JPH0376598A - 基質組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、化学反応により検知可能な変化を示す化合物
を含有する基質組成物に関し、更に詳しくは増強された
検知可能な変化を示す基質組成物に関す６゜ 〔従来の技術〕 過酸化水素を触媒の存在下、検知可能な変化を生じさせ
、その結果を検出する方法は分析の一つの分野として確
立した技術である。特に臨床化学の分野、生化学、免疫
学、分子生物学の分野で′多用されている。触媒として
は、生体触媒である酵素、ペルオキシダーゼがこの目的
のために使用され６゜特に微量の物質の存在を検知する
ために色原体、化学発光物質等が検知可能な変化を示す
物質として挙げられる。例えば、ペルオキシダーゼ、ル
ミノールを用いた化学発光法において、時開Ｅ５９−１
７１８３９号公報の記載によれ゛ばハロゲン化フェノー
ルの添加により、その発光が増強されるという開示があ
る。しかしながら、免疫学分野の例えばイムノアッセイ
や分子生物学分野の核酸の検出において、巨大分子であ
る酵素はその目的に必ずしも適していない。特に標識化
合物として用いる場合、大きな分子量が付加することで
元々の性質が変化したり、酵素自身の失活による感度低
下を来すという欠点を有している。

一方、特願昭６３−４４９８９号明細１の記載によれば
、金属錯体触媒を同様の目的に使用するこ占が開示され
ている。これらは、前記の酵素を用いることで生じる欠
点は改善されている。

〔発明が解決しようどする課題〕

１〜かしながら、検出感度の更なる向上が望まれている
。

本発明の目的は、低濃度レベルの極微量のもの検出が可
能な、増感された基質組成物を提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明を概説ずれば、本発明は基質組成物に関する発明
であって、化学反応により検知可能な変化を示す化合物
を含有する基質組成物において、°γルカリ金属ハロゲ
ン化物、アルカリ土類金属ハロゲン化物、及びイオン性
界面活性剤よりなる群から選択した化合物の少なくとも
１種を含有していることを特徴とする。

本発明者らは、上記理由よりポルフィリン金属錯体誘導
体を標識化合物として用いる核酸又は蛋白質の検出方法
の高感度化を鋭意検討を璽ねた結果以下の方法を用いる
ことで感度の向Ｊニが遠戚でき本発明を完成するに至っ
た。

すなわち、本発明は、標識化合物の信号検出のための基
質組成物であって、増感剤として前記ハロゲン化物及び
／又はイオン性界面活性剤を含有していることを特徴と
する。

１、たがって、本発明の基質組成物は、生物学的試料の
中の、あらかじめ定められた核酸又は蛋肉質を金属錯体
誘導体を標識化合物として用い、核酸又は蛋゛白質と特
異的に結合］２該標識化合物の信号を検出することで該
核酸又は蛋白質を検出する方法において利用するのが好
適である。

上記した金属錯体の例としては、０−フェナンスロリン
誘導体の銅（ＩＩ）及び／又はオスミウム（■）　ポル
フィリン誘導体の鉄、コバルト、マンガン、ニッケル、
クロム、亜鉛、オスミウム、モリブデン、カドミウム、
銅の錯体等が挙げられる。

ここで誘導体とは、核酸又は蛋白質に標識するために必
要な官能基、例えばアミノ基、カルボキシル基、ホルミ
ル基、イソチオシアネート基、アジド基等の官能基を導
入した化合物をいい、上記官能基を介して、又は二官能
性試薬を用いて金属錯体を核酸又は蛋白質と反応させる
ことにより行われる。

前記した金属錯体は、ペルオキシダーゼ様活性を示す触
媒として働き、例えばルミノール誘導体−過酸化水素を
発光反応に導き、例えば写真フィルム、フォトンカウン
ター　フォトマル等で検出される。

更に、過酸化水素と色原体を用いて生成する色素で検出
することも可能である。例えば、特開昭５７−１６６９
７号、特公昭６３−３７９０３号各公報に記載の色原体
を、この目的で用いることができる。

本発明の組成物において、増感剤として使用するハロゲ
ン化物の例としては、ＮａＣ１、ＮａＢｒ、Ｎａｌ　５
ＫＣＩ　、にＢｒ　ＳＫ１．％ＣａＣｌ２、ＣａＢｒ２
、Ｃａ１ａ等が挙げられる。これらはＱ、　ｌ　ｍｏｌ
／βから１、　Ｏｍｏｌ　／　７の範囲で有効な増感作
用を示す。

更に同様な効果を示すものとして、イオン性界面活性剤
が用いられる。イオン性界面活性剤としては、アニオン
又はカチオン性界面活性剤が用いられる。これらイオン
性界面活性剤は、０．０１から０゜５％の濃度が用いら
れる。

