FI70728C - Foerbaettrad luminescent eller luminometriskt bestaemning av en substans - Google Patents
Foerbaettrad luminescent eller luminometriskt bestaemning av en substans Download PDFInfo
- Publication number
- FI70728C FI70728C FI834024A FI834024A FI70728C FI 70728 C FI70728 C FI 70728C FI 834024 A FI834024 A FI 834024A FI 834024 A FI834024 A FI 834024A FI 70728 C FI70728 C FI 70728C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- peroxidase
- assay
- luminescence
- antibody
- amino
- Prior art date
Links
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 66
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 claims description 64
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 claims description 50
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 44
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 41
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims description 29
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 27
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 claims description 27
- ORIIXCOYEOIFSN-UHFFFAOYSA-N 1,3-benzothiazol-6-ol Chemical compound OC1=CC=C2N=CSC2=C1 ORIIXCOYEOIFSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 23
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 20
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 claims description 19
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 claims description 18
- KGLPWQKSKUVKMJ-UHFFFAOYSA-N 2,3-dihydrophthalazine-1,4-dione Chemical compound C1=CC=C2C(=O)NNC(=O)C2=C1 KGLPWQKSKUVKMJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 claims description 10
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 9
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 claims description 8
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 7
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims description 6
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims description 6
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 claims description 6
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 claims description 5
- -1 6-aminohexyl Chemical group 0.000 claims description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 3
- FZWLAAWBMGSTSO-UHFFFAOYSA-N Thiazole Chemical group C1=CSC=N1 FZWLAAWBMGSTSO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 125000002147 dimethylamino group Chemical group [H]C([H])([H])N(*)C([H])([H])[H] 0.000 claims description 3
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 claims description 3
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 claims description 3
- 239000012491 analyte Substances 0.000 claims description 2
- 125000005605 benzo group Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 claims description 2
- YEDUAINPPJYDJZ-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxybenzothiazole Chemical compound C1=CC=C2SC(O)=NC2=C1 YEDUAINPPJYDJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N luminol Chemical compound O=C1NNC(=O)C2=C1C(N)=CC=C2 HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 36
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 31
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 29
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 29
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 25
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 21
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 18
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 description 18
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 17
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 17
- HUDPLKWXRLNSPC-UHFFFAOYSA-N 4-aminophthalhydrazide Chemical compound O=C1NNC(=O)C=2C1=CC(N)=CC=2 HUDPLKWXRLNSPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 102100023635 Alpha-fetoprotein Human genes 0.000 description 13
- 101710165631 Dihydropyrimidine dehydrogenase [NADP(+)] Proteins 0.000 description 13
- 102100022334 Dihydropyrimidine dehydrogenase [NADP(+)] Human genes 0.000 description 13
- 101710183660 NAD-dependent dihydropyrimidine dehydrogenase subunit PreA Proteins 0.000 description 13
- 101710183648 NAD-dependent dihydropyrimidine dehydrogenase subunit PreT Proteins 0.000 description 13
- 108010026331 alpha-Fetoproteins Proteins 0.000 description 13
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 10
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 10
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N Progesterone Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](C(=O)C)[C@@]1(C)CC2 RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N 0.000 description 10
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 10
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 10
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 10
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 10
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 9
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 8
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 7
- 102000016387 Pancreatic elastase Human genes 0.000 description 7
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 description 7
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 7
- 201000005404 rubella Diseases 0.000 description 7
- SQAVNBZDECKYOT-UHFFFAOYSA-N 6-hydroxy-1,3-benzothiazole-2-carbonitrile Chemical compound OC1=CC=C2N=C(C#N)SC2=C1 SQAVNBZDECKYOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N dehydroluciferin Chemical compound OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 6
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 5
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 5
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 229920002549 elastin Polymers 0.000 description 5
- 108010046301 glucose peroxidase Proteins 0.000 description 5
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 5
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 5
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 5
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 5
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 5
- 239000000186 progesterone Substances 0.000 description 5
- 229960003387 progesterone Drugs 0.000 description 5
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- ZTOJFFHGPLIVKC-YAFCTCPESA-N (2e)-3-ethyl-2-[(z)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound S\1C2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=C2N(CC)C/1=N/N=C1/SC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=C2N1CC ZTOJFFHGPLIVKC-YAFCTCPESA-N 0.000 description 4
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- YSZIOXAEADAJLX-UHFFFAOYSA-N phthalazine-1,4-dione Chemical compound C1=CC=C2C(=O)N=NC(=O)C2=C1 YSZIOXAEADAJLX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 4
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 102000016942 Elastin Human genes 0.000 description 3
- 108010014258 Elastin Proteins 0.000 description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 241000710799 Rubella virus Species 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 3
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 3
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 3
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 3
- 238000007422 luminescence assay Methods 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 3
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- UXFQFBNBSPQBJW-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-methylpropane-1,3-diol Chemical compound OCC(N)(C)CO UXFQFBNBSPQBJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 2
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 description 2
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 2
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003418 antiprogestin Substances 0.000 description 2
- 125000002057 carboxymethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[*] 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000007398 colorimetric assay Methods 0.000 description 2
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 230000003623 progesteronic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 229960001922 sodium perborate Drugs 0.000 description 2
- YKLJGMBLPUQQOI-UHFFFAOYSA-M sodium;oxidooxy(oxo)borane Chemical group [Na+].[O-]OB=O YKLJGMBLPUQQOI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- PROQIPRRNZUXQM-UHFFFAOYSA-N (16alpha,17betaOH)-Estra-1,3,5(10)-triene-3,16,17-triol Natural products OC1=CC=C2C3CCC(C)(C(C(O)C4)O)C4C3CCC2=C1 PROQIPRRNZUXQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZTOJFFHGPLIVKC-UHFFFAOYSA-N 3-ethyl-2-[(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound S1C2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=C2N(CC)C1=NN=C1SC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=C2N1CC ZTOJFFHGPLIVKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BEADQYOTAORBKI-UHFFFAOYSA-N 6-[6-aminohexyl(ethyl)amino]-2,3-dihydrophthalazine-1,4-dione Chemical compound O=C1NNC(=O)C=2C1=CC(N(CCCCCCN)CC)=CC=2 BEADQYOTAORBKI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KPXVMEHUAOLERT-UHFFFAOYSA-N 7-(dimethylamino)-1-(hydrazinecarbonyl)naphthalene-2-carboxylic acid Chemical compound C1=CC(C(O)=O)=C(C(=O)NN)C2=CC(N(C)C)=CC=C21 KPXVMEHUAOLERT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 240000003291 Armoracia rusticana Species 0.000 description 1
- 235000011330 Armoracia rusticana Nutrition 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000055006 Calcitonin Human genes 0.000 description 1
- 108060001064 Calcitonin Proteins 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- XUIIKFGFIJCVMT-GFCCVEGCSA-N D-thyroxine Chemical compound IC1=CC(C[C@@H](N)C(O)=O)=CC(I)=C1OC1=CC(I)=C(O)C(I)=C1 XUIIKFGFIJCVMT-GFCCVEGCSA-N 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- LTMHDMANZUZIPE-AMTYYWEZSA-N Digoxin Natural products O([C@H]1[C@H](C)O[C@H](O[C@@H]2C[C@@H]3[C@@](C)([C@@H]4[C@H]([C@]5(O)[C@](C)([C@H](O)C4)[C@H](C4=CC(=O)OC4)CC5)CC3)CC2)C[C@@H]1O)[C@H]1O[C@H](C)[C@@H](O[C@H]2O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](O)C2)[C@@H](O)C1 LTMHDMANZUZIPE-AMTYYWEZSA-N 0.000 description 1
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 1
- 102000008857 Ferritin Human genes 0.000 description 1
- 238000008416 Ferritin Methods 0.000 description 1
- 108050000784 Ferritin Proteins 0.000 description 1
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 1
- 102000051325 Glucagon Human genes 0.000 description 1
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 description 1
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 241000254158 Lampyridae Species 0.000 description 1
- 102000009151 Luteinizing Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010073521 Luteinizing Hormone Proteins 0.000 description 1
- 241000711386 Mumps virus Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- QKMORCHBYLSJHF-UHFFFAOYSA-N O=C1NNC(=O)C2=C1C1=CC(N(C)C)=CC=C1C=C2.C1=CC(C(O)=O)=C(C(=O)NN)C2=CC(N(C)C)=CC=C21 Chemical group O=C1NNC(=O)C2=C1C1=CC(N(C)C)=CC=C1C=C2.C1=CC(C(O)=O)=C(C(=O)NN)C2=CC(N(C)C)=CC=C21 QKMORCHBYLSJHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003982 Parathyroid hormone Human genes 0.000 description 1
- 108090000445 Parathyroid hormone Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 108700020962 Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- BJGNCJDXODQBOB-SSDOTTSWSA-N Photinus luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 102000003946 Prolactin Human genes 0.000 description 1
- 108010057464 Prolactin Proteins 0.000 description 1
- 102100038803 Somatotropin Human genes 0.000 description 1
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 description 1
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 229960004015 calcitonin Drugs 0.000 description 1
- BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N calcitonin Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(N)=O)C(C)C)C(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1 BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 229920001429 chelating resin Polymers 0.000 description 1
- 239000007809 chemical reaction catalyst Substances 0.000 description 1
- 239000005081 chemiluminescent agent Substances 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010908 decantation Methods 0.000 description 1
- LTMHDMANZUZIPE-PUGKRICDSA-N digoxin Chemical compound C1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](C)O[C@@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@@H](O[C@@H]3C[C@@H]4[C@]([C@@H]5[C@H]([C@]6(CC[C@@H]([C@@]6(C)[C@H](O)C5)C=5COC(=O)C=5)O)CC4)(C)CC3)C[C@@H]2O)C)C[C@@H]1O LTMHDMANZUZIPE-PUGKRICDSA-N 0.000 description 1
- 229960005156 digoxin Drugs 0.000 description 1
- LTMHDMANZUZIPE-UHFFFAOYSA-N digoxine Natural products C1C(O)C(O)C(C)OC1OC1C(C)OC(OC2C(OC(OC3CC4C(C5C(C6(CCC(C6(C)C(O)C5)C=5COC(=O)C=5)O)CC4)(C)CC3)CC2O)C)CC1O LTMHDMANZUZIPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- PROQIPRRNZUXQM-ZXXIGWHRSA-N estriol Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H]([C@H](O)C4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 PROQIPRRNZUXQM-ZXXIGWHRSA-N 0.000 description 1
- 229960001348 estriol Drugs 0.000 description 1
- 230000005281 excited state Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- LIYGYAHYXQDGEP-UHFFFAOYSA-N firefly oxyluciferin Natural products Oc1csc(n1)-c1nc2ccc(O)cc2s1 LIYGYAHYXQDGEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 description 1
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 description 1
- 229930182480 glucuronide Natural products 0.000 description 1
- 150000008134 glucuronides Chemical class 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 150000003278 haem Chemical class 0.000 description 1
- 231100001261 hazardous Toxicity 0.000 description 1
- 235000008216 herbs Nutrition 0.000 description 1
- 229940098197 human immunoglobulin g Drugs 0.000 description 1
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- XMBWDFGMSWQBCA-YPZZEJLDSA-N iodane Chemical compound [125IH] XMBWDFGMSWQBCA-YPZZEJLDSA-N 0.000 description 1
- 229940044173 iodine-125 Drugs 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 229940040129 luteinizing hormone Drugs 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- JJVOROULKOMTKG-UHFFFAOYSA-N oxidized Photinus luciferin Chemical compound S1C2=CC(O)=CC=C2N=C1C1=NC(=O)CS1 JJVOROULKOMTKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001319 parathyroid hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000000199 parathyroid hormone Substances 0.000 description 1
- 150000002978 peroxides Chemical class 0.000 description 1
- 150000008442 polyphenolic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 235000013824 polyphenols Nutrition 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 229940097325 prolactin Drugs 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 239000012744 reinforcing agent Substances 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- CIJQGPVMMRXSQW-UHFFFAOYSA-M sodium;2-aminoacetic acid;hydroxide Chemical compound O.[Na+].NCC([O-])=O CIJQGPVMMRXSQW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-M thioglycolate(1-) Chemical compound [O-]C(=O)CS CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940034208 thyroxine Drugs 0.000 description 1
- XUIIKFGFIJCVMT-UHFFFAOYSA-N thyroxine-binding globulin Natural products IC1=CC(CC([NH3+])C([O-])=O)=CC(I)=C1OC1=CC(I)=C(O)C(I)=C1 XUIIKFGFIJCVMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
- C12Q1/28—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving peroxidase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/581—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with enzyme label (including co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or substrates)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/81—Packaged device or kit
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/968—High energy substrates, e.g. fluorescent, chemiluminescent, radioactive
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Luminescent Compositions (AREA)
Description
7 0 7 2 8
Parannettu aineen luminesenssi- tai lurninometrinen määritys Förbättrad luminescent eller luminometrisk bestämning av en substans Tämä keksintö kohdistuu parannettuun aineen luminesenssi- tai luminometriseen määritykseen, etenkin immunoanalyysiin, ja diagnostiseen välinesarjaan määrityksen suorittamiseksi.
