DE3689784T2

DE3689784T2 - Das kationische Merichinon eines Benzidins enthaltende ionische Komponenten, diese enthaltende Testkombinationen und deren Gebrauch bei Untersuchungen.

Info

Publication number: DE3689784T2
Application number: DE3689784T
Authority: DE
Inventors: Will Bloch; Robert James Goodson; Patrick James Sheridan
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1985-10-04
Filing date: 1986-10-03
Publication date: 1994-07-28
Anticipated expiration: 2006-10-04
Also published as: JPS62182659A; US4789630A; AU594378B2; EP0219286A3; AU6350386A; JPH0737985B2; DK474786D0; CA1286986C; EP0219286B1; DK474786A; FI863996A; EP0219286A2; DE3689784D1; FI863996A0

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf neue, wenig lösliche Salze und immobilisierte ionische Komplexe der Merichinon- Oxidationsprodukte von Benzidin und substituierten Benzidinen und auf ihre Verwendung als analytische Sichtbarmachungssignale in einem weiten Bereich von chemischen, biologischen und klinischen Tests.
Peroxidative Oxidation erfolgt üblicherweise gemäß einem oder mehreren der folgenden Reaktionsschemata: AH&sub2; + ROOH - → A + ROH + H&sub2;O; H&sub2;O + AH&sub2; + ROOH → AH&sub2;&spplus;² + ROH + 2OH&supmin;, worin AH&sub2; ein Wasserstoff-Donator und ROOH ein Hydroperoxid sind. (Welche Reaktion bevorzugt ist, hängt von der Basenstärke von A und vom Reaktions-pH ab.) Über die Jahre sind viele Analysenmethoden für die peroxidative Wirksamkeit entwickelt worden. Einige sind dazu bestimmt, Peroxide zu identifizieren, zu lokalisieren oder zu quantifizieren, entweder als interessierende Verbindungen oder, im Falle von Wasserstoffperoxid, als Produkt von Oxidationen durch molekularen Sauerstoff, insbesondere solche, die durch eine Klasse von Enzymen katalysiert werden, die als Oxidasen bekannt sind. Andere derartige Methoden sind dazu bestimmt, Katalysatoren mit peroxidativer Wirksamkeit, wie Übergangsmetall-Ionen, Häme, Hämoproteine, und die Peroxidase-Enzyme, zu identifizieren, zu lokalisieren oder zu quantifizieren. Unter den letzteren sind zwei Verwendungsklassen gegenüber allen anderen vorherrschend: (a) Analyse von Hämoglobin in forensischen Proben, Stuhl, Urin und zellfreiem Blutplasma oder Serum und (b) Analyse von Peroxidase, die als Label [Markierung] in Bindungsassays verwendet wird.
Die erste Klasse von Assays ist nicht sehr empfindlich, da nicht-Peroxidase-Hämoproteine und isolierte Häme keine effizienten peroxidativen Katalysatoren sind. Außerdem unterliegen sie einem Einfluß von verunreinigenden Übergangsmetall-Ionen, hauptsächlich Eisen und Kupfer und gelegentlich von verunreinigenden Peroxidaseenzymen. Trotzdem sind sie so einfach und ihre diagnostische Relevanz so groß, daß sie auf ihren betreffenden Anwendungsgebieten beliebt sind. Zum Beispiel existieren viele kommerzielle klinische Tests auf okkultes Blut in Stuhlmaterial zur Prüfung auf Krebs und präkanzeroses Wachstum im Dickdarm.
Die zweite Klasse von Assays kann außerordentlich empfindlich sein, da Meerrettich-Peroxidase nicht nur katalytisch viel stärker wirksam ist als andere Hämoproteine, sondern auch eines der wirksamsten Enzyme ist, das in der Lage ist, gefärbte Produkte zu erzeugen, die sich für eine spektrophotometrische oder fluorometrische Analyse eignen. Sie können auch hoch spezifisch sein, da Peroxidaseenzyme natürlich in relativ wenigen klinischen oder biologischen Proben vorkommen und der potentielle Einfluß der Übergangsmetall- Ionen üblicherweise durch Chelatbildner blockiert werden kann.
Eine Schlüsselvariable im Aufbau von mit Peroxidase verbundenen Assays besteht in der Wahl des chromogenen Substrats, aus verschiedenen Gründen:
(a) Die katalytische Enzymwirksamkeit liegt im Bereich von mehreren Größenordnungen, in Abhängigkeit von der Struktur des Wasserstoff-Donators.
(b) Einige mit der Oxidation verbundene Spektraländerungen sind empfindlicher als andere, wobei größere Extinktionskoeffizienten-Aenderungen vorhanden sind oder diese in leichter feststellbaren Spektralbereichen auftreten.
(c) Einige gefärbte Produkte sind löslich, andere sind unlöslich. Die ersteren sind für instrumentelle Analysen der Produkt-Absorption oder Fluoreszenz in Lösung erwünscht. Die letzteren sind für Assays wesentlich, bei denen das Signal in einem Gel oder auf einer festen Oberfläche lokalisiert oder festgehalten werden soll.
(d) Viele Peroxidase-Substrate, Phenole und aromatische Amine sind bekannt dafür oder man sagt von ihnen, daß sie mutagen oder karzinogen sind.
Benzidin und mehrere substituierte Benzidin-Derivate sind als Peroxidase-Substrate entwickelt worden, die mit höheren Umsatzzahlen verbraucht werden, als viele andere aromatische Amine und Phenole, da sie günstige und große Absorptionsänderungen im sichtbaren Spektralbereich liefern. Die meisten können in Wasser unlösliche Produkte liefern, die üblicherweise von polymerer Natur sind. Jedoch ist von den meisten bekannt oder man sagt von Ihnen, daß sie karzinogen oder mutagen sind. 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB) wurde als nicht-karzinogenes Peroxidase-Substrat entwickelt (z. B. Holland et al. (1974) Tetrahedron, 30 : 3299-3302). Aus diesem Grund und weil es auch eines der empfindlichsten Peroxidase- Substrate zu sein scheint, hat es rasch weitverbreitete Anwendung gefunden (a) in Enzymimmunoassays, worin die Produktfarbe spektrophotometrisch in Lösung gemessen wird (z. B. Bos et al. (1981) Journal of Immunoassay, 2 : 187-204), (b) bei der spektrophotometrischen Bestimmung von Hämoglobin in Lösungsphase (z. B. Liem et al. (1979) Analytical Biochemistry, 98 : 388-395), (c) bei der spektrophotometrischen Festphasen- Bestimmung von Hämoglobin (z. B. Burkhardt et al. (1981) Europäische Patentanmeldung 81104634.1; U.S. Patent 4 447 542) oder Arzneimitteln (via mit Peroxidase verknüpfte spezifische Bindungsassays, U.S. Patent 4 447 529) , (d) bei der Bestimmung von Hämoglobin, anderen Hämoproteinen oder Oxidasen in elektrophoretischen Gelen (z. B. Thomas et al. (1976) Analytical Biochemistry, 75 : 168-176) , und (e) in der Neurohistochemie (z. B. Mesulam (1978) Journal of Histochemistry and Cytochemistry, 26 : 106-117)
Auffallend gering in den dokumentierten Berichten sind Berichte über TMB als Peroxidase-Substrate in üblichen mit Enzym verbundenen Festphasenassays, wie immunohistochemische Färbung, Westernblots, Southernblots oder Immunodotblots, bei denen weniger empfindliche und gefährlichere, unlösliche Produkte bildende HRP-Substrate verwendet worden sind (z. B. Hawkes et al (1982) Analytical Biochemistry, 119 : 142-147). Obwohl es unveröffentlichte Anwendungen von TMB auf Southern-, Northern-, Western- oder Immunodotblots gibt, berichtet Trojanowsky et al. (1983) Journal of Histochemistry and Cytochemistry, 31 : 1217-1223 über dessen immunohistochemische Verwendung in einem Vergleich mit mehreren anderen Chromogenen, die klarerweise unlösliche Produkte bilden: Diaminobenzidin, Aminoethylcarbazol, o-Tolidin und eine Mischung von p-Phenylendiamin und Brenzcatechin. Jedoch wurde TMB als eines der am wenigsten wirksamen Substrate beurteilt, das weniger empfindlich ist als Diaminobenzidin (trotz des gegenteiligen Befundes in neurohistochemischen Untersuchungen) und hinreichend große Kristalle liefert, um mikrostrukturelle Details zu verdecken.
In mehreren der anderen oben angegebenen Festphasen- oder Gelphasen-Studien, war das TMB-Signal ebenfalls nicht völlig befriedigend. Fujii et al., (1984) Neuroscience Research, 1 : 153-156, zitierte die Instabilität des TMB-Produkts in Abwesenheit von speziellen Fixativen und Olsson et al., (1983) J. Neuroscience Methods, 7 : 49-59 und viele andere Neurohistochemiker erwähnten die Neigung des TMB-Produkts, so große Kristalle zu bilden, daß sie feine Details verdecken. In einem histochemischen Bemühen, die Lokalisation von natürlicher Peroxidase in Querschnitten von Pflanzenstielen zu beobachten, wurde beobachtet, daß die TMB-erzeugte Farbe instabil ist (Imberty et al. (1984) Plant Science Letters, 35 : 103- 108). Broyles et al. (1979) Analytical Biochemistry, 94 : 211- 219 fand, daß das TMB-Produkt in dem gefärbten elektrophoretischen Gel beweglich ist, wodurch die Quantifizierung oder das Aufrechterhalten einer dauerhaften Aufzeichnung vereitelt wird. Sowohl Broyles et al. als auch Francis et al., (1984) Analytical Biochemistry, 136 : 509-514 stellten einen gefärbten Untergrund in mit TMB-gefärbten Gelen fest, was peroxidative Katalyse durch Verunreinigungen im Gel oder den Reagentien bedeuten muß. In der anderen zitierten Klasse von Festphasenassays auf Hämoglobin oder Peroxidase (z. B. Burkhardt et al., oben) war das Assayintervall so kurz, daß es unwahrscheinlich wäre, daß die physikalische Form oder die Labilität des TMB-Produkts das Resultat beeinflußt.
Die Entfernung von zwei Elektronen vom Benzidin oder einem substituierten Benzidin (z. B. durch peroxidative Oxidation) erzeugt ein oxidiertes Produkt, das ein Chinondiimin genannt wird. Es wurde berichtet, daß das blaue Reaktionsprodukt der TMB-Oxidation größtenteils als Ladungstransferkomplex zwischen einem TMB-Molekül und einem Chinondiimin existiert, der einen durchschnittlichen Oxidationsstatus in der Mitte zwischen jenem der beiden Komponenten aufweist und ein Merichinon genannt wird (Josephy et al. (1982) J. Biol. Chem., 257 : 3668-3675). In jener Publikation wurden sowohl das Merichinon als auch das Chinondiimin als neutrale Moleküle dargestellt, wie es auch in einer früheren Veröffentlichung über den Mechanismus der o-Dianisidin-Oxidation der Fall war (Claiborn und Fridovich (1979) Biochemistry, 18 : 23242329). Später wurde-das durch Benzidinoxidation gebildete Chinondiimin und Merichinon als Dikationen dargestellt (Josephy et al. (1983) J. Biol. Chem., 258 : 5561-5569), obwohl über keine pKa-Werte für Merichinone oder Chinondiimine berichtet wurde.
Vor der Entdeckung von TMB beobachtete Straus (1963), Journal of Histochemistry und Cytochemistry, 12 : 462-469, daß unspezifizierte Puffersalze die Ursache sind, daß das blaue Produkt der Benzidin-Oxidation (Merichinon) Kristalle von unbestimmter Zusammensetzung bilden. Andere Festphasen- oder Gelphasen-Anwendungen von TMB als ein peroxidatives Substrat, wie oben angegeben, benützten Puffer, wobei die Anmelder gezeigt haben, daß deren Anionen (Acetat, Citrat und Phosphat) relativ lösliche Salze des TMB- Merichinons bilden. Während Mesulam, oben, Olsson et al., oben, und andere Neurohistochemiker über die Ablagerung des blauen Produkts der TMB-Oxidation als Kristalle (von unbestimmter Zusammensetzung) von Acetat- und Phosphat-Puffern in neurohistochemischen Anwendungen berichtet haben, offenbaren die meisten der zitierten Referenzen über Festphasen- und Gelphasen-Anwendungen keinen klaren Nachweis der Produktabscheidung oder Immobilisierung. In der Tat wurde von Broyles et al., oben, das gegenteilige Ergebnis berichtet. Noch 1983 zitierte Josephy et al. (Journal of Biological Chemistry, 285 : 5561-5569) die Beobachtung von Broyles et al. hinsichtlich der unbefriedigenden Löslichkeitseigenschaften des TMB-Merichinons. Neurohistochemiker haben Methylsalicylat (Adams (1980) Neuroscience Letters, 17 : 7-9), Ammoniummolybdat (Fujii et al., oben), Kaliumferricyanid (Albers et al. (1984) Journal of Histochemistry und Cytochemistry, 32 : 1005-1008) oder Nitroprussidnatrium (z. B. Mesulam, oben) verwendet, um das blaue TMB-Produkt zu stabilisieren. Jedoch ist die molekulare Basis dieser Effekte unbekannt. Methylsalicylat ist im verwendeten pH-Bereich nicht-ionisch und die anderen drei Stabilisatoren können Reduktionsreaktionen unterliegen oder als Quellen von Anionen dienen, die das Merichinon ausfällen könnten. Das U.S. Patent Nr. 4 525 452 beschreibt die Isolierung von nichtoxidiertem TMB als festes Sulfat- oder Dichloridsalz, es wird aber kein Hinweis auf oxidiertes TMB gemacht.
Die hauptsächlich berichteten Schwierigkeiten bei der Anwendung von TMB als ein peroxidatives Substrat bei Festphasen- oder Gelphasenassays sind (a) übermäßige Löslichkeit des gefärbten Reaktionsprodukts, (b) fehlende Beeinflussung der Kristallisation bei neurologischen und immunohistochemischen Färbungsanwendungen, wo ein unlösliches Produkt erhalten wird, aber große Kristalle die zellularen Mikrostrukturen verdecken können, (c) übermäßige Untergrundoxidation des TMB durch Verunreinigungen und (d) "Verblassen" der Merichinon-Farbe aus unbekannten Gründen.
Van Du&ijlig;n, Receuil des Travaux Chimiques des Pays-Bas (1955) 74 : 771-778, offenbarte, daß anorganische Cl&supmin;- und SO&sub4;-&supmin;²-Salze das blaue Merichinon-Zwischenprodukt der Benzidin-Oxidation ausfällten. Es wurde weder gezeigt, daß die Fällungen ionisch waren, noch daß die Ausfällung vollständig war. Zusätzlich wurde keine Quantifizierung der Merichinon- Löslichkeit vorgenommen. Weis, Chemistry and Industry (1938) 16 : 517-518, offenbarte nicht-experimentelle Vorschläge, daß die von Schlenk und von Barzilowsky beobachteten blauen Verbindungen Semichinone, keine Ladungstransfer-Komplex-Merichinone wären, daß die Semichinone Monokationen und daß die mit verschiedenen Anionen erhaltenen blauen Feststoffe Salze sein sollten. Schlenk, Annalen der Chemie (1908) 363 : 313-339, offenbarte blaue Chlorid-"Salze" des Merichinons von 3,3'-Dichlor-5,5'-dimethylbenzidin und 3,3'-Dimethylbenzidin, ausgefällt aus Wasser. Keine Messung der Löslichkeit oder ein Beweis für die ionische Natur der Feststoffe wurde erhalten. Barzilowsky, Chemiker-Zeitung (1905) 29 : 292, offenbarte das Salz des Ferrocyanid-tetraanions und zwei Merichinon-dikationen. Es wurde keine Messung der Löslichkeit vorgenommen.
Diese vier Veröffentlichungen und diejenige von Straus, oben, zeigen, daß trotz der Verwendung des Ausdrucks "Salz", um den gebildeten blauen Niederschlag zu beschreiben, wenn gewisse anorganische oder unspezifizierte Salze in hohen oder unspezifizierten Konzentrationen zum blauen Produkt der Oxidation von Benzidin oder mehreren substituierten Benzidinen zugesetzt wurden, es keine Darlegung der Allgemeingültigkeit des Phänomens, der quantitativen Steuerbarkeit des Phänomens, der Löslichkeiten der Produkte oder der ionischen Natur des Produkts gegeben wurde. Der Mittelpunkt dieser frühen Arbeiten waren die Strukturen der blauen Farbstoffe, es gab jedoch nicht einmal einen Konsens über ihre chemische Struktur.
Obwohl Benzidin und substituierte Benzidine sehr gebräuchlich als chromogene Elektronen-Donatoren bei der Oxidation durch Peroxid verwendet werden, katalysieren mindestens einige Oxidase-Enzyme die TMB-Oxidation durch molekularen Sauerstoff (Miller und Nicholas, (1984) Analytical Biochemistry, 140 : 577-580). Diese Tatsache erinnert daran, daß Verbesserungen in der Technologie der Sichtbarmachung von oxidativen Reaktionen mit Benzidin oder substituierten Benzidinen eine breite Anwendungsfähigkeit außerhalb des Gebiets der auf Peroxidase basierenden Assays besitzen.
Die vorliegende Erfindung beseitigt die obigen Schwierigkeiten der Anwendung von Benzidin oder substituierten Benzidinen auf Festphasen- und Gelphasen-Assays bei allen Oxidationen, die aus diesen Verbindungen Merichinone erzeugen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf peroxidative Oxidationen. Sie gestattet eine steuerbare Ausfällung des Merichinons als feste Salze eines weiten Bereichs von Anionen, welche Salze unter definierten Bedingungen weniger löslich sind als die Salze der Acetat- und Phosphationen, die üblicherweise in Puffern für peroxidative Färbeanwendungen mit Merichinon verwendet werden. Die Löslichkeit wird durch Temperatur, pH, Anionenkonzentration, gesamte Ionenstärke und die Wahl des Anions gesteuert.
Die Erfindung gestattet auch die Bildung von Komplexen zwischen Merichinonen und polymeren Anionen. Kristalline Salze als Mittel der Bestimmung können nicht gut auf der Oberfläche fester Phasen haften, so daß das analytische Signal mechanisch labil ist und wichtige Strukturen in histochemischen und zytochemischen Analysen zerstören könnten. Komplexe zwischen Merichinon-Kationen und polymeren Anionen können dieses Problem lösen, wenn das polymere Anion an einer festen oder Gelphase adsorbiert, daran kovalent gebunden oder darin eingeschlossen ist. Die Bildung der immobilisierten Komplexionen zwischen Merichinon und polymorphen Anionen kann die Merichinon-Löslichkeit so wirksam vermindern wie die Salzbildung und eine dauerhaftere lokalisierte Farbe erzeugen. Außerdem können solche Polymere nicht kristallisieren und so nicht die Mikrostruktur in zytochemischen und histochemischen Anwendungen zerstören.
Die Ausfällung der Salze und die Immobilisierung der Komplexe gestattet auch eine Lokalisierung des analytischen Merichinon-Signals an der Oberfläche einer festen Phase oder in einer Gelphase, wobei in dramatischer Weise die Bestimmungsgrenzen von Fest- und Gelphasen-Assays erniedrigt werden, wodurch eine Steigerung der quantitativen Empfindlichkeit und der qualitativen Unterscheidungsfähigkeit gegenüber vorgängig offenbarten Analysen erreicht wird. Der Wert dieser Erfindung wird am meisten offensichtlich, wenn TMB als peroxidativer Elektronen-Donator verwendet wird. TMB ist wegen seiner vernachlässigbaren Karzinogenität und hohen Reaktionsgeschwindigkeit in einzigartiger Weise als Chromogen wertvoll, war jedoch bisher wegen der Schwierigkeit der Immobilisierung des Reaktionsprodukts von beschränktem Wert in Festphasen- und Gelphasenassays. Als Ergebnis dieser Erfindung kann die TMB- Färbung der peroxidativen Wirksamkeit auf Southern-, Western-, Northern-, Nukleinsäure-Hybridisierungsdot- und Immunodotblots und auf immunohistochemische und immunozytochemische Färbungen ausgedehnt werden, auf Analysen, bei denen die zusätzliche Empfindlichkeit des TMB (relativ zu anderen chromogenen Peroxidase-Substraten) zur Erniedrigung der Bestimmungsgrenzen besonders wertvoll ist. TMB-Färbungen von histochemischen Präparaten können nun mit größerer Dauerhaftigkeit und mit weniger durch Kristalle verursachte Artefakte ermöglicht werden, als es bisher ersichtlich war.
Schließlich gibt es eine steigende Verwendung von klinischen Diagnostika in "schnellen" immunodiagnostischen Testkombinationen, bei denen Immunreaktionen vorgenommen und in oder oberhalb einer Filtermembrane bestimmt werden, wobei überschüssige Reagenzien durch die Membrane gewaschen werden, um Reaktionen zu beenden und den analytischen Untergrund zu minimieren. Das Festhalten des Merichinons als kristallines Salz oder immobilisiertes Komplexion in oder auf der Membrane ist für diese Anwendung in idealer Weise geeignet.
Spezifisch betrifft die vorliegende Erfindung Materialzusammensetzungen, die für die Sichtbarmachung von biologischen Materialien geeignet sind, wobei die Zusammensetzungen einen immobilisierten oder gelösten Komplex eines polymeren Anions und des Merichinons von Benzidin oder einem substituierten Benzidin enthalten. In einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung Materialzusammensetzungen, die zur Sichtbarmachung von biologischen Materialien geeignet sind, wobei die Zusammensetzungen ein festes Salz des Merichinons von Benzidin oder einem substituierten Benzidin enthalten, worin das Anion des Salzes die konjugierte Base einer ungesättigten oder einer aromatischen organischen Säure ist.
Das Komplexion wird durch Bindung des Merichinons an ein polymeres Anion gebildet und hat eine Farbe, die für das Merichinon, das polymere Anion und das Molverhältnis von Merichinon zu polymerem Anion charakteristisch ist. Obwohl häufig in wäßrigen Lösungsmitteln löslich, kann das Komplexion amorphe unlösliche gefärbte Ablagerungen bilden, entweder durch Adsorption an einen weiten Bereich von festen oder suspendierten Materialien oder durch das Erreichen von ungefährer Äquivalenz zwischen positiven Merichinon-Ladungen und negativen Polymeranion-Ladungen. Spezifische Beispiele von polymeren Anionen umfassen Dextransulfat, Polyphosphat, Polyanetholsulfonat, Polyacrylat, Polymethacrylat und einen weiten Bereich von Ionenaustausch-Adsorbentien, die Zusammensetzung des Komplexions ist aber sehr variabel, wobei ein weiter Bereich von Polymerisationsgraden für das polymere Anion wie auch ein weiter Bereich von Molverhältnissen von Merichinon zu polymerem Anion möglich ist.
Das feste Salz wird durch Reaktion der ladungsäquivalenten Mengen des Merichinons und einem spezifischen Anion von begrenzter Größe und Ladung gebildet, hat eine Farbcharakteristik des Merichinons und des Anions, ist üblicherweise kristallin und hat üblicherweise eine Löslichkeit unter 10&supmin;³M, wenn es mit Wasser in Abwesenheit von überschüssigem Anion äquilibriert wird. Die spezifischen Anionen, die als Bestandteile solcher Salze beansprucht werden, umfassen Malat, Tartrat, Succinat, Malonat, Glutarat, Oxalat, Format, Pyrophosphat, Isocitrat, Ethylendinitrilotetraacetat, 1,2,3,4- Butantetracarboxylat, Fumarat, Maleat, Phthalat, Isophthalat, Terephthalat, Benzoat, Hemimellitat, Trimellitat, Trimesat, Pyromellitat, Mellitat und Mesaconat. Die spezifischen Anionen umfassen alle Anionen, die aromatische Gruppen oder ungesättigte Kohlenstoffketten enthalten. Zusätzlich kann das Anion Sulfat, Citrat, Nitrat und ein Halogenid (z. B. Chlorid, Bromid, Jodid, Fluorid) sein, wenn das substituierte Benzidin TMB ist.
In einem anderen Aspekt betrifft diese Erfindung eine feste Phase oder ein Gel, welche eine der oben beschriebenen Zusammensetzungen enthält.
Vorzugsweise ist das Benzidin-Derivat TMB. Ebenso wird das oxidierte Benzidin oder dessen Derivat vorzugsweise in Anwesenheit eines Peroxids und eines Katalysators gebildet, der eine Peroxidase, ein Hämoprotein oder ein proteinfreies Eisenporphyrin ist.
In einem Verwendungsaspekt betrifft die Erfindung analytische Verfahren, bei denen ein visuelles Signal erzeugt (und manchmal später verteilt) wird, indem man die wäßrige Löslichkeit des Merichinons des Benzidins oder eines substituierten Benzidins steuert. Die Steuerung wird vor allem durch Zusatz einer Menge eines polymerem Anions oder eines Anions erreicht, das für eine Löslichkeit des Merichinons von unter 10&submin;&sup5; M ausreichend ist, wodurch eine ausgefällte oder immobilisierte Ablagerung mit einer charakteristischen Farbe erzeugt wird. Ein breiterer Bereich von Anionen, als oben angegeben, ist für diese Aufgabe geeignet, wobei jedes eine charakteristische minimale wirksame Konzentration besitzt. Da die Löslichkeit durch die Temperatur, den pH, die Anionenkonzentration, die gesamte Ionenstärke und die Identität und Konzentration irgendeines organischen Co-Lösungsmittels, wie auch durch die Identität des Merichinons und Anions gesteuert wird, gibt es viele Wege, die gewünschte Löslichkeit zu erreichen, einschließlich von Wegen, die Ablagerung aufzulösen (z. B. durch Erniedrigung der Konzentration des ausfällenden Anions oder Steigerung der gesamten ionischen Stärke.
