JPS6381266A - 化学発光反応による酵素免疫測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はデヒドロゲナーゼ活性を測定することにより被
検体量を測定する酵素免疫測定法に関するものである。

（従来技術） 生体内微量物質の検出や自己免疫疾患の診断などの臨床
検査では、抗原抗体反応を利用した酵素免疫測定法が広
く利用されている。デヒドロゲナーゼは安定性に優れ長
期保存できるとともに。

比活性が高いため酵素免疫反応における標識酵素として
有用である。

しかし標ムデヒドロゲナーゼの活性を高感度に検出する
酵素免疫測定法は未だ開発されていない、デヒドロゲナ
ーゼにより生成されるＮＡＤＨ（或いはＮＡＤＰＨ）は
直接３４０ｎｍの吸収より検出できるが生体内微量物質
を検出する酵素免疫測定法としては感度が乏しい、また
遊ＱＮＡＤＨ量をテトラゾリウム塩を用いててアホラー
ゼ（ＥＣ１，６，４，３）存在下、ホルマザン色素を生
成させて比色定量する方法（特公昭５６−３８１９９、
同５６−４６７９９）もあるが、感度の点で未だ十分で
はなかった。

この点遊ｇｌＮＡＤＨ量をルシフェラーゼ存在下、ルシ
フェリンの発光により検出する生物発光法は高感度であ
る。しかしルシフェラーゼや補酵素フラビンヌクレオチ
ドが失活しやすく安定性に欠けるため、ルーティン的に
行なう酵素免疫測定法には不都合であった。

（発明の目的） 本発明はこのような事情に鑑みなされたもので、高感度
で安定性に優れた。デヒドロゲナーゼ活性測定により被
検体量を測定する酵素免疫測定法を提供することを目的
とする。

（発明の構成） 本発明のこのような目的は、デヒドロゲナーゼ活性を測
定することにより被検体量を測定する酵素免疫測定法に
おいて、前記デヒドロゲナーゼにより生成されたＮＡＤ
Ｈ或いはＮＡＤＰＨを５一メチルフエナジニウムメチル
硫醜類縁化合物と反応させ、生じた過酸化物の量を化学
発光反応で測定することを特徴とする化学発光反応によ
る酵素免疫測定法により達成される。

すなわち本発明は、５−メチルフェナジニウムメチル硫
酸類縁化合物がＮＡＤＨ（又はＮＡＤＰＨ）から非酵素
反応的にプロトンを受は取ってＮＡＤを再生するととも
に、溶存酸素を還元して０２−アニオンや８２０２等の
過酸化物を生成する点に着目してなされたものであり、
゛これら過酸化物を化学発光反応で検出することにより
被検体量に依存するデヒドロゲナーゼ活性を測定するよ
うにしたものである。

（実施態様） 第１図は本発明の第２抗体固相法における一実施態様の
概念説明図である。

符号１は未知量の被検体たる抗原（Ａｇ）である、２は
デヒドロゲナーゼ（ＤＨ）で標識された抗原（Ａｇ）　
、　　３はその抗体（Ａｂ）　、　　４は抗体３の第２
抗体（２ｎｄ　Ａｂ）であり不溶性担体５に不動化され
ている。担体５にはポリスチレン、ポリアセタール等の
ビーズ又はチューブを用いることができる。

これらを混合し、未標識抗原ｌと標識抗原２とを抗体３
との間で免疫競争反応させる（ステップ１）、この免疫
反応は約θ℃〜約４０℃、ｐ）ｌ約６〜約９の範囲で行
うことができるが、操作性を考慮すれば４℃で２４時間
、又は３７℃で４時間、ｐＨ６、５〜７．５の条件下で
行うのが好ましい。