Immunokoe on eräs laajimmin käytettyjä analyysitekniikkoja kliinisessä laboratoriossa. Nykyään useimmissa immunokokeissa käytetään radioaktiivista isotooppia, etenkin jodi-125, merkkiaineena. Radioaktiivisilla isotoopeilla on kuitenkin useita huomattavia epäkohtia. Ensinnä, merkitsemismenetelmään sisältyy erittäin radioaktiivisten ja täten potentiaalisesti vaarallisten reagenssien käyttö. Toiseksi, radioaktiivisesti merkityn aineen elinikä on usein suhteellisen lyhyt, ei vain sen vuoksi, että radioaktiivinen isotooppi jo luonteensa takia jatkuvasti heikkenee, vaan myös koska radioaktiivisesti merkityt proteiinit usein ovat epästabiileja. Kolmanneksi, on usein vaikeata riittävästi merkitä proteiineja herkästi ja nopeasti havaittavan reagenssin saamiseksi. Neljänneksi, radioaktiivisesti merkittyjen aineiden hävittäminen on hankalaa .
Nämä epäkohdat ovat käynnistäneet tutkimukset radiomerkkiainei-den käyttökelpoisten vaihtoehtojen löytämiseksi. Ollakseen sopiva merkkiaineena aineen tulee täyttää ainakin seuraavat kolme vaatimusta: a. sen tulee olla havaittavissa sekä nopeasti ja erittäin pieninä määrinä ollessaan kiinnitettynä ligandiin, kuten antigeeniin tai vasta-aineeseen, b. tulisi olla mahdollista kiinnittää se, vaikuttamatta sen määritykseen, ligandiin, kuten antigeeniin tai vasta-aineeseen,ja c. kerran kiinnitettynä se ei saisi merkittävästi muuttaa ligandin ominaisuuksia.
Eräitä lupaavimpia vaihtoehtoisia merkkiaineita ovat joko aineet,jotka itse pystyvät osallistumaan reaktioon, jonka 2 70728 vaikutuksesta syntyy luminesoivan valon säteilyä, tai aineet, jotka sopivalla tavalla käsiteltyinä synnyttävät yhdisteitä, jotka kykenevät osallistumaan luminesenssireaktioon. Kemilumi-nesenssireaktio (kemiallinen reaktio, joka johtaa luminesoivan valon säteilyyn) on yleensä riittävän kestävä, jotta on mahdollista havaita ja mitata säteilevä valo ja täten mahdollistaa merkityn aineen määrän määrittäminen. Toisaalta luminesenssin mittaaminen on nopea prosessi ja se voidaan suorittaa muutamassa sekunnissa verrattuna radioaktiivisuuden mittaamiseen tarvittaviin useihin minuutteihin. Yhteenveto tästä aiheesta on esitetty aikakausjulkaisussa T.P. Whitehead et ai., Clinical Chemistry, voi. 25.ss. 1531-1546 (1979).
Luminesenssia on käytetty hyväksi kolmessa tärkeässä luminesenssi-eli luminometrisessä immunokoejärjestelmässä: a) Organoluminesenssi- eli organoluminometrisissä immunokokeissa, joissa on käytetty kemilurninesoivia tai bioluminesoivia yhdisteitä, jotka osallistuvat suoraan luminesenssireaktioihin (siis jotka muuttuvat viritettyyn olotilaan ja sitten palautuva virittämät-tömään olotilaan luovuttaen fotonin), ligandien, kuten proteiinien, hormonien, hapteenien, steroidien, nukleiinihappojen, metaboliittien, antigeenien ja/tai vasta-aineiden merkitsemiseen. Esimerkkejä sopivista kemiluminesoivista yhdisteitä ovat luminoli ja isoluminoli; ja esimerkkejä bioluminesoivista yhdisteistä ovat lusiferiinit ja JLusiferaasit, ks. GB-patenttihakemusjulkaisut 2 008 247 A ja 2 026 690 A.
b) Luminesenssikatalysaattori- eli kofaktori-immunokokeet, joissa on käytetty luminesenssireaktioiden katalysaattoreita eli kofak-toreita merkkiaineina. Esimerkki sopivasta katalysaattorista on peroksidaasientsyymi.
c) Entsyymiin sidotut immunokokeet, joissa luminesenssireaktioi-ta on käytetty entsyymimerkkiaineiden vaikutuksesta sopiviin substraatteihin syntyvien tuotteiden määritykseen. Esimerkkinä tämäntyyppisestä immunokokeesta on vasta-aineeseen kytketyn glukoosioksidaasin määritys saattamalla entsyymi/vasta-aine-reagenssi reagoimaan glukoosin kanssa vetyperoksidin muodostamiseksi ja sitten mittaamalla syntyneen vetyperoksidin määrä lisäämällä luminolia säädetyissä olosuhteissa luminesenssireak-tion aikaansaamiseksi.
Edellä esitettyjen inununokokeiden herkkyys määräytyy osaksi merkkiaineen tai merkkiainetuotteen määrityksen alarajan mukai sesti .
3 70728
Luminesenssi- tai luminometristen inununokokeiden tapauksessa järjestelmän herkkyys on osaksi riippuvainen luminesenssireaktion säteilemästä valosta merkityn aineen yksikköä kohti. Tämän keksinnön eräänä tarkoituksena on saada aikaan luminesenssi-eli luminometrinen immunokoe, jolla on parannettu herkkyys, joka on saatu aikaan määrittämällä merkitty aine tai merkkiaineen tuote esillä olevan parannetun luminesenssireaktion välityksellä.
EP-patenttihakemusjulkaisusta 0 070 686 A tunnetaan määritysmenetelmä, jossa kemiluminesenssireaktiosta vapautuvaa energiaa käytetään fluoresoijän (nk. absorboija-säteilijä) virittämiseksi. Syntynyt fluoresoiva säteily mitataan. Julkaisun mukaan analyysin herkkyyttä parannetaan. Ajatus perustuu siihen, että ainoastaan kun fluoresoijaan sitoutunut ensimmäinen vasta-aine ja peroksidaasiin sitoutunut toinen vasta-aine sitoutuvat samaan antigeeniin niin voidaan havaita fluoresoivaa säteilyä. Toisin sanoen se tekijä, joka aikaansaa parannetun herkkyyden, on fluo-resoijan (absorboija-säteilijä) ja kemiluminesenssireaktion reagenssin (peroksidi) saattaminen läheiseen kosketukseen toistensa kanssa. Kemiluminesoiva säteily suodatetaan pois, jotta fluoresoiva säteily voidaan mitata.
GB-patenttijulkaisusta 2 095 830 A tunnetaan samoin määritysmenetelmä, jossa kemiluminesenssireaktiosta vapautuvaa energiaa käytetään fluoresoivan yhdisteen virittämiseksi. Luminolilla merkitty vasta-aine saatetaan reagoimaan fluoreseiinilla merkityn antigeenin kanssa. Lisätään peroksidaasia ja vetyperoksidia. Mitataan valon säteily fluoreseiinin fluoresenssi-aallonpituudella (joka on suurempi kuin luminolin kemiluminesenssi-aallonpituus).
Esimerkkejä kokeista, jotka eivät ole immunokokeita, mutta joissa voidaan käyttää luminesenssireaktiota, ovat: 70728 a) Elastaasikoe, joka perustuu peroksidaasin vapautumiseen liukenemattomasta peroksidaasi-elastiini-valmisteesta, b) glukoosikoe, joka perustuu koimmobilisoituun glukoosioksi-daasiin ja peroksidaasiin, ja c) peroksidaasi-entsyymin, 2,3-dihydro-1,4-ftalatsiinidionin, 6-hydrobentsotiatsolin tai hapettimen, kuten vetyperoksidin koe, jolloin nämä aineet eivät ole merkkiaineita eivätkä merkkiaineen tuotteita.
Artikkelissa D. Slawinska et ai., Int. Symp. Anal. Appi. Biolumin. Chemilumin., toim.Schram ja Stanley (1979), ss. 239-257, josta on esitetty tiivistelmä julkaisussa Chemical Abstracts, voi.
93 (1980), 64280 u, on raportoitu kokeista, joissa on suoritettu luminesenssireaktioita käyttäen luminolia, erilaisia polyfenoleja tai tulikärpäs-lusiferiinia yhdessä vetyperoksidin ja peroksidaasin kanssa peroksidaasin määrittämiseksi. Tulikärpäs-lusiferiini synnyttää 10 mM l^C^sn läsnäollessa voimakkaita kemiluminesenssi-huippuja. Voimakkailla kemiluminesenssihuipuilla tarkoitetaan hyvin nopeata, lyhytikäistä ja nopeasti vaimentuvaa valon säteilyä, eli valon leimahduksia. Tällaiset leimahdukset ovat herkkiä reagenssien sekoitusnopeudelle ja vaativat, että reagenssit sekoitetaan detektorin edellä hyvin nopeasti, tehokkaasti ja tarkoin toisinnettavissa olevalla tavalla. Ne vaativat myöskin mittausten täsmällisen ajoituksen tarkkojen tulosten saamiseksi. Tällaiset ehdot rajoittavat huomattavasti reaktioiden käyttökelpoisuutta analyyseissä.
Esillä olevan keksinnön laajimman aspektin mukaan on täten saatu aikaan parannettu aineen luminesenssi- tai luminometrinen määritys saattamalla peroksidaasi-entsyymi, hapetin ja kemiluminoiva
2,3-dihydro-1,4-ftalatsiinidioni reagoimaan luminesenssireaktiossa aineen määrän toteamiseksi, havaitsemiseksi tai paikallistamiseksi, jolle määritykselle on tunnusomaista se, että luminesenssireaktion herkkyyttä parannetaan 6-hydroksibentsotiätsolin läsnäololla, jolla on yleinen kaava II
*1
X2 ' N
Ί l! V*
'.l ς/ II
*3 5 70728
jossa X.J , X2 ja X^ ovat jokainen H ja R on H, CN tai tiatsoli-substituentti, jolla on yleinen kaava III
X5 X7 jossa X^ on COOH ja Xg, Xg ja X^ ovat jokainen H, tai X^ ja Xg ovat yhdessä O ja Xg ja X^ ovat kumpikin H tai X^ on COOH, Xg ja Xg edustavat kaksoissidosta ja X^ on H.