Vorzugsweise umfaßt das analytische Verfahren das Oxidieren von Benzidin oder eines substituierten Benzidins zum
Merichinon davon bei einem pH von etwa 3 bis 7 und in Anwesenheit einer wirksamen (ausfällenden oder immobilisierenden) Konzentration eines Anions oder polymeren Anions, eines Oxidationskatalysators und einer wirksamen Menge Oxidationsmittel, wobei ein festes Salz oder ein immobilisierter Komplex des genannten Anions oder polymeren Anions und des genannten Merichinons gebildet wird, der eine steuerbare Löslichkeit, wie oben angegeben, und eine charakteristische Farbe und feste Form besitzt. Der pH beträgt vorzugsweise 3.5 bis 4.5, wenn der Oxidationskatalysator Meerrettich-Peroxidase und das Benzidinderivat TMB sind, und die TMB-Konzentration ist vorzugsweise in der Nähe der Löslichkeitsgrenze für den spezifischen pH, d. h. sie ist innerhalb eines Faktors von zwei der Löslichkeitsgrenze von TMB.
Vorzugsweise ist der Oxidationskatalysator an eine Nukleinsäure gebunden, deren Sequenz komplementär zu einer DNA- Sequenz von Chromosom(en) eines Organismus ist oder an ein nicht-katalytisches Protein gebunden ist, wie einen Antikörper, ein Antigen, Avidin, Lectin oder staphylokokkales Protein A. Die Sichtbarmachung wird vorzugsweise auch erreicht auf einem Southernblot, einem Northernblot, einem DNA- oder RNA-Dotblot, einem Westernblot, einem Antigen- oder Antikörperdotblot, in einer immunodiagnostischen oder Nukleinsäureprobenassay-Vorrichtung, in einem Gel oder auf einem Papier- oder Plastikstreifen (z. B. bei der Elektrophorese, Chromatographie oder isoelektrischen Fokussierung verwendet), auf einer Nährstoffgelplatte, die Zellkolonien enthält, oder auf einem präparierten histologischen Schnitt oder einem zytologischen Abstrich.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Sichtbarmachung eines biologischen Materials, das in oder auf einer Testprobe enthalten ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einer festen Phase, einem Gel, einer gelösten oder suspendierten Mischung, die komplementären Antikörper und Antigen enthält, und einer gelösten oder suspendierten Mischung, die komplementäre einsträngige Nukleinsäuren enthält, welches Verfahren die Bildung des festen Salzes oder immobilisierten Komplexes des Merichinons mit einer steuerbaren Löslichkeit, wie oben angegeben, und die Beobachtung der erhaltenen gefärbten Ablagerung enthält.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Feststellung der Anwesenheit eines oder mehrerer Antigene oder Antikörper in einer flüssigen Testprobe, welches Verfahren umfaßt:
(a) Inkubieren der Testprobe oder eines Extrakts davon mit einer Oberfläche, um das Antigen oder den Antikörper festzuhalten, und mit einem mit Peroxidase-markierten Antikörper oder Antigen, welche mit dem zu bestimmenden Antigen oder Antikörper binden, wobei diese Inkubationen getrennt, in einer beliebigen Reihenfolge, oder zusammen stattfinden;
(b) Filtrieren der Inkubationsmischung von Schritt (a);
(c) Waschen des Filters von Schritt (b);
(d) Inkubieren des gewaschenen Produkts von Schritt (c) mit einem Benzidin oder substituierten Benzidin und einer wirksamen Konzentration eines wirksamen Anions oder polymeren Anions, um ein festes Salz oder einen immobilisierten Komplex mit dem Merichinon des genannten Benzidins oder substituierten Benzidins zu bilden;
(e) Filtrieren und Waschen des Inkubats von Schritt (d); und
(f) Bestimmung der Bildung des genannten festen Salzes oder immobilisierten Komplexes des genannten Anions oder polymeren Anions und des Merichinons des genannten Benzidins oder substituierten Benzidins, wobei die genannte Bildung die Anwesenheit des genannten Antikörpers oder Antigens anzeigt.
Die Inkubationen von Schritt (a) können zusammen oder getrennt in einer beliebigen Reihenfolge stattfinden.
Vorzugsweise ist die bindende Oberfläche eine Filtermembrane oder Kügelchen, die in der Testprobe oberhalb der Filtermembrane suspendiert sind und in der Lage sind, den Analyt festzuhalten. Vorzugsweise werden die Schritte (d) und (e) bei einer niedrigen ionischen Stärke und einem pH von 3.5-5.5 durchgeführt. Alternativ wird die Mischung nach Schritt (f) filtriert und bei einer hohen Ionenstärke gewaschen, um das Merichinon zu entfernen, ein mit Peroxidase-markierter Antikörper oder Antigen, das verschieden von demjenigen ist, das vorgängig in Schritt (a) verwendet wurde, wird mit der gewaschenen Mischung inkubiert, um eine verschiedene Region des Antigens oder Antikörpers oder ein verschiedenes Antigen oder Antikörper in der Testprobe festzustellen, die Mischung wird filtriert, gewaschen und mit Benzidin oder einem substituierten Benzidin und einem wirksamen Anion oder polymeren Anion inkubiert, die erhaltene Inkubationsmischung wird filtriert und gewaschen und die Bildung des Salzes oder Komplexes wird festgestellt. Wegen der möglichen Steuerung der Merichinon- Löslichkeit, die durch diese Erfindung eingeführt wurde, können wiederholte Untersuchungen einer Immunoassay-Testprobe mehrmals wiederholt werden.
Im Bereich dieser Erfindung liegen auch Testkombinationen, üblicherweise im Mehrfachbehälter-Format, zur Sichtbarmachung einer Nukleinsäure, eines Antigens oder Antikörpers in gewissen Analysenformaten, wobei die Testkombinationen Anweisungen enthalten, wie das Merichinon mit einem Anion oder polymeren Anion ausgefällt und immobilisiert wird, und das ausfällende Mittel enthalten kann. Die Testkombinationen können auch das Benzidin oder substituierte Benzidin und eine Nachweisverbindung umfassen, die spezifisch mit der Nukleinsäure, dem Antigen oder dem Antikörper in Wechselwirkung tritt (daran bindet), welche Nachweisverbindung entweder direkt durch ein beigefügtes Peroxidase-Enzym oder indirekt durch die Verwendung einer Verbindung bestimmt wird, die spezifisch mit der Nachweisverbindung reagiert und zu einer Peroxidase konjugiert ist. Eine immunodiagnostische Testkombination kann auch eine Filtermembrane, anionische Latexkügelchen, einen anionischen Teststreifen oder einen Inkubationspuffer umfassen, der ein Anion oder ein polymeres Anion enthält, welches das Merichinon des Benzidins oder substituierten Benzidins ausfällt. Falls der feste Träger anionisch ist, braucht der Puffer kein ausfällendes Mittel enthalten.
Die Merichinone sind im allgemeinen stärker gefärbt als die Benzidine, die üblicherweise als Reagentien in peroxidativen Umwandlungen benützt werden, die durch Peroxidaseenzyme und durch verschiedene Häme-Proteine oder proteinfreie Häme katalysiert werden. Deshalb weist die Merichinon-Bildung in Anwesenheit eines Peroxids auf die gleichzeitige Anwesenheit einer Peroxidase oder Häme-enthaltenden Verbindung hin, vorausgesetzt, daß eine nicht-enzymatische Katalyse durch gewisse Übergangsmetallionen vermieden wird. Alternativ weist die Merichinon-Bildung in Gegenwart einer Peroxidase, einer Häme-Verbindung oder gewisser Übergangsmetallionen auf die gleichzeitige Anwesenheit eines Peroxids hin.
Bei Anwendungen, bei denen die Abwesenheit von Peroxidase-Enzymen und Hämen sichergestellt ist, kann die Merichinon-Bildung in Gegenwart eines Benzidins und eines Peroxids verwendet werden, um die Anwesenheit gewisser Übergangsmetallionen mit Oxidations-Reduktions-Aktivität festzustellen, hauptsächlich die Ionen von Eisen, Kobalt, Nickel, Mangan, Chrom, Kupfer, Molybdän, Rhodium, Ruthenium, Platin und Palladium. Zusätzlich sind Testkombinationen zur Bestimmung von Hämoglobin oder Hämen im Umfang der Erfindung eingeschlossen. Analysen von Peroxiden und Häm-Proteinen (insbesondere Hämoglobin von Blut) besitzen offensichtlichen Wert in der Chemie, Biologie, Medizin und der forensischen Wissenschaft. Peroxidasen sind weniger häufig Gegenstand von direkten Untersuchungen, als Hilfsmittel bei der sehr empfindlichen Analyse irgendeiner anderen Verbindung, für die ein Bindungsassay entwickelt werden kann, oder der Analyse von topologischen Beziehungen in Kompartiment-Systemen, wie Geweben, bei denen auf die Injektion von Peroxidase in einen Teil eines Kompartiments dessen Diffusion in alle Teile des Kompartiments, aber nicht in benachbarte Kompartimente erfolgt.
Fig. 1 stellt die gekuppelte Oxidation, die Ladungstransfer-Komplexbildung, die Konjugation und die Salzausfällungsreaktionen dar, die auftreten, wenn Benzidin oder ein substituiertes Benzidin, wie TMB, in Anwesenheit eines ausfällenden Anions oxidiert wird. Es wird eine diprotische Puffersäure zugrundegelegt, deren Dianion ein unlösliches Salz mit dem Merichinon bildet. Ähnliche Netzwerke können für Puffersäuren und ausfällende Anionen mit verschiedenen Stöchiometrien erhalten werden.
Fig. 2 stellt die log. Merichinon-Löslichkeit gegen die log. Anionen-Konzentration für sieben ausfällende Anionen und das TMB-Merichinon dar. Die Stöchiometrien der Merichinonsalze können aus den Steigungen dieser Kurven ersehen werden. In der Fig. steht A für Fumarat, B für Maleat, C für Oxalat, D für Succinat, E für Sulfat, F für Pyrophosphat und G für Citrat.
Fig. 3 stellt ein Westernblot dar, enthaltend TMB und Diaminobenzidin (DAB) als Substrate zur Sichtbarmachung von HRP-markiertem Antikörper gegen p21-ras-Protein.
Wie es hierin verwendet wird, bedeutet "substituiertes Benzidin" eine Verbindung der allgemeinen Formel:
in der R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; unabhängig voneinander die folgenden Gruppen bedeuten: H-, CH&sub3;-, NH&sub2;-, CH&sub3;O-, CH&sub3;(CH&sub2;)n-, CH&sub3;(CH&sub2;)n-O-, CN-, NO&sub2;-, F-, Cl-, Br- oder J-, worin n eine ganze Zahl von 1 bis 10, vorzugsweise 1 oder 2, bedeutet und worin R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; nicht alle für H- stehen. (In der Stammverbindung, Benzidin, sind R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; alle gleich H-.) Repräsentative Derivate umfassen die folgenden: 3,3',5,5'- Tetramethylbenzidin oder TMB, (R&sub1; ist H- und R&sub2; und R&sub3; sind CH&sub3;-), o-Dianisidin (R&sub1; und R&sub2; sind H- und R&sub3; ist CH&sub3;O-), o- Tolidin (R&sub1; und R&sub2; sind H- und R&sub3; ist CH&sub3;-) und Diaminobenzidin (R&sub1; und R&sub2; sind H- und R&sub3; ist NH&sub2;-). Vorzugsweise sind R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; unabhängig voneinander ausgewählt aus H-, CH&sub3;-, CH&sub3;O- und NH&sub2;-, und am meisten bevorzugt ist R&sub1; gleich H- und R&sub2; und R&sub3; sind gleich CH&sub3;-.
Wie es hierin verwendet wird, bedeutet "Chinondiimin" von Benzidin oder substituiertem Benzidin eine Verbindung mit einer der allgemeinen Formeln:
in der R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; die oben angegebene Bedeutung haben und R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; alle gleich H- (falls Benzidin) sein können. Falls R&sub1; gleich H- ist, hat das Molekül bei pH-Werten über den pKa-Werten einer oder beider Iminiumgruppen ein oder zwei Protonen von den Stickstoffatomen verloren und besitzt eine Nettoladung von +1 bzw. 0.
Wie es hierin verwendet wird, bedeutet "Merichinon" von Benzidin oder substituiertem Benzidin ein Molekül mit einem Oxidationsstatus in der Mitte zwischen demjenigen des Benzidins und dessen Chinondiimin und bestehend aus einem 1 : 1 nicht-kovalenten Ladungstransfer-Komplex zwischen dem Benzidin oder substituierten Benzidin und dessen Chinondiimin. Ohne auf einer bestimmten Theorie zu beharren, wird angenommen, daß, im Hinblick auf die hierin festgestellten Daten, welche die Bildung von kristallinen Salzen mit definierten Zusammensetzungen mit einem weiten Bereich von Anionen zeigen, das Merichinon im pH-Bereich von 3-7 hauptsächlich als ein Dikation existiert. Die Gleichgewichtskonstante für die Bildung dieses Komplexes ist normalerweise so günstig, daß das meiste durch Oxidation von Benzidin oder einem substituierten Benzidin gebildete Chinondiimin unmittelbar das Merichinon bildet, solange nicht-umgesetzte Stammverbindung vorhanden ist.
Wie es hierin verwendet wird, bedeutet "Peroxid" eine Verbindung, welche die Peroxid-(-O-O-)-Gruppe, und vorzugsweise eine Verbindung, welche die Hydroperoxid-(-O-O-H)- Gruppe enthält. Beispiele von Peroxiden umfassen z. B. Wasserstoffperoxid, Methylperoxid, Ethylperoxid, Isopropylperoxid, tert.Butylperoxid, substituierte Cumenperoxide, Harnstoffhydrogenperoxid und Peroxysäuren.
Wie es hierin verwendet wird, bedeutet "Oxidation" die Abstraktion von einem oder zwei Elektronen von Benzidin oder einem substituierten Benzidin unter Bildung eines Merichinons oder Chinondiimins. Vorzugsweise verwendet die Oxidation hierin ein Peroxid-Oxidationsmittel.
Wie es hierin verwendet wird, bedeutet "Oxidationskatalysator" eine Verbindung, welche die Oxidationsgeschwindigkeit von Benzidin oder einem substituierten Benzidin zum Merichinon oder Chinondiimin steigert.
Wie es hierin verwendet wird, bedeutet "peroxidativer Katalysator" einen Oxidationskatalysator, der die Reduktion eines Peroxids zum entsprechenden Alkohol (oder Wasser, falls das Oxidationsmittel Wasserstoffperoxid ist) durch einen Wasserstoff-Donator, wie einen Alkohol oder ein Amin, katalysiert. Unterklassen von peroxidativen Katalysatoren umfassen aquakomplexierte oder in anderer Weise komplexierte Übergangsmetallionen, die gegen Elektronentransfer reaktiv sind (z. B. Kupfer, Eisen, Kobalt, Mangan), Häme, Hämoproteine und spezifische als Peroxidasen bekannte Enzyme. Eine Unterklasse von Peroxidasen, die "Haloperoxidasen", verwenden ein Halogenidion als Cofaktor. Die am häufigsten verwendete Peroxidase sind gereinigte Meerrettich-Wurzeln.
Wie es hierin verwendet wird, bedeutet (< Löslichkeit" die Konzentration einer Verbindung in Lösung, wenn sie im Gleichgewicht mit einer die gleiche Verbindung enthaltenden festen Phase ist. Falls die Verbindung ein kationisches Merichinon (oder irgendein Ion) ist, sollte die feste Phase ein Gegenion von gegensätzlicher Ladung in ausreichender Menge enthalten, um die kationische Ladung genau auszugleichen, und die Löslichkeit der Verbindung variiert umgekehrt in bezug auf die Gegenionenkonzentration in Lösung und (in den meisten Fällen) direkt in bezug auf die Temperatur und die Ionenstärke, die durch schwach ausfällende Elektrolyten beigesteuert werden.
Wie es hierin verwendet wird, wird "steuerbar" verwendet, um Eigenschaften der Merichinon-enthaltenden festen Phase, wie die Löslichkeit, Farbe, Kristallinität und Kristallgröße, zu beschreiben, die in einfacher Weise durch Steuerung der Bedingungen ausgewählt werden können, unter denen das Merichinon in der festen Phase abgelagert wird. Zum Beispiel wird die Löslichkeit des Merichinonsalzes durch die chemische Identität des Anions, die Anionenkonzentration, den pH-Wert, die Temperatur und die gesamte Ionenstärke des Mediums gesteuert. Die Kristallinität und die Farbe werden durch die chemische Identität des Anions bestimmt. Die Kristallgröße kann durch die chemische Identität des Anions, die Temperatur, die Anionenkonzentration und die Geschwindigkeit gesteuert werden, mit der Merichinon durch Oxidation des Benzidins oder eines substituierten Benzidins erzeugt wird.
Wie es hierin verwendet wird, bedeutet "biologisches Material" eine Substanz oder Struktur, die in einem lebenden oder toten biologischen Organismus vorhanden oder daraus extrahiert ist. Beispiele biologischer Materialien umfassen Proteine, spezifische Regionen innerhalb von Proteinen, Nukleinsäuren, spezifische Nukleinsäure-Sequenzen, Kohlenhydrate, subzellulare Strukturen, Zellen und Gewebe.
Wie es hierin verwendet wird, bedeutet "Sichtbarmachen" und "Sichtbarmachung" die Bestimmung des biologischen Materials oder Identifizierung oder Charakterisierung mindestens eines Teils oder einer Region des biologischen Materials, wobei das letztere beispielhaft für einen normalen nicht mit einer Krankheit verbundenen genetischen Polymorphismus ist.
Wie es hierin verwendet wird, bedeutet "Testprobe" eine feste Phase, wie ein Polymer, ein Gel, ein histologischer Schnitt oder ein zytologischer Abstrich oder eine flüssige Phase, einschließlich gelöster und suspendierter Mischungen, wie sie in einem Immunoassay oder einem anderen diagnostischen Assay untersucht werden.
Wie es hierin verwendet wird, bedeutet "polymeres Anion" ein Polymer, das eine negative Ionenladung besitzt. Beispiele umfassen Polyacrylat, Polymethacrylat, Dextransulfat, sulfatierte Glykosaminoglykane, Polyglutamat, Polyaspartat, Carboxymethylcellulose, -dextran oder -agarose, Sulfoethyl- oder Sulfopropylcellulose, -dextran oder -agarose, Polyphosphat, Polyanetholsulfonat oder irgendein anderes geeignetes negativ geladenes Polymer.
Wie es hierin verwendet wird, bedeutet "wirksame Menge eines wirksamen Anions oder polymeren Anions" die Menge eines geeigneten Anions oder polymeren Anions, das zur Bildung eines festen Salzes oder eines immobilisierten Komplexes des Anions oder polymeren Anions mit dem Merichinon von Benzidin oder dem substituierten Benzidin führt, welches auch im Verfahren verwendet wird, wobei das Salz oder der immobilisierte Komplex eine Merichinon-Löslichkeit unter 10&supmin;&sup5; M besitzt.
Wie es hierin verwendet wird, bedeutet "tag"[Etikett] einen markierenden Rest, der in der Lage ist, ein radioaktives, Elektronen-opakes, gefärbtes oder fluoreszierendes Material zu erzeugen oder dies enthält und durch starke Bindung mit dem betreffenden Probenprotein oder der Nukleinsäure oder einem anderen Molekül verbunden ist, das in der gleichen Weise an die Probe bindet. Ein Beispiel ist ein Enzym, wie Peroxidase, das mit einem Substrat reagiert, um ein feststellbares Produkt zu bilden und kovalent an einen Antikörper oder an Streptavidin gebunden ist.
Wie es hierin verwendet wird, bedeutet "bestimmende Verbindung" jede Verbindung, die spezifisch an ein biologisches Material bindet. Zum Beispiel, wenn das biologische Material ein Antikörper ist, kann die bestimmende Verbindung ein Antigen sein, das ein Epitop enthält, das spezifisch an den Antikörper bindet. Falls das biologische Material eine Nukleinsäure ist, kann die bestimmende Verbindung ein komplementärer Strang der Nukleinsäure sein, der in der Lage ist, daran zu hybridisieren.
Wie es hierin verwendet wird, bedeutet "Westernblot" ein analytisches Verfahren, bei dem (a) eine Mischung, die ein Antigen enthält, durch Gelelektrophorese oder isoelektrische Fokussierung getrennt wird, (b) die getrennten Komponenten auf Papier, Glasfaser oder Plastikblättchen übergeführt und darauf immobilisiert werden und (c) die Positionen und Identitäten der Komponenten durch verschiedene Methoden bestimmt werden, die sichtbare Signale erzeugen können, einschließlich Bindung an einen mit einem tag versehenen Antikörper, der für das betreffende Antigen spezifisch ist, oder für einen anderen Antikörper, der für das betreffende Antigen spezifisch ist. Dieser Ausdruck wird auch so benützt, daß er Analysen deckt, bei denen (a) eine Mischung, die Proteine enthält, die irgendeine Art von Rest tragen, der von einem bindenden Protein erkannt wird, einer Elektrophorese oder isoelektrischen Fokussierung unterworfen wird, (b) ein Blot des Trennungsmuster hergestellt wird und (c) der Blot durch Einwirkenlassen des bindenden Proteins, das direkt oder indirekt am tag gebunden ist, sichtbar gemacht wird.
Wie es hierin verwendet wird, bedeutet "Southernblot" ein analytisches Verfahren, bei dem (a) eine Mischung, die verschiedene RNA-Stücke enthält, durch Gelelektrophorese getrennt wird, (b) die aufgetrennten DNA-Moleküle in einer Einzelstrangform auf Papier, Glasfaser oder Plastikblättchen übergeführt und darauf immobilisiert werden und (c) die Positionen und Identitäten der Komponenten durch verschiedene Methoden bestimmt werden, die sichtbare Signale erzeugen können, einschließlich Basenpaar-Hybridisierung zu einer mit einem tag versehenen Polynukleotid-Basensequenzprobe, die mindestens teilweise komplementär zu der interessierenden Zielsequenz ist. Die Probe kann direkt oder indirekt mit einem tag versehen sein; im letzteren Fall ist das tag an ein anderes Molekül angehängt, das fest mit der Probe bindet.
Wie es hierin verwendet wird, bedeutet "Northernblot" ein analytisches Verfahren, bei dem (a) eine Mischung, die verschiedene RNA-Stücke enthält, durch Gelelektrophorese getrennt wird, (b) die aufgetrennten RNA-Moleküle in einer Einzelstrangform auf Papier, Glasfaser oder Plastikblättchen übergeführt und darauf immobilisiert werden und (c) die Position und Identitäten der Komponenten durch verschiedene Methoden bestimmt werden, die sichtbare Signale erzeugen können, einschließlich Basen-gepaarte Hybridisierung zu einer mit einem tag versehenen Polynukleotid-Basensequenzprobe, die mindestens teilweise komplementär zu der interessierenden Zielsequenz ist. Die Probe kann direkt oder indirekt an ein tag gebunden sein, wie bei Southernblots.
Wie es hierin verwendet wird, bedeutet "Immunodotblot" ein analytisches Verfahren, bei dem ein Antigen in einer Mischung auf der Oberfläche eines Papier-, Glasfaser- oder Plastikblättchens immobilisiert wird und die Anwesenheit des Antigens durch verschiedene Methoden bestimmt werden, die sichtbare Signale erzeugen können, einschließlich Bindung an einen direkt oder indirekt mit einem tag versehenen spezifischen Antikörper. Alternativ kann die Mischung einen Antikörper enthalten, der mit einem direkt oder indirekt mit einem tag versehenen Antigen identifiziert wird.
Wie es hierin verwendet wird, bedeutet "Nukleinsäure- Hybridisierungsdotblot" ein analytisches Verfahren, bei dem eine Nukleinsäure in einer Mischung in einer Einzelstrangform auf der Oberfläche eines Papier-, Glasfaser- oder Plastikblättchens immobilisiert wird und die Anwesenheit der Nukleinsäure durch verschiedene Methoden bestimmt werden, die sichtbare Signale erzeugen können, einschließlich Basengepaarte Hybridisierung zu einer direkt oder indirekt mit einem tag versehenen Polynukleotid-Basensequenzprobe, die mindestens teilweise komplementär zu der interessierenden Zielsequenz ist.