次に、抗体３．第２抗体４を介して担体５に結合した抗
原（Ｂ）１．２を未結合抗原（Ｆ）１゜２から分離する
（Ｂ／Ｆ分離、ステップ２）。

これに標識酵素デヒドロゲナーゼの基質とニコチン酸ア
ミドアデニンヌクレオチド（ＮＡＤ）を添加すれば、還
元型ニコチン酸アミドアデニンヌクレオチド（ＮＡＤＨ
）が生成される（ステップ３）、デヒドロゲナーゼとし
てグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１，
１，１，４９）を用いる場合には基質グルコース−６−
リン酸（Ｇ　６　Ｆ）からグルコノ−δ−ラクトン−６
−リン酸（ＧＬ６Ｆ）が生成される。なおデヒドロゲナ
ーゼはこれに限られず、例えばグルコースデヒドロゲナ
ーゼ（ＥＣ１，１，１，４７，ＥＣ１，１，１，１８，
ＥＣ１，１，１，１９の３種を利用できる）やガラクト
ースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１，１，１，４８；　ＥＣ
１，１，１，１２０の２種を利用できる）を用いること
ができ、その場合には各デヒドロゲナーゼに対応する基
質を用いればよい、またＮＡＤの代りにＮＡＤＰにコチ
ン酸アミドアデニンヌクレオチドリン酸）を用いてもよ
く、この場合にはその還元型であるＮＡＤＰＨが生成さ
れる。ステップ３の酵素反応はｐＨ約７〜約９で約り℃
〜約４０℃　の温度範囲で行うことができるが、操作性
を考慮すれば、ｐＨ７，６〜８．２の条件下で４℃で約
２４時間或いは３７℃で約２時間行うのが好ましい。

次にこの反応液に５−メチルフェナジニウムメチル硫酸
類縁化合物（ＦＭＳ）を添加する（ステップ４）、この
ＦＭＳは Ｈ３ の基本骨格構造を有するフェナジン化合物であり、ＮＡ
ＤＨ（またはＮＡＤＰＨ）から反応液中の溶存酸素へプ
ロトンを伝達してスーパーオキシドアニオン（０２−）
さらには過酸化水素（Ｈ２０２）等の過酸化物を生成す
る。ＦＭＳとしては次の構造をとる、 Ｈ３ （ｌ−メトキシ）−５−メチルフェナジニウムメチル硫
酸が好ましく、約０．０５〜約１．０　＝Ｍ好ましくは
約０．２〜約０．６　、Ｍの濃度範囲で、約０〜約４０
℃好ましくは４℃で約２４時間、ｐＨ約７〜約９好まし
くはＰＨ７，Ｇ〜８．２の範囲で反応させる。

なおＦＭＳ＠Ｇ６Ｐ、ＮＡＤと共にデヒドロゲナーゼに
添加すればステップ３，４を同時に行うことができる。

こうして得られた過酸化物を化学発光反応で検出する（
ステップ５）、化学発光反応はＨ２Ｏ２や０２−７ニオ
ンなどの過酸化物量と相関性の良いものであれば十分で
あり、例えばペルオキシダーゼ存在下のルミノール化合
物の発光反応や、ビス　　　′（２，４，６−）リクロ
ロフェノール）オキザレートにより８−７ニリノナフタ
レンー１−スルホン酸などの蛍光物質を発光させる反応
がある。

ペルオキシダーゼ（ＥＣ１，１１，１，７）には西洋わ
さびペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼノール
、イソルミノール、Ｎ−（４−アミノブチル）−Ｎ−エ
チルイソルミノール等を用いることができる。これらの
内温１図に示すようにミクロペルオキシダーゼ（ｍ−Ｐ
ＯＤ）存在下イソルミノール（ＩＬ）の化学発光による
のが好ましい。

ｍ　−Ｐ　ＯＤの使用可能濃度は約０．０１〜約１ｐＭ
であり、約０．０２〜約０．０８ｐＭが好ましい、イソ
ルミノール又はルミノールの使用可能濃度は約１〜約１
００　＝ｒｖｔであり、約１０〜約４０ＬＭが好ましい
０反応ｐＨ領域は約９〜約１０である。

このようにして生じる化学発光の発光量をフォトマル等
の受光素子を含む測光手段で測定すれば、被検体たる抗
原の量は発光量の減少として検出することができる。

以上の実施態様では第２抗体固相法で説明したが、本発
明はこれに限られず、第１抗体をそのまま固相に固定し
たものでもよく、抗原−抗体の結合により標識デヒドロ
ゲナーゼ活性が変化する場合はＢ／Ｆ分離しなくてもよ
いのは勿論である。

また２以上の抗原決定基を有する抗原を被検体とする場
合には、被検体を担体に固定した抗体とデヒドロゲナー
ゼ標識抗体で挾みこむいわゆるサンドイツチ法であって
もよい。

なお標識酵素は必ずしもデヒドロゲナーゼである必要は
なく、デヒドロゲナーゼの基質を生成又は増減する酵素
であってもよい、この場合は免疫反応（ステップ１）、
Ｂ／Ｆ分ｇｌ（ステップ２）後に、デヒドロゲナーゼを
添加してステップ３の酵素反応と共役させればよい。

