JP2013205261A

JP2013205261A - 酵素免疫測定法及び酵素免疫測定法用化学発光試薬キット

Info

Publication number: JP2013205261A
Application number: JP2012075337A
Authority: JP
Inventors: Yoshiro Furukawa; 喜朗古川
Original assignee: Sanyo Chemical Industries Ltd
Current assignee: Sanyo Chemical Industries Ltd
Priority date: 2012-03-29
Filing date: 2012-03-29
Publication date: 2013-10-07

Abstract

【課題】生体中の微量物質を高感度に測定できる酵素免疫測定法及び酵素免疫測定法用化学発光試薬キットを提供する。
【解決手段】化学発光物質（ａ）及び酸化剤（ｂ）を用いる化学発光酵素免疫測定法において、アルカリ金属又はアルカリ土類金属の塩（ｃ）の存在下で化学発光を行うことを特徴とする酵素免疫測定法。アルカリ金属又はアルカリ土類金属の塩（ｃ）は、塩化カルシウム及び／又は臭化リチウムであることが好ましい。酵素はペルオキシダーゼであることが好ましく、化学発光物質（ａ）はルミノールの金属塩であることが好ましい。
【選択図】なし

Description

本発明は臨床検査薬等に使用される酵素免疫測定法に関する。更に詳しくは、生体中の微量物質を高感度に測定できる酵素免疫測定法に関する。

酵素免疫測定法は、生体中の微量物質の測定法として知られており、臨床検査の分野においてはその測定値が病態の診断や経過観察等に用いられることから、生体中の微量物質をより高感度に測定できる試薬が望まれている。従来、微量物質をより高感度に測定するために、界面活性剤を添加した化学発光試薬キットで測定する方法（例えば特許文献１参照）、フラーレンを添加した化学発光試薬キットで測定する方法（例えば特許文献２参照）、フッ素原子含有界面活性剤を添加した化学発光試薬キットで測定する方法（例えば特許文献３参照）が知られている。しかしながら従来の測定方法では、近年益々要求が高まっている生体中の超微量の対象物質に対して、その測定感度は十分とはいえない。

特開平０８−２６１９４３号公報特開２００３−２５４９７３号公報特開２００８−０５４５８５号公報

本発明の目的は、生体中の微量物質を高感度に測定できる酵素免疫測定法及び酵素免疫測定法用化学発光試薬キットを提供することにある。

本発明者は、上記の目的を達成すべく鋭意検討した結果、本発明に到達した。即ち本発明は、
化学発光物質（ａ）及び酸化剤（ｂ）を用いる化学発光酵素免疫測定法において、アルカリ金属又はアルカリ土類金属の塩（ｃ）の存在下で化学発光を行うことを特徴とする酵素免疫測定法；化学発光物質（ａ）を含む溶液（Ａ）と酸化剤（ｂ）を含む溶液（Ｂ）、及びアルカリ金属又はアルカリ土類金属の塩（ｃ）を含む溶液（Ｃ）から構成され、前記測定法に用いられる酵素免疫測定法用化学発光試薬キット；化学発光物質（ａ）及びアルカリ金属又はアルカリ土類金属の塩（ｃ）を含む溶液（Ｄ）と、酸化剤（ｂ）を含む溶液（Ｂ）とから構成され、前記測定法に用いられる酵素免疫測定法用化学発光試薬キット；化学発光物質（ａ）を含む溶液（Ａ）と、酸化剤（ｂ）及びアルカリ金属又はアルカリ土類金属の塩（ｃ）を含む溶液（Ｅ）とから構成され、前記測定法に用いられる酵素免疫測定法用化学発光試薬キット；である。

本発明の酵素免疫測定法用化学発光試薬キットを用いた酵素免疫測定法により、生体中の対象物質を高感度に測定することができる。

本発明の酵素免疫測定法は、化学発光物質（ａ）及び酸化剤（ｂ）を用いる化学発光酵素免疫測定法において、アルカリ金属又はアルカリ土類金属の塩（ｃ）の存在下で化学発光を行うものである。