Wie es hierin verwendet wird, bedeutet "Enzymimmunoassay" (EIA), auch als "Enzymimmunosorbentassay" (ELISA) ein analytisches Verfahren, bei dem ein Antigen oder ein Antikörper in einer Mischung via deren Bindung an einen komplementären Antikörper oder Antigen bestimmt wird, die in irgendeiner Weise auf einem festen Träger oder suspendierten Teilchen immobilisiert sind, derart daß die Bindung ein proportionelles enzymatisch erzeugtes Signal erzeugt, das sich entweder am Träger befindet oder in das flüssige Medium freigesetzt wird, das von Träger oder den Teilchen abgetrennt werden kann. Es gibt viele Wege, wie das Signal mit dem Bindungsereignis gekoppelt werden kann. Bei einer "Sandwich"-Methode für Antigene, wird das Antigen von der Mischung durch ein unspezifisches Adsorbens extrahiert oder an einen spezifischen "Capture"[Fänger]- Antikörper gebunden, der mit der festen Phase oder den suspendierten Teilchen verbunden ist, und der spezifische Proben-Antikörper wird an das immobilisierte Antigen gebunden. Der Proben-Antikörper kann zu Enzym konjugiert sein oder kann durch ein Molekül bestimmt werden, das an den Proben-Antikörper bindet und direkt oder indirekt mit dem Enzym verbunden ist. Bei der "Sandwich"-Methode für Antikörper wird der Antikörper aus der Mischung durch Bindung an Antigen entfernt, das mit der festen Phase oder den suspendierten Teilchen verbunden ist, und danach an ein Proben-Molekül bindet, wie einen anderen Antikörper oder Staphylococcus aureus Protein A, das an gewisse Immunoglobuline bindet. Die Probe kann mit dem Enzym konjugiert werden oder kann durch ein Molekül bestimmt werden, das mit der Probe bindet und direkt oder indirekt mit dem Enzym verbunden ist.
Wie es hierin verwendet wird, bedeutet "Immunohistochemische Färbung" ein analytisches Verfahren, bei dem eine dünne Scheibe eines biologischen Gewebes (ein "histologischer Schnitt") an einem Glasobjektträger haftet und einer Antikörperprobe ausgesetzt wird, die für das Antigen spezifisch ist, das im Gewebe vorhanden sein könnte. Die Anwesenheit, der Ort und die ungefähre Menge des Antigens kann durch das Mikroskop bestimmt werden, nach der Bestimmung des gebundenen Antikörpers via einen direkt gekuppelten tag oder Einwirkenlassen eines anderen Moleküls, das mit dem Antikörper bindet und an das ein tag gekuppelt worden ist.
Wie es hierin verwendet wird, bedeutet "Immunozytochemische Färbung" ein analytisches Verfahren, bei dem eine Zellsuspension (z. B. von Blut oder von einer Zellkultur) auf einem Glasobjektträger aufgetragen (um einen "zytochemischen Abstrich" zu bilden) und darauf eine Antikörper- oder Antigen-Probe einwirken gelassen wird, die für ein Antigen oder einen Antikörper spezifisch sind, welche die Zellen mitführen könnten. Die Anwesenheit, die Verteilung und die ungefähre Menge des Antigens oder Antikörpers kann durch das Mikroskop bestimmt werden, nach der Bestimmung des gebundenen Antikörpers oder Antigens via einen direkt gekuppelten tag oder Einwirkenlassen eines anderen Moleküls, das mit dem zugesetzten Antikörper oder Antigen bindet und an das ein tag gekuppelt worden ist.
Gelegentlich wird die histochemische oder zytochemische Färbung für eine endogene peroxidative oder oxidative katalytische Aktivität durchgeführt, indem man auf histologische Schnitte oder zytologische Abstriche direkt Benzidin oder ein substituiertes Benzidin einwirken läßt, mit oder ohne zugesetztem Peroxid, aber ohne Vermittlung einer immunologischen Reaktion. Zusätzlich beginnt man, die mit einem Enzymtag versehene Nukleinsäure-Hybridisierung zu verwenden, um spezifisches genetisches Material in Zellen oder subzellularen Fraktionen zu identifizieren, die mikroskopisch untersucht werden. Alle diese Methoden werden durch die Ausdrücke "histochemische Färbung" und "zytochemische Färbung" umfaßt.
Die vorliegende Erfindung wird durch die gesteuerte Bildung eines festen Salzes des Merichinons von Benzidin oder einem substituierten Benzidin realisiert, das eine Löslichkeit von weniger als etwa 10&supmin;&sup5; M in bezug auf Merichinon besitzt. Falls ein polymeres Anion vorhanden ist, kann das Merichinon in einem gelösten oder immobilisierten Komplex oder einem festen Salz des polymeren Anions vorhanden sein. Das Salz oder der Komplex wird durch Umsetzung des Benzidins oder substituierten Benzidins in wäßriger Lösung bei einem pH von 3-7 mit einem Oxidationsmittel in Gegenwart eines Oxidationskatalysators und einem Anion gebildet, das so gewählt wird, daß das Salz oder der Komplex die gewünschte Löslichkeit, Farbe, Kristallinität oder Kristallgröße besitzt. Das ausgefällte oder immobilisierte Salz oder der Komplex können verwendet werden, um den Ort der oxidativen katalytischen Aktivität auf einer festen Phase oder in einem Gel anzuzeigen und dabei die Sichtbarmachung eines biologischen Materials wie oben definiert durch Farbbildung am Feststoff oder im Gel zu ermöglichen. Alternativ kann die Immobilisierung des Salzes oder Komplexes durch einfache Trennung des Merichinons von den überschüssigen Reagentien erleichtert werden.
Das Benzidin oder substituierte Benzidin kann irgendeines der oben definierten sein. Am meisten bevorzugt hierin ist das Benzidin TMB, weil karzinogene und mutagene Aktivität klar fehlt und es durch Meerrettich-Peroxidase umgewandelt wird, dem bevorzugten Oxidationskatalysator für die meisten Anwendungen, mit einer sehr hohen katalytischen Geschwindigkeit und einer sehr geringen Geschwindigkeit der Enzymzerstörung. Falls die Niederschläge der Merichinone von Benzidinen, die von TMB verschieden sind, anders gefärbt sind als derjenige von TMB können jedoch Spezifitätsdoppelprüfungen in Festphasenassays möglich sein, wobei eine Probe mit TMB entwickelt wird, bis das Enzym inaktiviert ist, und eine andere Probe wird dann einem anderen Benzidin-Substrat unterworfen und entwickelt.
Es wird angenommen, daß die Struktur des festen Salzes des Merichinons durch eine der folgenden Formeln dargestellt werden kann, jedoch ohne Begrenzung auf irgendeine besondere Theorie: MA&sub2;, MA, M&sub3;A&sub2; oder M&sub2;A, worin A das Anion und M das Merichinon sind.
Polymere Komplexionen zeigen im allgemeinen keine derartigen stöchiometrischen Begrenzungen, außer daß die positive Ladung, die durch das Merichinon geliefert wird, nicht signifikant größer ist (und üblicherweise viel geringer ist) als die negative Ladung des polymeren Anions.
Das Anion ist üblicherweise Teil des Puffers, kann sich aber auf der festen Phase befinden, wie wenn (a) eine Membrane oder eine andere feste Phase mit einem polymeren Anion behandelt wird, das vor Beginn der Oxidationsreaktion damit bindet, oder (b) die feste Phase ein Kationenaustauschpolymer ist. Das monomere Anion muß in Wasser löslich sein und das polymere Anion kann wasserlöslich oder unlöslich sein. Im allgemeinen kann das monomere Anion irgendein Anion sein, das ein Merichinonsalz mit einer Löslichkeit von weniger als 10&supmin;&sup5; M bildet. Spezifische monomere Anionen innerhalb dieser Klasse umfassen Malat, Pyrophosphat, Maleat, Fumarat, Format, Oxalat, Succinat, Isocitrat, Tartrat, Phthalat, Isophthalat, Terephthalat, Benzoat, Hemimellitat, Trimellitat, Trimesat, Pyromellitat, Mellitat, Mesaconat, Ethylendinitrilotetraacetat, 1,2,3,4-Butantetracarboxylat, Malonat, Glutarat und irgendwelche andere Anionen, welche die Löslichkeitsdefinition erfüllen. Sulfat, Citrat, Nitrat oder ein Halogenid kann ebenfalls verwendet werden, wenn TMB das substituierte Benzidin ist. Vorzugsweise ist das Anion ein Dianion oder Tetraanion. Ebenfalls bevorzugt sind Anionen, die konjugierte Basen von ungesättigten oder aromatischen organischen Säuren sind. Eine ungesättigte organische Säure ist eine Carbonsäure, die mindestens eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung enthält und Kohlenstoff-, Sauerstoff- und Wasserstoffatome enthält, gegebenenfalls mit Stickstoff- und/oder Schwefelatomen. Eine aromatische organische Säure ist eine Carbonsäure, die mindestens Kohlenstoff-, Wasserstoff- und Sauerstoffatome enthält und mindestens eine Arylgruppe enthält.
Es wird festgehalten, daß die Löslichkeit des Merichinons im Salz hauptsächlich von der Anionenstruktur (Ladung, Größe und Gestalt), der Anionenkonzentration und der gesamten Ionenstärke des Mediums abhängt. Zum Beispiel sind in vielen Fällen Monoanionen, wie Acetat, Format und Dihydrogenphosphat viel weniger wirksame Ausfällungsmittel der Salze, als Di-, Tri- oder Tetraanionen, wie Oxalat, Succinat, Sulfat, Citrat, Pyrophosphat und Fumarat. Die Auswahl eines Anions, das wirksam ist, hängt von dessen endgültiger Verwendung ab: der gewünschten Löslichkeit, der gewünschten Farbe und Kristallinität. Bevorzugte wirksame Anionen für niedrigste Löslichkeitswerte sind Maleat, Sulfat (nur für TMB), Pyrophosphat, Oxalat, Succinat, Glutarat, Fumarat, Benzoat, Hemimellitat, Trimellitat, Trimesat, Pyromellitat, Mellitat, Mesaconat, Phthalat, Isophthalat und Terephthalat, und am meisten bevorzugt hinsichtlich der Wirksamkeit bei der Ausfällung sind die planaren Anionen, wie Oxalat, Maleat, Fumarat, Phthalat, Isophthalat, Terephthalat, Benzoat, Hemimellitat, Trimellitat, Trimesat, Pyromellitat, Mellitat und Mesaconat.
Das Anion hierin kann auch ein anionisches Detergens sein, das nicht-kovalent an den festen Träger gebunden ist, wie Laurylsulfat, Taurocholat oder Taurodesoxycholat. Zusätzlich kann das Anion ein polymeres Anion sein, wie oben definiert. Bevorzugt unter solchen polymeren Anionen sind Polyacrylat, Polymethacrylat, Polyphosphat, Polyanetholsulfonat und Dextransulfat. Ein polymeres Anion, wie Dextransulfat kann mit einem monomeren Anion, wie Fumarat, kombiniert werden.
Falls das Anion, an welches das Merichinon bindet, nicht selbst ein wirksamer Chelatbildner von Übergangsmetallionen ist und der in Aussicht genommene Oxidationskatalysator nicht ein aquakomplexiertes oder in anderer Weise komplexiertes (nicht-Häm) Übergangsmetall ist, ist es bevorzugt, in das Reaktionsmedium eine wirksame Menge eines geeigneten Chelatbildners, wie zum Beispiel EDTA, o-Phenanthrolin, Biphenyl oder dergleichen, zuzusetzen, um die konkurrierende Katalyse durch Spuren-Übergangsmetallionen (insbesondere Eisen, Kupfer, Kobalt, Nickel und Mangan) zu blockieren, die als Verunreinigungen vorhanden sein könnten. Alternativ, aber weniger zweckmäßig werden alle oder die meisten Komponenten des Reaktionssystems einem immobilisierten Chelatbildungsmittel unterworfen, wie Chelex 100, einem Harz, das von Bio-Rad Laboratories geliefert wird, entweder durch chargenweises Mischen und Filtrieren oder Dekantieren oder durch Passage durch ein Bett des immobilisierten Chelatbildungsmittels.
In ihrer allgemeinsten Form basiert die vorliegende Erfindung auf der Fähigkeit von Benzidin und substituierten Benzidinen als Elektronendonatoren für die oxidativen Reaktionen zu wirken, wobei das Oxidationsmittel irgendein Elektronenakzeptor, einschließlich, zum Beispiel, Sauerstoff oder Peroxid, in Anwesenheit eines oxidativen Katalysators sein kann. Das Benzidin oder substituierte Benzidin kann verwendet werden, um derartige oxidative Aktivitäten durch das Aufscheinen einer Farbe zu lokalisieren und zu quantifizieren, wenn das Benzidin dem Katalysator in Anwesenheit von Sauerstoff oder Peroxid angeboten wird. Vorzugsweise ist der Elektronenakzeptor ein Peroxid. Das Peroxid kann zugesetzt oder durch eine getrennte Oxidationsreaktion erzeugt werden, wobei Sauerstoffals Oxidationsmittel und ein Oxidaseenzym als Katalysator verwendet werden. In diesem Fall wird die Ausfällung oder Immobilisierung der Merichinonsalze oder -komplexe, welche eine leicht sichtbare Farbe besitzen verwendet, um die lokalisierte Anwesenheit von peroxidativer Aktivität anzuzeigen oder die Peroxide zu lokalisieren ,oder zu quantifizieren, entweder als Analyte oder, im Falle von Wasserstoffperoxid, als Katalyseprodukte gewisser Oxidaseenzyme.
Das Peroxid für diesen Zweck kann sein, ist aber nicht beschränkt darauf- Wasserstoffperoxid, irgendein Alkyl- oder Arylperoxid, wie zum Beispiel Methyl-, Ethyl-, t-Butyl- und Cumenperoxid, Harnstoffhydrogenperoxid und dergleichen. Vorzugsweise ist das Peroxid Wasserstoffperoxid, ein C&sub1;-C&sub1;&sub0;- Alkylperoxid, Cumenperoxid oder Harnstoffhydrogenperoxid, am meisten bevorzugt Wasserstoffperoxid, Methyl-, Ethyl- oder t- Butylperoxid oder Harnstoffhydrogenperoxid.
Falls Peroxid das Oxidationsmittel ist, katalysiert der Oxidationskatalysator spezifisch die Reaktion des Benzidins oder substituierten Benzidins mit dem Peroxid. Vorzugsweise ist der Katalysator eine Peroxidase, wie Meerrettich- oder Rüben-Peroxidase, ein Hämoprotein, wie Hämoglobin oder ein proteinfreies Eisenporphyrin. Am meisten bevorzugt ist der Katalysator Meerrettich-Peroxidase. Der genaue Katalysatortyp wird ausgewählt auf Basis der endgültigen Verwendung, bei der das Merichinon eingesetzt wird. Wenn zum Beispiel der Katalysator ein Hämoprotein oder davon abgeleitetes Eisenporphyrin ist, wird die Erfindung vorzugsweise verwendet, die Anwesenheit von Blut in irgendeiner Körperflüssigkeit, wie Urin, in Stuhlmaterial oder in einer forensischen Probe, anzuzeigen, oder um das Vorhandensein von Hämolyse in Blut (via die Anwesenheit von Hämoglobin im zellfreien Plasma oder Serum) aufzuzeigen. Bei einer derartigen Verwendung ist das Häm oder Hämoprotein im allgemeinen frei in Lösung und das Peroxid und Benzidin oder substituierte Benzidin werden adsorbiert oder aufgesogen in einer festen Phase oder einem Gel, auf welche die Lösung angewendet wird.
Falls der Katalysator ein Peroxidaseenzym ist, wird er vorzugsweise verwendet, um einen Analyt festzustellen. Beispiele solcher Analysen umfassen Westernblots, Southernblots (wobei zum Beispiel die Membrane mit Dextransulfat behandelt wird, welche das blaue Merichinonprodukt auf der Membrane abfängt), Northernblots, Nukleinsäure-Hybridisierungsblots, Immunodotblots, Immunohistochemische Färbung, Immunozytochemische Färbung, EIAs (in Lösung oder Suspension), und dergleichen. Obwohl die Peroxidase (oder ein anderer Oxidationskatalysator) wie bei der Immobilisierung innerhalb der oder durch Injektion in Organismen oder Zellen an der Stelle, wo die Farbentwicklung gewünscht wird, zur Verfügung gestellt werden kann, ist sie vorzugsweise getrennt, direkt oder indirekt, an ein anderes Molekül gebunden, das spezifisch mit dem zu bestimmenden spezifischen Analyt bindet. In einer speziellen Anwendung werden Oxidase- und Peroxidase-Enzyme an getrennte Moleküle gekuppelt, die direkt oder indirekt an den Analyten binden. Dieser letztere Aufbau vermindert den Untergrund in den Analyt-Bindungsassays, da ein Signal nur auftritt, wenn der Analyt in genügender Dichte lokalisiert wird, um die Katalysatoren in enger Nachbarschaft zu immobilisieren. Zufällige nicht-spezifische Bindung von getrennten Oxidase- oder Peroxidase-Konjugaten an das Gel oder die feste Oberfläche erzeugt kein Wasserstoffperoxid in der Nähe eines Peroxidase-Moleküls und das Peroxid wird in das Medium diffundieren, weg vom Gel oder dem festen Träger, bevor es eine Chance hat, ein Benzidin oder substituiertes Benzidin zum gefärbten Merichinon zu oxidieren.
Beispiele von Molekülen, die verwendet werden können, um an den Analyt zu binden, umfassen Nukleinsäuren und nichtkatalytische Proteine. Die Nukleinsäuren sind vorzugsweise DNA oder RNA, die eine Nukleotidsequenz enthalten, die komplementär zu einer Codon- oder Anticodon-Sequenz von Chromosom(en) eines Organismus ist, vorzugsweise einem lebenden Organismus, derart daß Hybridisierung stattfinden kann. Beispiele von Organismen, deren Sequenzen bestimmt werden sollen, umfassen Viren, Rickettsiale, Bakterien und Eukaryoten.
Beispiele von nicht-katalytischen Proteinen, die an die Peroxidase gebunden werden können, umfassen Antikörper, Antigene, Hormon-bindende Proteine, Avidin (einschließlich Streptavidin), Lectine, Proteasehemmer, Nukleinsäure-bindende Proteine und Antikörper-bindende Proteine, wie staphylokokkales Protein A und Anti-Antikörper. Für Immunoassays ist das nicht-katalytische Protein vorzugsweise ein Antikörper, der spezifisch an einen Organismus oder einen Bestandteil eines Organismus bindet, vorzugsweise ein(e) Virus, Rickettsial, Bakterium, Protozoe, Hefe, Pilz oder Krebszelle. Für Nukleinsäure-Hybridisierung-Assays kann das nicht-katalytische Protein Avidin oder Streptavidin sein, das an eine biotinylierte Hybridisations-Probe bindet.
Falls Peroxid als Oxidationsmittel verwendet wird, wird es höchstwahrscheinlich in Lösung zusammen mit dem Benzidin oder substituierten Benzidin zur Verfügung gestellt. Jedoch kann auch eine getrennte Anwendung dieser beiden Reagentien ins Auge gefaßt werden, wobei eines oder beide Reagentien in fester Form oder in einem Gel inkorporiert vorhanden sind. Das Anion, einschließlich das polymere Anion, an welches das Merichinon bindet, kann ebenfalls zusammen mit oder getrennt von dem Peroxid und Benzidin oder substituierten Benzidin zur Verfügung gestellt werden kann und kann gelöst in Lösung, suspendiert in Lösung oder inkorporiert in einem Gel oder entweder kovalent oder durch Adsorption an eine feste Phase gebunden zur Verfügung gestellt werden. Das polymere Anion kann selbst der feste Träger sein, mit dem das Benzidin in Kontakt kommt. Irgendeines dieser Reagentien kann in Lösungsform auf eine feste Phase angewendet werden und durch Eindampfen oder Zusatz eines ausfällenden Lösungsmittels abgelagert werden.
Die Kristallinität, Kristallgröße, Farbe und Löslichkeit des Merichinonsalzes oder Komplexions kann bewußt durch Änderung solcher nicht-exklusiver Faktoren gesteuert werden, wie Anionentyp, Anionenkonzentration (das Anion ist üblicherweise der verwendete Puffer), Temperatur, Typ des Benzidins oder substituierten Benzidins, pH des Reaktionsmediums, Ionenstärke des Mediums und Typ des Lösungsmittels. Fig. 1 faßt die gekuppelten Redox-, Fällungs- und Säure-Basen- Gleichgewichte zusammen, die das Ergebnis der Reaktion steuern, wobei TMB, Peroxid und ein ausfällendes Dianion verwendet wird. Die Fig. zeigt, wie überschüssiges TMB das Zwei- Elektronen-Reaktionsprodukt in das Merichinon treibt und wie die Löslichkeit des Salzes in kritischer Weise vom pH abhängt. Zu viel Säure protoniert das TMB und bricht den Ladungstransferkomplex auf oder protoniert das Pufferanion und bricht das Salz auf. Zu viel Base deprotoniert das Chinondiiminion und bricht den Ladungstransferkomplex auf. Der wirksame pH-Bereich hierin ist 3 bis 7, vorzugsweise 3 bis 6, für eine maximale Salzausfällung. Gesteigerte Anionenkonzentration und niedrigere Reaktionstemperatur begünstigen die Salzausfällung oder Komplexionenbildung, wobei Anionenkonzentrationen von 10&supmin;³ bis 10&supmin;¹ M und Reaktionstemperaturen von 0 bis 60ºC bevorzugt sind. Die optimale Konzentration des Oxidationsmittels im Reaktionsmedium für eine maximale Unlöslichkeit hängt hauptsächlich vom Typ und der endgültigen Verwendung des Salzes ab, liegt aber für Wasserstoffperoxid im allgemeinen im Bereich von etwa 10&supmin;&sup4; bis 10&supmin;²M.
Das Reaktionsmedium ist notwendigerweise wäßrig, um die Messung der oxidativen Aktivität zu ermöglichen; das Medium kann aber ein organisches Co-Lösungsmittel enthalten, um die Löslichkeiten sowohl des Benzidin- oder substituierten Benzidin-Reagens als auch des Merichinonprodukts zu steuern. Irgendwelche organische Co-Lösungsmittel können verwendet werden in einer Menge, die nicht 30 Vol.% des gesamten Lösungsmittels, abhängig von dem besonderen verwendeten Co- Lösungsmittel, übersteigt. Vorzugsweise beträgt die Menge des Co-Lösungsmittels etwa 0 bis 10%. Bevorzugte Co-Lösungsmittel sind solche, die das Benzidin oder substituierte Benzidin stärker solubilisieren als das Merichinonprodukt und die gegen den Oxidationskatalysator weniger hemmend sind als gegen andere Lösungsmittel. Bevorzugte Co-Lösungsmittel, die diese Kriterien erfüllen, wenn Meerrettich-Peroxidase als Katalysator verwendet wird, umfassen Isopropylalkohol, Ethylalkohol und Dimethylsulfoxid.
Die Stoffkombinationen und Verfahren dieser Erfindung können verwendet werden, um die Anwesenheit spezifischer biologischer Materialien sichtbar zu machen, wie Proteine, Nukleinsäuren, und nicht-Protein-Antigene. Falls das biologische Material eine Nukleinsäure ist, kann das vorliegende Verfahren, zum Beispiel, in einem Southernblot, Northernblot oder Nukleinsäuredotblot vorhanden sein. Das Protein kann, zum Beispiel, Hämoprotein, ein Antikörper oder ein Antigen sein. Falls das Protein ein Antikörper (monoklonal oder polyklonal) oder Antigen ist, kann das vorliegende Verfahren, zum Beispiel, in einem Westernblot, Antigendotblot, Antikörperdotblot, ELISA, einer immunohistochemischen Färbung, immunozytochemischen Färbung oder in Zellkultur vorhanden sein, wie zur Prüfung irgendwelcher Populationen von Bakterien- Hefen oder eukaryotisch kultivierten Zellen zur Expression eines natürlich oder gentechnisch erzeugten Antigens. Falls das biologische Material ein Gewebe, Zellen oder eine subzellulare Struktur ist, kann das Verfahren hierin, zum Beispiel, in einer histochemischen, zytochemischen bzw. Zell-ultrastrukturellen Färbung vorhanden sein.
Das biologische Material kann auf einer festen Phase lokalisiert (abgelagert in einer kleinen Region) oder in einem Gel oder einer Flüssigkeit enthalten sein. Die feste Phase kann die Oberfläche eines Papiers, einer Membrane oder eines Polymers sein, hergestellt in Form, zum Beispiel, einer Faser, eines Fadens, Blättchens, Kügelchens, Röhrchens, Scheibchens, Stäbchens oder eines Gewebes. Die zu wählende feste Phase ist eine solche, an der das Merichinonprodukt am besten haftet. Das Polymer kann, zum Beispiel, Cellulose, chemisch modifizierte Cellulose, Nylon, chemisch modifiziertes Nylon, Fluorcarbon, Polyester, Agarose, Acrylester, Acrylamid, Polystyrol, chemisch modifiziertes Polystyrol und dergleichen sein. Die feste Phase ist vorzugsweise Cellulose, Nylon, Nitrocellulose, Polystyrol oder ein Ionenaustausch-Polymer, in Kügelchen- oder Blättchenform. Falls ein Kationenaustausch-Polymer verwendet wird, kann die feste Phase und das polymere Anion ein und dasselbe sein. Spezifisch eingeschlossen sind gleichmäßige Latexkügelchen, Teilchen oder Mikrokügelchen, die üblicherweise einen Durchmesser unter 10 um und häufig kovalent gebundene anionische Gruppen aufweisen.