以下実施例により本発明をより詳細に説明する。

（実施例１） １７−α−ヒドロキシプロゲステロン（１７−０）ＩＰ
）を被検体とする酵素免疫測定について説明する。

１７−０ＨＰ活性エステルの合成 １７−０ＨＰ−３−カルボキシメチルオキシム１．７ｍ
ｇ、Ｎ−ヒドロキシサクシミド２．２ｍｇ及びｌ−エチ
ル−３−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］カロポジ
イミド塩酸２．９ｍｇを８０牌文のジオキサン／水（８
５／　ｌ　５）混合溶媒に溶解し、室温で２時間反応さ
せた。この液に水２ｍＪｌ、酢酸エチル１ｍｆＬを加え
てよく混合し。

酢酸エチル層に１７−０ＨＰ活性エステルを抽出した。

抽出酢酸エチル溶液は、硫酸ナトリウムを加えて脱水乾
燥した後、アルミナカラムを通して精製した。カラム溶
出後、減圧乾燥し、２．４ｍ見のジオキサン／水混合溶
媒に溶かした。

−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（０６ＰＤＨ）粉末０．
２３ｍｇを１．４ｍＭの０．９％Ｍａｉｌ　。

５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に溶解し、これに
１７−０ＨＰ活性工ステル溶液１４０ｇＭを添加し、水
冷下２時間反応させた０反応終了後、２文の０．９％Ｍ
ａｉｌ　、　５０　ｍＭリン゛酸緩衝液（ｐＨ７，０）
に対して、水冷下約１０時間３回透析して、未反応の１
７−０ＨＰ誘導体を除去して１７０ＨＰ−Ｇ６ＰＤＨ標
識体溶液とした。

抗体の調製 常法に従い家兎より抗１７−０ＨＰ抗体（抗血清）を調
製した。

抗１７−０ＨＰ抗体に対する第２抗体にはヤギの抗ウサ
ギＩｇＧを用いた。

第２抗体固相化担体（ＤＡＳＰビーズ）の調製０．５５
％リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７。

４）で２２ｇｇ／ｍ文抗ウサギＩｇＧ抗体溶液を調製し
、これに洗浄乾燥したポリアセタール樹脂製ビーズ（直
径３ｍｍ）を浸漬して、室温的２３°Ｃで一夜物理吸着
させた。このビーズは５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７、
４、０、３％ＢＳＡ　（牛血清アルブミン）、０．９％
ＮａＣＩ含有）中で保存した。

１７−０ＨＰの酵素　疫測 １７−０ＨＰ試料溶液　　　・・・・１００ｐ交抗１７
−０ＨＰ抗体（６０万倍希釈） ０・φ１００ＩＬ１ １７０ＨＰ−Ｇ６ＰＤＨ標識体溶液（１万倍希釈）　　
　　　　　　　　　・・・・１０１００ＩＬ４１５０リ
ン酸緩衝液（ｐＨ７，８，０，１％ＢＳＡ　。

０．０５％ＮａＮ３．０．０９％Ｍａｉｌ含有）・・・
・１００鉢文 ＤＡＳＰビーズ　　　　　　・・・・１個これらを小試
験管に入れ、振盪しながら３７℃で４時間インキュベー
トして免疫反応させた。

反応終了後、ＤＡＳＰビーズを生理食塩水で３回洗浄し
、 ０．５ｍＭ　　ＮＡＤ。

０．６ｍＭ　　グルコース−６−リン酸。

０．５１ＬＭ　　（１−メトキシ）−５−メチルフェナ
ジニウムメチル硫酸 ５０ｍＭ　　Ｔｒｉｓｌ衝液（ｐＨ７，８）を含む溶液
５００ｐｉの入った試験管に入れ、−晩酵素反応をさせ
た。

反応終了後、上記反応混合物２００ｐ文を蒸留水３００
−交で希釈し、化学発光測定用の試料とした。これに１
２ｇＭイソルミノール、０．０５ｇＭミクロペルオキシ
ダーゼ、０．８Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９，５）５００ＩＬ
ｆＬを添加し、添加３０秒後から６秒間Ｐ　ｉ　ｃ　ｏ
　ｌ　ｉ　ｔ　ｅ　（Ｐａｃｋａｒｄ社製）で発光量を
測定した。

標識抗原と抗体との結合率（Ｂ／Ｂｏ　）　１００％の
カウント値として１７−０ＨＰ試料未添加の場合のカウ
ント値１９４０９０を、Ｂ／ＢＯ０％のカウント値とし
て第２抗体をコーティングしていないビーズを用いた場
合のカウント値、すなわち被特異吸着によるバックグラ
ウンド値２３３３２を用い、１７−０ＨＰ８濃度におけ
る結合率Ｂ　／　Ｂ　ｏを求めた。