界面活性剤は、親水性原子団と疎水性原子団から成り、
必要に応じて連結剤（２価の有機基）を含んでも良い。

親水性原子団の例としては−ＣＯＯＭ　、　−０３Ｏ，
Ｍ（硫酸塩）　　−３０３Ｍ　　（スルホン酸塩）　ホ
スファイト、ホスホネート、ホスホン酸、アンモニラ五
、チウロニウム、ホスホニウム、スルホニウム等が挙げ
られる。

疎水性原子団の例としてはパラフィン、アルキルベンゼ
ン、アルキルアリール、脂肪酸、脂肪酸アミド、脂肪族
アルコール、脂肪族アミン等が挙げられる。

これらの親水性原子団及び疎水性原子団の組合せにより
生成する種々のアニオン性及びカチオン性界面活性剤を
用いることができる。

アニオン性界面活性剤の具体７例としては、脂肪酸塩類
（Ｒ（：’ＯＯＭ）、高級アルコール硫酸エステル塩類
（ＲＯ３Ｏ，Ｍ）、液体脂肪油硫酸エステル塩類ｒ　Ｒ
（Ｏ２０，Ｍ）ＣＯＯＲ’　）　、脂肪族アミン及び脂
肪族アミドの硫酸塩類（例えばＲＣＯＮＨＲ’　ＣＨ２
Ｃｌ１２０３０３Ｍ〕、脂肪族アルコールリン酸エステ
ル塩類口 １：ＲＯＰ（ＯＭ）２］　、二塩基性脂肪酸エステルの
スルホン酸塩類（例えばＲＯＣＯＣＨ２ ＲＯＣＯＣＩＳＯ，Ｍ　） 脂肪酸アミドスルホン酸塩類（例えばＲＣＯＮＲ’Ｃ１
Ｃ１１２ＣＩ２ＳＯ３フルキルアリールスルホン酸塩ホ
ルマリン縮合のナフタリンスルホン酸塩類等が挙げられ
る。

挙げられる。但し、前記各式中Ｒ及びＲ’　　Ｒ，。

Ｒ２、Ｒ５、Ｒ４は置換、未置換のアルキル基、Ｍは１
価のカチオン、Ｘは１価のアニオンを示す。

これら増感剤は、標識化合物の検出反応のシグナル形成
反応時に添加されていれば良い。しかしながら他の検出
反応時の反応を阻害しない限りにおいて、添加の時点に
制限はない。

例えば化学発光法により核酸を検出する場合、特願昭６
３−９３９４４号明細書に記載の方法及ヒ常法〔コール
ド　スプリング　バーパーラ　ボ　ラ　ト　リ　−　（
Ｃｏｌｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ　　Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ）１９８２年発行、Ｔ、　マ＝アティス
（Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓ）ほか編、モレキュラー　ク
ローニング　アラポラトリー　マニュアル（Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ　Ｃ’ｌｏｎｉｎｇＡ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
　Ｍａｎｕａｌ、））に従いα、β、Ｔ、δテトラキス
（４−アミノエチルカルバモイルフェニル）ポルフィナ
トＦｅ（ＩＩＩ）錯体をグルタルアルデヒドを用い、−
木調ＤＮＡ又はＲＮＡに標識し前記ＤＮＡ又はＲ，Ｎ　
Ａと相補的ＤＮＡ又はＲＮＡをメンブレンフィルター」
二に固定し、錯体を標識したプローブとハイブリダイズ
させた後に過酸化水素とルミノール誘導体を含有する発
光液を供給することで検出される。本発明の増感剤は、
上記発光液中に含有させることが好ましい。但し、ハイ
ブリダイゼーション反応等直接シグナル検出反応にかか
わらない反応の場合、その反応を阻害しない限りにおい
て添加の時点に制限はない。

免疫測定についても、公知の方法、例えば石川栄治ら編
「酵素免疫測定法Ｊ　　（１９７８）医学書腕利記載の
競合法、二抗体法、サンドウィッチ法等の原理に従って
標識化合物を本発明に係る金属錯体を用いることで、容
易に達成できる。この際基質どして過酸化水素ど共に色
原体を用いれば比色法で、化学発光の基質を用いれば発
光法で測定できる。核酸の検出と同様に、本発明の増感
剤は、最終結果検出の反応系に添加することで、十分な
増感効果が認められる。

最終結果の検出は、化学発光法の場合、例えば発光を写
真フィルムに露光、現像しその銀画像から検出すること
は可能である。ここで用いられる写真フィルムは、例え
ばルミノール誘導体の場合、少なくとも４００ｔ＋＋ｎ
〜５００ｎｍに分光感度を有するフィルムを用い、好ま
しくは前記波長領域の比感度が他の領域に比較して高い
フィルムを用いるべきである。また、必要に応じて増感
処理を行っても良い。更にはインスタントフィルムの使
用も、現像処理の煩雑さを低減させることから望ましい
。例えば高感度タイプのポラロイド■タイプ６１２等が
好ましい。