Das Gel kann, zum Beispiel, Polyacrylamid, Agarose, Stärke, Gelatine oder dergleichen sein. Vorzugsweise ist das Gel Polyacrylamid oder Agarose. Die Flüssigkeit kann irgendeine Körperflüssigkeit sein, z. B. Blut, Sperma, Schleim, Eiter, Urin oder Speichel oder kann ein chemischer Extrakt einer Körperflüssigkeit oder eines Kulturmediums sein.
In einem Aspekt kann das Vorhandensein des biologischen Materials in einer festen Phase, einem Gel oder einer Flüssigkeit festgestellt oder eine Region (z. B. die HLA-Gene der menschlichen DNA) im biologischen Material charakterisiert oder identifiziert werden, indem man:
(a) die feste Phase oder das Gel mit einem Oxidationskatalysator in Kontakt bringt, der an eine feststellende Verbindung gebunden ist, die in der Lage ist, in spezifischer Weise mit dem biologischen Material in Wechselwirkung zu treten;
(b) die feste Phase oder das Gel von Schritt (a) unter Bedingungen inkubiert, bei denen die feststellende Verbindung mit dem biologischen Material in Wechselwirkung tritt, falls es in der festen Phase oder im Gel vorhanden ist;
(c) die feste Phase oder das Gel von Schritt (b) wäscht, um nicht-reagierende feststellende Verbindung zu entfernen;
(d) zur gewaschenen festen Phase oder zum Gel von Schritt (c) Benzidin oder einsubstituiertes Benzidin zusetzt;
(e) die feste Phase oder das Gel Bedingungen unterwirft, unter denen das Benzidin oder substituierte Benzidin zu einem Merichinon davon oxidiert wird, falls der Oxidationskatalysator vorhanden ist (wobei die Bedingungen eine Reaktionstemperatur von 0 bis 60ºC und ein wäßriges Medium von pH 3 bis 7, enthaltend eine wirksame Menge eines Oxidationsmittels, umfassen), und worin eine wirksame Menge eines wirksamen ausfällenden oder immobilisierenden Anions während einer oder mehreren der obigen Schritte (a)-(e) (vorzugsweise (c), (d) oder (e)) zugesetzt wird; und
(f) die Bildung eines festen Salzes oder immobilisierten Komplexes des genannten Anions oder polymeren Anions und des genannten kationischen Merichinons feststellt, wobei die wirksame Merichinon-Löslichkeit kleiner als etwa 10&supmin;&sup5; M ist und wobei die genannte Bildung die Anwesenheit oder Charakteristika des biologischen Materials anzeigt.
In einem EIA-Aufbau enthält der Schritt (f) das Adsorbieren einer sichtbaren Menge des Merichinons an eine anionische Oberfläche, Adsorbieren einer sichtbaren Menge eines anionischen Komplexes des Merichinons an eine kationische Oberfläche, Festhalten einer sichtbaren Menge eines unlöslichen Salzes des Merichinons an einer Filtermembrane oder Festhalten einer sichtbaren Menge des Merichinons, das an mikroskopische anionische Teilchen auf einer Filtermembrane adsorbiert ist.
Hinsichtlich Schritt (e) beeinflussen drei unabhängige Variable (abgesehen von der Temperatur) äußerst stark die Peroxid-Aktivität von Meerrettich mit TMB als chromogenes Substrat: TMB-Konzentration, H&sub2;O&sub2;-Konzentration und pH. Die Netto-HRP-Aktivität, definiert als gesamte Farbausbeute in einem speziellen Reaktionszeitintervall setzt sich aus zwei unabhängigen Variablen zusammen, Anfangsgeschwindigkeit und Geschwindigkeitskonstante der katalytischen Zerstörung, falls das Analysenzeitintervall genügend kurz ist, so daß die Substrate nicht signifikant verbraucht sind (wahrscheinlich nahe der Bestimmungsgrenze irgendeines Enzym-gekoppelten Assays).
Für relativ kurze Analysen (0-10 Min.) ist die Zerstörung jedoch nicht schwerwiegend und die Anfangsgeschwindigkeit ist der wichtigste Indikator für die Enzym-Aktivität. Die Anfangsgeschwindigkeit steigt monoton mit der TMB-Konzentration und ist annähernd proportional zur TMB-Konzentration bei einer H&sub2;O&sub2;-Konzentration größer als 2 mM. Die pH-Abhängigkeit der Anfangsgeschwindigkeit bei konstanter TMB-Konzentration zeigt ein Optimum bei einem pH von 4 an. Die pH-Abhängigkeit der TMB-Löslichkeit zeigt eine monotone und zunehmend steilere Anstieg, wenn der pH von 5 erniedrigt wird. Die pH- Abhängigkeit der Anfangsgeschwindigkeit bei sättigendem TMB zeigt eine vierfache Steigerung von pH 5.0 bis pH 4.0 und eine viel kleinere Steigerung der Aktivität, wenn der pH von 4.0 auf 3.6 erniedrigt wird. Deshalb ist ein pH von 2.5-4.5 der bevorzugte pH-Bereich für Schritt (e), stärker bevorzugt pH 4.0, falls das substituierte Benzidin TMB und der Oxidationskatalysator Meerrettich-Peroxidase ist. Die optimalen Bedingungen für den Meerrettich-Peroxidase-Assay sind Raumtemperatur, pH 4.0, 0.4 mM (gesättigt) TMB und 2-3 mM H&sub2;O&sub2;. Die kombinierten Kriterien des pH und gesättigten TMB haben den stärksten Einfluß auf die Netto-Wirksamkeit, eine vierfache Steigerung von pH 5.0, bei dem das Enzym am meisten gebräuchlich getestet wird, bis zu pH 4.0.
In einem anderen Aspekt kann das Vorhandensein des biologischen Materials in einer festen Phase oder einem Gel durch das gleiche Verfahren bestimmt werden, mit Ausnahme, daß die erstem zwei Schritte durch die folgenden drei Schritte ersetzt werden:
(a) in Kontakt bringen der festen Phase oder des Gels mit einer feststellenden Verbindung, die in der Lage ist, spezifisch mit dem biologischen Material in Wechselwirkung zu treten;
(b) in Kontakt bringen der festen Phase oder des Gels von Schritt (a) mit einem Oxidationskatalysator, konjugiert mit einem Rest, der in der Lage ist, spezifisch mit der feststellenden Verbindung in Wechselwirkung zu treten; und
(c) Inkubieren der festen Phase oder des Gels von Schritt (b) unter Bedingungen, wobei die feststellende Verbindung mit dem Katalysator und mit dem biologischen Material reagiert, falls es in der Testprobe vorhanden ist.
Nach Bildung des Merichinonsalzes oder immobilisierten Komplexions, kann die feste Phase mit einem wäßrigen Lösungsmittel, wie Wasser, einem wäßrigen Puffer oder einer wäßrigen Lösung eines organischen Lösungsmittels, wie Ethanol, gespült werden, um überschüssiges Peroxid und Benzidin oder substituiertes Benzidin wegzuwaschen. Die feste Phase kann dann luftgetrocknet oder in einem wäßrigen Lösungsmittel eingetaucht gelagert werden.
In bevorzugten Aspekten der obigen Mehrstufenverfahren sind die Inkubationszeit und die Temperatur 1-30 Minuten bei Raumtemperatur, der Waschschritt zur Entfernung der nicht umgesetzten feststellenden Verbindung wird mehr als einmal bei Raumtemperatur durchgeführt und die Behandlung mit Benzidin oder substituiertem Benzidin wird während 1-70 Minuten bei Raumtemperatur in Gegenwart eines organischen Co-Lösungsmittels, wie oben beschrieben, durchgeführt, das die Löslichkeit des Benzidins oder substituierten Benzidins steigert.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung Verfahren zur Sichtbarmachung eines biologischen Materials (das ein Antigen, Antikörper oder eine Nukleinsäure ist), enthalten in oder an einer festen Phase, wobei ein Southernblot, Northernblot, DNA-Dotblot, RNA-Dotblot, Westernblot, Antigendotblot oder Antikörperdotblot verwendet wird. Die Schritte dieser Verfahren widerspiegeln diejenigen, die oben in allgemeiner Weise beschrieben wurden, mit Ausnahme, daß (a) die Testprobe spezifisch eine feste Phase ist (b) die feststellende Verbindung spezifisch ein Antikörper gegen ein Antigen, ein Antigen oder Antikörper gegen einen Antikörper oder eine Nukleinsäure-Hybridisierungs-Probe ist, enthaltend eine Einzelstrang-Nukleotidsequenz, die komplementär zu einer Codon oder Anti-Codon-Sequenz ist, die in einer Nukleinsäure im biologischen Material enthalten sein könnte, (c) das Oxidationsmittel spezifisch ein Peroxid ist und (d) der Oxidationskatalysator spezifisch eine Peroxidase ist.
In einer anderen spezifisch bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung Verfahren zur Sichtbarmachung eines Analyten in einem Enzym-Immuno-Assay-Aufbau, worin der Analyt ein Antikörper oder Antigen sein kann, das suspendiert oder gelöst in einer flüssigen Testprobe enthalten ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens ist das verwendete substituierte Benzidin TMB und das Anion wird während der Stufe zugesetzt, bei der die feste Phase den Oxidationsbedingungen unterworfen wird. In anderen bevorzugten Ausführungsformen wird ein polymeres Anion mit der Testprobe inkubiert; und überschüssiges polymeres Anion wird durch Waschen mit einem wäßrigen Lösungsmittel vor der Oxidation entfernt.
Falls das biologische Material eine Nukleinsäure ist, ist sie vorzugsweise DNA, lokalisiert auf einer Membrane in einem Southernblot-Aufbau, wie beschrieben zum Beispiel im U.S. Patent Nr. 4 358 535. Die feststellende Verbindung ist vorzugsweise eine DNA-Hybridisierungs-Probe, gebunden an Biotin und die Peroxidase ist vorzugsweise Meerrettich-Peroxidase, gebunden an ein Avidin, am meisten bevorzugt Streptavidin. Das ausfällende oder immobilisierende Anion oder polymere Anion ist vorzugsweise Citrat, Fumarat, Polyphosphat, Polyanetholsulfonat, Polyacrylat, Polymethacrylat und/oder Dextransulfat.
Das Meerrettich-Peroxidase-Avidin- oder -streptavidin- Konjugat wird vorzugsweise mit der Proben-hybridisierten Ziel-DNA in einem Lösungsmittel inkubiert, das ein chaotropes Mittel oder ein Detergens enthält- oder ein derartiges Lösungsmittel wird verwendet, um die feste Phase nach der Inkubation zu waschen. Es wurde festgestellt, daß die Verwendung solcher Detergentien oder Harnstoff den enzymatischen Untergrund von Southernblots verkleinert, der durch nicht-spezifische Bindung von Enzym-Konjugat an den festen Träger verursacht wird. Diese Verringerung des Untergrunds ist notwendig, falls die gesteigerte analytische Empfindlichkeit in eine verminderte Bestimmungsgrenze umgesetzt werden soll. Beispiele geeigneter Detergentien für diesen Zweck umfassen eines oder mehrere der folgenden: Triton X-100, Nonidet P-40, Natriumdodecylsulfat, Neodol 25-35, Zwittergent 3-16 oder Taurodesoxycholat. Das am meisten bevorzugte Detergens ist Triton X-100 oder Nonidet P-40. Beispiele von chaotropen Mitteln umfassen Harnstoff und dessen Monoalkyl- oder Dialkylhomologe, vorzugsweise Harnstoff oder 1,1-Diethylharnstoff.
Falls das Merichinonsalz verwendet wird, um die Anwesenheit von biologischen Materialien in Nukleinsäure-Hybridisierungs-Assays festzustellen, kann ein Polymerase-Kettenreaktionsverfahren verwendet werden, um die Zielsequenz im biologischen Material zu amplifizieren, wobei Primer, DNA- Polymerase und Nukleotide verwendet werden. Die Amplifikation wird vorzugsweise vor dem Zusatz des Feststellungssystems eingeleitet. Die Amplifikation ist ausführlicher in Saiki et al., Science, 230, 1530-1534 (1985) beschrieben.
Außerdem ist die DNA-Hybridisierungs-Probe hierin am meisten bevorzugt eine zirkulare M13-Probe, enthaltend einen "gapped circle[Ring mit Lücke]". Eine solche Probe kann durch irgendeine Technik hergestellt werden, einschließlich der Zweitstrang-Synthesemethode, beschrieben von Brown et al., (1982) Gene, 20 : 139-144, oder der in vitro Hybridisierung von Plus- und Minus-Strängen, beschrieben von Courage-Tebbe et al., Biochim. Biophys. Acta, (1982), 697 : 1-5 und von Everett et al., The EMBO Journal, (1982) 1 : 433-437. Die gapped circle Konstruktion ist vorzugsweise mittels eines 4'-Methylen-substituierten-4,5',8-trimethylpsoralen-Restes an Biotin gebunden, wie ausführlicher im U.S. Patent Nr. 4 582 789, erteilt am 15. April 1986, beschrieben wurde. Die am meisten bevorzugte dieser biotinylierten Psoralen-Verbindungen ist die Verbindung der Struktur:
Die Probe ist ebenfalls am meisten bevorzugt gerichtet auf ein Onkogen, die β-Globin-Region der menschlichen DNA oder die menschliche Leukozyten-Antigen(HLA)-Region der menschlichen DNA. HLA-Proben sind ausführlicher im U.S. Patent Nr. 4 582 788, erteilt am 15. April 1986 an H. Erlich, beschrieben.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform hierin ist das biologische Material ein Antigen oder Antikörper, der in einem Westernblot-Aufbau bestimmt wird, wobei die feststellende Verbindung notwendigerweise ein Antikörper, spezifisch (daran bindet) für das zu bestimmende Antigen, oder ein Antikörper oder Antigen, spezifisch für den zu bestimmende Antikörper, ist. Die Peroxidase ist vorzugsweise Meerrettich- Peroxidase, konjugiert zu einem Antigen, Anti-Antikörper oder Antikörper, welche spezifisch mit der feststellenden Verbindung reagiert, und das ausfällende Anion ist Dextransulfat und/oder Fumarat. Stärker bevorzugt ist das biologische Material ein ras p21-Protein-Antigen, die feststellende Verbindung ist ein Antikörper, gerichtet auf einen spezifischen Mutanten des Proteins, und die Meerrettich-Peroxidase ist konjugiert mit einem Anti-Antikörper, spezifisch für die feststellende Verbindung. Die für einen Mutanten des normalen p21-ras-Proteins spezifischen Antikörper und ihre Erzeugung sind ausführlicher in der Europäischen Patentveröffentlichung Nr. 175 360 von F. McCormick et al beschrieben. Im wesentlichen werden Peptide, welche die Region vortäuschen, welche die Aminosäure in Stellung 12 des p21-Proteins (normalerweise Serin) umgibt, erzeugt und in Kaninchen injiziert, wodurch Mutant-spezifische polyklonale Antikörper gebildet werden. Der Anti-Antikörper kann zum Beispiel ein Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG sein, das mit Meerrettich-Peroxidase konjugiert und gegen die Mutant-spezifischen Antikörper gerichtet ist. Bevorzugte Anionen für Westernblots sind eine Kombination von Fumarat und Dextransulfat oder Pyrophosphat allein. Es wurde festgestellt, daß die Ergebnisse viel empfindlicher und dauerhafter sind, wenn Dextransulfat mit Fumarat verwendet wird, als wenn Fumarat allein als Anion verwendet wird.
Der Hauptvorteil der vorliegenden Erfindung gegenüber dem, was in der Literatur beschrieben wurde, besteht darin, daß sie es ermöglicht, TMB in einem weiten Bereich von Analysen der peroxidativen Aktivität zu verwenden, bei denen das Reaktionsprodukt aus einer Lösung an der Stelle der Erzeugung abgelagert oder von nicht umgesetzten Reagentien abgetrennt werden muß (z. B. um den Untergrund zu minimieren). Die Peroxidase-Substrate, von denen man bisher wußte, daß sie unlösliche Produkte bilden, machen dies mit geringerer katalytischer Aktivität, wodurch geringere analytische Empfindlichkeiten resultieren. Zusätzlich konzentriert die Ausfällung oder Komplexierung des Merichinons die Farbe in einem relativ kleinen Volumen und verhindert dessen Diffusion in das ganze analytische System. Eine derartige Lokalisierung steigert die analytische Empfindlichkeit, denn die Absorption ist proportional zur chromophoren Konzentration, die umgekehrt proportional zum Volumen ist, in dem das Chromophor verteilt ist. Die Konzentration des analytischen Signals erlaubt die visuelle Evaluierung der Anwesenheit des Analyten, ohne auf teure oder ausgefeilte Instrumentation zurückzugreifen und erleichtert die Konservierung oder das optische Festhalten einer dauerhaften Aufzeichnung. Es gestattet auch das Waschen, um nicht reagierte Reagentien zu entfernen, die sonst den analytischen Untergrund vergrößern könnten. Schließlich erfordern einige Assays die Kenntnis des Ortes des Analyten an einer bestimmten Stelle (via Lokalisation des sichtbaren Signals, das dessen Vorhandensein erzeugt), um den Analyten zu identifizieren oder zu charakterisieren und ihn von Alternativen zu unterscheiden.
Die Erfindung hierin liefert andere potentielle Verbesserungen gegenüber bekannten Verfahren. Da die Merichinonsalze gewisser Anionen gegenüber solchen anderer Anionen verschiedene Farben besitzen, liefert die Wahl des Anions einen gewissen Spielraum für die optimale Farbe für eine gegebene Anwendung. Die Farbe des gebildeten Salzes oder Komplexions reicht von schwarz bis grün. Da die Merichinonsalze Löslichkeiten im Bereich von vielen Größenordnungen besitzen, könnte die Wahl des Salzes verwendet werden, um den Kontrast in der räumlichen Verteilung der Farbe in einem Gel oder an der Oberfläche eines Feststoffs zu verstärken. Die Salzlöslichkeit kann beeinflußt werden, so daß Bereiche, die hohe Analyt-Konzentrationen enthalten, ausreichend Merichinon liefern, um mit einem gegebenen Anion auszufallen, während solche mit geringeren Gehalten an peroxidativer Aktivität zu wenig Merichinon liefern, um auszufallen, bevor es vom Gel oder der Oberfläche wegdiffundiert. Eine derartige Kontrastverstärkung kann verwendet werden, um die Unterscheidung zwischen analytischem "Signal" und "Untergrund" zu verbessern. Schließlich bilden polymere Anionen eher amorphe als kristalline Ablagerungen mit Merichinon, wobei Artefakte vermieden werden, die in histochemischen oder zytochemischen Analysen beobachtet werden wenn die Kristalle zu groß wachsen. Zusätzlich haften amorphe Ablagerungen im allgemeinen stärker an Oberflächen als es Kristalle tun.
Spezifische Anwendungen hierin für die Verwendung des immobilisierten oder ausgefällten Merichinons bei der Sichtbarmachung umfassen irgendeinen Kontext, bei dem eine oxidative Aktivität gemessen und im Raum lokalisiert wird d. h. wo das Reaktionsprodukt sich nicht von der Stelle der Bildung wegbewegt. Beispiele umfassen (sind aber nicht beschränkend): (1) Southernblots, sichtbar gemacht durch Meerrettich-Peroxidase (HRP) -Streptavidin(SA) -Konjugate, gebunden an biotinylierte DNA-Proben, hybridisiert mit spezifischen Genom- oder cDNA-Sequenzen; (2) Northernblots, festgestellt in ähnlicher Weise nach Hybridisierung mit spezifischen RNA-Sequenzen; (3) DNA- oder RNA-Dotblots (z. B. für Infektionskrankheiten), festgestellt in ähnlicher Weise; (4) Westernblotssichtbar gemacht durch HRP-Streptavidin-Konjugate, gebunden an biotinylierte erste oder zweite Antikörper oder durch HRP- derivatisierte erste oder zweite Antikörper; (5) Antigendotblots, sichtbar gemacht durch ähnliche Verfahren; (6) Antikörperdotblots festgestellt durch HRP-Streptavidin-Konjugate, gebunden an biotinyliertes Antigen, oder durch HRP-derivatisiertes Antigen; (7) irgendeine Art von Bindungsassay, bei dem ein Reagens an einer festen Phase oder in einem Gel lokalisiert ist und das andere Reagens direkt oder indirekt an eine Peroxidase gebunden ist; (8) Tests auf Blut im Stuhl oder Urin oder auf Hämolyse in Plasma; (9) forensische chemische Tests auf Blut; (10) histochemische oder zytochemische Färbung von Peroxidase-enthaltenden, Peroxidase-markierten oder Immuno-Peroxidase-markierten Zellen; und (11) Prüfung von mikrobiellen Kolonien auf Expression eines natürlich oder gentechnisch eingeführtes Antigens.
In einer unterschiedlichen aber überlappenden Anwendungsgruppe gestattet die Immobilisierung des Reaktionsprodukts das Filtrieren oder Dekantieren, gefolgt von Waschen, um nicht reagierte Reagentien zu entfernen, wobei die Reaktion in einer kontrollierten Weise beendet, der Untergrund vermindert und die Erzeugung einer permanenten Aufzeichnung vereinfacht wird. Diese Anwendungen umfassen Enzymimmunoassays, zusätzlich zu den oben aufgeführten.
Testkombinationen von Bestandteilen, die verwendet werden können, um Antikörper, Antigene oder Nukleinsäuren in Lösung, in Suspension, an histochemischen Schnitten, an zytochemischen Abstrichen oder in oder an Fest- oder Gelphasen zu bestimmen, wie in Southernblots, Northernblots, DNA- oder RNA- Dotblots, Westernblots, Antigendotblots, Antikörperdotblots und Lösungsphasen-Enzym-Immuno-Assays sind ebenfalls innerhalb des Umfangs dieser Erfindung. Das wesentliche Merkmal einer derartigen Testkombination besteht darin, daß sie Anweisungen enthält, welche die Immobilisierung oder die Fällung des Merichinons von Benzidin oder eines substituierten Benzidins durch die Anwendung eines polymeren Anions oder einer wirksamen Konzentration eines wirksamen Anions ergibt, um dem Merichinon eine Löslichkeit von weniger als 10&supmin;&sup5; M zu verleihen. Fakultative Bestandteile umfassen (a) Benzidin oder ein substituiertes Benzidin; (b) Materialien zur Herstellung von Lösungen (z. B. Inkubationspuffer), enthaltend das ausfällende Anion oder polymere Anion oder die Lösungen selbst; (c) ein Peroxid in gelöster oder reiner Form; (d) einen peroxidativen oder oxidativen Katalysator, wahrscheinlich gekuppelt an eine andere Verbindung, die direkt an den Analyten bindet oder die mit einer Verbindung reagiert, die an den Analyten bindet; (e) eine nicht-anionische Filtermembrane oder eine feste Phase, die den Analyten in einer spezifischen oder nichtspezifischen Weise adsorbieren kann, wie eine anionische festhaltende Komponente, einschließlich zum Beispiel eine Filtermembrane, Latexkügelchen, ein Teststreifen oder ein Kationenaustauschharz (worin "anionisch" eine Oberfläche bedeutet, die fixierte negative Ladungen trägt); und (f) eine oder mehrere Kontrollproben, wie mit einem tag versehene (z. B. biotinylierte) Molekulargewicht-Marker, chromosomale DNA oder ribosomale RNA für Testkombinationen zur Bestimmung von Nukleinsäuren, nichtspezifische und spezifische Immunoglobuline für Testkombinationen zur Bestimmung von Antigenen (z. B. nicht-spezifische (nicht auf Mutanten beschränkte) polyklonale und monoklonale Antikörper gegen p21- Protein), und Antigen-enthaltende Proben für Testkombinationen zur Bestimmung von Antigenen. Andere Komponenten der Testkombination, wie Waschpuffer und Stabilisatoren sind ebenfalls im Bereich dieser Erfindung, wie auch Testkombinationen, die Teststreifen enthalten, vollgesogen und getrocknet mit dem Benzidin oder substituierten Benzidin, dem ausfällenden Anion oder polymeren Anion und einem Peroxid.
Ebenfalls im Bereich dieser Erfindung sind Testzusammensetzungen zur Bestimmung von oxidativen Katalysatoren, wie Peroxidasen, Oxidasen, Hämoproteinen, Hämen und Übergangsmetallionen, vorausgesetzt daß sie den Benützer anweisen, das Merichinon von Benzidin oder einem substituierten Benzidin durch Anwendung eines polymeren Anions oder einer wirksamen Konzentration eines wirksamen Anions auszufällen oder zu immobilisieren. Die Testkombination kann alles oder einen Teil eines Gens eines HTLV III-Virus, eines HLA-Gens, alles oder einen Teil des Gens für ein normales oder mutantes Hämoglobin oder alles oder einen Teil eines normalen oder mutanten Onkogens bestimmen. Das Antigen kann menschliches Choriongonadotrophin, menschliches luteinierendes Hormon und pathogene Organismen sein, wie Neisseria gonorrhoea, Chlamydia oder Herpes simplex Virus.
Die Ausführungsformen der Erfindung werden durch die folgenden Beispiele näher erläutert. In den Beispielen sind alle Teile und Prozentzahlen bei Feststoffen auf das Gewicht und bei Flüssigkeiten auf das Volumen bezogen, außer es ist etwas anderes angegeben. Die Temperaturen sind in Grad Celsius angegeben.