その結果第２図白丸に示す検量線が得られた。

検出限界はＩ　Ｐ　ｇ　／　ａｓｓａｌすなわち１０Ｐ
ｇ／ｍｕという低濃度であり、極めて高感度に１７−０
ＨＰを測定できることがわかった。

（実施例２） Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｐｅｃｉｅｓ由来のグルコースデ
ヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）を実施例１と同様な方法で１
７−０ＨＰ活性エステルと結合し、ＧＤＨ標識１７−０
ＨＰを調製した。このＧＤＨ標識１７−０ＨＰを用いて
実施例１と全く同様な条件で免疫反応を行い、洗浄した
ＤＡＳＰビーズを。

０．２５ｍＭ　　ＮＡＤ。

０．１Ｍ　　　グルコース−６−リン酸。

０．５ＪＬＭ　　（１−メトキシ）−５−メチルフェナ
ジニウムメチル硫酸 ５０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７，８）を含む溶液５０
０４１の入った試験管に入れ、−脱酵素反応をさせた。

反応終了後、実施例１と全く同様の方法で化学発光を測
定した。その結果、第１図黒丸で示すように１０　ｐ　
ｇ　／　ａｓｓａｙすなわち１１００ｐ／ｍｕを検出限
界としてｌ　７−０ＨＰを検出できた。

（実施例３） 化学発光に用いる各試薬の安定性を調べた。

下記に示すように、化学発光反応時の１００倍濃度の保
存用試薬を作り褐色瓶内で室温で保存した。２ケ月後実
施例１と同様な方法で１　’７−　ＯＨＰの酵素免疫測
定を行い、当日調製した試薬による測定値と比較した。

Ａ液：５０μＭ　１−メトキシ−５−メチルフェナジニ
ウムメチル硫酸 Ｂ液：５．Ｍ　　　ミクロペルオキシダーゼ水溶液 Ｃ液：１２ｍＭ　　イソルミノール、　０　、８Ｍ炭酸
緩衝液（ｐＨ９，５） バッググラウンド値を差引いた発光量から相対発光強度
を求めると下記の表のようになった。このように各゛試
薬を２か月室温保存しても化学発光反応にはほとんど影
響が無く、各試薬は安定であることが確認できた。

（発明の効果） 以上のように本発明は、デヒドロゲナーゼにより生成さ
れたＮａＯＨ或いはＮＡＤＰＨを５−メチルフェナジニ
ウムメチル硫酸類縁化合物と反応させ、生じた過酸化物
を化学発光反応で検出した。従って高感度でかつ安定的
に酵素免疫測定ができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の第２抗体固相法における一実施態様の
概念説明図、第２図は実施例１．２の測定結果を示す図
である。 ｌ・・・被検体たる抗原、 ２・・・デヒドロゲナーゼ標識抗原、 ３・・・抗体、４・・・第２抗体、５・・・不溶性担体
。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）デヒドロゲナーゼ活性を測定することにより被検
   体量を測定する酵素免疫測定法において、前記デヒドロ
   ゲナーゼにより生成されたＮＡＤＨ或いはＮＡＤＰＨを
   ５−メチルフェナジニウムメチル硫酸類縁化合物と反応
   させ、生じた過酸化物の量を化学発光反応で測定するこ
   とを特徴とする化学発光反応による酵素免疫測定法。
2. （２）前記デヒドロゲナーゼがグルコース−６−リン酸
   デヒドロゲナーゼであることを特徴とする特許請求の範
   囲第１項記載の化学発光反応による酵素免疫測定法。
3. （３）前記デヒドロゲナーゼがグルコースデヒドロゲナ
   ーゼであることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載
   の化学発光反応による酵素免疫測定法。
4. （４）前記化学発光反応が、ミクロペルオキシダーゼ存
   在下、前記過酸化物によるイソルミノール或いはルミノ
   ールの化学発光反応であることを特徴とする特許請求の
   範囲第１〜３項のいずれかに記載の化学発光反応による
   酵素免疫測定法。
5. （５）前記５−メチルフェナジニウムメチル硫酸類縁化
   合物が、（１−メトキシ）−５−メチルフェナジニウム
   メチル硫酸であることを特徴とする特許請求の範囲第１
   〜４項のいずれかに記載の化学発光反応による酵素免疫
   測定法。
6. （６）前記デヒドロゲナーゼが抗原の標識酵素である特
   許請求の範囲第１〜５項のいずれかに記載の化学発光反
   応による酵素免疫測定法。