Määritys on edullisesti immunoanalyysi, mutta keksintöä voidaan myöskin soveltaa edellä mainittuihin kokeisiin. Esillä oleva keksintö perustuu siihen yllättävään havaintoon, että tiettyjen 6-hydroksibentsotiatsolien lisääminen tunnettuun 2,3-dihydro- 1.4- ftalatsiinidioni/hapetin/peroksidaasi-järjestelmään merkittävästi parantaa aikaansaadun luminesenssireaktion herkkyyttä.
Tässä selityksessä termi "parannettu" tarkoittaa sitä, että esillä olevan luminesenssireaktion valon säteily ja/tai esillä olevan luminesenssireaktion signaalin suhde taustaan on suurempi kuin se, joka saadaan aikaan 2,3-dihydro-1,4-ftalatsiinidio-ni/hapetin/peroksidaasi-järjestelmällä 6-hydroksibentsotiatsolin poissaollessa. Vain ne kokeet, joihin sisältyy luminesenssireaktio, joka on tällä tavalla "parannettu", lankeavat esillä olevan keksinnön puitteisiin.
Esillä olevan järjestelmän erikoisena etuna on, että 6-hydroksi-bentsotiatsolia lisäämällä aikaansaatu parannus on spesifinen reaktioille, joissa käytetään peroksidaasi-entsyymiä.
Esillä olevan keksinnön mukainen kemiluminesoiva 2,3-d.ihydro- 1.4- ftalatsiinidioni (DPD) voi olla mikä tahansa DPD, joka on muutettu viritettyyn olotilaan kemiluminesenssireaktiolla ja joka sitten palautuu virittämättömään olotilaan valoa säteillen.
6 70728
Edullisesti 2,3-dihydro-1,4-ftalatsiinidioni on yhdiste, jolla on yleinen kaava
R. O
2 ^ -v NH
i |
NH
R3 T Y r2 O
jossa R1 on amino ja R2, R3 ja R4 ovat jokainen H tai R2 on amino tai metyylillä, etyylillä tai 6-aminoheksyylillä substituoitu amino ja R1 , R3 ja R4 ovat jokainen H tai R.| ja R2 ovat yhdessä dimetyyliaminolla substituoitu bentsoryhmä ja R3 ja R4 ovat kumpikin H.
Muoto, jonka kemiluminesoiva DPD ottaa keksinnön mukaisessa lumi-nesenssireaktiossa, on riippuvainen kyseessä olevasta koetyypistä. Sellaisten kokeiden, kuten organoluminesenssi- eli organolumino-metristen immunokokeiden ollessa kyseessä, joissa ftalatsiini-dionia käytetään merkkiaineena, kemiluminesoiva DPD on 2,3-dihyd-ro-1,4-ftalatsiinidionin substituoitu aminojohdannainen, jossa aminoryhmä on kytketty ligandiin, kuten proteiiniin, hormoniin, hapteeniin, steroidiin, nukleiinihappoon, metaboliittiin, antigeeniin tai vasta-aineeseen. Aminoryhmä voi olla kytketty ligandiin suoraan tai silloitusvarren välityksellä. Sopivat silloitusvarret ovat alan ammattimiehille hyvin tunnettuja, kuten käy ilmi niiden selostuksesta GB 2 008 247 A:ssa ja US 4 104 029:ssa. Sopiviin silloitusvarsiin kuuluvat hemi-sukkinaatti-, hemiglutaraatti-, hemimaleaatti-, karboksimetyy1i-, glukoronidi-, merkaptoasetaatti- ja karboksimetyylijohdannaisista johdetut. Aminoryhmä voi olla kytketty ligandiin millä tahansa hyvin tunnetulla menetelmällä, joista muutamia on myös selostettu GB 2 008 247 A:ssa ja US 4 104 029:ssa. Mieluimmin käytetyt kytkentämenetelmät käsittävät seka-anhydridien, karbodi-imidien ja/tai aktiivisten estereiden käytön.
Vaikkakin sellaisiin kokeisin, joissa käytetään ftalatsiinidionia merkkiaineena, soveltuvat kemllumlnesoivat DPD:t voi olla mikä
II
7 70728 tahansa 2,3-dihydro-1,4~ftalatsiinidionin substituoituamLnojoh-dannainen, aminoryhmän ollessa kytketty ligandiin, mieluimmin käytetyt aineet ovat 5-amino-2,3-dihydro-1,4-ftalatsiinidioni (luminoli) ja 6-amino-2,3-dihydro~1,4-ftalatsiinidioni (iso-luminoli), jolloin kummassakin tapauksessa aminoryhmä on kytketty ligandiin, etenkin vasta-aineeseen.
Muissa kuin ftalatsiinidionia merkkiaineena käyttävissä kokeissa kemiluminesoiva DPD voi olla 2,3-dihydro-1,4-ftalatsiinidioni, etenkin edellä esitettyä mieluimmin käytettyä tyyppiä oleva, joka ei ole kytketty ligandiin. Tässä tapauksessa kemiluminesoiva DPD voi olla vapaana liuoksessa tai kantajalle immobili-soituna. Kaikkein mieluimmin käytetyt aineet ovat luminoli ja isoluminoli.
Keksinnön mukaisessa luminesenssireaktiossa voidaan käyttää mitä tahansa peroksidaasi-entsyymiä /joka on International Union of Biochemistry1 n määrittelemä donorina; vetyperoksidina; oksidoreduk-taasina (EC No. 1.11.1.7//, joka katalysoi 2,3-dihydro-1,4-ftalatsiinidionin luminesenssireaktiota, etenkin luminolia. Esimerkkinä mainittakoon kasviperoksidaasit. Entsyymi on mieluimmin piparjuuri-peroksidaasi (EC No. 1.11.1.7).
Peroksidaasi-entsyymin keksinnön mukaisessa luminesenssireaktiossa ottama muoto on riippuvainen kyseessä olevasta koetyypistä. Kokeiden, etenkin immunokokeiden ollessa kyseessä, joissa peroksidaasia käytetään merkkiaineena, se kytketään ligandiin, kuten proteiiniin, hormoniin, hapteeniin, steroidiin, nukleiinihappoon, metaboliittiin, antigeeniin tai vasta-aineeseen. Yleensä peroksidaasi kytketään ligandiin silloitusvarren välityksellä. Sopivia silloitusvarsia ja kytkentämenetelmiä ovat edellä kemiluminesoivan DPD:n yhteydessä esitetyt.
Muiden kuin peroksidaasia merkkiaineena käyttävien kokeiden ollessa kyseessä, entsyymi on vapaassa muodossa, joko liuoksena tai kantajalle immobilisoituna, kytkemättä ligandiin.
Esillä olevassa luminesenssireaktiossa voidaan käyttää mitä tahansa hapetinta, joka reagoi 2,3-dihydro-1,4-ftalatsiinidionin kanssa, etenkin luminolia tai isoluminolia, DPD:n virityksen aikaansaamiseksi niin, että se säteilee valoa luminesenssireaktiossa. Kaikkein mieluimmin käytettyjä hapettimia ovat perboraatti-Loni ja vetyperoksidi .
8 70728
Kokeissa, etenkin immunokoke Lssa, joissa käytetään 2,3-dihydro- 1,4-ftalatsiinidionia tai peroksidaasi-entsyymiä ligandin merkkiaineena, lisätään reaktioseokseen tunnettu määrä hapetinta, yleensä omistajalähteestä. Joissakin toisissa kokeissa on kuitenkin hapettimen, tavallisesti vetyperoksidin läsnäoleva määrä tuntematon. Tässä toisentyyppisessä kokeessa merkkiaine on aine, usein entsyymi, kuten glukoosioksidaasi tai laktaattide-hydrogenaasi, joka osallistuu substraatin muuttamiseen hapetti-meksi. Täten tässä tapauksessa esillä olevaa luminesenssireak-tiota käytetään merkityn ligandin määritykseen mittaamalla hapettimen konsentraatio luminesenssireaktioseoksessa.
Keksinnön mukaisen luminesenssireaktion säteilemä valo, vaikkakin se on riippuvainen ensisijaisesti peroksidaasin, hapettimen, 6-hydroksibentsotiatsolin ja kemiluminesoivan DPD:n valinnasta, määräytyy myös sekundäärisistä tekijöistä, kuten lämpötilasta, pHtsta, reagenssien konsentraatiosta, sekoitusnopeudesta ja valonmittausmenetelmästä. Esillä olevan järjestelmän herkkyyden maksimoimiseksi näitä sekundäärisiä tekijöitä tulee säätää siten, että saadaan aikaan maksimaalinen valon säteily reprodusoitavalla ja helposti mitattavalla tavalla, signaalin suhteen taustan ollessa mahdollisimman suuri.
Valitut olosuhteet ovat tavallisesti kompromissi peroksidaasin entsyymi- tai katalyyttiaktiivisuuden, reaktiokinetiikan, käytetyn laitteen, signaali/taustasuhteen ja tarvittavan herkkyyden välillä.
Keksijät ovat todenneet, että parhaiden tulosten saavuttamiseksi esillä oleva luminesenssireaktio tulisi suorittaa kohtalaisissa lämpötilaolosuhteissa alueella 10-50°C ja pH-alueella 6-10, useimmiten 7-9. Sopivia puskuriaineita keksinnön mukaisessa menetelmässä ovat fosfaatti, tris(hydroksimetyyli)-aminometaani, 2-amino-2-metyyli-1,3-propaanidioli, asetaatti, karbonaatti ja boraatti.
Yleensä luminesenssireaktioseoksen reagenssien konsentraatiot pidetään vakiona, lukuunottamatta määritettävän aineen konsentraa-tiota. Muuttuva tekijä voi esimerkiksi olla merkityn ligandin, merkkiaineen tuotteen, hapettimen tai sitomattoman peroksidaadin konsentraatio.
it 9 70728
Seuraavat reagenssien konsentraatiot ovat erikoisen sopivia käytettäviksi esillä olevassa luminesenssireaktiossa: peroksidaasi 0,1 ^,ug - 5000 mg/1 hapetin 10 ^,umol - 300 mmol/1 6-hydroksibentsotiatsoli 0,01 mmol - 4 mmol/1 kemiluminesoiva DPD 0,5 ^umol - 200 mmol/1
Esillä olevaa luminesenssireaktiota suoritettaessa tietyt neljästä olennaisesta reagenssista (jättämällä ainakin yksi pois) pannaan koeputkeen. Luminesenssireaktio käynnistetään sitten lisäämällä koeputkeen puuttuva(t) reagenssi(t). Säteilevän valon määrä voidaan mitata standardimittauslaitteella, kuten fotomultiplikaattoriputkella, jonka signaali syötetään rekisteröintiköjeeseen, oskilloskooppiin tai skalaariin ilmaistavaksi tai rekisteröitäväksi. Valo voidaan joissakin tapauksissa myös todeta paljain silmin tai rekisteröidä valokuvauslevyllä. Mieluimmin valon määrä kuitenkin mitataan luminomet-rillä, joka on GB-patenttihakemuksessa 2 025 609A kuvattua tyyppiä.