BEISPIEL 1

Bildung und Beschreibung von festen Salzen des Merichinons von 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB)

50 ml Volumina von 0.2 mg/ml TMB, 0.0015% H&sub2;O&sub2;, 10% Ethanol in jedem der folgenden pH 5.0 Puffer wurden hergestellt: 0.10 M Natriumacetat, 0.10 M Natriumformat, 0.10 M Natriumphosphat, 0.10 M Natriumsulfat, 0.010 M Natriumacetat, 0.10 M Natriumpyrophosphat, 0.010 M Natriumacetat, 0.10 M Natriumfumarat, 0.10 M Natriummaleat, 0.10 M Kaliumoxalat, 0.10 M Natriummalonat, 0.10 M Natriumsuccinat, 0.10 M Natriumglutarat, 0.10 M Natriumcitrat, 0.10 M Natriummalat, 0.10 M Natriumtartrat, 0.10 M Natriumisocitrat, 0.10 M Kaliumphthalat, 0.10 M Kalium-ethylendinitrilotetraacetat (EDTA), 0.10 M Natrium-1,2,3,4-butantetracarboxylat, 0.025 M Kaliumisophthalat, 0.025 M Kaliumterephthalat (End-pH=5.4, nicht 5.0), 0.07% Natriumpolyacrylat (MG 2000), 0.70% Natriumpolyacrylat, 0.10% Natriumdextransulfat (MG 500 000) und 1.0% Natriumdextransulfat. Zu jedem wurde bei Raumtemperatur ungefähr 1 ug Meerrettich-Peroxidase zugesetzt. Nach Zusatz des Enzyms verfärbte sich jede Probe innerhalb weniger Sekunden in dunkelblau bis schwarz. Nach 15-30 Minuten wurde begonnen, die Reaktionsmischungen auf etwa 5ºC abzukühlen. Nach Stehen über Nacht wurden sie in einer Zentrifuge bei 0ºC 135 Minuten lang mit 10&sup4; UpM zentrifugiert. Die leichten aber reichlichen Niederschläge wurden durch dieses Verfahren unvollständig pelletiert. Nach Entfernung des Hauptteils der klaren Überstände, wurden die zurückbleibenden suspendierten Kristalle durch Zentrifugieren während 5 Minuten bei 5ºC in 1.5 ml Polypropylen-Eppendorf-Röhrchen in einer Mikrozentrifuge pelletiert.
Alle Reaktionsmischungen, ausgenommen Acetat und Dextransulfat ergaben Endpellets, die ein Volumen von 0.1-0.3 ml hatten. Es gab einige Kristalle im gekühlten Acetatpuff er, die jedoch nicht ausreichten, um für eine physikalische Untersuchung gewonnen zu werden. Kein Dextransulfatansatz lieferte irgendwelche Kristalle, obwohl die violett-schwarze Färbung der Lösung darauf hindeutete, daß eine gewisse Reaktion des Merichinons mit Dextransulfat (wahrscheinlich in Form eines Komplexions) stattgefunden hat, da das gelöste Merichinon blau und nicht violett ist. Prüfung aller Niederschläge mit Ausnahme desjenigen mit Polyacrylat in einem Mikroskop mit polarisierender Optik zeigte eine doppelbrechende Kristallform, die aus kurzen oder langen Nadeln bestand. Die Polyacrylat-Niederschläge waren nicht-doppelbrechende amorphe Feststoffe. Der Niederschlag von 1,2,3,4-Butantetracarboxylat war eine Mischung von doppelbrechenden Kristallen und nichtdoppelbrechenden amorphen Teilchen. Die verschiedenen Niederschläge hatten charakteristische Farben, die von den zu ihrer Herstellung verwendeten Anionen abhingen, wie in Tabelle I gezeigt wird. TABELLE I Farben der Salze und Komplexionen des Merichinons von TMB (zweite Farbe im Ausdruck mit Bindestrich ist dominant) Haupt-Anion Farbe Feststoffmasse¹ Kristall² Acetat blau Phosphat blau-schwarz grau-blau Malat blau-schwarz graugrün Pyrophosphat violett-schwarz violett-blau Dextransulfat violett-schwarz³ violett&sup4; Sulfat violett-schwarz schwarz 0.07% Polyacrylat schwarz grün-schwarz 0.7% Polyacrylat grün-blau grün-blau Maleat blau-violett grau-grün Fumarat royalblau blau-grün Format royalblau grün-blau Oxalat royalblau blau-grün Succinat royalblau blau-grün Citrat royalblau blau-grün Isocitrat royalblau grün-blau Tartrat royalblau blau-grün Phthalat royalblau blau-grün Isophthalat royalblau blau Terephthalat royalblau blau-grün EDTA royalblau grün-blau 1,2,3,4-Butan- royalblau grün-blau tetracarboxylat ¹ = reflektierte Umgebungs-Fluoreszenz-Beleuchtung ² = durchscheinende Wolfram-Halogen-Beleuchtung bei 20X Vergrößerung ³ = reflektiert aus konzentrierter Lösung (kein Feststoff) &sup4; = durchscheinend durch die Lösung (kein Feststoff)
Die meisten der Feststoffmassen zeigten einen satten violett-blauen Farbton, den wir "royalblau" genannt haben. Unter durchscheinender Beleuchtung zeigten ihre Kristalle eine kombinierte grüne und blaue Farbe. Jedoch war eine signifikante Teilmenge der Feststoffe viel dunkler - schwarz oder fast schwarz. Sie zeigten einen Bereich von violetten, blauen und grünen Farbtönen im durchscheinenden Licht. Der Farbkontrast zwischen den amorphen aus zwei verschiedenen Konzentrationen von Polyacrylat ausgefällten Feststoffen kann einen Hinweis daraufliefern, warum gewisse Salze und Komplexe dunkler sind als andere. Merichinon-Moleküle, die mit 0.07% Polyacrylat komplexiert wurden, müssen sich auf der Polymerkette viel enger beieinander befinden als solche, die mit 0.7% Polyacrylat komplexiert wurden. Gesteigerte Nähe bewirkt in dramatischer Weise, daß die Farbe dunkler wird.
Die amorphe Natur der Polyacrylat-Merichinon- Niederschläge läßt darauf schließen, daß die polymeren Anionen besonders nützliche Ausfällmittel bei histochemischen und zytochemischen Analysen sind, wo die Kristalle die Ultrastruktur zerstören könnten, die bei der Untersuchung von zentralem Interesse ist.

BEISPIEL 2

Löslichkeiten von Salzen des Merichinons von TMB

I. Bestimmung der Stöchiometrie aus der Abhängigkeit der Merichinon-Löslichkeit von der Anionenkonzentration

Falls sich ein gelöstes Merichinon, M+m, im Gleichgewicht mit dem festen Salz befindet, das es mit einem Anion, A-a, bildet, erfordert das thermodynamische Gesetz, daß der folgende Gleichgewichtsausdruck erfüllt ist:
[M+m] [A-a]m/a = Keq.
Diese Gleichung besitzt die folgende logarithmische Form:
log [M+m] + m/a log [A-a] = log Keq.
[M+m] ist einfach die Löslichkeit des Merichinons. Aus dieser Gleichung folgt, daß der log der Löslichkeit gegen den log der Anionenkonzentration aufgetragen eine gerade Linie ergeben sollte mit einer Steigung von -m/a. Diese Steigung gibt das stöchiometrische Verhältnis von Anion zu Merichinon im Salz an. Es ist zu erwarten, daß viele der in dieser Studie verwendeten Pufferanionen verschiedene Werte der anionischen Ladung, a, in verschiedenen pH-Bereichen besitzen, weil sie konjugierte Basen zu diprotischen, triprotischen oder tetraprotischen schwachen Säuren sind. Einige, wie Sulfat und Format, können jedoch bei erreichbaren pH-Werten nur einen a-Wert besitzen. Falls das m/a für sie gemessen wird, kann m berechnet werden. Vermutlich behält das Merichinon diese Nettoladung in allen Salzen bei, die es im relevanten pH- Bereich (4-7) bildet. Wenn deshalb einmal m für ein Salz evaluiert ist und m/a für andere Salze evaluiert wird, ergeben die Quotienten dieser Werte a-Werte für die anderen Salze.
Das hierin beschriebene Experiment verwendete die vorstehende Theorie, um m und a für sieben Salze abzuschätzen. Vorgängige Löslichkeitsstudien deuten darauf hin, daß die Gleichgewichtskonzentration von [M+m] für jedes dieser Salze bei Raumtemperatur genau gemessen werden könnte, wenn [A-a] im Bereich von 10&supmin;³ bis 10&supmin;² M liegt. Um die ionische Stärke während der Studie der Abhängigkeit von der Pufferanionen- Konzentration ungefähr konstant zu halten, wurde 10&supmin;¹ M Naacetat zu allen diesen Puffern zugesetzt, zusammen mit 10% Ethanol, um die Löslichkeiten sowohl des TMB als auch des Merichinons zu erhöhen. Vorgängige Studien hatten gezeigt, daß das Acetatsalz des TMB-Merichinons so löslich ist, daß irgendwelche festgestellte Niederschläge das andere Pufferanion in der Mischung enthalten würden und nicht Acetat.
Eine Reihe von Puffern wurde hergestellt, alle mit pH 5.0 bei Raumtemperatur, 10% in Ethanol und 0.10 M in Natriumacetat und entweder 10&supmin;³ M, 3 · 10&supmin;³ M oder 9 · 10&supmin;³ M in einem der folgenden Elektrolyte: Sulfat, Pyrophosphat, Oxalat, Succinat, Maleat, Fumarat oder Citrat. Diese sind stöchiometrische Konzentrationen, unkorrigiert bezüglich Ionisierung bei pH 5.0. Die entsprechenden in Beispiel 1 erhaltenen festen Merichinonsalze wurden dreimal in 10&supmin;² M Konzentrationen der entsprechenden pH 5.0-Puffer (enthaltend kein Ethanol) durch kräftiges Mischen gewaschen, um die Pellets wieder zu suspendieren, gefolgt von Zentrifugieren während mehreren Minuten in einer Mikrozentrifuge. Jedes Waschen benötigte ein Gesamtvolumen von 1.5 ml (Pelletvolumen etwa 0.3 ml) in einem Eppendorf-Polypropylen-Zentrifugenröhrchen. Dann wurden 20-50 ul des gewaschenen, pelletierten Merichinonsalzes und einige wenige mg TMB in 2 ml des das gleiche Anion enthaltenden Puffers in einem Glasröhrchen vermischt, verschlossen und in einem mit Thermostat versehenen Wasserbad bei 25.2 ± 0.1ºC geschüttelt. Nach 30-60 minütigen Intervallen wurden die Kristallsuspensionen 3-5 Minuten lang bei Raumtemperatur in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert. Die überstehenden Lösungen wurden sorgfältig von den leichten und empfindlichen Pellets mit Pasteur-Pipetten entfernt und in einem Spektrophotometer zwischen 260 und 700 nm untersucht. Nach der Untersuchung wurden die Lösungen und Pellets in die Gleichgewichtsröhrchen zur erneuten Schüttelung zurückgebracht. Wiederholte Messungen wurden durchgeführt, bis eine Genauigkeit innerhalb 20% erreicht wurde. Häufig waren für jede Probe nur zwei und nicht mehr als drei Messungen notwendig, um diesen Grad der Reproduzierbarkeit zu erreichen, was auf ein vollständiges Gleichgewicht zwischen fester und Lösungsphase schließen läßt; die meisten wiederholten Messungen stimmten innerhalb von 5% überein. Sorgfalt wurde angewendet, um sicherzustellen, daß festes Merichinonsalz und festes TMB in jedem Röhrchen vorhanden war. Überschüssiges (sättigendes) TMB wurde zugesetzt, um die Dissoziation des Merichinon-Ladungstransfer-Komplexes in die Komponenten Chinondiimin und TMB zu unterdrücken (siehe Fig. 1). Diese Vorsorge ändert die Merichinonlöslichkeit nicht, vereinfacht aber deren Messung. Diese Spektren enthielten Adsorptions-Peaks bei 370 und 650 nm, die charakteristisch für Merichinon sind, und eine sehr kleine Schulter bei 450 nm, die Chinondiimin zugeordnet wurde; ein viel größerer Peak in der Nähe von 280 nm bestätigte die Anwesenheit von überschüssigem TMB. Alle Spektren wiesen die gleiche Form auf, unabhängig von dem ausfällenden Anion oder der Farbe des Niederschlages. Die Merichinonkonzentration wurde vom A&sub6;&sub5;&sub0; berechnet unter der Annahme eines molaren Extinktionskoeffizienten von 3.9 · 10&supmin;&sup4; M&supmin;¹cm&supmin;¹ (Josephy et al., (1982) Journal of Biological Chemistry, 257 : 3669-3675). Falls die Konzentration zu hoch war, um sie unverdünnt mit einem 1 cm Lichtweg zu messen, wurde die Untersuchung mit einer unverdünnten Probe mit einem 2 mm Lichtweg oder einer geeignet verdünnten Probe (später verworfen) mit einem 1 cm Lichtweg durchgeführt.
Wenn einmal die Löslichkeitsgleichgewichte bei 25.2ºC erreicht wurden, wurden alle Röhrchen in ein Eiswasserbad gebracht. Die Löslichkeiten bei 0ºC wurden für alle Lösungen bestimmt, bei denen sie für eine genaue Messung hoch genug waren.
Fig. 2 enthält die graphische Darstellung der log. Löslichkeit versus die log. Anionenkonzentration, aus denen die Salz-Stöchiometrien abgeschätzt wurden. Diese Darstellung zeigt in dramatischer Weise den Löslichkeitsbereich für verschiedene Salze über mehr als 3 Größenordnungen. Die strichlierten Linien wurden visuell angepaßt. Tabelle II faßt die stöchiometrischen Abschätzungen zusammen, auf Basis der Rundung der Steigung auf den nächsten ganzen oder gebrochenen Wert, der ganze Werte für m und a ergibt. Zum Beispiel ist die Steigung für Sulfat von 0.9 nahe genug bei 1.0, um ein 1 : 1-Verhältnis von M zu A für dieses Salz nahezulegen; die gleiche Annäherung wurde bezüglich der Fumarat-, Oxalat- und Succinatsalze vorgenommen. Da Sulfat bei einem pH nahe 5 ein Dianion sein muß, muß das Merichinon ein Dikation sein. Es sollte ein Dikation in allen Salzen sein. Die Citrat-Steigung von 0.62 ist so nahe am m/a-Wert von 2/3, daß Citrat deshalb als ein Trianion ausfallen muß. Die Pyrophosphat-Steigung von 0.4 ist nahe genug bei einem m/a-Wert von 1/2, daß Pyrophosphat als ein Tetraanion ausfallen muß. Die Maleat-Steigung legt eine Kristallisation als ein Monoanion nahe, obwohl eine dianionische Struktur vorausgesagt werden könnte. TABELLE II Stöchiometrien und Löslichkeiten einiger Salze des Merichinons von TMB Anion Steigung m/a¹ m a Molare Löslichkeit in 0.1M-Anion² Sulfat Succinat Oxalat Fumarat Maleat Citrat Pyrophosphat ¹ = nächster vernünftiger Steigungswert ² = extrapoliert
Tabelle III faßt die Temperaturabhängigkeiten der Löslichkeit für die sieben Salze zusammen, gemittelt für die verschiedenen angegebenen Konzentrationen jedes Salzes. Die Puffer wurden alle auf pH 5.0 bei Raumtemperatur eingestellt, würden aber etwas verschiedene pH-Werte bei 0ºC haben (üblicherweise um 0.2-0.3 pH-Einheiten niedriger). Derart starke Temperaturabhängigkeiten deuten auf hohe Werte für die Lösungswärmen hin, was für Ionengitter charakteristisch ist.

II. Vergleich der Löslichkeitseigenschaften von TMB und seinem Merichinon

Wenn die gleiche Methode angewendet wurde, um die Löslichkeit von TMB in einer Reihe von Puffern (jeder pH 5.0 und 0.10 M in einem Einzelanion) zu messen, wurden die Daten in Tabelle IV erhalten.

TABELLE III

Temperaturabhängigkeit der Löslichkeit für einige TMB-Merichinonsalze

Anion Löslichkeitsverhältnis: 25.2ºC/0.0ºC Sulfat 6.9
Succinat -*
Oxalat 8.4
Fumarat 5.6
Maleat 8.1
Citrat 9.6
Pyrophosphat 3.7
* Das Löslichkeitsverhältnis für das Succinatsalz lag im Bereich von 39 bis 3, wenn die Anionenkonzentration von 10&supmin;³ auf 10&supmin;² M erhöht wurde, was auf einen Wechsel der Kristallform bei niedriger Temperatur hindeutet. TABELLE IV Löslichkeit und dessen Temperaturabhängigkeit für TMB in mehreren Puffern Anion Löslichkeit bei 30.9ºC (mM) Löslichkeitsverhältnis 30.9ºC/0.0ºC Sulfat 0.15 1.9 Oxalat 0.16 12 Fumarat 0.16 3.9 Maleat 0.21 7.6 Citrat 0.17 2.3 Phosphat 0.16 2.0 Acetat 0.17 2.4 Malonat 0.16 1.8 Glutarat 0.17 2.0
Für die meisten Pufferionen stand das Verhalten des TMB in starkem Gegensatz zu demjenigen seines Merichinons. Die Löslichkeit war unabhängig vom Pufferion und die Temperaturabhängigkeit der Löslichkeit war gering und unabhängig vom Pufferion. Dieses Verhalten wird für ein molekulares, im Gegensatz zu einem ionischen Kristallgitter erwartet. Bei pH 5.0 muß TMB eine molekulare Ladung besitzen, die nahe genug bei 0 liegt, so daß es dazu neigt, in einem nicht-ionischen Zustand zu kristallisieren. Oxalat und Maleat und möglicherweise Fumarat stören dieses einfache Bild für TMB, zumindest bei 0ºC. Bei Temperaturen im Bereich von 25-30ºC besaß TMB in diesen Puffern die gleiche Löslichkeit wie TMB in den andern Puffern, was auf eine Kristallisation in einem molekularen Gitter hindeutet. Jedoch war TMB bei 0ºC signifikant weniger löslich in diesen Puffern als in den anderen; dieses Phänomen deutet darauf hin, daß Ionengitter mit höheren Lösungswärmen bei niedriger Temperatur für diese zwei oder drei Puffer bevorzugt sind.
Die Daten der Löslichkeit von TMB und des Merichinonsalzes haben mehrere wichtige praktische Konsequenzen für die analytische Verwendung der TMB-Oxidation.
(1) Einige Puffer, wie Fumarat, Maleat und Oxalat sollten bei der Lokalisierung und Immobilisierung von Merichinon als unlösliche Ausfällungen am Ort der Erzeugung wirksamer sein als andere Puffer, wie Citrat und Pyrophosphat. (Andere Puffer, die in den vorstehenden Löslichkeitsuntersuchungen nicht beschrieben sind, wie Acetat, Format und Phosphat, sind bei der Ausfällung von Merichinon noch weniger wirksam).
(2) Die Löslichkeit des Merichinonsalzes kann durch Variierung der Pufferkonzentration wirksam gesteuert werden. Die Genauigkeit der Steuerung hängt von der Ladung des Anions im Kristallgitter ab. Falls es erwünscht ist, die Löslichkeit eines bestimmten Salzes zu erniedrigen, wird einfach die Pufferkonzentration erhöht.
(3) Die Löslichkeit des Merichinonsalzes kann durch die Temperatur wirkungsvoll gesteuert werden. Niedrige Temperaturen vermindern in dramatischer Weise die Löslichkeit.
(4) Der Unterschied im Löslichkeitsverhalten zwischen TMB und dessen Merichinon bedeutet, daß Maßnahmen zur Verminderung der Löslichkeit des Produkts keine oder nur eine bescheidene Wirkung auf die Löslichkeit des Reagens besitzen (für das normalerweise ein hoher Wert wünschbar ist). Diese Tatsache vereinfacht die Optimierung der analytischen Verfahren.
(5) Die Abhängigkeit der Löslichkeit von der Ionenstärke kann einen einfachen Test liefern, ob der durch Oxidation des Benzidins oder eines substituierten Benzidins gefärbte Niederschlag das Merichinon enthält oder das nichtionische Polymer darstellt, das sich nach weiterer Reaktion des Chinondiimins bildet.