化学発光物質（ａ）としては、例えば「生物発光と化学発光−基礎と実験−」（廣川書店，１９８９年発行）に記載の２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物、１，２−ジオキセタン化合物、アクリジン化合物、インドール化合物等が挙げられる。このうち、測定感度及び保存安定性の観点から、２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物｛ルミノール、イソルミノール、Ｎ−アミノヘキシル−Ｎ−エチルイソルミノール（ＡＨＥＩ）及びこれらの金属（アルカリ金属等）塩等）、１，２−ジオキセタン化合物｛３−ガラクトシドキシフェニルジオキセタン、４−メトキシ−４−（３−フォスフェートフェニル）スピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’−アダマンタン］等｝が好ましい。更に例えば酵素としてペルオキシダーゼを用いた場合は、２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物が好ましく、更に好ましくはルミノール及びルミノールの金属塩、特に好ましくはルミノールのナトリウム塩である。

化学発光物質（ａ）の使用量はその種類及び適用する測定方法や測定条件等によって適宜設定されるが、測定感度及び保存安定性の観点から化学発光時に混合される全液量を基準として、好ましくは０．２５〜６０ｍＭ、更に好ましくは０．９〜３０ｍＭ、特に好ましくは１．５〜１５ｍＭとなる量である。

酸化剤（ｂ）としては、例えば、特開平８−２６１９４３号公報及び特開２０００−２７９１９６号公報に記載の酸化剤の水溶液｛無機の過酸化物（過酸化水素、過ホウ酸ナトリウム、過ホウ酸カリウム等）、有機過酸化物（過酸化ジアルキル、過酸化アシル等）、ペルオクソ酸化合物（ペルオクソ硫酸、ペルオクソリン酸等）等の水溶液等｝が挙げられる。これらのうち、測定感度及び保存安定性の観点から、過酸化水素水溶液、過ホウ酸ナトリウム水溶液及び過ホウ酸カリウム水溶液が好ましく、更に好ましくは過酸化水素水溶液である。

酸化剤（ｂ）の含有量は、その種類及び適用する測定方法や測定条件等によって適宜設定されるが、化学発光物質（ａ）のモル数を基準として、０．１〜６０モル％が好ましく、更に好ましくは０．２〜３０モル％、特に好ましくは０．３〜２０モル％である。

アルカリ金属又はアルカリ土類金属の塩（ｃ）としては、例えばリチウム、ナトリウム、カリウム等の第一族元素又はカルシウム、ストロンチウム、バリウム等の第二族元素のハロゲン化物（塩化ナトリウム、塩化カリウム、臭化リチウム、フッ化ナトリウム及び塩化カルシウム等）、硫酸塩（硫酸ナトリウム及び硫酸カリウム等）及びリン酸塩（リン酸ナトリウム及びリン酸カリウム等）等があげられる。これらのうち測定感度の観点から塩化カルシウム及び臭化リチウムが好ましい。（ｃ）は１種を単独で用いても２種以上を併用してもよい。

アルカリ金属又はアルカリ土類金属の塩（ｃ）の含有量は測定感度及び保存安定性の観点から、酸化剤（ｂ）のモル数を基準として０．０１〜１０モル％が好ましく、更に好ましくは０．０２〜８モル％、特に好ましくは０．０５〜５モル％である。