Keksinnön mukaista luminesenssireaktiota voidaan käyttää immuno-kokeen kolmessa päätyypissä, joiden tunnusomainen piirre on kulloinkin ligandiin kiinnitetyn merkkiaineen tyyppi. Merkkiaineet ovat a. 2,3-dihydro-l,4-ftalatsiinidionin substituoitu aminojohdan-nainen, jossa aminoryhmä on kytketty ligandiin, b. peroksidaasi-entsyymi, ja c. muu aine kuin a- ja b-kohdissa esitetyt ja yleensä entsyymi, kuten glukoosioksidaasi tai laktaattidehydrogenaasi, joka osallistuu substraatin muuttamiseen aineeksi, joka voidaan määrittää esillä olevalla luminesenssireaktiolla (yleensä vetyperoksidi tai peroksidaasi) .
Edellä esitetyissä immunokokeissa tutkittavan aineen tai sen vasta-aineen merkitseminen on mahdollista. Riippuen käytetyn merkkiaineen tyypistä koe voi olla joko heterogeeninen tai 10 7 0 7 2 8 homogeeninen. Ensin mainitussa tapauksessa voidaan analysoida moniainenesteitä kuten seerumia, mutta jälkimmäisessä tapauksessa saattaa kuitenkin alustava uutto- tai puhdistusvaihe olla tarpeellinen.
Seuraavassa esitetään tyypillisiä heterogeenisiä ja homogeenisiä luminesenssi- tai luminometrisiä immunokokeita: 1. Heterogeeninen luminesenssi- tai luminometrinen immunokoe Tämän tyyppisessä immunokokeessa tutkittava aine saatetaan reagoimaan vasta-aineensa kanssa. Vapaa vasta-aine erotetaan sitten sidotusta vasta-aineesta. Reaktion kvantitatiivinen määritys suoritetaan merkitsemällä joko vasta-aine, tutkittava aine tai muu molekyyli, joka kykenee reagoimaan vapaan tai sidotun aineen kanssa erottamisen jälkeen.
2. Kilpaileva heterogeeninen luminesenssi-immunokoe Tässä tapauksessa sekoitetaan tutkittavan aineen tuntematon määrä saman merkkiaineeseen kytketyn aineen tunnetun määrän ja sen vasta-aineen tunnetun, mutta rajoitetun määrän kanssa. Tapahtuu merkityn ja merkitsemättömän aineen kilpaileva reaktio vasta-aineen kanssa. Vasta-aineen ja merkitsemättömän aineen kompleksi ja vasta-aineen ja merkityn aineen kompleksi erotetaan vapaasta merkitystä ja merkitsemättömästä aineesta.
Vasta-aineeseen sidotun merkityn aineen määrän suhde merkitsemättömän aineen määrään liuoksessa todetaan. Nämä määrät voidaan todeta joko mittaamalla vasta-aineeseen sidotun merkkiaineen määrä tai mittaamalla jäljelle jäävän merkityn aineen määrä. Esimerkkejä tämäntyyppisestä kokeesta, jossa peroksi-daasi on merkkiaineena ja vasta-aine on sidottu kiinteään faasiin lasisen koeputken seinien välityksellä, on esitetty GB-julkaisussa 2 044 927A.
3. "Kaksi-kohta” heterogeeninen luminesenssi-immunokoe Tämäntyyppisessä immunokokeessa tutkittava aine sidotaan ensin merkitsemättömään vasta-aineeseensa, joka vuorostaan sidotaan n 70728 kiinteäfaasiseen kantajaan, kuten muoviin. Kompleksia (vasta-aineen ja aineen) käsitellään sitten merkityllä vasta-aineella.
Saadun kiinteään kompleksiin sisältyvän merkityn vasta-aineen analyysi voidaan sitten suorittaa erottamalla kiinteä kompleksi liuoksesta ja sen jälkeen määrittämällä joko erotettuun kiinteään kompleksiin sisältyvän merkkiaineen määrä tai liuokseen liuenneen jäljellä olevan merkityn vasta-aineen määrä.
Tämäntyyppisen immunokokeen vaihtoehtoisissa suoritustavoissa tutkittava aine voidaan joko sitoa peräkkäin merkittyyn vasta-aineeseen ja merkitsemättömään, kiinteään kantajaan sidottuun vasta-aineeseen tai sitoa sekä merkittyyn että merkitsemättömään vasta-aineeseen yhdessä sidontavaiheessa.
4. Homogeeninen luminesenssi- tai luminometrinen immunokoe Tämä on sovellettavissa immunokokeisiin, joissa merkkiaine on 2,3-dihydro-l,4-ftalatsiinidionin amino- tai substituoitu amino-johdannainen. Koe perustuu siihen, että kiinnostavan merkityn aineen (tai sen vasta-aineen) säteilemä valo eroaa voimakkuudeltaan tai aallonpituudeltaan kiinnostavan sidotun merkityn aineen (tai sen vasta-aineen) säteilemästä valosta.
Eräässä esimerkissä todettiin, että (progesteroni-isoluminoli-johdannaisen) konjugaatin, hemokatalysaattorin ja vetyperoksidin reaktiosta säteilevän valon voimakkuus oli vähäisempi kuin samasta reaktiosta anti-progesteroni IgG:n läsnäollessa säteilevän valon.
Kokeessa inkuboitiin täten ensin tuntematon progesteroninäyte anti -progesteroni IgG:n tunnetun määrän kanssa. Kun tasapainotila oli saavutettu lisättiin tunnettu määrä (progesteroni-iso lumino li -der iv) konjugaattia ja sen jälkeen tunnettu määrä hemiä ja vetyperoksidia. Säteilevä valo mitattiin ja tällöin määritettiin tuntemattomaan näytteeseen sisältyvän progesteronin määrä standardikäyrästä. (Mitä enemmän progesteronia sisältyy tuntemattomaan näytteeseen, sitä vähemmän vapaata IgG :tä i2 70728 jää tasapainotilassa ja sitä pienempi on luminesenssireaktion valon määrä.) Tällä tavalla voidaan progesteronin määritys saada aikaan tarvitsematta erotusvaihetta.
Kaikissa edellä esitetyissä immunokokeissa määrän toteamis-vaiheena, havaitsemis- tai paikallistamisvaiheena voi olla keksinnön mukainen luminesenssireaktio.
Edellä esitetyissä immunokokeissa käytettyjä vasta-aineita voidaan ostaa tai valmistaa tunnetulla immunologiatekniikalla. Vasta-aineet voivat olla vasta-aineiden moniaineisina seoksina tai yhtenä tai useampana monokloonisena vasta-aineena. Tavallisesti tarvitaan vain pientä määrää vasta-ainetta ja sitä säilytetään sen aktiivisuuteen nähden sopivissa pH-, ioniväkevyys-ja lämpötilaolosuhteissa.
Seuraavien ei-tyhjentävästi lueteltujen aineiden vasta-aineita voidaan edullisesti käyttää esillä olevaa luminesenssireaktiota hyväksi käyttävissä immunokokeissa: proteiinit, kuten insuliini, alfafetoproteiini ja ferritiini, hormonit, kuten kasvuhormoni, paratyroidihormoni, follikkelia stimuloiva hormoni, lutenisoiva hormoni, kilpirauhasta stimuloiva hormoni, adrenokortikotrooppi-hormoni, glukagoni, prolaktiini ja kalsitoniini, hapteenit/steroidit, kuten estrioli, progesteroni ja kortisoli, rohdokset, kuten digoksiini, antigeenit, kuten solun pinta-antigeenit ja kasvainalkionantigeeni ja vasta-aineet, kuten sikotautiviruksen vasta-aine, humaani-immunoglobuliini G (IgG) kani-IgG, lammas-IgG, marsu-IgG, aasi-IgG ja humaani-immunoglobuliinit E ja M.
Keksinnön mukaista luminesenssireaktiota voidaan myös käyttää muissa kokeissa kuin edellä esitetyissä immunokokeissa. Näihin kuuluu:
II
13 70728 1. Elastaasikoe perustuen peroksidaasin vapautumiseen liuke- nemattomasta peroksidaasi-elastilnivalmisteesta _ _ Tässä kokeessa kiinteä elastiini-peroksidaasikonjugaatti inkuboi-daan eri määrillä elastaasi-entsyymiä. Ennalta määrätyn ajan kuluttua reagoimaton konjugaatti poistetaan linkoamalla ja supernatantti tutkitaan sitoutumattomaan peroksidaasiin nähden.
Supernatanttiin sisältyvä sitoutumattoman peroksidaasin määrä liittyy tutkitun näytteen elastaasiaktiivisuuteen.
2. Proteinaasikoe perustuen isoluminolin vapautumiseen synteet- tisestä peptidisubstraatista_ Tässä kokeessa käsitellään immobilisoitua synteettistä peptidi-substraattia, Affi-geeli 10-Ala-Ala-Ala-Phe-isoluminolia vaihte-levilla määrillä proteinaasia. Ennalta määrätyn ajan kuluttua poistetaan reagoimaton substraatti linkoamalla ja supernatantti tutkitaan isoluminoliin nähden. Supernatanttiin sisältyvä määrä isoluminolia liittyy tutkitun näytteen proteinaasiaktiivisuuteen.
3. Glukoosikoe perustuen koimmobilisoituun glukoosioksidaa- siin ja peroksidaasiin_ Tässä kokeessa glukoosioksidaasia ja peroksidaasia koimmonibili-soidaan kantajalle, esimerkiksi sefaroosille tai muoviputkille. Tähän lisätään luminolin ja 6-hydroksibentsotiatsolin liuos. Lopuksi lisätään glukoosin liuos ja valon säteily rekisteröidään. Valon säteily liittyy suoraan liuoksen sisältämän glukoosin määrään .
Esillä olevaa koetta ja luminesenssireaktiota käytetään ensisijaisesti kliinisissä laboratorioissa ja lääkäriasemilla.
On tavallista, että tällaiset laboratoriot ja/tai lääkäriasemat hankkivat tiettyyn kokeeseen käytettävät aineet koepakkauksena.
Esillä oleva keksintö koskee näin ollen myös määritysvälinesarjaa käytettäväksi keksinnön mukaisessa parannetussa luminesenssi- tai luminometrisessä määrityksessä, joka välinesarja käsittää: 14 707 2 8 a. peroksidaasientsyymin b. 6-hydroksibentsotiatsolin/ jolla on edellä esitetty yleinen kaava II, ja c. kemiluminesoivan 2,3-dihydro-l,4-ftalatsiinidionin.
Välinesarja voi myös sisältää hapettimen, mutta monessa tapauksessa tämä aine voidaan joko hankkia erikseen tai sen voi muodostaa tutkittava aine.
Peroksidaasi-entsyymi, hapetin, 6-hydroksibentsotiatsoli ja kemi-luminesoiva DPD ovat mieluimmin edellä kokeeseen käytettäviksi sopivimpina luetellut. Esillä olevan välinesarjan erikoisen edullisessa sovellutusmuodossa ainakin toinen peroksidaasi-entsyymistä ja kemiluminesoivasta DPDrsta on kytketty tutkittavan aineen vasta-aineeseen.
Välinesarja voi haluttaessa myös sisältää yhden tai useamman stan-dardiliuoksen, joista jokainen sisältää tunnetun määrän tutkittavaa ainetta, ja/tai yhden tai useamman sopivimmin käytettävän puskuriliuoksen. Välinesarja voi edullisesti myös sisältää reak-tioastian, joka sopii käytettäväksi koetta suoritettaessa säteilevän valon määritykseen käytetyn kojeen kanssa. Välinesarjaan voidaan myös sisällyttää sekoituslaite, jota voidaan käyttää varmistamaan, että reagenssit sekoittuvat tarkoituksen mukaisella tavalla.