BEISPIEL 3

Immobilisierung des Merichinons von TMB durch polymere, an Festphasen-Adsorbentien gebundene Anionen

I. Kationische Adsorbentien

Polyacrylsäure (mittl. MG 2000) wurde in Wasser auf eine Konzentration von 0.7% gelöst und mit NaOH auf pH 4.4 eingestellt. Dextransulfat (Natriumsalz, mittl. MG 500 000 wurde in Wasser auf eine Konzentration von 1.0% gelöst und mit HCl auf pH 4.8 eingestellt. Getrennte 11 · 1 cm Streifen mit drei kationischen Adsorbentien, hergestellt in Blattform (ladungsmodifiziertes Nylon und Cellulosepapier) wurden zwei Stunden bei Raumtemperatur in ungefähr 20 ml Volumina des 0.7%igen Polyacrylat, des 1.0%igen Dextransulfats oder Wasser inkubiert und einmal in ähnlichen Volumina Wasser gewaschen. Die Streifen wurden dann verwendet, um die vertikalen Wände der Vertiefungen in Mikrotiterplatten mit 6 Vertiefungen auszukleiden. Die Vertiefungen wurden gefüllt mit 8 ml Volumina von 0.20 mg/ml TMB, 0.00075% H&sub2;O&sub2;, 10% Ethanol in entweder 0.10 M Na-Citrat oder 0.10 M Na-Pyrophosphat, pH 5.0. Zu jeder Vertiefung wurden etwa 5 ng Meerrettich-Peroxidase zugesetzt. Die blaue Farbe, die für die TMB-Oxidation zum Merichinon charakteristisch ist, begann sofort zu erscheinen und intensivierte sich langsam; die Reaktion wurde über Nacht bei Raumtemperatur ablaufen gelassen.
Nach einer Reaktionszeit von ungefähr 12 Stunden, enthielten alle Vertiefungen eine dunkelblaue Lösung von Merichinon. Die Vertiefungen, die Citratpuffer enthielten, enthielten auch blaue Kristalle des Citratsalzes des TMB-Merichinons. Die Vertiefungen, die Pyrophosphat enthielten, enthielten ebenfalls blau-violett Kristalle des Merichinonpyrophosphatsalzes. Die Adsorbensstreifen, die in Wasser inkubiert wurden, enthielten sehr wenig Farbe - nicht mehr, als von Eintauchen in die Merichinonlösung erwartet wurde. Die Streifen, die in 0.7% Polyacrylat inkubiert worden waren, zeigten ein gleichmäßiges helles (robin's-egg[Ei der Wanderdrossel])-Blau. Die Streifen, die in 1.0% Dextran- SO&sub4; inkubiert worden waren, zeigten ein gleichmäßiges Blau-violett. Diese Unterschiede wurden bei allen drei Adsorbentienarten und bei beiden Inkubationspuffern gesehen, obwohl die Streifenfärbung in Citrat dunkler war als in Pyrophosphat.
Jeder Streifen wurde sechs Stunden bei Raumtemperatur in 50 ml von 0.10 M Na-Acetat, 10% Ethanol, pH 5.0, eingetaucht. Die Dextransulfatstreifen verloren im wesentlichen keine Farbe an das Lösungsmittel. Die Streifen, die in Polyacrylat inkubiert wurden, verloren über die Hälfte ihrer Farbe an das Lösungsmittel. Die Streifen, die in Polyacrylat inkubiert wurden, verloren viel weniger als die Hälfte ihrer Farbe an das Lösungsmittel. Die in Wasser inkubierten Streifen verloren fast die gesamte Farbe an das Lösungsmittel. Mechanisches Abschaben der Streifen, welches das Trägermaterial nicht entfernte, verursachte keinen merklichen Verlust an Farbe. Der Nylonträger war viel widerstandsfähiger gegen Abschaben als die Papiere.
Diese Ergebnisse zeigen mehrere Dinge.
(1) Die kationischen Adsorbentien besitzen keine eigentliche Affinität für TMB-Merichinon.
(2) Nach Ladung mit jedem der zwei polymeren Anionen, binden alle drei kationischen Adsorbentien leicht sichtbare Mengen des Merichinons, trotz Konkurrenz durch Pufferanionen, die unlösliche Merichinonsalze bilden.
(3) Die Merichinon-Polyanion-Komplexe besitzen charakteristische Farben, grün-blau für Polyacrylat und blau-violett für Dextransulfat, unabhängig von den Farben der Pufferanionensalze, die sich gleichzeitig in der gleichen Reaktionsmischung bilden.
(4) Der Polyacrylat-Komplex ist nicht so fest an die kationischen Adsorbentien gebunden wie der Dextransulfat- Komplex. Dieser Effekt wird erwartet, da Polyacrylat viel weniger negativ geladen ist als Dextransulfat.
(5) Nylon bindet den Polyacrylat-Merichinon-Komplex fester als es kationische Papiere tun. Dieser Effekt ist ebenfalls nicht überraschend, da sowohl Polyacrylat als auch Nylon viel weniger hydrophil sind als Dextransulfat und Papier und so eine gewisse nicht-kovalente Affinität gegenüber hydrophoben Wechselwirkungen zeigen könnten.
(6) Die Komplexionen durchdringen die polymeren Träger vollständig in solcher Weise, daß der Farbe eine große mechanische Widerstandsfähigkeit verliehen wird.

II. Neutrale Adsorbentien

Die in Teil A mit kationischen Adsorbentien verwendete Methode wurde mit zwei ungeladenen Polymeren wiederholt, die in Streifenform hergestellt wurden: Membranfilter von Nitrocellulose (0.45 um) und Nylon 66 (0.45 um). Die kationische Nylonmembrane wurde als positive Kontrolle wiederholt. Der einzige prozedurale Unterschied zu Teil A bestand darin, 1-2 ng Meerrettich-Peroxidase pro 3 ml Vertiefung zu verwenden anstelle von 5 ng, so daß Merichinon langsamer entwickelt wurde. Dieser Unterschied hatte zur Folge, daß beinahe alles Merichinon an den Streifen adsorbiert wurde, statt als Citrat- oder Pyrophosphatsalz abgelagert zu werden, wahrscheinlich deshalb, weil das meiste Merichinon eine Chance besaß, in die Streifen zu diffundieren, bevor dessen Konzentration ausreichend groß wurde, um eine Ausfällung zu erzeugen.
Die kationischen Nylonmembran-Streifen verhielten sich wie zuvor. Unabhängig vom Pufferanion wurden die mit Dextransulfat vorbehandelten Membrane blau-violett; mit Wasser vorbehandelte Membrane hielten keine Farbe zurück nach weniger als einer Stunde Eintauchen in 10&supmin;¹ M Na-Acetat, 10% Ethanol, pH 5.0. Durch Eintauchen über Nacht in diesem Lösungsmittel konnte keine Farbe der mit Polyanionen behandelten Membrane entfernt werden. Die ungeladene Nylonmembrane verhielt sich in jeder Hinsicht völlig gleich wie die kationische Nylonmembrane. Die Nitrocellulosemembranen unterschieden sich von den anderen in einem wesentlichen Aspekt: eine gleichmäßige grüne Farbe wurde in allen Membranen festgestellt, unabhängig von der Vorbehandlung oder dem Pufferion. Dextransulfat ergab keine blau-violette Ablagerung und die mit Wasser behandelten Membranen waren beinahe so dunkel wie jene, die Polyanion gesehen hatten.
Aus diesem Experiment müssen zwei wesentliche Schlußfolgerungen gezogen werden:
(1) Die polymeren Anionen haben ausreichende Affinität zu nominell neutralen Membranen, so daß Adsorbentien nicht auf kationische Polymere beschränkt werden müssen.
(2) Das TMB-Merichinon besitzt genug Affinität zu der geprüften, am meisten hydrophoben Membrane, Nitrocellulose, so daß ein polymeres Anion nicht immer notwendig sein könnte. Die bei der Bindung an Nitrocellulose gebildete Farbe ist jedoch nicht so dunkel als jene, die man bei anderen Membranen sieht, die mit polymeren Anionen behandelt wurden.
Diese Versuche erlauben keine Wahl des besten Adsorbens und immobilisierenden Ions für tatsächliche analytische Verfahren, da nicht versucht wurde, in der Nähe der optischen Bestimmungsgrenze zu arbeiten. Aus der Fähigkeit von Merichinon, ohne polymeres Anion an Nitrocellulose zu binden, folgt nicht, daß diese Wechselwirkung stark genug ist oder daß die Farbe dunkel genug ist, um analytisch nützlich zu sein. Wie in Teil A ist die auf Membranen gebildete Farbe völlig widerstandsfähig gegen mechanische Entfernung, unabhängig von der Membranzusammensetzung.
Dieses Beispiel liefert ein Modell für einen weiten Bereich von analytischen Anwendungen der ionischen Eigenschaften des TMB-Merichinons, wobei dieser gefärbte Indikator der oxidativen (insbesondere peroxidativen) Aktivität immobilisiert und lokalisiert wird über eine Komplexierung mit polymeren Anionen, welche eindringen und stark an polymere Träger gebunden sind. Die Wechselwirkungen, welche die polymeren Anionen immobilisieren, können ionisch oder hydrophob sein oder beides, abhängig von der Wahl des polymeren Anions und des Trägers. Solche Komplexionen können einen großen Vorteil gegenüber kristallinen Merichinonsalzen aufweisen, indem sie viel fester an den Träger gebunden sind als Kristalle, auf eine Art, die einer mechanischen Zerstörung widersteht.

BEISPIEL 4

Immobilisierung des Merichinons von TMB und dessen Komplex mit Dextransulfat auf Ionenaustauschharzen

Lösungen des Merichinons von TMB und des Merichinonkomplexes mit Dextransulfat wurden hergestellt durch Inkubieren bei Raumtemperatur von ungefähr 1 ug Meerrettich-Peroxidase mit 50 ml Volumina von 0.2 mg/ml TMB, 0.0015% H&sub2;O&sub2;, 10% Ethanol in jedem der folgenden Puffer: 0.10 M Natriumacetat, 1.0% Dextransulfat und 0.10% Dextransulfat. Alle Puffer wurden mit NaOH oder HCl auf End-pH-Werte von 5.0 eingestellt, nachdem das Ethanol zugesetzt wurde. Nach 12-stündiger Reaktion wurde die Acetat-Reaktionsmischung dunkelblau ohne Kristalle und die Dextransulfat-Reaktionsmischung wurde violettschwarz ohne Kristalle. Die Niederschläge wurden bei 5ºC bis zur Verwendung gelagert; während dieser Inkubation bildeten sich im Acetat einige Kristalle; keine entwickelten sich in beiden Dextransulfatlösungen.
Etwa 0.5 ml Schichten der folgenden Ionenaustauschpolymere wurden bei Raumtemperatur in Polypropylen-Wegwerfkolonnen gegossen: Carboxymethylcellulose, Carboxymethyl- Sepharose, Sulfopropyl-Trisacryl, Diethylaminoethylcellulose und Diethylaminoethyl-Sepharose. (Sepharose ist eine kügelchenförmige Agarose. Trisacryl ist ein besonders hydrophiles Analogon von Polyacrylamid, ebenfalls in Kügelchenform ausgebildet). Drei Kolonnen von jedem Ionenaustauscher wurden hergestellt, eine für jede der oben beschriebenen löslichen Merichinon-Präparate. Nachdem jede Schicht mit mindestens 5 ml 0.10 M Natriumacetat, 0.001 M EDTA, 10% Ethanol, pH 5.0, gewaschen wurde, wurden Aliquote von jedem der drei Merichinon- Präparate zu getrennten Kolonnen von jedem Austauscher zugesetzt und die Kolonne durchdringen gelassen; dann wurden 2-10 ml Volumina des Kolonnen-Gleichgewichtspuffers verwendet, um irgendwelches ungebundenes Merichinon durch jede Kolonne zu waschen.
Drei Serien-Aliquote von Merichinon in Acetatpuffer wurden auf eine Kolonne gebracht, die jede Ionenaustauscher enthielt: 0.10 ml, 0.50 ml und 5.0 ml. Bei jedem der Kationenaustauscher befand dich die gesamte blaue Farbe in einem sehr engen Band am oberen Ende der Kolonne. Weniger als 20% der Kolonnenkapazität wurde in jedem Fall benützt. Es konnte keine Farbe aus der Kolonne ausgewaschen werden in 0.10 M Na- Acetat, 10% Ethanol, pH 5.0. Bei allen Anionenaustauschern wurde die gesamte Farbe direkt durch die Kolonne gewaschen. Einige wenige Kristalle des Acetatsalzes des Merichinons, die sich während der Lagerung bei 5ºC gebildet hatte, wurde mechanisch am oberen Ende der Kolonne aufgefangen und mußte durch Durchwirbeln im Eluentenpuffer gelöst werden. Es gab keine Anzeichen eines Zurückhaltens durch Ionenaustausch- Wechselwirkungen.
Ein 0.10 ml Aliquot von Merichinon in 1% Dextransulfat wurde auf eine Kolonne mit jedem Ionenaustauscher geben. Die violette Farbe wurde mit 2-3 ml Lösungsmittel durch den Kationenaustauscher gewaschen mit keiner offensichtlichen Verzögerung oder einem Zurückhalten. Die Kolonnen blieben sehr schwach grün, was auf eine leichte Konkurrenz zwischen dem Ionenaustauscher und dem Dextransulfat für Merichinon hindeutet. Zwei der Kationenaustauscher blieben stärker grün als der andere; diese Tatsache deutet darauf hin, daß die ersteren höhere Austauschkapazitäten oder Affinitäten zu Kationen besitzen als die letztere. Die violette Farbe wurde vollständig in einem Band am oberen Ende einer der Anionenaustauschkolonnen zurückgehalten, wurde aber durch die andere Anionenaustauschkolonne unvollständig zurückgehalten. Diese Tatsache deutet darauf hin, daß die erstere eine größere Austauschfähigkeit hat als die letztere.
Zwei Serien-Aliquote von Merichinon in 0.1% Dextransulfat wurden aufgetragen und durchgewaschen durch eine Kolonne, die jeweils Austauscher enthielt: 0.10 ml und 0.40 ml. Abermals wurde die gesamte violette Farbe durch jeden Kationenaustauscher gewaschen, wobei eine schwach grüne Farbe zurückblieb, die schwächer in einer als in den anderen war. Eine Anionenaustauschkolonne hielt die gesamte aufgetragene violette Farbe zurück, sogar nach Waschen mit 5 ml 0.10 M Na-Acetat, 10% Ethanol, pH 5.0. Die andere Anionenaustauschkolonne hielt die gesamte violette Farbe im 0.10 ml Aliquot des Merichinons zurück, aber ließ etwa die Hälfte davon im folgenden 0.40 ml Aliquot durch. Wiederum schien es, daß die substituierte Cellulose höhere Austauschfähigkeit besitzt als die substituierte Sepharose.
Diese Ergebnisse sind in völliger Übereinstimmung mit dem folgenden strukturellen Modell für das Merichinon und dessen Komplex mit Dextransulfat. Das Merichinon ist ein Kation, das ein sehr lösliches Acetatsalz bildet. Als ein Kation bindet es gut an Kationenaustauscher, aber nicht an Anionenaustauscher. Die Festigkeit der Bindung unterstützt die Idee, daß das Merichinon ein Dikation ist. Es bildet einen engen Komplex mit dem polymeren Anion, Dextransulfat. Bei den hierin verwendeten molaren Verhältnissen von Merichinon und polymerem Anion gibt es einen Überschuß an negativen Ladungen am Dextransulfat, so daß das Komplexion nicht ausfallen kann, sich fest an Anionenaustauschern und nicht an Kationenaustauschern bindet. Die Nettoladung des Komplexions ist jedoch so viel höher als diejenige des Merichinons, daß Ionenaustauschadsorbentien mit ähnlicher ionischer Kapazität viel weniger Pigmentierung binden, wenn es an Dextransulfat gebunden ist, als wenn es als nicht komplexiertes Merichinon vorhanden ist. Da die Wechselwirkung zwischen Merichinon und polymerem Anion reversibel ist, kann etwas Merichinon aus dem Komplex austreten und an einen Kationenaustauscher binden, wenn der Komplex durch den letzteren durchgeleitet wird. (Die grüne Farbe, Anzeichen von partieller Dissoziation des Merichinons in TMB und das Chinondiimin, wird allgemein gesehen, wenn das Merichinon in niedriger Konzentration in Abwesenheit von überschüssigem TMB vorhanden ist.)
Dieses Experiment liefert ein Modell für einen weiten Bereich von analytischen Anwendungen der ionischen Eigenschaften des TMB-Merichinons, wobei dieser gefärbte Indikator der oxidativen (insbesondere peroxidativen) Aktivität immobilisiert und auf Ionenaustauschpolymeren lokalisiert wird. Er kann direkt an negativ geladene Träger gebunden oder an ein polymeres Anion komplexiert werden, das an positiv geladene Träger bindet. In diesem Beispiel trat eine solche Komplexierung vor der Immobilisierung ein. In einer derartigen Anwendung sollte ein zu großer Überschuß an polymerem Anion vermieden werden. Sonst kann die beschränkte Austauschfähigkeit des Trägers verhindern, daß alles Merichinon gebunden wird. In Beispiel 3 trat Komplexierung von Merichinon mit polymerem Anion ein, nachdem das letztere am Träger adsorbiert wurde. Eine solche Strategie hat zwei Vorteile. Sie vermindert die Wahrscheinlichkeit einer Beschränkung der Trägerbindungskapazität für polymeres Anion. Sie wird auch weniger wahrscheinlich die Diffusion des Merichinons von der Stelle der Bildung weg erlauben. Dieses letztere Merkmal ist für viele analytische Anwendungen wichtig, wo eine Lokalisation der peroxidativen Aktivität ebenso wichtig ist, wie die die Empfindlichkeit steigernde Konzentration der Farbe in einer kleinen Region.

BEISPIEL 5

Verwendung von TMB zur Sichtbarmachung der Nukleinsäure- Hybridisierung an Gen-Southernblots

I. Herstellung der DNA-Proben

Die Synthese von N-Biotinyl-N'-(4'-methylen-trioxsalen)- 3,6,9-trioxa-undecan-1,11-diamin und von 1-(Biotinylamino)- 13-(4,5',8-trimethylpsoralen-4'-yl)-3,6,9,12-tetraoxa-tridecan ist im U.S. Patent Nr. 4 582 789, erteilt am 15. April 1986, beschrieben. Zusätzlich offenbart dieses Patent die Biotinylierung von DNA unter Verwendung dieser Verbindungen zur Herstellung von HLA-DPa-Proben.

II. Hybridisierung von Proben zu HLA-Insert

Zwei ug menschlicher DNA wurden mit BglII verdaut, elektrophoretisch in 1% Agarose-Minigels behandelt und auf eine Genatran 45 ladungsmodifizierte Nylonmembrane, wie durch Southern, (1975) JMB 98 : 503-517, beschrieben, übergeführt. In einigen Spuren wurden biotinylierte DNA-Molekulargewichts- Marker (oben beschrieben) und/oder eine positive Kontrolle mit eingeschlossen, bestehend aus Gen-DNA, isoliert aus einer homozygoten Typisierungs-Zellinie WT51 (Tissue Antigen Laboratory, Imperial Cancer Research Fund, London, England), verdaut mit der gleichen Restriktions-Endonuklease. Nach dem Transfer auf das Membran wurde die filtergebundene menschliche DNA auf der Membrane fixiert, unter Verwendung des Standardverfahrens mit Base, Neutralisation mit Tris-HCl-Puffer und Erhitzen während einer Stunde oder länger auf 80ºC in einem Vakuumofen, wie beschrieben von Southern, oben. Die Membrane wurde dann während einer Minute mit destilliertem Wasser befeuchtet und in einen verschließbaren Beutel gebracht. Eine Vorhybridisationslösung wurde dann zu der Membrane zugesetzt, bestehend aus 5 · Denhardt's Lösung mit 50% Formamid, 5 · SSPE, 0.5% (Gew./Vol.) SDS, 0-10% (vorzugsweise 5%) Dextransulfat und 150 ug/ml denaturierte Heringssperma-DNA (erhältlich von Sigma). Die Membrane wurde 2-4 Stunden bei 42ºC mit der Lösung inkubiert. Dann wurde zu der Membrane eine Hybridisationslösung zugesetzt in einer Menge von 0.1 ml Lösung/cm² Membrane, bestehend aus 5 · Denhardt's Lösung mit 50% Formamid, 5 · SSPE, 0.5% (Gew./Vol.) SDS, 0-10% Dextransulfat, 150 ug/ml denaturierte Heringssperma-DNA (vor der Denaturierung einer Scherbehandlung unterworfen durch wiederholte Passagen durch eine 25 gauge Hypoderm-Nadel) und 50-200 ng pro ml von jeder Probe. Die Membranen wurden über Nacht (etwa 14-18 Stunden) bei etwa 42ºC inkubiert. Die Membranen wurden dann durch dreimaliges Schütteln während je fünf Minuten bei Raumtemperatur in 2 · SSPE, 0.5% Tensid und dreimaliges Schütteln während fünf Minuten bei 60ºC in 0.2-0.3 · SSPE, 0.5% Tween 20 gewaschen, um einen Probe-hybridisierten Southernblot herzustellen.

III. Meerrettich-Peroxidase-Streptavidin(HRP-SA)- Konjugat-Herstellung

Meerrettich-Peroxidase(HRP)-Mengen wurden auf Grund eines angenommenen Molekulargewichts von 40 000 g/mol und einem angenommenen A402, 1cm, 0.1% von 2.5 berechnet. Streptavidin(SA)-Mengen wurden auf Grund eines angenommenen Molekulargewichts von 60 000 g/mol und einem angenommenen A280, 1cm, 0.1% von 3.0 berechnet.
Zu 40 mg HRP, gelöst in 1.9 ml 0.10 M Na-Phosphat, pH 7.5, und dialysiert bei 4ºC gegen den gleichen Puffer, wurden 0.14 ml eines 14 mg/ml mal-sac-HNSA-Esters, gelöst im gleichen Puffer, zugesetzt. [Der mal-sac-HNSA-Ester (wobei HNSA = 4-Hydroxy-3-nitrobenzolsulfonsäure) wird wie folgt hergestellt. Bhatnagar et al., Peptides:Synthesis-Structure- Function, Her. durch D. Rich et al. (Rockford:Pierce Chemical Co., 1981), S. 97-100, beschreibt eine Methode zur Herstellung von DNP-SAC- und TNP-SAC-Estern durch Verwendung von N- Maleimido-6-aminocapronsäure als die Säure, die zur Herstellung des mal-sac-HNSA-Esters verwendet werden kann. Der HNSA- Ester wird auch von Nitecki et al., High-Technology Route to Virus Vaccines (American Society for Microbiology: 1986) in einem Kapitel mit dem Titel "Novel Agent for Coupling Synthetic Peptides to Carriers und Its Application" {Neues Mittel zum Kuppeln von synthetischen Peptiden an Träger und ihre Anwendung}] beschrieben. Diese Mischung wurde 105 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, an einer 10.5 ml Kolonne von Sephadex G-25, äquilibriert mit 0.010 M Na-Phosphat, 0.005 M EDTA, pH 6.0, entsalzt und bei 4ºC gegen drei 200 ml Volumina des gleichen Puffers dialysiert. Der Maleimid-Gehalt der derivatisierten HRP wurde analysiert durch Verdünnen von 0.2 mg in 0.50 ml 0.10 M Na-Phosphat, 0.005 M EDTA, pH 7.0, Zusetzen von 20 ul 0.74 mM Cystein, Inkubieren während 5 Minuten bei Raumtemperatur, Zusetzen von 33 ul von 4 mg/ml 5,5'-Dithiobis(2-nitrobenzoesäure), Inkubieren während 2 Minuten bei Raumtemperatur und Messen von A&sub4;&sub1;&sub2; in einem Spektrophotometer. Der Unterschied in ΔA&sub4;&sub1;&sub2; zwischen dieser Reaktion und einer Kontrollmischung, zu der kein Protein zugesetzt wurde, dividiert durch den Δ&epsi;&sub4;&sub1;&sub2; von 1.36 · 10&sup4; M&supmin;¹cm&supmin;¹ lieferte die Maleimid-Molarität in der verdünnten HRP.
Fünfzehn mg SA wurden in 1.5 ml von 0.10 M Na-Phosphat, pH 8.0, gelöst, bei 4ºC gegen drei 200 ml Volumina des gleichen Puffers dialysiert und auf eine Konzentration von 6 mg/ml im gleichen Puffer verdünnt. S-Acetyl-mercaptobernsteinsäureanhydrid (SAMCA) wurde in Dimethylformamid mit einer Konzentration von 8.8 mg/ml gelöst. Zu 12 mg dialysiertes SA wurden 125 ul dieser SAMCA-Lösung im Verlaufe von etwa 1 Minute unter leichtem Rühren bei Raumtemperatur zugesetzt. Nach 30-minütigem Inkubieren bei Raumtemperatur wurde die Reaktionsmischung an einer 10.5 ml Kolonne von Sephadex G-25, äquilibriert mit 0.10 M Tris-Cl, 0.005 M EDTA, pH 6.8, entsalzt. Das vereinigte Protein wurde bei 4ºC gegen drei 200 ml Volumina des gleichen Puffers dialysiert. Das dialysierte derivatisierte SA wurde bei Raumtemperatur auf 10 mg/ml in einer Ultrafiltrationseinrichtung mit einer YN10-Membrane eingeengt. Zehn mg des konzentrierten SA wurden mit 0.5 ml von 1.0 M Hydroxylamin in 0.10 M Tris-Cl, 0.005 M EDTA, pH 6.8, unter leichtem Rühren vermischt. Nach einer 30-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur wurde das SA an einer 10.5 ml Kolonne von Sephadex G-25, äquilibriert mit 0.010 M Na-Phosphat, 0.005 M EDTA, pH 6.0, entsalzt. Ein kleines Aliquot des vereinigten Proteinpeaks wurde auf reaktive Thiole analysiert durch Messung des Unterschieds in A&sub4;&sub1;&sub2; nach Zusatz von 5,5'- Dithiobis(2-nitrobenzoesäure) auf eine Konzentration von 1 mM in 0.10 M Na-Phosphat, pH 8.0.
Die Assays auf Maleimid bei HRP und auf Thiolen bei SA wurden unmittelbar vor ihrem Mischen zur Durchführung der Kupplungsreaktion vorgenommen. Dann wurden 3.95 ml von 13.0 mg/ml HRP mit 0.67 Maleimiden/HRP in einem Eisbad mit 2.47 ml von 4.19 mg/ml SA mit 9.66 Thiolen/SA vermischt. Nach 24- stündigem Inkubieren bei 5ºC wurden die nicht reagierten Thiole durch Zusatz von 0.47 ml von 4.6 mg/ml N-Ethylmaleimid, gelöst in 0.010 M Na-Phosphat, 0.005 M Na-EDTA, pH 6.0, und Inkubieren bei Raumtemperatur während 30 Minuten blockiert
Die Reaktionsmischung wurde in Konjugat-Sammlungen(Pools) mit verschiedenem mittleren HRP/SA-Molverhältnis fraktioniert, von nicht-umgesetzter HRP durch Gelfiltrations-Chromatographie an einer 2.5 · 80 cm Kolonne bei 4ºC in 0.10 M Na- Phosphat, pH 6.8, bei einer Fließgeschwindigkeit von 3 cm/Stunde getrennt. Die Zusammensetzung der Konjugat-Sammlungen wurde spektrophotometrisch aus dem A&sub4;&sub0;&sub2;/A&sub2;&sub8;&sub0;-Verhältnis geschätzt und genau durch densitometrische Auswertung an einem grün-gefärbten 5-20% Gradient-SDS-PAGE-Gel quantifiziert, durchgeführt unter reduzierenden Bedingungen. Etwa 10 mg von gemischtem Dimer und Trimer (Arten, die 2 HRP:SA und 3 HRP:SA enthalten) und 5 mg von ziemlich reinem Monomer wurden aus der Gelfiltration gewonnen. Diese Konjugat-Sammlungen, die kein feststellbares nicht gekuppeltes SA oder HRP enthielten, wurden bei 4ºC während vieler Monate mit vernachlässigbarem Verlust an Protein oder katalytischer HRP-Aktivität gelagert. Die Mischung von Dimer und Trimer wurde vorzugsweise verwendet bei der Bestimmung von biotinylierter DNA-Probe, hybridisiert zu menschlichem Gen-Southernblots, doch Monomer gab beinahe die gleiche Intensität der Färbung.