化学発光物質（ａ）は、化学発光増強剤と併用することができる。化学発光増強剤は化学発光物質（ａ）の種類に応じて選択されるが、例えば、化学発光物質（ａ）がルミノール又はルミノールの金属塩の場合、特開昭５９−５００２５２号、特開昭５９−１７１８３９号、特開平７−１４３８９９号又は特開平４−２９３４９８号の各公報に記載された化合物［チアゾール化合物｛６−ヒドロキシベンゾチアゾール、４−［２’−（４’−メチル）チアゾリル］フェノール、４−［４’−（２’−メチル）チアゾリル］フェノール等｝、ナフトール化合物、フェノール化合物｛４−シアノメチルチオ−２−クロロフェノール、４−（シアノメチルチオ）フェノール、４−（２’−チエニル）フェノール、ｐ−ヨードフェノール等｝〕が挙げられ、また、（ａ）が１，２−ジオキセタン化合物の場合、特開平３−５３８９７号又は特開平４−１２４１８５号の各公報記載の化合物〔重合性４級アンムニウム塩｛ポリ（ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロライド）、ポリ｛ビニルベンジル（ベンジルジメチルアンモニウムクロリド）｝等〕が挙げられる。特に（ａ）が４−メトキシ−４−（３−フォスフェートフェニル）スピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’−アダマンタン］の場合、蛍光ミセル（例えば、セチルトリメチルアンモニウムブロミドと５−Ｎ−テトラデカノイル−アミノフルオレセインで形成したミセル）等が挙げられる。
これらのうち、化学発光増強効果の観点から、チアゾール化合物、フェノール化合物が好ましく、更に好ましいのはフェノール化合物、次に更に好ましいのはｐ−ヨードフェノール、４−（シアノメチルチオ）フェノール及び４−シアノメチルチオ−２−クロロフェノールである。

化学発光増強剤の含有量は化学発光物質（ａ）のモル数を基準として、化学発光増強効果及び保存安定性等の観点から、０．１〜１５モル％が好ましく、更に好ましくは０．１〜５モル％、特に好ましくは０．２〜２モル％である。

本発明で使用される酵素としては従来免疫測定法で使用されるペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ等が挙げられる。これらのうち、測定感度及びＴ．Ａ．Ｔ（ＴｕｒｎＡｒｏｕｎｄＴｉｍｅ）などの観点から、ペルオキシダーゼが好ましい。

測定対象物質としてはタンパク質関連物質（ＡＦＰ、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、ＣＡ７２−４、ＣＡ５０、トロポニンＩ、トロポニンＴ、ペプシノゲンＩ、ペプシノゲンＩＩ、ＰｒｏＧＲＰ、ＢＮＰ、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ、ＰＳＡ、ＰＡＰ、ＳＣＣ、ＫＭＯ１、ＮＳＥ、ＩｇＥ、特異ＩｇＥ、β２−ミクログロブリン、フェリチン、ＩＡＰ、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、ＣＲＰ、α２−ＭＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＣＫ−ＭＢ、ＣＫ−ＭＭ、ミオグロビン、ミオシン、トランスフェリン、アポリポタンパク、糖タンパク、アルブミン、マイクロアルブミン、ヘモグロビン、グリコヘモグロビン、フルクトサミン、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＲＦ、リンパ球サブセット、ＬＥ細胞、抗サイログロブリン抗体、抗マイクロゾーム抗体及びＡＳＯ等）、ホルモン関連物質（インスリン、ＨＧＣ、β−ＨＣＧ、成長ホルモン、ＴＳＨ、ＬＨ、ＦＳＨ、プロラクチン、Ｔ３、Ｔ４、ＦＴ３、ＦＴ４、ＴＢＧ、Ｃ−ペプチド、Ｔ−Ｕｐｔａｋｅ、エストロゲン、ＨＰＬ、Ｅ２、コルチゾール、プロゲステロン、テストステロン及びソマトスタチン等）、薬物関連物質（ジゴキシン、フェニトイン、フェノバルビタール及びテオフィリン等）、感染症関連物質（真菌、連鎖球菌、大腸菌、結核菌、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、エイズウイルス、カンシダ、マイコプラズマ、トキソプラズマ、梅毒、マラリア原虫及び赤痢アメーバー等そのもの自体、並びにこれらに対する抗体及びこれらの代謝物等）が挙げられる。