Keksinnön mukainen koe, luminesenssireaktio ja välinesarja esitetään seuraavassa vain esimerkkimielessä viittaamalla piirustuksiin, joissa kuva 1 esittää peroksidaasilla merkityn anti-AFPin laimennus-käyrää, kuva 2 esittää valon säteilyä kanin anti-humaani-AFP/HRP:sta, joka on immobilisoitu vasta-aineella päällystetyille helmille, tulikärpäs-lusiferiinin läsnäollessa tai poissaollessa, kuva 3 esittää vertailua signaali/tausta-suhteen välillä AFP:n luminesenssi- ja kolorimetrisessä määrityksessä, ja 15 70 72 8 kuva 4 esittää vertailua valon säteilyn ja absorboinnin muutosten välillä suurenevalla T4-luminesenssi- ja kolorimetrisessä määrityksessä.
Aineet ja menetelmät Reagenssit
Piparjuurioksidaasin /HRP, puhtausluku (A403:n suhde A250:een, RZ) noin 1,0/ toimitti Hughes and Hughes Ltd. Romford, Essex, UK, ja se puhdistettiin geelisuodatuksella käyttäen 2,6 x 40 cm AcA 34-kolonnia (LKB Instruments Ltd. South Croydon, Surrey, UK). Kolonni eluoitiin käyttäen 0,015 moolia/1 fosfaattipuskuria, pH 7,2, joka sisälsi 0,15 mooli/1 NaCl. Saadun puhdistetun perok-sidaasin RZ oli noin 3,0.
Alfafetoproteiinin (AFP), kanin anti-humaani-AFP:n (koodi 100-008) ja kani- ja vasta-humaani-AFP/HRP-konjugaatin toimitti Dako Products, Mercia Brocades Ltd, Brocades House, Pyrford Road, West Bufleet, Weybridge, Surrey.
Tyroksiinin (T4), kani-anti-T4:11a päällystetyt pullot ja T4/ HRP-konjugaatin toimitti Boehringer Corporation, Lewes, Sussex, UK.
Rubella-viruksella (humaani) päällystetyt helmet ja anti-humaani-IgG (vuohi)/HRP-konjugaatin toimitti Abbott Laboratories Ltd, Diagnostic Division, Bright-Hill Parade, Basingstoke, Hampshire.
D-tulikärpäs-lusiferiinin (4,5-dihydro-2-(6-hydroksi-2-bentso-tiatsoli)-4-tiatsolikarboksyylihappo, tuote No. L5904, synteettinen, kiteinen), naudan seerumialbumiinin (BSA, tuote A4503) ja 2-amino-2-metyyli-l,3-propaanidiolin (AMP, tuote No. A9754) toimitti Sigma Chemical Co, Poole, Dorset, UK.
Luminolin (5-amino-2,3-dihydro-l,4-ftalatsiinidioni) ja isolumino- lin (6-amino-2,3-dihydro-l,4-ftalatsiinidioni) toimitti Sigma
Chemical Co, Fancy Road-Poole, Dorset, UK. Luminolin mono- ie 70728 natriumsuola valmistettiin edellä esitetyllä tavalla (Ham et ai., Anal.Lett. 1979, 12, 535).
7-dimetyyliaminonaftaleeni-1,2-dikarboksyylihappohydratsidin (kaava I, ja R2 muodostavat yhdessä dimetyyliamino-substatuoidun bentsoryhmän, R^ = R^ = H) toimitti Boehringer Mannheim.
N-(6-aminoheksyyli-N-etyyli)isoluminolin toimitti LKB, Suomi.
Tween-20 toimitti Koch-Light Laboratories Ltd, Colnbrook, Bucks, UK.
2,2'-atsinodi-(3-etyylibentstiatsoliini-6-sulfonaatti) (ABTS) toimitti Boehringer Corporation, Lewes, Sussex, UK.
Elastiinin, elastaasin ja glukoosioksidaasin toimitti Sigma Chemical Co, Dorset. Syanogeenibromidin toimitti Aldrich Chemical Cl, Gillingham.
6-hydroksibentsotiatsoli saatiin lahjana Chemistry Deptrlta, University of Birmingham.
2-syano-6-hydroksibentsotiatsoli ja dehydrolusiferiini valmistettiin Methods of Enzymology'ssa, Voi LVII "Bioluminescence and Chemiluminescence", M. DeLuca, Academic Press, Lontoo, 1978, s. 15-28 kuvatulla menetelmällä.
Oksilusiferiini valmistettiin Bitler et al:in, Arch.Biochem. Biophys., 1957, 72, 358, menetelmällä.
Kaikki muut reagenssit olivat mikäli mahdollista analyysipuhtai-ta ja ne toimitti BDH Ltd, Dorset, UK. Tuoreeltaan lasiin tislattu vesi puhdistettiin lisää syöttämällä 2,6x 40 cm Amberlite MB-1 sekaioninvaihtohartsikolonnin läpi (BDH Ltd, Poole, Dorset, UK) .
Il 70728
Analyysikoj eisto
Kemiluminesenssireaktiot suoritettiin 10 mm x 10 mm, tilavuus 4 ml, muovisissa kertakäyttökyveteissä (W. Sarstedt Ltd, Leicester, LE 3 1 UQ, UK). Säteilevän valon määrä todettiin aikaisemmin selostetulla luminometrillä (Carter et ai, GB 2 025 609 A), joka oli modifioitu niin, että useita kyvettejä voitiin peräkkäin asettaa paikoilleen, tarkasti ja reprodusoitavasti, fotomultipli-kaattoriputken fotokatodin eteen. Tulokset rekisteröitiin nopeaan potentiometriseen korttirekisteröintikojeeseen (Tyyppi PM 8202, Philips, Eindhoven, Hollanti; täysiasteinen taittoaika alle 0,25 s).
Esimerkki 1 - Peroksidaasin luminesenssikoe
Alustavissa kokeissa 10 ^ul tulikärpäs-lusiferiinia (0,01-1,0 g/1 0,1 mooli/1 AMP-puskuria pH 8,9, sisältäen 1 mmooli/1 MgCl2), 10 ^ul luminolia (0,0003-30 g/1 vedessä), 10 ^ul H202 (3-300 mmoolia/1 vedessä) ja 10 ^,ul HRP (0,05-5000 mg/1 0,015 mooli/1 fosfaattipuskurissa, pH 7,2, sisältäen 0,14 mooli/1 NaCl, 2 g/1 BSA ja 0,5 g/1 Tween 20) sijoitettiin kukin 10 mm x 10 mm muovikyvetin eri nurkkiin antamatta niiden sekoittua. Luminesenssireaktio käynnistettiin sitten injektoimalla 1 ml puskuria (0,1 mooli/1 glysiini-NaOH, pH 8,6-12,5; 0,1 mooli/1 glysyglysiini-NaOH, pH 7,5-9,0: Tris-HCl, pH 7,2-8,5; tai 0,1 mooli/1 AMP, pH 7,5-9,5) ja valopiikki mitattiin.
Kun tässä edellä esitettyä analyysimenetelmää käyttävässä kokeessa käytettyjen reagenssien konsentraatiot oli optimoitu, käytettiin yksinkertaistettua koemenetelmää alhaisten HRP-konsentraatioiden mittaamiseen. Natriumluminolia (50 mg) ja vetyperoksidia (62 ^ul, 30 % p/t) lisättiin 200 mlraan Tris-puskuria (0,01 mooli/1, pH 8,0), joka sisälsi kaliumkloridia (0,15 mooli/1). Liuos valmistettiin useita tunteja ennen käyttöä ja sitä käytettiin luminesenssireaktion käynnistämiseen.
10 yul tulikärpäs-lusiferiinia (1 mg/ml) Tris-puskurissa (0,01 mooli/1, pH 8,0) sijoitettiin kyvetin yhteen nurkkaan ja 10 ^ul anti —AFP/HRP-konjugaattia sijoitettiin toiseen nurkkaan.
is 7072 8
Reaktio käynnistettiin injektoimalla luminoli/I^O^-reagenssia (0,9 ml). Valon säteily 30 sekunnin kuluttua tai valopiikki mitattiin.
Esimerkki 2
Esimerkin 1 mukainen yksinkertaistettu menettely toistettiin paitsi että 6-hydroksibentsotiatsoli DMS0:ssa korvasi tuli-kärpäs-lusiferiinin.
Esimerkki 3
Esimerkin 1 mukainen yksinkertaistettu menettely toistettiin paitsi että 2-syano-6-hydroksibentsotiatsoli DMS0:ssa korvasi tulikärpäs-lusiferiinin.
Esimerkki 4
Esimerkin 1 mukainen yksinkertaistettu menettely toistettiin paitsi että N-(6-aminoheksyyli)-N-etyyli-isoluminoli korvasi luminolin.
Esimerkki 5
Esimerkin 1 mukainen yksinkertaistettu menettely toistettiin paitsi että isoluminoli korvasi luminolin.
Esimerkki 6
Esimerkin 1 mukainen yksinkertaistettu menettely toistettiin paitsi että luminoli korvattiin 7-dimetyyliamino-naftaleeni-l,2-dikarboksyylihappohydratsidilla (9-dimetyyliamino-2,3-dihydro-bentso/f_/ftalatsiini-l,4-dioni) ja ftalatsiinidioni/H202 laimennettiin 1:10 ennen käyttöä.
Esimerkki 7
Esimerkin 1 mukainen yksinkertaistettu menettely toistettiin paitsi että vetyperoksidi korvattiin natriumperboraatilla.
Esimerkki 8 - anti-AFP/HRP-konjugaattikoe
Natriumluminolia (50 mg) ja vetyperoksidia (62 ^ul, 30 % p/t) lisättiin 200 mitään Tris-puskuria (0,01 mooli/1, pH 8,0), joka
II
i9 70728 sisälsi kaliumkloridia (0,15 mooli/1). Liuos valmistettiin useita tunteja ennen käyttöä ja sitä käytettiin luminesenssi-reaktion käynnistämiseen. 10 ^,ul tulikärpäs-lusiferiinia (1 mg/ml) Tris-puskurissa (0,01 mooli/1, pH 8,0) sijoitettiin kyvetin yhteen nurkkaan ja 10 ^ul anti-AFP/URP-konjugaattia sijoitettiin toiseen nurkkaan. Reaktio käynnistettiin injektoimalla luminoli/H202-reagenssia (0,9 ml). Valon säteily 30 sekunnin kuluttua tai valopiikki mitattiin.
Kuvassa 1 esitetään peroksidaasilla merkityn anti-AFP:n lai-mennuskäyrä. Tämän reaktion signaali/taustasuhteet on esitetty taulukossa 1.
Esimerkki 9 (Vertailu)
Noudatettiin esimerkin 8 mukaista menettelyä paitsi ettei käytetty tulikärpäs-lusiferiinia. Tämän reaktion signaali/taustasuhteet on esitetty taulukossa 1.
Taulukko 1
Luminolin, vetyperoksidin, anti-AFP/HRP-reaktion pH-arvossa 8,0 signaali/taustasuhteen mittaaminen tulikärpäs-lusiferiinin läsnä- ollessa ja poissaollessa______
Luminoli/ Luminoli/H 0 / H2O2 tulikärpäs- lusiferiini
Valon sätei- Näyte 135 1420 lyn piikki
Vertailu 15 170
Signaali/tausta- suhde 9 8,4
Valon Näyte 35 540 säteily Vertailu 15 20
30 S
kuluttua Signaali/tausta- suhde 2,3 27
Huomautus 1: Valon säteily mitataan ulostulona (mV) fotomultipli-kaattorin jännitteellä 1200 V. Käytetty näyte oli anti-AFP/HRP-konjugaatin 1:10 000 laimennus.