IV. Proben-Analyse

Alle Operationen fanden bei Raumtemperatur statt. Der Proben-hybridisierte Southernblot von Sektion II wurde einmal in 35 ml mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (2.7 mM KCl, 136.9 mM NaCl, 1.5 mM KH&sub2;PO&sub4; und 8 mM Na&sub2;HPO&sub4;) gespült, zu der 0.1 M NaCl und 5% Triton X-100 (Puffer A) zugesetzt worden war. Nach 5 Minuten unter schwachem Rühren wurde das Spüllösungsmittel durch Puffer A ersetzt, der HRP-SA in einer solchen Konzentration enthielt, daß der Bestandteil HRP in einer Menge von 0.3 ug/ml vorhanden war. Die Menge Puffer A plus HRP-SA war 0.5-1 ml/cm³ Membrane. Das Konjugat wurde 20 Minuten mit der Membrane mit oder ohne Rühren inkubiert. Dann wurde die Membrane in eine reine Petrischale entfernt und 5 mal mit 45 ml Volumina Puffer A gespült, dem 0.15 M 1,1- Diethylharnstoff und 1% Na-Dextransulfat (Puffer B) zugesetzt worden war. Diesen Waschungen von 5 Minuten unter schwachem Rühren folgte eine Waschung unter schwachem Rühren während 5 Minuten mit 10 mM Na-Citrat, 10 mM Na-EDTA, pH 5.0, (Puffer C), enthaltend 0.1 mg/ml TMB. An diesem Punkt wurde die Membrane ungestört in 50 ml Puffer C inkubiert, enthaltend 0.1 mg/ml TMB und 0.0014% H&sub2;O&sub2;. Nach 15-60 Minuten entwickelten sich auf der Membrane dunkelblaue Bänder, wo biotinylierte DNA lokalisiert war - entweder biotinylierte λ-DNA-Fragmente, verwendet als Molekulargewichtsstandards, oder biotinylierte Probe, hybridisiert zur Ziel-DNA. Wenn ein zufriedenstellender Kontrast erhalten wurde, wurde die Substratlösung von der Membrane abtropfen gelassen, die viermal während je fünf Minuten mit 50 ml Wasser unter leichtem Rühren gewaschen wurde. Die gewaschene Membrane wurde in Wasser in einem verschlossenen Teströhrchen oder Plastikbeutel im Dunkeln bei Raumtemperatur, 4ºC oder -20ºC aufbewahrt.
Wenn 2 ug DNA von einer menschlichen Person, die ein DQα- HLA-Gen-Träger ist, der gerade beschriebenen Analyse unterworfen wird und das Southernblot mit einer zirkularen DNA- Probe hybridisiert wurde, die ein DQα-Insert enthält und kovalent durch 0.05 Mole BP3 pro Mol DNA-Basenpaar mit einem tag versehen war, enthielt das Muster nach HRP-TMB Sichtbarmachung zwei Bänder von gleicher Intensität, eine bei 2.3 Kilobasen und eine bei 4.7 Kilobasen, relativ zu den biotinylierten Molekulargewichtsstandards auf dem gleichen Blot. Wenn das Citrat im Puffer C durch Pyrophosphat oder Sulfat ersetzt wurde, Ionen, für welche Beispiel 1 zeigt, daß sie Merichinonsalze mit viel dunkleren Farben ergeben, als es Citrat tut, blieb die Southernblot-Farbe unverändert. Wenn Dextransulfat aus der Hybridisierungsvorschrift entfernt wurde, wurde auf dem Southernblot kein dauerhaftes Muster gebildet. Wenn neutrale Nylon-Membrane anstelle von kationischen Ladungs-modifizierten Membranen, wie in Beispiel 3 oder in diesem Beispiel, verwendet wurden, um den Southernblot herzustellen, war das Merichinon-gefärbte Bandmuster ebenfalls sehr labil und tendierte, von der Oberfläche der Membrane in die Lösung zu diffundieren, falls, aber nur falls Dextransulfat nicht zum Puffer B zugesetzt wurde. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, daß bei wie oben beschrieben hergestellten Southernblots etwas Dextransulfat, das in der Hybridisierungsstufe verwendet wurde, an die kationische Membrane bindet und die Immobilisierung des während der Probenanalyse gebildeten Merichinons erlaubt. Zusatz von Dextransulfat während den Waschungen nach Konjugat-Inkubation kann eine Kompensation für die schwache Retention von Dextransulfat aus der Hybridisierung ergeben.

BEISPIEL 6

Verwendung von TMB zur Sichtbarmachung von Immunoblots

I. Immunoblot-Herstellung

Die oben angegebenen eukaryotischen Zellinien wurden bis zum annähernden Zusammenfluß in einem DME-Gewebekultur- Medium gezüchtet, ergänzt mit 5% fötalem Kälberserum. ganzzellen-Extrakte wurden hergestellt durch Absaugen des Gewebekultur-Mediums und Zusatz von Lyse-Puffer (0.20 M LiCl, 0.020 M Tris-Cl, 0.001 M EDTA, 0.5% Nonidet P-40 und 0.05% Aprotinin, pH 8.0) direkt zu den Gewebekultur-Platten. Die erhaltene klare Lösung wurde mit einem gleichen Volumen von 5% SDS, 1 M Dithiothreit, 10% Glycerin, 0.005% Bromphenol-Blau, 0.125 M Tris-Cl, pH 6.8, vermischt. Fünfzig ul Proben wurden durch SDS-PAGE in einem 3.5 · 4 cm 12% Polyacrylamid-Gel (Laemmli (1970), Nature 227 : 680-685) fraktioniert.
Eine Herstellung eines Immunoblots des Gels auf Nitrocellulose (Schleicher und Schuell, 0.45 um) wurde in einer Bio-Rad Trans-Blot-Zelle bei 35 V während einer Stunde bei Raumtemperatur vorgenommen, im wesentlichen gemäß den veröffentlichten Methoden (Towbin et al. (1979) Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 76 : 4350-4354; Bittner et al. (1980) Analytical Biochemistry 102 : 459-471; Burnette et al. (1981) Analytical Biochemistry 112 : 195-203). Anschliessend an den Transfer wurden nicht-spezifische Antikörperbindungsstellen auf der Nitrocellulose blockiert durch Inkubieren während 30 Minuten bei Raumtemperatur unter schwachem Rühren in 250 ml von 5% entrahmtem Milchpulver, 1% Ovalbumin, 1 M Glycin. Dann wurde der Blot dreimal während je fünf Minuten unter schwachem Rühren bei Raumtemperatur mit 250 ml Volumina von 0.1% entrahmtem Milchpulver, 0.1% Tween 20, 0.15 M NaCl, 17.5 mM KH&sub2;PO&sub4;, 14.74 mM NaOH, pH 7.4, gewaschen und unter schwachem Rühren während drei Stunden bei Raumtemperatur in 5 ml einer 1/400 Verdünnung in dem vorstehenden Puffer von Kaninchen-Antiserum gegen ein synthetisches Oligopeptid mit der Aminosäuresequenz inkubiert, die den Aminosäuren 29 bis 44 des ras-Onkogens entspricht. Nach dreimaligem Waschen wie oben beschrieben, wurde der Blot eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit 5 ml einer 1/3000 Verdünnung des Ziegenanti-Kaninchen IgG, konjugiert mit Meerrettich-Peroxidase, inkubiert und abermals dreimal gewaschen wie oben.

II. TMB-Bestimmung von immobilisiertem HRP-Immunokonjugat

Der Immunokonjugat-behandelte Blot wurde bei Raumtemperatur ohne Bewegung fünf Minuten in 50 ml von 0.10 M Na-Fumarat, 0.0001 M EDTA, pH 4.8, und dann 30-60 Minuten in 50 ml von frisch hergestelltem 0.10 M Na-Fumarat, 0.001 M EDTA, 5% Ethanol, 0.1 mg/ml TMB, 0.00075% H&sub2;O&sub2; eingetaucht. Als das Muster den gewünschten Kontrastgrad zwischen den spezifisch gefärbten Bändern und dem Untergrund erreicht hatte, wurde der Blot 30-60 Minuten in 50 ml von 0.10 M Na-Fumarat, 0.001 M EDTA, pH 4.8, eingetaucht und anschließend bei Raumtemperatur zwischen zwei Blättern Löschpapier getrocknet.

III. 3,3'-Diaminobenzidin(DAB)-Bestimmung von immobilisierten HRP-Immunokonjugaten

Der Immunokonjugat-behandelte Blot wurde ohne Bewegung bei Raumtemperatur während 10 Minuten in 50 ml von 0.1 M Tris-Cl, pH 7.4, enthaltend 25 mg DAB und 0.03% H&sub2;O&sub2;, inkubiert. Nach 15-minütigem Waschen in zirkulierendem destillierten Wasser, wurde der Blot zwischen zwei Blättern Löschpapier getrocknet.
Fig. 3 vergleicht die Verwendung von TMB und DAB, um spezifische Polypeptide von Ganzzellen-Extrakten von eukaryotischen Zellen nach dem Immunoblotting sichtbar zu machen. Die Teile 1 und 2 wurden via TMB-Oxidation gefärbt. Teil 3 wurde via DAB-Oxidation gefärbt. Teil 4 wurde für Protein mit Amido-Black gefärbt. Alle vier Teile stellen Immunoblots dar, hergestellt in identischer Weise außer für die SDS-PAGE unterworfene Probe. Teil 4 stellt eine kommerzielle Mischung von Proteinen dar, die als Molekulargewichts-Marker dienen. Die Molekulargewichtswerte sind (von oben nach unten): 92, 66, 45, 31, 20 bzw. 14 KD.
Das Teil 1 stellt Ganzzellen-Extrakte einer kultivierten Maus-Zellinie, K-balb (linke Spur), und einer kultivierten Ratten-Zellinie, Kp6 (rechte Spur), dar, analysiert auf einem Immunoblot mit einem Antiserum (onc 29), hergestellt durch Inokulieren eines Kaninchens mit einem synthetischen Polypeptid (Aminosäuren 29-44 des 21 KD-Proteins, codiert durch das ras-Onkogen), konjugiert zu Hämocyanin von der Schlüsselloch-Napfschnecke [keyhole limpet] und anschließend blokkiert durch Inkubieren mit dem gleichen synthetischen Polypeptid, konjugiert zu Rinderserumalbumin. Die Teile 2 und 3 sind duplikate Immunoblots von Ganzzellen-Extrakten von drei Zellinien: "Hs242" (linke Spur), K-balb (mittlere Spur) und Kp6 (rechte Spur), analysiert mit dem gleichen Anti-p21- (ras)-Kaninchen-Antiserum, verwendet für den Teil 1, nicht blockiert durch das Serumalbumin-gekuppelte Antigen-Oligopeptid. K-balb und Kp6 werden von Clark et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82 : 5280-5284, beschrieben. "Hs242" ist eine Maus-Zellinie, erzeugt durch Umwandlung der NIH-3T3- Linie mit dem aktivierten ras-p21-Gen aus einer Zellinie, abgeleitet von einem menschlichen Lungen-Adenokarzinom (Yuasa et al. (1983) Nature 303 : 775-779).
Ein Vergleich der Teile 2 und 3 der Fig. 3 zeigt, daß bei Immunoblots die TMB-Sichtbarmachung zwei- bis viermal empfindlicher ist als die DAB-Sichtbarmachung. Das natürlich vorkommende Polypeptid p21, identifiziert durch das Kaninchen-Antiserum onc 29, besitzt gemäß dem Immunoblot ein Molekulargewicht von 21 KD und wird nicht festgestellt, wenn das Antiserum durch das immunogene kürzere Polypeptid blokkiert ist, das verwendet wird, um den Anti-p21-Antikörper festzustellen (Teil 1).
Die obigen Beispiele zeigen die verbesserte Leistungsfähigkeit von Westernblots und Southernblots, wenn TMB als ein Meerrettich-Peroxidase- Substrat unter Bedingungen verwendet wird, bei denen das zugesetzte Anion dazu beiträgt, die entwickelte Farbe zu lokalisieren. Diese Technologie hat es gestattet, die Zielsetzung hinsichtlich der Bestimmungsgrenze bei DNA-Proben in menschlichen Gen-Southernblots und die Identifikation des ras-p21-Antigens in Westernblots von Zellextrakten zu erreichen.

BEISPIEL 7

Bestimmung von HRP in Lösung durch Festhalten des Fumaratsalzes des Merichinons von TMB auf Filter

Eine Fumarat-gepufferte HRP-Assay-Lösung wurde hergestellt durch Mischen von 50 ul 0.60 M H&sub2;O&sub2; (in Wasser), 50 ul 0.060 M 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB, in 95% Ethanol) 40 ul 0.25 M Natrium-EDTA, pH 7.2, 1.00 ml 0.100 M Natriumfumarat, pH 3.60, und 9.00 ml entionisiertes Wasser. Die Endlösung war 3.0 mM H&sub2;O&sub2;, 0.31 mM TMB, 1.0 mM EDTA, 10 mM Fumarat, pH 3.92. Kurz vor dem Assay wurden mit 0.10 M NaCl, 1.0 mM Na-Phosphat, pH 6.0, HRP-Stammlösungen hergestellt, enthaltend 22 ng/ml oder 0.43 ng/ml HRP. Die HRP-katalysierte Oxidation von TMB durch H&sub2;O&sub2; wurde durch Zusatz von 20 oder 2.0 ul von 22 ng/ml HRP oder 20 oder 10 ul von 0.43 ng/ml HRP auf 1.00 ml Assaylösung bei 25ºC eingeleitet. Bei den zwei höheren HRP-Konzentrationen (11 und 1.1 pM in der Küvette) wurde die Bildung des Merichinons bei 652 nm während fünf Minuten in einem Spektrophotometer verfolgt. Bei den zwei niedrigeren HRP-Konzentrationen (0.22 und 0.11 pM in der Küvette) wurde die Reaktion 30 Minuten lang verfolgt. Am Ende jeden Reaktionsintervalls wurden 100 ul Replikat-Volumina der Reaktionsmischung auf ein Polycarbonatfilter (Porengröße 3 um) getüpfelt und durch geringes Saugen getrocknet, um Ablagerungen von 3-4 mm Durchmesser zu geben.
Die kinetischen Kurven dieser Reaktionen zeigten die Anfangssteigungen, die für die betreffenden HRP-Konzentrationen zu erwarten sind. Nach einem Intervall von 1-10 Minuten jedoch (steigend mit der Erniedrigung der HRP-Konzentration) wurden die Kurven abrupt ebener und zeigten häufig einen scharfen Einschnitt. Dieses Verhalten, das nicht charakteristisch ist für Assays, die in Puffern durchgeführt werden, die das Merichinon nicht leicht ausfällen, wie Citrat und Acetat, zeigt die Keimbildung der Produktkristalle, in diesem Fall das Fumaratsalz des Merichinons. Nach der Keimbildung divergieren die Replikatkurven beträchtlich, wegen der zufälligen Natur von Kristallkeimbildung und -wachstum. Für jede der vier Reaktionen hinterließen 3 um Filtrationen von 100 ul Volumina Reaktionsmischung blaue Ablagerungen, die klar mit dem bloßen Auge sichtbar waren und die beim Stehen während über einer Woche bei Raumtemperatur, ausgesetzt dem sichtbaren Umgebungslicht (aus Fluoreszenzleuchten), stabil waren.
Tabelle V faßt die Ergebnisse der Reaktionen zusammen. Die Anfangsgeschwindigkeit wurde von Absorptionseinheiten pro Zeit durch Division durch den Merichinon-Extinktionskoeffizient, 3.9 · 10&sup4;M&supmin;¹cm&supmin;¹, und durch die HRP-Konzentration auf reziproke Zeit (Umsatzzahl) umgewandelt. Die Gleichmäßigkeit der Umsatzzahl über zwei Größenordnungen der HRP-Konzentration und die Tatsache, daß diese Umsatzzahl-Werte gleich sind wie jene, die bei nicht-ausfällenden Puffern gesehen werden, deutet darauf hin, daß die einzige Wirkung des Fumarats in der Produktlöslichkeit liegt. Die Umwandlungszeit ist die Zeit bis zur Kristallkeimbildung. Diese Daten zeigen, daß dann, wenn die Anwesenheit von HRP visuell durch Beobachtung der Kristalle des Merichinon-Fumaratsalzes verfolgt wird, die durch ein 3 um Filter festgehalten werden können, die HRP-Bestimmungsgrenze in einer 100 ul Reaktionsmischung nach 5-minütiger Reaktion unter 1.1 · 10&supmin;¹&sup6; Mole und nach 30-minütiger Reaktion unter 1.1 · 10&supmin;¹&sup7; Mol liegen würde. Die A&sub6;&sub5;&sub2; der 30-minütigen Reaktionsmischung für 0.11 pM HRP war unter 0.03, dem ungefähren visuellen Schwellenwert, so daß das Festhalten durch Filtration dazu diente, das Signal zu konzentrieren, um die Sichtbarkeit zu erhöhen. Da etwas blaue Farbe beobachtet wurde, die diese ultrafeinen Geradkanal-Filtermembranen durchdringen, könnte eine zusätzliche Empfindlichkeit erreicht werden, indem man eine kleinere Porengröße, ein Tiefenfilter oder eine anionische Membrane verwendet. Zusätzlich würde eine weiße Membrane schärfere visuelle Kontraste bieten als das leicht gelbe, durchscheinende Polycarbonat. Die Umwandlungszeit hat eine sehr flache HRP- Konzentrationsabhängigkeit, so daß es sogar unwahrscheinlich ist, daß geringere HRP-Konzentrationen längere Analysenzeiten erfordern als 30 Minuten, um das Eintreten der Kristallisation zu erlauben. Die Umwandlungszeit könnte wahrscheinlich durch Zusatz von anionischen Latex-Mikrokügelchen verringert werden, die als Kristallisationskeime dienen könnten.
Dieses Experiment ist ein Modell für die Verwendung der Ausfällung des TMB-Merichinons durch wirksame Anionen als Methode des Festhaltens des HRP-Reaktionsproduktes für die visuelle Bestimmung in raschen Enzymimmunoassays. Diese Analysen, die bei der klinischen Diagnostik beliebt werden, folgen einem allgemeinen Aufbau, bei dem man eine Körperflüssigkeit oder einen Extrakt einer Körperflüssigkeit mit einer festhaltenden Oberfläche und mit einem Probenantikörper mit einem tag-Enzym, das für den interessierenden Analyt spezifisch ist, inkubiert, filtriert und wäscht, um die fremden Bestandteile der Testprobe und überschüssiges Proben-Konjugat zu entfernen, mit Enzym-Assay-Puffer inkubiert und, in solchen Fällen, bei denen das gefärbte Enzym-Reaktionsprodukt unlöslich oder immobilisierbar ist, filtriert und abermals wäscht, um die enzymatische Reaktion zu beenden und die Untergrund- Entwicklung zu begrenzen. Die festhaltende Oberfläche kann die Filtermembrane selbst sein oder Teilchen, die in der Flüssigkeit über der Membrane suspendiert sind, und kann den Analyt durch Chemisorption binden oder mit einem Antikörper oder einem anderen bindenden Protein mit einiger Spezifität für den Analyt derivatisiert werden. In allen diesen Fällen ist der Schritt der Enzymbestimmung nicht sehr verschieden, und das gefärbte Produkt muß in gleicher Weise festgehalten werden, falls Filtration und Waschen verwendet wird, um die Reaktion zu unterbrechen und das Signal zu sichern. TABELLE V Kinetik der TMB-Oxidation durch H&sub2;O&sub2; und HRP in einem Fumarat-EDTA-Puffer vom pH 3.9 Reaktionen durchgeführt in 0.31 mM TMB, 3.0 mM H&sub2;O&sub2;, 10 mM Na-Fumarat, 1 mM EDTA, pH 3.92 bei 25ºC Umwandlung Zeit (Min) Mole