本発明の酵素免疫測定法用化学発光試薬キットは、例えば以下の（１）〜（３）の形態を取り得る。
（１）化学発光物質（ａ）を含む溶液（Ａ）と酸化剤（ｂ）を含む溶液（Ｂ）、及びアルカリ金属又はアルカリ土類金属の塩（ｃ）を含む溶液（Ｃ）から構成される試薬キット。
（２）化学発光物質（ａ）及びアルカリ金属又はアルカリ土類金属の塩（ｃ）を含む溶液（Ｄ）と、酸化剤（ｂ）を含む溶液（Ｂ）とから構成される試薬キット。
（３）化学発光物質（ａ）を含む溶液（Ａ）と、酸化剤（ｂ）及びアルカリ金属又はアルカリ土類金属の塩（ｃ）を含む溶液（Ｅ）とから構成される試薬キット。

上記溶液（Ａ）〜（Ｅ）におけるその他の成分としては必須成分である精製水及び任意成分としての緩衝剤及びキレート剤が挙げられる。

緩衝剤としては、慣用のものであれば特に制限はなく、例えば、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、Ｇｏｏｄ緩衝液（ＰＩＰＥＳ，ＭＥＳ，ＴＥＳ，ＭＯＰＳ，ＨＥＰＥＳなど）が挙げられる。

キレート剤としては、公知（例えば、特開平９−７５０９９号公報及び特開２００３−２７９４８９号公報）のキレート剤が使用できる。これらのうち、保存安定性等の観点から、４配位キレート剤が好ましく、更に好ましいのはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及びこの塩（ナトリウム、カリウム等）、並びにトランス−１，２ジアミノシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＣｙＤＴＡ）、特に好ましいのはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及びこのナトリウム塩である。

本発明の酵素免疫測定法及び酵素免疫測定法用化学発光試薬キットは、臨床検査の分野において免疫測定を行う際に用いることができる。特に、生体中の微量物質をより高感度に測定できることから酵素免疫測定法及び酵素免疫測定法用化学発光試薬キットとして好適に使用できる。

以下、実施例により本発明を更に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
［実施例１〜５及び比較例１］
＜化学発光物質を含む溶液の調製＞
ルミノールのナトリウム塩０．２８ｇ、４−（シアノメチルチオ）フェノール（ｄ１）０．０５６ｇ、３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸１．２６ｇ、水酸化ナトリウム０．４０ｇを秤量し、メスフラスコに仕込み、全重量が１００ｇなるように精製水を加え、２５℃で均一混合し、実施例１〜５及び比較例１で使用する化学発光物質を含む溶液（Ａ−１）を調製した。

＜酸化剤及びアルカリ金属又はアルカリ土類金属の塩を含む溶液の調製＞
表１に記載の濃度となるようアルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩（ｃ）を秤量し、更に酸化剤（ｂ）としての３０％過酸化水素水０．１９２ｇを秤量した後、全重量が１００ｇとなるように精製水を加え、２５℃で均一混合して実施例１〜５の酸化剤及びアルカリ金属又はアルカリ土類金属の塩を含む溶液（Ｅ−１）〜（Ｅ−５）及び比較例１の酸化剤及びアルカリ金属又はアルカリ土類金属の塩を含む溶液（Ｅ’−１）を調製した。

＜抗ＰＳＡポリクローナル抗体結合ビーズの調製＞
抗ＰＳＡポリクローナルウサギ抗体［ダコ・サイトメーション（株）製］をｐＨ９の０．１Ｍ炭酸緩衝液に２０μｇ／ｍｌの濃度で溶解させた。直径３ｍｍのガラスビーズ［（株）岡部製作所製ケイ酸塩ガラス］を加え、４８時間反応させた後、０．１％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液でコーティングし乾燥させた。

＜ペルオキシダーゼ標識抗ＰＳＡポリクローナルウサギ抗体試薬の調製＞
抗ＰＳＡポリクローナルウサギ抗体［ダコ・サイトメーション（株）製］及び西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ（東洋紡社製）を用い、文献「エス・ヨシタケ、エム・イマガワ、イー・イシカワ、エトール；ジェイ．バイオケム，Ｖｏｌ．９２（１９８２）１４１３−１４２４」に記載の方法でペルオキシダーゼ標識抗ＰＳＡポリクローナルウサギ抗体を調製した。