20 7 0 7 2 8
Huomautus 2: Valon säteilyn mittaaminen 30 sekunnin kuluttua mahdollisti signaali/taustasuhteen suurenemisen kertoimella 3 verrattuna tulikärpäs-lusiferiinin poissaollessa saatuun valo-piikin signaali/tausta-suhteeseen.
Esimerkki 10 - AFP-koe a. (1) Laajakaulaiseen 500 ml lasipulloon lisättiin 125 ml glysiini/NaOH-puskuria (0,1 mooli/1, pH 8,8) ja 0,25 g BSA. Liuosta sekoitettiin sitten 2 tuntia pyörivässä sekoittimessa 20°C:ssa. Tämän ajan jälkeen pullo (ja sen kansi) huuhdeltiin glysiini-puskurilla (3 x 50 ml) sitoutumattoman albumiinin poistamiseksi ja annettiin sitten valua tyhjäksi.
(2) 1000 polystyreenihelmeä pestiin Lipsol'lla (tavaramerkki, 1 %, 500 ml) 30 minuuttia. Pesun jälkeen tislatulla vedellä helmet sijoitettiin Buchner-pulloon yhdessä 200 ml:n kanssa glysiinipuskuria ja vapautettiin kaasusta.
(3) Glysiinipuskuria (400 ml) siirrettiin esipäällystettyyn lasipulloon ja lisättiin kanin anti-humaani-AFP (1,5 ml).
Liuosta sekoitettiin hyvin ja sitten lisättiin kaasusta vapautetut helmet. Sekoitettiin pyörivässä sekoittimessa 6 tuntia 20°C:ssa.
(4) 6 tunnin kuluttua glysiinipuskuri-vasta-aineliuos dekantoi-tiin ja helmet pestiin kahdesti 400 ml:11a PBS (0,015 mooli/1 fosfaattia, 0,15 mooli/1 NaCl, pH 7,2). Toisen PBS-pesunesteen dekantoinnin jälkeen lisättiin BSA-liuos (0,5 %) PBSrssa (400 ml). Sekoitettiin uudelleen pyörivässä sekoittimessa 20°C:ssa.
30 minuutin kuluttua PBS-albumiiniliuos poistettiin ja lisättiin asetaattipuskuria (0,1 mooli/1, pH 4,2, 400 ml), joka sisälsi Tween 20 (tavaramerkki, 0,01 %). Sekoitettiin 10 minuuttia ja sitten asetaattipuskuri korvattiin PBS-puskurilla, joka sisälsi 0,05 % Tween'iä (2 x 400 ml). Lopuksi PBS dekantoitiin ja helmet kuivattiin suodatinpaperilla 20°C:ssa 30 minuuttia. Helmet säilytettiin kierrekorkkipulloissa 4°C:ssa.
2i 70728 b. (1) Riittävä määrä vasta-aineella päällystettyjä helmiä (vaihe a. edellä) PBSrssa vapautettiin kaasusta 15-30 minuuttia.
(2) 50 ^,ul AFP sisältävää standardia tai näytettä lisättiin kyvettiin yhdessä 0,95 ml:n kanssa PBS/BSA/Tween (fosfaatti 0,015 mooli/1, NaCl 0,15 mooli/1, BSA 0,2 %, Tween 20 0,05 %, pH 7,2). Liuos lämmitettiin 37°C:een ja inkuboitiin sitten helmillä tunnin ajan.
(3) Liuos dekantoitiin sitten ja helmet pestiin PBS/Tween'lla (200 ml 15 s, sitten 200 ml 5 min).
(4) Helmet inkuboitiin sitten 0,9 ml:lla kanin anti-humaani-AFP/HRP-konjugaattia-laimennus 1:1000, tunnin ajan. (Konju-gaatti oli laimennettu PBS/BSA/Tween Vila ja ennen lisäämistä helmiin lämmitetty 37°C:een).
c. (1) Liuos dekantoitiin uudelleen ja helmet pestiin deionisoi-dulla, tislatulla vedellä 2 min. Veden dekantoinnin jälkeen helmet siirrettiin varovasti kyvetteihin (yksi kyvettiä kohti).
(2) Jokaisen kyvetin yhteen nurkkaan sijoitettiin myös 10 ^ul tulikärpäs-lusiferiinia (1 mg/ml) Tris-puskurissa (0,01 mooli/1, pH 8,0).
Luminesenssireaktio käynnistettiin injektoimalla 0,9 ml luminoli/ H202~liuosta /natriumluminoli (50 mg), H2O2, (62 yUl, 30 % p/t),
Tris (0,01 mooli/1, pH 8,0, 200 ml), kaliumkloridi (0,15 mooli/l)_7. Valon säteily 30 s kuluttua mitattiin ja se on esitetty kuvassa 2. Signaali/taustasuhteen vertailu suurenevalla AFP-konsentraa-tiolla on esitetty kuvassa 3.
Esimerkki 11 (Vertailu)
Esimerkin 10 mukainen menettely toistettiin paitsi ettei käytetty tulikärpäs-lusiferiinia luminesenssireaktiossa. Valon säteily 30 s kuluttua mitattiin ja se on esitetty kuvassa 2.
70728 22
Esimerkki 12 (Vertailu)
Esimerkin 10 mukainen menettely toistettiin paitsi että peroksidaasilla merkitty anti-AFP määritettiin seuraavalla kolorimetrisella menetelmällä.
ABTS (0,55 g) liuotettiin asetaattipuskuriin (500 ml, 0,1 mooli/1, pH 4,2), joka sisälsi 0,01 % Tween 20. Vetyperoksidia (2,83 ml, 30 % p/t) laimennettiin 100 mlraan tislatulla vedellä. Nämä liuokset varastoitiin 4°C:ssa. Välittömästi ennen käyttöä 1 ml H„0 -liuosta sekoitettiin ABTS-liuoksen kanssa ja 0,9 ml saatua 2 2 _ seosta inkuboitiin kunkin helmen kanssa /esimerkin 10 vaiheesta c (1]_7 37°C:ssa 30 min hämmentäen. Tämän inkubointijakson jälkeen absorbointi 405 nm:ssa mitattiin näyte-entsyymisubstraat- tiliuosta vastaan. Signaali/taustasuhteen vertailu suurenevalla AFP-konsentraatiolla on esitetty kuvassa 3 .
Esimerkki 13
Esimerkin 10 mukainen koe toistettiin paitsi että tulikärpäs-lusiferiini korvattiin 6-hydroksibentsotiatsolilla DMS0:ssa.
Esimerkki 14
Esimerkin 10 mukainen koe toistettiin paitsi että tulikärpäs-lusiferiini korvattiin 2-syano-6-hydroksibentsotiatsolilla DMSO:ssa.
Esimerkki 15 - T4-koe T4 määritettiin käyttäen kilpailevaa entsyymikytkettyä immuno-absorbointikoetta. Merkitsemättömän T4:n (näyte tai standardi) ja T4/HRP-konjugaatin seos inkuboitiin rajoitetulla määrällä anti —T4 päällystettynä koeputkille.
Kun oli saavutettu tasapainotila, koeputket pestiin sitoutumattomien komponenttien poistamiseksi ja sitten lisättiin 10 ^.ul tulikärpäs-lusiferiinia (1 mg/ml) Tris-puskurissa (0,01 mooli/1, pH 8,0) jokaiseen koeputkeen. Luminesenssireaktio käynnistettiin injektoimalla 0,9 ml luminoli/H^O^-liuosta /natriumluminoli (50 mg), 1^02 (62 ^ul, 30 % p/t), Tris (0,01 mooli/1, pH 8,0, 11 70728 200 ml), kaliumkloridi (0,15 mooli/lj^/. Valon säteily 30 s kuluttua mitattiin. Valon säteilyn muuttuminen suurenevalla T4-konsentraatiolla on esitetty kuvassa 4.
Esimerkki 16 (Vertailu) T4 määritettiin käyttäen kilpailevaa entsyymikytkettyä immuno-absorbointikoetta. T4:n (näyte tai standardi) ja T4/HRP-konju-gaatin seos inkuboitiin rajoitetulla määrällä kanin anti-T4 päällystettynä koeputkille.
Kun tasapainotila oli saavutettu ja ylimäärin olevat reagenssit poistettu, lisättiin 1,0 ml fosfaatti/sitraattipuskuria (pH 5,0), joka sisälsi 9,1 mmooli/1 ABTS ja 1,47 mmooli/1 natriumperboraat-tia, ja sitä käytettiin kussakin koeputkessa olevan vasta-aine-T4-HRP-kompleksin määrän määrittämiseksi inkuboimalla 60 min 25°C:ssa. Absorboinnin 420 nm:ssa muutoksen vertailu suurenevalla T4-konsentraatiolla on esitetty kuvassa 4.
Esimerkki 17 - Anti-rubella IgG-koe
Anti -rubella IgG sisältävä koenäyte inkuboitiin rubella-viruk-sella (humaani) päällystetyillä helmillä Tris-puskurissa. Pesun jälkeen reagoimattomien komponenttien poistamiseksi helmet inkuboitiin anti-humaani IgG (vuohi)/HRP-konjugaatilla, tämäkin Tris-puskurissa..
Liuos dekantoitiin ja helmet pestiin deionisoidulla tislatulla vedellä. Pestyjen helmien poistamisen jälkeen vedestä ne siirrettiin kyvetteihin (yksi kyvettiä kohti).
Jokaisen kyvetin nurkkaan sijoitettiin myös 10 ^ul tulikärpäs-lusiferiinia (1 mg/ml) fosfaattipuskurissa (0,1 mooli/1, pH 8,0). Luminesenssireaktio käynnistettiin injektoimalla 0,9 ml luminoli/ Η202-·*·1αοδΐ·9 Znatriumluminoli (50 mg) , H2°2 ^62 /ulf 30 % p/t) ,
Tris (0,01 mooli/1, pH 8,0, 200 ml), kaliumkloridi (0,15 mooli/l)7. Valon säteily 30 s kuluttua mitattiin ja se on esitetty taulukossa 2. Signaali/taustasuhteen vertailu suurenevilla vasta-rubella IgG-konsentraatioilla on esitetty taulukossa 3.
24 7072 8
Esimerkki 18 (Vertailu)
Anti -rubella IgG sisältävä koenäyte inkuboitiin rubella-viruksella (humaani) päällystetyillä helmillä Tris-puskurilla. Pesun jälkeen reagoimattomien komponenttien poistamiseksi helmet inkuboitiin anti-humaani-IgG (vuohi)/HRP-konjugaatilla, tämäkin Tris-puskurissa.
Liuos dekantoitiin ja helmet pestiin deionisoidulla tislatulla vedellä. Pestyjen helmien poistamisen jälkeen vedestä ne siirrettiin kyvetteihin (yksi kyvettiä kohti).
Kuhunkin helmeen sidotun merkityn vasta-aineen määrä määritettiin lisäämällä kyvettiin o-fenyleenidiamiini/i^O,^ sitraatti-fosfaatti-puskurissa. Puolen tunnin kuluttua reaktio pysäytettiin lisäämällä kloorivetyhappoa ja absorbointi 492 nm:ssa mitattiin. Tulokset on esitetty taulukossa 2. Signaali/tausta-suhteen vertailu suurenevalla anti-rubella-IgG-konsentraatiolla on esitetty taulukossa 3.
