニウム誘導体の化学発光体の形成をもたらす反応を例示する。
【図5】 図5は、アクリジニウム誘導体の化学発光体の形成をもたらさない反応を例示する。
【図6】 図6は、米国特許第5,795,784号に記載の装置上で実施されうるエタノールに関するアッセイを例示する流れ図である。
【図7】 図7は、エタノールに関するアッセイの反応スキームを例示する概要図である。
【図8】 図8は、1mM当たりのNADHの濃度の関数としての相対光単位(Relative Light Units)(RLU)の検量線を例示するグラフである。
【図9A】 図9Aは、エタノールからアセトアルデヒドへの変換に対するpHおよびバッファーの影響を例示するグラフである。
【図9B】 図9Bは、エタノールからアセトアルデヒドへの変換に対するpHおよびバッファーの影響を例示するグラフである。
【図10】 図10は、エタノールからアセトアルデヒドへの変換に対するpHおよびバッファーの効果を例示するグラフである。
【図11】 図11は、REAアッセイにより測定したエタノール濃度を、本発明のアッセイにより測定したエタノール濃度と比較するグラフである。
【図12】 図12は、REAアッセイにより測定したエタノール濃度と本発明のアッセイにより測定したエタノール濃度との間の相関性を例示するグラフである。
【図13】 図13は、エタノールに関するアッセイの別法を例示する流れ図である。
【図14】 図14は、エタノールに関するアッセイの別法を例示する流れ図である。
【図15】 図15は、エタノールに関するアッセイの別法を例示する流れ図である。
【図16】 図16は、エタノールに関するアッセイの別法を例示する流れ図である。
Claims (24)
- 生物学的サンプル中の被検体の濃度の測定方法であって、
(a)該生物学的サンプル、関心のある被検体に関する少なくとも1つの酸化酵素、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよび化学発光標識を一緒にして、反応混合物を形成させ、
(b)該被検体を酸化−還元反応に付し、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドをニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの還元型に変換し、さらに該化学発光標識をニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの還元型と反応させ、
(c)放出された光の量をニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの還元型の濃度と相関させることにより、該生物学的サンプル中の関心のある被検体の濃度を測定する工程を含み、
さらに、アルカリ性過酸化物との反応に備えて該化学発光標識を調整するために予備誘発剤を使用し、及び、該化学発光標識を求核剤と反応させて発光性化合物の形成を可能にするために誘発剤を使用する方法。 - ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの還元型の形成の開始後に、該化学発光標識を該反応混合物に加える、請求項1記載の方法。
- 該被検体が、エタノール、エチレングリコール、フェニトイン、グルコース、ケトン体、トリグリセリド、コレステロール、乳酸、α−アミラーゼ、アンモニア、リンゴ酸、アンドロステロンおよびテストステロンよりなる群から選ばれる、請求項1記載の方法。
- 該被検体がエタノールである、請求項1記載の方法。
- 工程(a)の反応混合物に捕捉剤を加える工程を更に含む、請求項1記載の方法。
- 該化学発光標識がルミノールの誘導体またはアクリジンの誘導体である、請求項1記載の方法。
- 該標識が還元により不活性化される、請求項1記載の方法。
- 該化学発光標識がアクリジニウム誘導体を含む、請求項1記載の方法。
- 該化学発光標識がアクリジニウム共役体を含む、請求項1記載の方法。
- 該反応混合物を9以上のpHに維持する、請求項1記載の方法。
- 該反応混合物中にバッファーが含まれる、請求項1記載の方法。
- 該誘発剤がアルカリ性過酸化物である、請求項1記載の方法。
- 生物学的サンプル中の被検体の濃度の測定方法であって、
(a)該生物学的サンプル、固相、関心のある被検体に関する少なくとも1つの酸化酵素、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよび化学発光標識を一緒にして、反応混合物を形成させ、
(b)該被検体を酸化−還元反応に付し、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドをニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの還元型に変換し、さらに該化学発光標識をニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの還元型と反応させ、
(c)該化学発光標識を該固相から分離し、
(d)放出された光の量をニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの還元型の濃度と相関させることにより、該生物学的サンプル中の被検体の濃度を測定する工程を含み、
さらに、アルカリ性過酸化物との反応に備えて該化学発光標識を調整するために予備誘発剤を使用し、及び、該化学発光標識を求核剤と反応させて発光性化合物の形成を可能にするために誘発剤を使用する方法。 - ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの還元型の形成の開始後に、該化学発光標識を該反応混合物に加える、請求項13記載の方法。
- 該被検体が、エタノール、エチレングリコール、フェニトイン、グルコース、ケトン体、トリグリセリド、コレステロール、乳酸、α−アミラーゼ、アンモニア、リンゴ酸、アンドロステロンおよびテストステロンよりなる群から選ばれる、請求項13記載の方法。
- 該被検体がエタノールである、請求項13記載の方法。
- 工程(a)の反応混合物に捕捉剤を加える工程を更に含む、請求項13記載の方法。
- 該化学発光標識がルミノールの誘導体またはアクリジンの誘導体である、請求項13記載の方法。
- 該標識が還元により不活性化される、請求項13記載の方法。
- 該化学発光標識がアクリジニウム誘導体を含む、請求項13記載の方法。
- 該化学発光標識がアクリジニウム共役体を含む、請求項13記載の方法。
- 該反応混合物を9以上のpHに維持する、請求項13記載の方法。
- 該反応混合物中にバッファーが含まれる、請求項13記載の方法。
- 該誘発剤がアルカリ性過酸化物である、請求項13記載の方法。
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