上記で調製した試薬を用いて、全自動酵素免疫測定装置［オリンパス（株）製「スフィアライト１８０」］」により発光量の測定を行った。即ちまず、抗ＰＳＡポリクローナル抗体結合ビーズ１個が入った反応槽に後述の検体４０μＬ及び０．１％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液１００μＬを加え、３７℃、約７分間反応させた（工程１）。次いで、０．１％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液をＢ／Ｆ分離で除いた（工程２）。次に工程１で得られた反応物に１％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液で１０００倍希釈したペルオキシダーゼ標識抗ＰＳＡポリクローナル抗体を１４０μＬ加えて反応させた（工程３）。次いで、１％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液をＢ／Ｆ分離で除いた（工程４）。最後に上記化学発光物質を含む溶液７０μＬ及び上記酸化剤及びアルカリ金属又はアルカリ土類金属の塩を含む溶液７０μＬを更に加えて、工程３で得られた反応物中のペルオキシダーゼと反応させることにより、発光量を計測した（工程５）。
なお、上記検体として、０ｎｇ／ｍＬ及び０．００５ｎｇ／ｍＬの各濃度の標準ＰＳＡ溶液を用いて測定し、０ｎｇ／ｍＬを用いた場合の発光量を、ブランクの発光量（Ｘ）、０．００５ｎｇ／ｍＬを用いた場合の発光量を（Ｙ）とし、発光量（Ｙ）を、ブランクの発光量（Ｘ）で除した比（Ｙ／Ｘ）、及び発光量（Ｙ）からブランクの発光量（Ｘ）を減じた値（Ｙ−Ｘ）を測定感度とした。結果を表１に示す。

表１から、本発明の方法は比較例の場合に比べて（Ｙ／Ｘ）及び（Ｙ−Ｘ）の値が大きく向上していることから、測定感度が向上し、生体中の微量ＰＳＡをより高感度に測定することができることが分かる。

化学発光物質（ａ）及び酸化剤（ｂ）を用いる化学発光酵素免疫測定法において、アルカリ金属又はアルカリ土類金属の塩（ｃ）の存在下で化学発光を行うことを特徴とする本発明の酵素免疫測定法を用いることにより、生体中の微量物質を高感度に測定することが出来るため、高感度な酵素免疫測定法として有用である。

Claims

化学発光物質（ａ）及び酸化剤（ｂ）を用いる化学発光酵素免疫測定法において、アルカリ金属又はアルカリ土類金属の塩（ｃ）の存在下で化学発光を行うことを特徴とする酵素免疫測定法。
アルカリ金属又はアルカリ土類金属の塩（ｃ）が、塩化カルシウム及び／又は臭化リチウムである請求項１に記載の酵素免疫測定法。
アルカリ金属又はアルカリ土類金属の塩（ｃ）の含有量が、酸化剤（ｂ）のモル数を基準として０．０１〜１０モル％である請求項１又は２に記載の酵素免疫測定法。
酵素がペルオキシダーゼであって、化学発光物質（ａ）がルミノール又はルミノールの金属塩である請求項１〜３のいずれか記載の酵素免疫測定法。
化学発光物質（ａ）を含む溶液（Ａ）と酸化剤（ｂ）を含む溶液（Ｂ）、及びアルカリ金属又はアルカリ土類金属の塩（ｃ）を含む溶液（Ｃ）から構成され、請求項１〜４記載の測定法に用いられる酵素免疫測定法用化学発光試薬キット。
化学発光物質（ａ）及びアルカリ金属又はアルカリ土類金属の塩（ｃ）を含む溶液（Ｄ）と、酸化剤（ｂ）を含む溶液（Ｂ）とから構成され、請求項１〜４記載の測定法に用いられる酵素免疫測定法用化学発光試薬キット。
化学発光物質（ａ）を含む溶液（Ａ）と、酸化剤（ｂ）及びアルカリ金属又はアルカリ土類金属の塩（ｃ）を含む溶液（Ｅ）とから構成され、請求項１〜４記載の測定法に用いられる酵素免疫測定法用化学発光試薬キット。