Taulukko 2
Anti -rubella- Luminesenssi Kolorimetria
IgG-näyte 30 s kuluttua sätei- Absorbointi 492 nm:ssa levä valo 30 min kuluttua _ (mV, 1200 FM)___
Negatiivinen vertailu 8 0,06
Alhainen positii- 92 0,46 vinen vertailu (HAI-tiitteri noin 10)
Korkea positiivi- 455 1,51 nen vertailu (HAI-tiitteri noin 80) li 25 7 0728
Taulukko 3
Anti—rubella- _Signaali/taustasuhde_
IgG näyte Luminesenssi Kolorimetria
Negatiivinen 1 1 vertailu
Alhainen positii- 11,2 8,5 vinen vertailu (HAI tiitteri noin 10)
Korkea positiivi- 55 28 nen vertailu (HAI tiitteri noin 80)
Esimerkki 19 - Elastaasikoe
Piparjuuri-peroksidaasia kon-jugoitiin jauhetun elastiinin kanssa G.C. Saunders et al:n menetelmällä, Analytical Biochemistry, 1982, 126, 122. 1 ml elastiini-peroksidaasi-suspensiota pestiin ja tasapainotettiin 2 mlrssa 0,01 mooli/1 Tris-puskuria (pH 9), joka sisälsi CaCl^ (2 mmooli/1), puoli tuntia 37°C:ssa. Konju-gaattiin lisättiin elastaasia (0-100 ng/ml) Tris-CaC^-puskuris-sa ja inkuboitiin 37°C:ssa elastiini-HRP:11a.
60 minuutin kuluttua reagoimaton HRP-konjugaatti poistettiin linkoamalla ja supernatantin alikvootti siirrettiin ja lingot-tiin uudelleen. 20 ^ul supernatanttia poistettiin ja sijoitettiin kyvettiin ja valon säteily käynnistettiin lisäämällä 0,9 ml luminoli/H202/6-hydroksibentsotiatsoliliuosta /natriumluminoli (50 mg), H2O2 (62 ^ul, 30 % p/t), 6-hydroksibentsotiatsoli (2 ml, 1 mg/ml DMSOrssa) 200 mlrssa Tris-puskuria (0,1 mooli/1, pH 8,0)7. Valon säteily 30 s kuluttua mitattiin.
Esimerkki 20
Esimerkin 19 mukainen koe toistettiin paitsi että 2-syano-6-hydroksibentsotiatsoli korvasi 6-hydroksibentsotiatsolin.
Esimerkki 21
Esimerkin 19 mukainen koe toistettiin paitsi että tulikärpäs-lusiferiini korvasi 6-hydroksibentsotiatsolin.
2« 7 0 7 2 8
Esimerkki 22 - Glukoosikoe perustuen immobilisoituun glukoosi- oksidaasiin ja peroksidaasiin_
Glukoosioksidaasia (5 mg, Sigma) ja piparjuuri-peroksidaasia (5 mg, Sigma) koimmobilisoitiin syanogeenibromidilla aktivoidulle Sepharose'lle (Pharmacia, UK) Fordin ja DeLucan menetelmällä, Anal.Biochem., 1981, 110, 43. Immobilisoidut entsyymit suspendoitiin fosfaattipuskuriin (0,1 mooli/1, pH 7,0). Immo-bilisoitujen entsyymien suspensio (100 g/1, 50 ^ul) lisättiin kyvetissä olevaan 1 ml:aan luminolin vesiliuosta (25 mg/100 ml) ja 50 ^ul:aan 6-hydroksibentsotiatsolia (1 mg/ml DMS0:ssa).
Sitten lisättiin glukoosia sisältävän vesiliuoksen 10 ^ul :n näyte, kyvetin sisältö sekoitettiin ja valon säteily rekisteröitiin. Valon säteilyn piikki oli lineaarinen välillä 50-500 nmoo-lia glukoosia. Vaihtoehtoisesti glukoosioksidaasi ja peroksidaa-si voidaan immobilisoida muovikantajan pinnalle (esim. Leon et ai, Clin.Chem., 1977, 23, 1556).
Esimerkki 23
Esimerkin 22 mukainen koe toistettiin paitsi että 2-syano-6-hydroksibentsotiatsoli korvasi 6-hydroksibentsotiatsolin.
Esimerkki 25
Esimerkin 1 mukainen yksinkertaistettu koe toistettiin paitsi että tulikärpäs-lusiferiini korvattiin oksilusiferiinilla.
Esimerkki 26
Esimerkin 1 mukainen yksinkertaistettu koe toistettiin paitsi että tulikärpäs-lusiferiini korvattiin dehydrolusiferiinilla.
27 707 2 8
Koetuloksia
Vasta-AFP/HRP:ta (10 ^um, laimennus 1:1000 0,1 M Tris-puskurissa, pH 8,0) ja 6-hydroksibentsotiatsolijohdannaista (10 ^,ul 0,5 mg/ml liuosta DMSOzssa) sijoitettiin kyvetin eri nurkkiin. Luminolia (50 ^ul, 1,2 mM) ja vetyperoksidia (50 yUl, 40 mM) Tris-puskurissa (0,1 M, pH 8,0) sijoitettiin sitten kyvetin vapaisiin nurkkiin ja luminesenssireaktio käynnistettiin manuaalisesti lisäämällä Tris-puskuria (900 y.ul, 0,1 M, pH 8,0). Valon säteily ajan suhteen rekisteröitiin 30 ja 60 sekunnin kuluttua.
Suoritettiin myöskin kotrollikoe, jossa 6-hydroksibentso-tiatsolijohdannainen korvattiin DMSO:lla (10 ^,ul). Tulokset on esitetty taulukossa 4.
Taulukko 4 6-hydroksibentsotiatsolijohdannaisten vaikutus luminoli/ vetyperoksidi/peroksidaasi-järjestelmän valon säteilyyn
Vahvistava aine Valon suhteellinen säteily (mV) 30 s 60 s
Kontrolli (DMSO korvaa vahvistavan aineen) 16 11 6-hydroksibentsotiatsoli 5950 7340 2-syano-6-hydroksibentsotiat- soli 600 750 6-hydroksi-2-bentsotiatsolyylitrat soleeni-4-karbok syy lihappo (dehydrolusiferiini) 7240 6990
Tulikärpäs-lusiferiini 2840 2460
Claims (16)
1. Parannettu aineen luminesenss.i- tai luminometrinen määritys saattamalla peroksidaasi-entsyymi, hapetin ja kemiluminoiva 2,3-dihydro-1,4-ftalatsiinidioni reagoimaan luminesenssireak-tiossa aineen määrän toteamiseksi, havaitsemiseksi tai paikallistamiseksi, tunnettu siitä että luminesenssireaktion herkkyyttä parannetaan 6-hydroksibentsotiatsolin läsnäololla, jolla on yleinen kaava II X1 N 1 ! / R 11 HO ' Y S X3 jossa , X2 ja X^ ovat jokainen H ja R on H, CN tai tiatsoli-substituentti, jolla on yleinen kaava III X5 x ._// I 4 111 ^ S Jam xc £- v X7 jossa X^ on COOH ja X^, Χβ ja X7 ovat jokainen H, tai X4 ja X^ ovat yhdessä O ja Xg ja Χη ovat kumpikin H tai X4 on COOH, X5 ja Xg edustavat kaksoissidosta ja X^ on H.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen määritys, tunnettu siitä, että kemiluminoivalla 2,3-dihydro-1 ,4-ftalatsiin.idionilla on yleinen kaava I 29 7 0 7 2 8 R, O R2 X. X NH I 1 1 r3/yV” r4 0 jossa on amino ja R2/ R^ 3a R4 ovat jokainen H tai R2 on amino tai metyylillä, etyylillä tai 6-aminoheksyylillä substituoitu amino ja R^, R^ ja R^ ovat jokainen H tai ja R2 ovat yhdessä dimetyyliaminolla substituoitu bentsoryhmä ja R^ ja R4 ovat kumpikin H.
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen määritys, tunnet-t u siitä, että peroksidaasi-entsyymi kasvi-peroks Idaasi.
4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen määritys, tunnettu siitä, että peroksidaasi-entsyymi on piparjuuri-peroksidaasi.
5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen määritys, tunnettu siitä, että hapetin on perboraatti-ioni tai vetyperoksidi.
6. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen määritys, tunnettu siitä, että peroksidaasi-entsyymi on kytketty ligan-diin.
7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen määritys, tunnettu siitä, että ligandi on vasta-aine.
8. Patenttivaatimuksen 6 mukainen määritys, tunnettu siitä, että ligandi on joko proteiini tai hormoni.
9. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen määritys, tunnettu siitä, että se on immunoanalyysi. 30 7 0 7 2 8
10. Määritysvälinesarja käytettäväksi patenttivaatimuksen 1 mukaisessa luminesenssi- tai luminometrisessa määrityksessä, tunnettu siitä, että se käsittää (a) peroksidaasi-entsyymin, (b) 6-hydroksibentsotiatsolin, jolla on yleinen kaava II *1 X2 \ F xV- r 11 X3 jossa X1, X2 ja X^ ovat jokainen H ja R on H, CN tai tiatsoli-substituentti, jolla on yleinen kaava III / N b X7 jossa X4 on COOH ja Xg, Xg ja X? ovat jokainen H, tai X4 ja X^ ovat yhdessä O ja Xg ja X^ ovat kumpikin H tai X4 on COOH, Xg ja Xg edustavat kaksoissidosta ja X^ on H, ja (c) kemiluminoivan 2,3-dihydro-l,4-ftalatsiinidionin.
11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen määritysvälinesarja, tunnettu siitä, että kemiluminoivalla 2,3-dihydro-l,4 -ftalatsiinidionilla on yleinen kaava I R1 O 2rY% K3 -v vnh R4 o II 31 70728 jossa R^ on amino, ja R2, R^ ja R^ ovat jokainen H tai R2 on amino tai metyylillä, etyylillä tai 6-aminoheksyylillä subs-tituoitu amino ja R^, ja R^ ovat jokainen H tai R^ ja R2 ovat yhdessä dimetyyliaminolla substituoitu bentso ryhmä ja R^ ja R^ ovat kumpikin H.
12. Patenttivaatimuksen 10 tai 11 mukainen määritysvälinesar-ja, tunne ttu siitä, että peroksidaasi-entsyymi on kasvi-peroksidaasi.
13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen määritysvälinesarja, tunnettu siitä, että peroksidaasientsyymi on piparjuuri-peroksidaasi.
14. Jonkin patenttivaatimuksen 10-13 mukainen määritysvälinesar ja, tunnettu siitä, että se lisäksi sisältää hapet-timen.
15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen määritysvälinesarja, tunnettu siitä, että hapetin on perboraatti-ioni tai vetyperoksidi.