更にはツメトンカウンター　フォトマル等の検出装置を
用いても良い。

比色法についでは、通常の分光光度計を用い必要に応じ
て終点法や初速変法で測定することが可能である。更に
イ五ノステイニング法のように、メンブレン上で発色さ
せる場合には、例えば反射濃度計（デンシトメーター）
を用いることができる。

〔実施例〕

以下に、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、
本発明はこれによってなんら限定されるものではない。

実施例１ （１）　　ニトロセルロースフィルター上でのドツトブ
ロッティング ２Ｘ　３　ｃｍのニトロセルロースフィルター上に熱処
理し一本鎖にしたλフアージＤＮＡ（ｌｌｉｎｄＩＩＩ
で切断〉を０．５ｐｇ　、　ｌ　ｐｇ、　５　ｐｇ。

Ｔ、５ｐｇ　、　　１０ｐｇ、　　１００ｐｇ、　　１
　ｎｇ及び１０ｎｇを直径４ｎｏｎの大きさになるよう
にスポットし、減圧下８０℃で２時間焼付けをした。

（２）ＤＮＡプローブの作成 λファージＤ　Ｎ　Ａ　［ＨｉｎｄＩＩＩで切断、日本
ジーン■より入手］１０μｇを熱処理し一本鎖とした後
、２．５Ｘ１０−’Ｍα、β、Ｔ、δ−テトラキス（４
−アミノエチルカルバモイルフェニル）ポルフィナトＦ
ｅ（ＩＩＩ）　　（以下、ＴＣＰＰＡ−Ｆｅと略す。）
８μＡ、０．１％グルタルアルデヒド３μβに蒸留水を
加え全量５０μｌと１、反応させた。反応物はエタノー
ル沈殿法により精製した。

（３）　　ニトロセルロースフィルター上でのハイブリ
ダイゼーション （１）　テ作戊したニトロセルロースフィルターをヒー
トシールバッグに入れ、４２℃で２時間プレハイブリダ
イゼーションし、次いでＤＮＡプローブを加え、１６時
間ハイブリダイゼーションを行った。

フィルターは蒸留水で３回洗浄した。

（４）化学発光の検出 基質組成物として、３．４Ｘ　１０−２ルミノール、６
．ＯＸ　１０−２Ｍ　　ＫＯｔ（，３，ＯＸ　１０−’
Ｍホウ酸に下記第１表に示した本発明の増感剤を添加し
たものを用意し、増感剤な１．と比較した。すなわち上
記発光液にフィルターを浸漬したのち、インスタントフ
ィルム用フィルムホルダー（Ｍ４０５ポラロイド社〉に
ポラロイド■タイプ６１２を装てんし上記フィルムホル
ダーの露光窓にぴったり合致する。露光窓に接する部分
が透明のプラスチック板になった暗箱を用意し、上記フ
ィルターをプラスチック板上に設置し、ホルダーの遮光
板を開け■０分間露光ｊ〜た後、現像処理を行った。

現像したフィルムは、目視で判定した。結果を第１表に
合せて示す。

第　　１ 表 実施例２ 実施例１と同様に一本鎖λファージＤＮＡを制限酵素Ｈ
ｉｎｄｌｌＮで切断したもの〔日本ジーン■より人手〕
をニトロセルロースフィルター上にスポットし焼付け、
更に一本鎖λファージＤＮＡ　（ＨｉｎｄｌｌＩ切断）
を同様にＴＣＰＰＡ−Ｆｅをグルタルアルデヒドと反応
させプローブとし、ハンブリダイゼーションを行った。

化学発光の検出も実施例１と同様に３．４×１０−２Ｍ
ルミノール、６　、ＯＸ　１０−”Ｍ　　に旧）、３゜
Ｏｘ　１０−２Ｍホウ酸に本発明のＡオン性界面活性剤
を添加し、基質組成物とした。結果を第２表に示す。

第 表 以上のごとく良好な識別を示している。

〔発明の効果〕

以上説明したとおり、本発明の基質組成物を用いれば、
従来法より低濃度レベルの極微量のものも検出すること
ができるという顕著な効果が奏せられる。

手続補正書（出発） 平！２年８月２１

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、化学反応により検知可能な変化を示す化合物を含有
   する基質組成物において、アルカリ金属ハロゲン化物、
   アルカリ土類金属ハロゲン化物、及びイオン性界面活性
   剤よりなる群から選択した化合物の少なくとも１種を含
   有していることを特徴とする基質組成物。