BEISPIEL 8

Steuerung der Löslichkeit des Merichinons von TMB durch die Ionenstärke

Das unlösliche Dextransulfatsalz des TMB-Merichinons wurde in zwei Schritten hergestellt. Zuerst wurde das lösliche Merichinon durch Zusatz von 5.0 ml von 2.0 mg/ml TMB (in 95% Ethanol), 25 ul 3%iger H&sub2;O&sub2; (in H&sub2;O) und 20 ul von 20 mg/ml HRP (in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung) zu 45.0 ml von 0.010 M Na-Acetat-Puffer, pH 4.81, hergestellt. Die Endlösung, pH 5.02, war 0.83 mM in TMB und 0.44 mM in H&sub2;O&sub2;; sie wurde innerhalb von Sekunden tief blau. Nach Inkubation bei Raumtemperatur während mindestens 30 Minuten, wurden dann 800-850 ul 1%iges Dextransulfat (in Wasser; 500 kD Dextransulfat) zugesetzt, um sofort eine tief violette Suspension zu ergeben, die sich im Verlaufe von 30 Minuten bei Raumtemperatur absetzte und eine farblose überstehende Flüssigkeit zurückließ. Das Sediment wurde durch Zentrifugieren und mehrmaliges Waschen mit entionisiertem H&sub2;O gewonnen, bevor es bei 4ºC gelagert wurde.
Um die Abhängigkeit der Merichinonlöslichkeit von der Ionenstärke zu untersuchen, wurden Natriumacetat-Puff er von pH 4.96-5.02 hergestellt bei einer Acetat-Gesamtkonzentration von 0.010, 0.025, 0.050, 0.100, 0.200 und 0.400 M. Bei diesem pH sollten die Ionenstärkenwerte 64% der Acetat-Konzentrationen betragen. Zu einem 2 ml Volumen jedes Puffers wurden etwa 10 mg festes TMB und 5 mg eines feuchten Merichinon-Dextransulfatsalzes gegeben. Diese Mischungen wurden bei 23ºC während insgesamt je etwa fünf Minuten in einem Vortex-Gerät vermischt, bevor sie zentrifugiert und die überstehenden Lösungen mit einer Pasteur-Pipette sorgfältig entfernt wurden. Die 260-800 nm Spektren wurde in einem Spektrophotometer aufgenommen. Mischen, Zentrifugieren und Untersuchen wurden zweimal wiederholt, so daß insgesamt drei Reihen von Absorptionswerten erhalten wurden, um auf Gleichgewicht zu prüfen. Die Absorptionswerte blieben entweder konstant oder nahmen mit wiederholter Messung etwas ab, was darauf hindeutet, daß die erste Mischung ausreichte, um Gleichgewicht zu erreichen.
Die Merichinon-Löslichkeit war ungefähr proportional zur Ionenstärke für Acetatkonzentrationen bis zu 0.4 M (Ionenstärken bis zu 0.26), was eine fünffache Steigerung von 0.01 bis 0.4 M Acetat zeigt. Bei Acetat-Konzentrationen von 10&supmin;² M oder weniger war gelöstes Merichinon bei 652 nm (A&sub6;&sub5;&sub2; < 0.008) kaum feststellbar, wenn es im Gleichgewicht mit einem Salz stand, das Ladungs-äquivalente Mengen Merichinon und Dextransulfat enthielt. Eine derart niedrige Konzentration ist visuell nicht feststellbar. Die Abhängigkeit der TMB-Löslichkeit von der Acetat-Konzentration wurde ebenfalls in der gleichen Weise wie die Merichinon-Löslichkeit gemessen, mit Ausnahme, daß das Merichinonsalz bei den Inkubierungen weggelassen und gelöstes TMB bei 285 nm beobachtet wurde. In diesem Fall zeigte die Löslichkeit eine geringe und lineare Abnahme mit steigendem Acetat, insgesamt 15% von 0.01 bis 0.4 M Acetat. In 0.4 M Acetat bei pH 5.0 war die Löslichkeit des Merichinon-Dextransulfatsalzes fast gleich groß wie diejenige von TMB.
Acetat wurde gewählt, um die Ionenstärke zu steuern, weil das TMB-Acetatsalz bereits als sehr wenig löslich bekannt war, so daß nicht erwartet werden konnte, daß die Ausfällung des Acetatsalzes mit der Salzabhängigkeit der Löslichkeit des Merichinonsalzes interferieren würde. Die starke Abhängigkeit der Merichinonlöslichkeit von der Salzkonzentration ist in Übereinstimmung mit der ionischen Natur der Wechselwirkung zwischen Merichinondikation und Polyanion. Die leichte Abnahme in der TMB-Löslichkeit mit steigender Ionenstärke ist in Übereinstimmung mit der molekularen Natur des TMB-Kristalls, einem relativ hydrophoben Molekül. Diese Daten haben offensichtliche praktische Konsequenzen. Das Waschen von Assays, sichtbar gemacht mit TMB, H&sub2;O&sub2; und Peroxidase oder irgendeinem anderen Oxidationskatalysator, sollte bei sehr niedriger ionischer Stärke vorgenommen werden, um die Entfernung von überschüssigem TMB zu erleichtern und den Verlust von Signal durch Auflösen des immobilisierten Merichinons zu minimieren. Häufig sollte Wasser als Waschlösungsmittel genügen. Anderseits kann es Anwendungen geben, bei denen es erwünscht ist, daß das durch eine Probe erzeugte Signal entfernt wird, um eine Testprobe mit einer Probe verschiedener Empfindlichkeit zu prüfen. In diesem Fall sollte ein Waschen in hoher ionischer Stärke genügen, um alles Merichinon zu entfernen, ohne die Probe rauhen chemischen Bedingungen auszusetzen.

BEISPIEL 9

Bestimmung von Sichelzellen und normalen Allelen von β- Globin-Locus

Zwei Proben wurden hergestellt durch Klonieren der 676- und 627-Basenpaar-Sau3AI-Fragmente des 1. 9-Kilobasenpaar- BamHI-Fragments im 5'-Teil des β-Globin-Gens (in Übereinstimmung mit Fritsch et al. (1980) Cell, 19 : 959-972) an der BamHI-Stelle von M13mp10 in Übereinstimmung mit Messing, J. (1983) Meth. Enzymol., 101 : 20-78. DNA-Proben wurden hergestellt durch Hybridisierung der Einzelstrang M13 DNA, enthaltend das gewünschte DNA-Insert zur BamHI linearisierten M13 Replikationsform, im wesentlichen wie beschrieben von Courage-Tebbe, U. und Kemper, B. (1982) BBA 697 : 1-5. Die erhaltenen M13-Derivate wurden mit einem biotinylierten Psoralenderivat, N-Biotinyl-N'-(4'-methylentrioxsalen)-3,6,9-trioxa-undecan-1,11-diamin, wie im U.S. Patent Nr. 4 582 789, oben, beschrieben, mit einem Photo-Label versehen. Dies ergab Proben mit Labels von 5-10 biotinylierten Psoralen-Resten pro 100 Basenpaaren doppelsträngiger DNA, wie durch Messung der Absorption bei 333 nm, wie von Cimino et al., (1985) Ann. Rev. Biochem., 54 : 1151-1193, beschrieben, und durch Verwendung einer Standardkurve mit der Beziehung zwischen optischer Dichte und Einbau von (3H)-biotinyliertem Psoralen, festgestellt wurde.
Menschliche DNA wurde aus Gewebekulturzellen oder Blut durch Verwendung einer Methode gereinigt, die beschrieben wurde von Stetler et al., (1982) PNAS, 79 : 5966-5979. Homozygote Hämoglobin-δ-β-Deletion-DNA stammte von GM2064-Zellen (Human Genetic Mutant Cell Repository, Camden, NJ), Hämoglobin-β-S/β-S-DNA stammte von SC-1-Zellen, beschrieben von Saiki et al. (1985) Bio/Technology, 3 : 1008-1012), Hämoglobinβ-S/β-A-DNA stammte vom Blut eines Sichelzellenträgers und Hämoglobin-β-A/β-A-DNA stammte von HL60-Zellen, beschrieben von Collins et al. (1978) PNAS, 75 : 2448-2462. DNA-Verdauung mit SauI und anderen Restriktions-Endonukleasen wurde nach Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory), S. 382-389 vorgenommen. Um Molekulargewichtsstandards zu liefern, die eine koinzidente nicht-isotope Bestimmung erlauben, wurden Bakteriophagen-λ-BstEII-Fragmente mit biotinyliertem Psoralen markiert, wie im U.S. Patent 4 582 789, oben beschrieben. Die Molekulargewichtsstandards und durch Restriktion verdauten DNA-Proben wurden fraktioniert durch Elektrophorese in benachbarten Spuren in 1%igem Agarosegel in einem Puffer, enthaltend 0.04 M Tris-acetat, 0.002 M EDTA, pH 8.0. Blotten der DNA-Proben auf Nylonmembrane wurde während 3-16 Stunden durchgeführt unter Verwendung von 5 · SSPE, wie von Maniatis et al., oben, beschrieben (20 · SSPE = 3.6 M NaCl, 200 mM NaH&sub2;PO&sub4;, 20 mM EDTA, pH 7.4).
Die die DNA-Proben tragenden Nylonmembranen wurden bei 42ºC 2-6 Stunden in einer Vorhybridisierungsmischung inkubiert, die 5 · Denhardt's Lösung, 5 · SSPE, 150 mg/ml denaturiertes Heringssperma-DNA, 0.5% Natriumdodecylsulfat, 5% Natriumdextransulfat und 50% Formamid enthielt, und dann abtropfen gelassen. Darauf wurden 50 ng/ml der ersten Probe und 75 ng/ml der zweiten Probe zu einem getrennten Vorrat der gleichen Mischung zugesetzt, die vorher auf 60ºC erwärmt wurde, und dann mit der Membrane für eine Inkubierung über Nacht bei 42ºC vereinigt. Nach Hybridisierung wurde die Nylonmembrane gewaschen und ein Streptavidin-Meerrettich- Peroxidase-Konjugat und TMB unter Bedingungen zugesetzt, wie sie in Beispiel 5 beschrieben wurden. Die Farbentwicklung dauerte eine Stunde.
Das nicht-isotope Probensystem unterschied die 1.14-kb- Band-Charakteristik des normalen Allels des β-Globin-Gens von der 1.34-kb-Fragment-Charakteristik des sichelzellen-Allels in der geprüften menschlichen DNA, wodurch alle homozygoten und heterozygoten Genotypen korrekt identifiziert wurden.

Hinterlegung

Der Hinterlegungsgegenstand, identifiziert als Plasmid pDA318 in einem MM294-Wirt im U.S. Patent Nr. 4 582 789, oben, wurde in der American Type Culture Collection (ATCC) in Rockville, MD 20852 USA, am 8. November 1984 unter der Zugangsnummer 39 917 hinterlegt, im Anschluß an eine Vereinbarung zwischen der ATCC und dem Lizenznehmer dieser Patentanmeldung, Cetus Corporation. Die Vereinbarung mit ATCC sieht eine dauernde Verfügbarkeit der Nachkommen dieses Plasmidenthaltenden Wirts an die Öffentlichkeit nach Erteilung des U.S. Patents, das die Hinterlegung beschreibt und identifiziert, oder den Veröffentlichungen oder nach der Offenlegung irgendeiner U.S. oder ausländischen Patentanmeldung, was auch immer zuerst stattfindet, und eine Verfügbarkeit der Nachkommen dieses Wirtes an jemanden vor, der dazu berechtigt ist, wie es durch den U.S. Commissioner of Patents und Trademarks gemäß 35 USC §122 und den darauf beruhenden Regeln des Commissioners (einschließlich 37 CFR §1.14 unter besonderer Referenz auf 886 OG 638) bestimmt wird. Der Lizenznehmer der vorliegenden Anmeldung hat zugestimmt, daß, wenn der Wirt in der Hinterlegungsstelle absterben oder verloren gehen oder zerstört werden sollte, wenn er unter geeigneten Bedingungen kultiviert wird, er nach Benachrichtigung sofort mit einer lebensfähigen Kultur des gleichen Wirts ersetzt wird.
Zusammenfassend liefert die vorliegende Erfindung ein chromophores Reaktionsprodukt, dessen Verwendung die Empfindlichkeit steigert und die Bestimmungsgrenze eines weiten Bereichs von Analysen der oxidativen Aktivität erniedrigt. Das Produkt wird als unlösliches Salze oder immobilisierter Komplex am Ort der katalytischen Aktivität in einem Gel oder an der Oberfläche einer festen Phase abgelagert und verblaßt nicht mit der Zeit und wandert nicht, was diffuse Signale ergibt.

Claims

1. Material, das zur Sichtbarmachung von biologischen Materialien nützlich ist, enthaltend ein festes Salz oder einen immobilisierten oder gelösten Komplex des Merichinons von Benzidin oder einem substituierten Benzidin, worin das Anion des Salzes ein Malat, Pyrophosphat, Maleat, Fumarat, Format, Oxalat, Succinat, Isocitrat, Tartrat, Phthalat, Isophthalat, Terephthalat, Benzoat, Hemimellitat, Trimellitat, Trimesat, Pyromellitat, Mellitat, Mesaconat, Ethylendinitrilotetraacetat, 1,2,3,4-Butantetracarboxylat, Malonat, Glutarat oder die konjugierte Base einer ungesättigten oder einer aromatischen organischen Säure oder, falls das substituierte Benzidin TMB ist, ein Sulfat, Citrat, Nitrat oder ein Halogenid ist und das Anion des Komplexes ein polymeres Anion ist.

2. Material nach Anspruch 1, worin das substituierte Benzidin 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB) ist.

3. Material nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, enthaltend ein festes Salz des Merichinons von TMB und ein Anion, das ein Halogenid, Nitrat, Citrat, Maleat, Sulfat, Oxalat, Malonat, Succinat, Glutarat, Fumarat, Phthalat, Isophthalat, Terephthalat, Malat, Tartrat, Pyrophosphat, Format, Isocitrat, Ethylendinitrilotetraacetat, 1,2,3,4- Butantetracarboxylat, Benzoat, Hemimellitat, Trimellitat, Trimesat, Pyromellitat, Mellitat oder Mesaconat ist.

4. Verfahren zur Sichtbarmachung eines biologischen Materials, enthaltend die Oxidation von Benzidin oder eines substituierten Benzidins zu dem Merichinon davon bei einem pH von etwa 3 bis 7 und in Gegenwart einer wirksamen Konzentration eines wirksamen Anions oder polymeren Anions, eines Oxidationskatalysators und einer wirksamen Menge Oxidationsmittel, wobei ein festes Salz oder immobilisierter oder gelöster Komplex des genannten Anions oder polymeren Anions und des genannten Merichinons gebildet wird, worin das Salz oder der Komplex hinsichtlich des Merichinons eine Löslichkeit von weniger als etwa 10&supmin;&sup5; M besitzt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, worin das biologische Material in oder auf einer Testprobe enthalten ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einer festen Phase, einem Gel, einer gelösten oder suspendierten Mischung, die komplementären Antikörper und Antigen enthält, und einer gelösten oder suspendierten Mischung, die Einzelstrang- Nukleinsäuren enthält, welches Verfahren enthält, daß man:

(a) die Testprobe mit einem Oxidationskatalysator in Kontakt bringt, der an eine feststellende Verbindung gebunden ist, die in der Lage ist, in spezifischer Weise mit dem biologischen Material in Wechselwirkung zu treten;

(b) die Testprobe von Schritt (a) unter Bedingungen inkubiert, bei denen die feststellende Verbindung mit dem biologischen Material in Wechselwirkung tritt, falls es in der Testprobe vorhanden ist;

(c) die Testprobe von Schritt (b) wäscht, um nichtreagierende feststellende Verbindung zu entfernen;

(d) zur gewaschenen Testprobe von Schritt (c) Benzidin oder ein substituiertes Benzidin zusetzt;

(e) die Testprobe Bedingungen unterwirft, unter denen das Benzidin oder substituierte Benzidin zu einem Merichinon davon oxidiert wird, falls der Oxidationskatalysator vorhanden ist, wobei die genannten Bedingungen eine Reaktionstemperatur von 0 bis 60ºC und ein wäßriges Medium von pH 3 bis 7, enthaltend eine wirksame Menge eines Oxidationsmittels, umfassen;

worin eine wirksame Menge eines wirksamen Anions oder polymeren Anions während einem oder mehreren der Schritte (a)-(e) zugesetzt wird; und

(f) die Bildung eines festen Salzes oder immobilisierten Komplexes des genannten Anions oder polymeren Anions und des genannten kationischen Merichinons feststellt, wobei das Salz oder der Komplex bezüglich Merichinon eine Löslichkeit von weniger als etwa 10&supmin;&sup5; M besitzt und wobei die genannte Bildung die Anwesenheit oder Charakteristika des biologischen Materials anzeigt.

6. Verfahren nach Anspruch 4, worin das biologische Material in oder auf einer Testprobe enthalten ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einer festen Phase, einem Gel oder einer Flüssigkeit, welches Verfahren enthält, daß man:

(a) die Testprobe mit einer feststellenden Verbindung in Kontakt bringt, die in der Lage ist, spezifisch mit dem biologischen Material in Wechselwirkung zu treten;

(b) die Testprobe von Schritt (a) mit einem Oxidationskatalysator in Kontakt bringt, der mit einem Rest konjugiert ist, der in der Lage ist, spezifisch mit der feststellenden Verbindung in Wechselwirkung zu treten;

(c) die Testprobe von Schritt (b) unter Bedingungen inkubiert, wobei die feststellende Verbindung mit dem Katalysator und mit dem biologischen Material in Wechselwirkung tritt, falls es in der Testprobe vorhanden ist;

(d) die Testprobe von Schritt (c) wäscht, um nichtreagierende feststellende Verbindung zu entfernen;

(e) zur gewaschenen Testprobe von Schritt (d) Benzidin oder ein substituiertes Benzidin zusetzt;

(f) die Testprobe Bedingungen unterwirft, unter denen das Benzidin oder substituierte Benzidin zu einem Merichinon davon oxidiert wird, falls der Oxidationskatalysator vorhanden ist, wobei die genannten Bedingungen eine Reaktionstemperatur von 0 bis 60ºC und ein wäßriges Medium von pH 3 bis 7, enthaltend eine wirksame Menge eines Oxidationsmittels, umfassen;

worin eine wirksame Menge eines wirksamen Anions oder polymeren Anions während einem oder mehreren der Schritte (a)-(f) zugesetzt wird; und

(g) die Bildung eines festen Salzes oder immobilisierten Komplexes des genannten Anions oder polymeren Anions und des genannten kationischen Merichinons feststellt, wobei das Salz oder der Komplex bezüglich Merichinon eine Löslichkeit von weniger als etwa 10&supmin;&sup5; M besitzt und wobei die genannte Bildung die Anwesenheit oder Charakteristika des biologischen Materials anzeigt.

7. Verfahren nach Anspruch 4, worin das biologische Material ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem Antigen, einem Antikörper und einer Nukleinsäure, enthalten in oder auf einer festen Phase unter Verwendung eines Southernblots, eines Northernblots, eines DNA- oder RNA- Dotblots, eines Westernblots, eines Antigendotblots oder eines Antikörperdotblots, welches Verfahren umfaßt, daß man:

(a) die feste Phase mit einer Peroxidase in Kontakt bringt, die an eine feststellende Verbindung gebunden ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus (i) einem Antikörper, der in der Lage ist, spezifisch mit einem Antigen als biologisches Material in Wechselwirkung zu treten, (ii) einem Antigen oder einem Anti-Antikörper, der in der Lage ist, spezifisch mit einem Antikörper als biologisches Material in Wechselwirkung zu treten, und (iii) einer Nukleinsäure-Hybridisierungs-Probe, die eine Einzelstrang- Nukleotid-Sequenz enthält, die komplementär zu einer Sequenz ist, die in einer Nukleinsäure als biologisches Material enthalten sein könnte;

(b) die feste Phase von Schritt (a) unter Bedingungen inkubiert, wobei die feststellende Verbindung mit dem biologischen Material in Wechselwirkung tritt, falls es in der Testprobe vorhanden ist;

(c) die feste Phase von Schritt (b) wäscht, um nichtreagierende feststellende Verbindung zu entfernen;

(d) zur gewaschenen feste Phase von Schritt (c) Benzidin oder ein substituiertes Benzidin zusetzt;

(e) die feste Phase Bedingungen unterwirft, unter denen das Benzidin oder substituierte Benzidin zu einem Merichinon davon oxidiert wird, falls die Peroxidase vorhanden ist,

wobei die genannten Bedingungen eine Reaktionstemperatur von 0 bis 60ºC und ein wäßriges Medium von pH 3 bis 7, enthaltend eine wirksame Menge eines Peroxids, umfassen;

(f) die Bildung eines festen Salzes oder immobilisierten Komplexes des genannten Anions oder polymeren Anions und des genannten kationischen Merichinons feststellt, wobei die genannte Bildung die Anwesenheit des biologischen Materials anzeigt.

8. Verfahren nach Anspruch 4, worin das biologische Material ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem Antigen, Antikörper und einer Nukleinsäure, enthalten in oder auf einer festen Phase, wobei ein Southernblot, ein Northernblot, ein DNA- oder RNA-Dotblot, ein Westernblot, ein Antigendotblot oder ein Antikörperdotblot verwendet wird, welches Verfahren umfaßt, daß man:

(a) die feste Phase mit einer feststellenden Verbindung in Kontakt bringt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus (i) einem Antikörper, der in der Lage ist, spezifisch mit einem Antigen als biologisches Material in Wechselwirkung zu treten, (ii) einem Antigen oder einem Anti- Antikörper, der in der Lage ist, spezifisch mit einem Antikörper als biologisches Material in Wechselwirkung zu treten, und (iii) einer Nukleinsäure-Hybridisierungs-Probe, die eine Einzelstrang-Nukleotid-Sequenz enthält, die komplementär zu einer Sequenz ist, die in einer Nukleinsäure als biologisches Material enthalten sein könnte;

(b) die feste Phase von Schritt (a) mit einer Peroxidase in Kontakt bringt, die mit einem Rest konjugiert ist, der in der Lage ist, spezifisch mit der feststellenden Verbindung in Wechselwirkung zu treten;

(c) die feste Phase von Schritt (b) unter Bedingungen inkubiert, wobei die feststellende Verbindung mit der Peroxidase und mit dem biologischen Material in Wechselwirkung tritt, falls es in der festen Phase vorhanden ist;

(d) die feste Phase von Schritt (c) wäscht, um nichtreagierende feststellende Verbindung und Peroxidase zu entfernen;

(e) zur gewaschenen festen Phase von Schritt (d) Benzidin oder ein substituiertes Benzidin zusetzt;

(f) die feste Phase Bedingungen unterwirft, unter denen das Benzidin oder substituierte Benzidin zu einem Merichinon davon oxidiert wird, falls die Peroxidase vorhanden ist, wobei die genannten Bedingungen eine Reaktionstemperatur von 0 bis 60ºC und ein wäßriges Medium von pH 3 bis 7, enthaltend eine wirksame Menge eines Peroxids, umfassen;

(g) die Bildung eines festen Salzes oder immobilisierten oder gelösten Komplexes des genannten Anions oder polymeren Anions und des genannten kationischen Merichinons feststellt,

wobei die genannte Bildung die Anwesenheit oder Charakteristika des biologischen Materials anzeigt.

9. Verfahren nach Anspruch 4, worin die biologische Probe ein oder mehrere Antigene oder Antikörper in einer flüssigen Testprobe enthält, welches Verfahren umfaßt, daß man:

(a) die Testprobe oder einen Extrakt davon mit einer Oberfläche zum Festhalten des Antigens oder Antikörpers und mit einem mit Peroxidase-markierten Antikörper oder Antigen inkubiert, welches an das zu bestimmende Antigen oder Antikörper bindet, wobei diese Inkubationen getrennt, in einer beliebigen Reihenfolge, oder zusammen stattfinden;

(b) die Inkubationsmischung von Schritt (a) filtriert;

(c) den Filter von Schritt (b) wäscht;

(d) das gewaschene Produkt von Schritt (c) mit einem Benzidin oder substituierten Benzidin und einer wirksamen Konzentration eines wirksamen Anions oder polymeren Anions inkubiert, um ein festes Salz oder einen immobilisierten Komplex mit dem Merichinon des genannten Benzidins oder substituierten Benzidins zu bilden;

(e) das Inkubat von Schritt (d) filtriert und wäscht; und

(f) die Bildung des genannten festen Salzes oder immobilisierten Komplexes des genannten Anions oder polymeren Anions und des Merichinons des genannten Benzidins oder substituierten Benzidins feststellt, wobei die genannte Bildung die Anwesenheit des genannten Antikörpers oder Antigens anzeigt.

10. Testzusammensetzung zur Feststellung der Anwesenheit eines biologischen Materials, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Antigen, einem Antikörper und einer Nukleinsäure, welche Testzusammensetzung ein Benzidin oder substituiertes Benzidin und Anweisungen enthält, so daß die Immobilisierung oder die Fällung des Merichinons des Benzidins oder substituierten Benzidins durch die Anwendung eines polymeren Anions oder einer ausreichenden Konzentration eines Anions, um eine Merichinon-Löslichkeit von weniger als 10&supmin;&sup5; M zu ergeben, resultiert.

11. Verwendung eines festen Salzes oder eines immobilisierten oder gelösten Komplexes des Merichinons von Benzidin oder eines substituierten Benzidins, um ein Visualisierungssignal zu liefern, wobei das Anion des Salzes die konjugierte Base einer ungesättigten oder einer aromatischen organischen Säure und das Anion des Komplexes ein polymeres Anion ist.