16. Jonkin patenttivaatimuksen 10-15 mukainen määritysvälinesar ja, tunnettu siitä, että peroksidaasientsyymi on kytketty määritettävän aineen vasta-aineeseen. 7072 8
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB8206263 | 1982-03-03 | ||
| GB8206263 | 1982-03-03 | ||
| PCT/GB1983/000058 WO1983003104A1 (en) | 1982-03-03 | 1983-02-25 | Enhanced luminescent and luminometric assay |
| GB8300058 | 1983-02-25 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI834024A7 FI834024A7 (fi) | 1983-11-02 |
| FI834024A0 FI834024A0 (fi) | 1983-11-02 |
| FI70728B FI70728B (fi) | 1986-06-26 |
| FI70728C true FI70728C (fi) | 1986-10-06 |
Family
ID=10528761
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI834024A FI70728C (fi) | 1982-03-03 | 1983-11-02 | Foerbaettrad luminescent eller luminometriskt bestaemning av en substans |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4842997A (fi) |
| EP (1) | EP0087959B1 (fi) |
| JP (1) | JPS59500252A (fi) |
| AU (2) | AU558939B2 (fi) |
| CA (1) | CA1200486A (fi) |
| DE (1) | DE3360857D1 (fi) |
| FI (1) | FI70728C (fi) |
| NZ (1) | NZ203435A (fi) |
| WO (1) | WO1983003104A1 (fi) |
| ZA (1) | ZA831389B (fi) |
Families Citing this family (34)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3463395D1 (en) * | 1983-02-11 | 1987-06-04 | Nat Res Dev | Enhanced luminescent or luminometric assay |
| DE3439742A1 (de) * | 1984-10-31 | 1986-04-30 | Henning Berlin Gmbh Chemie- Und Pharmawerk, 1000 Berlin | Verfahren zur initiierung der lichtemission von phthalhydrazinen |
| US4853327A (en) * | 1985-07-10 | 1989-08-01 | Molecular Diagnostics, Inc. | Enhanced phthalazinedione chemiluminescence |
| US4794073A (en) * | 1985-07-10 | 1988-12-27 | Molecular Diagnostics, Inc. | Detection of nucleic acid hybrids by prolonged chemiluminescence |
| CA1307480C (en) | 1985-07-10 | 1992-09-15 | Nanibhushan Dattagupta | Prolonged chemiluminescence |
| DE3537877A1 (de) * | 1985-10-24 | 1987-04-30 | Geiger Reinhard | Luciferin-derivate und immunoassays unter einsatz derartiger luciferin-derivate |
| DE3545398A1 (de) * | 1985-12-20 | 1987-06-25 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur steigerung der quanten-ausbeute bei der oxidation von luminol durch peroxide in gegenwart von peroxidase |
| US4835101A (en) * | 1986-02-10 | 1989-05-30 | Kallestad Diagnostics, Inc. | Luminescent analyses with enhanced storage stability |
| CA1293725C (en) * | 1986-05-08 | 1991-12-31 | Universite Laval | Luminescent cyclic hydrazides for analytical assays |
| GB8621261D0 (en) * | 1986-09-03 | 1986-10-08 | Barnard G J R | Enhanced luminescent assay |
| US4985631A (en) * | 1988-02-16 | 1991-01-15 | Wannlund Jon C | Luminescence exposure apparatus |
| EP0384271B1 (en) * | 1989-02-14 | 1996-05-08 | Wako Pure Chemical Industries Ltd | Method for enhancement of chemiluminescence |
| KR960002875B1 (ko) * | 1989-04-28 | 1996-02-27 | 도오레 가부시기가이샤 | 옥사졸유도체 및 이것을 이용한 고감도 발광분석방법 |
| DE3916729A1 (de) * | 1989-05-23 | 1990-12-06 | Behringwerke Ag | Fluorogene verbindungen und ihre verwendung |
| EP0496793B1 (en) * | 1989-10-17 | 1995-12-20 | British Technology Group Ltd | Enhanced chemiluminescent assay |
| US5168047A (en) * | 1989-12-04 | 1992-12-01 | Takeda Chemical Industries, Inc. | Method for improvement of sensitivity of enzyme detection by photo irradiation |
| ATE130094T1 (de) * | 1990-04-30 | 1995-11-15 | Hitachi Chemical Co Ltd | Verbesserte chemilumineszierende reagenzien und verfahren. |
| IE66038B1 (en) * | 1990-06-12 | 1995-12-13 | British Tech Group | Antioxidant assay |
| CA2061189A1 (en) * | 1991-05-24 | 1992-11-25 | M. Hashem Akhavan-Tafti | Chemiluminescent method and compositions |
| US5401640A (en) * | 1992-03-30 | 1995-03-28 | Trustees Of Dartmouth College | Method for enhancing detection of superoxide anion |
| GB9209571D0 (en) * | 1992-05-02 | 1992-06-17 | Kodak Clinical Diagnostics Ltd | Signal generating reagent |
| US5552298A (en) * | 1992-10-23 | 1996-09-03 | Lumigen, Inc. | Enzyme-catalyzed chemiluminescence from hydroxyaryl cyclic diacylhydrazide compounds |
| US5451347A (en) * | 1993-06-24 | 1995-09-19 | Lumigen, Inc. | Methods and compositions providing enhanced chemiluminescence from chemiluminescent compounds using dicationic surfactants |
| US5801008A (en) * | 1995-05-31 | 1998-09-01 | Kyowa Medex Co., Ltd. | Method of quantitative determination of peroxide, a peroxidation-active substance or a pyrazolopyridopyridazine derivative |
| GB9514594D0 (en) * | 1995-07-17 | 1995-09-13 | Johnson & Johnson Clin Diag | Chemiluminescent analytical method |
| DE69826118T2 (de) | 1997-06-10 | 2005-01-20 | Unilever N.V. | Verfahren zur steigerung der enzymaktivität, bleichmittelzusammensetzung, waschmittel und verfahren zur verhinderung der farbstoffübertragung |
| IL150924A0 (en) | 2000-01-28 | 2003-02-12 | Brij Pal Giri | Novel stabilized formulations for chemiluminescent assays |
| ES2324509B1 (es) * | 2008-02-06 | 2010-06-17 | Matilde Esther Lleonart Pajarin | Composicion de revelado en ensayos de inmunodeteccion. |
| JP5311662B2 (ja) * | 2009-08-24 | 2013-10-09 | キッコーマン株式会社 | ペルオキシダーゼ化学発光反応の発光増強方法及びペルオキシダーゼ化学発光反応用発光増強剤 |
| CN103597353B (zh) | 2011-06-15 | 2016-03-02 | 三洋化成工业株式会社 | 使用磁性二氧化硅颗粒的测定方法和该测定方法用试剂 |
| JP2013205261A (ja) * | 2012-03-29 | 2013-10-07 | Sanyo Chem Ind Ltd | 酵素免疫測定法及び酵素免疫測定法用化学発光試薬キット |
| EP2959971A1 (de) | 2014-06-27 | 2015-12-30 | Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG | Verfahren und Vorrichtung zur Überführung von Flüssigkeiten |
| US11237170B2 (en) | 2018-12-04 | 2022-02-01 | Aat Bioquest, Inc. | Styryl phenols, derivatives and their use in methods of analyte detection |
| EP4494756A1 (de) | 2023-07-19 | 2025-01-22 | Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG | Vorrichtung und laborautomat zur inkubation von mehreren patientenproben unter verwendung mehrerer inkubationsgefässe |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL7801413A (nl) * | 1977-03-09 | 1978-09-12 | Hoffmann La Roche | Peroxydasebepaling. |
| GB2008247B (en) * | 1977-11-17 | 1982-12-15 | Welsh Nat School Med | Detecting or quantifying substances using labelling techniques |
| SE7811630L (sv) * | 1977-11-17 | 1979-05-18 | Welsh Nat School Med | Metod for uppteckt eller mengdbestemning av substanser med anvendning av merkningsteknik |
| US4363759A (en) * | 1978-04-10 | 1982-12-14 | Miles Laboratories, Inc. | Chemiluminescent-labeled haptens and antigens |
| US4375972A (en) * | 1979-10-17 | 1983-03-08 | Allied Corporation | Heterogeneous chemiluminescent immunoassays utilizing metallo porphyrin tag |
| JPS56117798A (en) * | 1980-02-21 | 1981-09-16 | Toyo Jozo Co Ltd | Kit for measuring lipoid peroxide |
| GB2070767B (en) * | 1980-03-03 | 1983-07-27 | Abbott Lab | Stabilizing the reaction product formed in enzyme immunoassays |
| CA1185177A (en) * | 1981-07-17 | 1985-04-09 | Larry E. Morrison | Non-radiative energy transfer immunochemical technique |
| DE3463395D1 (en) * | 1983-02-11 | 1987-06-04 | Nat Res Dev | Enhanced luminescent or luminometric assay |
-
1983
- 1983-02-25 EP EP83301030A patent/EP0087959B1/en not_active Expired
- 1983-02-25 US US06/551,985 patent/US4842997A/en not_active Expired - Fee Related
- 1983-02-25 AU AU12285/83A patent/AU558939B2/en not_active Ceased
- 1983-02-25 WO PCT/GB1983/000058 patent/WO1983003104A1/en not_active Ceased
- 1983-02-25 DE DE8383301030T patent/DE3360857D1/de not_active Expired
- 1983-02-25 JP JP83500837A patent/JPS59500252A/ja active Granted
- 1983-03-01 ZA ZA831389A patent/ZA831389B/xx unknown
- 1983-03-02 CA CA000422693A patent/CA1200486A/en not_active Expired
- 1983-03-02 NZ NZ203435A patent/NZ203435A/en unknown
- 1983-11-02 FI FI834024A patent/FI70728C/fi not_active IP Right Cessation
-
1986
- 1986-12-08 AU AU66199/86A patent/AU6619986A/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA1200486A (en) | 1986-02-11 |
| AU558939B2 (en) | 1987-02-12 |
| DE3360857D1 (en) | 1985-10-31 |
| FI834024A7 (fi) | 1983-11-02 |
| JPH0453518B2 (fi) | 1992-08-26 |
| AU6619986A (en) | 1987-04-02 |
| NZ203435A (en) | 1986-06-11 |
| WO1983003104A1 (en) | 1983-09-15 |
| EP0087959B1 (en) | 1985-09-25 |
| EP0087959A1 (en) | 1983-09-07 |
| AU1228583A (en) | 1983-10-18 |
| US4842997A (en) | 1989-06-27 |
| ZA831389B (en) | 1984-01-25 |
| FI70728B (fi) | 1986-06-26 |
| FI834024A0 (fi) | 1983-11-02 |
| JPS59500252A (ja) | 1984-02-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI70728C (fi) | Foerbaettrad luminescent eller luminometriskt bestaemning av en substans | |
| EP0116454B1 (en) | Enhanced luminescent or luminometric assay | |
| US4729950A (en) | Enhanced luminescent or luminometric assay | |
| Rongen et al. | Chemiluminescence and immunoassays | |
| US5171668A (en) | Method of the chemiluminescence assay of the activity of peroxidase | |
| EP0247796A1 (en) | Solid phase immunoassay method | |
| US5424194A (en) | 4-(cyanomethylthio)phenol enhanced peroxidase assays | |
| US4835101A (en) | Luminescent analyses with enhanced storage stability | |
| AU714498B2 (en) | Analytical element and method for the determination of a specific binding ligand using a vanadium bromoperoxidase as a signal-generating enzyme | |
| EP0892855B1 (en) | Use of vanadium bromoperoxidase as a signal-generating enzyme for chemiluminescent systems: test kits and analytical methods | |
| AU582341B2 (en) | Assay for immobilized reporter groups | |
| EP0480361A2 (en) | Quantitation by chemiluminescence using photosenstive substance | |
| JPH035539B2 (fi) | ||
| JP3727661B6 (ja) | シグナル発生酵素としてバナジウムブロモペルオキシダーゼを使った特異的結合リガンドの測定用の分析要素および方法 | |
| Thorpe | Enhanced chemiluminescent assays for horseradish peroxidase and their application in immunoassays | |
| JPH051995A (ja) | 金属ポルフインを用いる新規測定法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC | Transfer of assignment of patent |
Owner name: BRITISH TECHNOLOGY GROUP LIMITED |
|
| MM | Patent lapsed | ||
| MM | Patent lapsed |
Owner name: BRITISH TECHNOLOGY GROUP LTD |