JPS62229068A - サンプル中の核酸配列の存在を検出するための液体ハイブリダイゼ−シヨン法及びそのためのキツト - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、１又は複数の生物からの核酸を含有する試
験サンプル中に含有されることが疑われる特定の核酸配
列の検出のための方法及びキットに関する。特に、この
方法は、同じ標的機酸の相互に重らない部分に対して相
補的な少なくとも２種類のオリゴヌクレオチドプローブ
を液体ハイブリダイゼーション方式において用いて該プ
ローブをもし存在すれば該標的にアニールせしめ、そし
てプローブの一方による２ｆロ一プ標的サンドインチ構
造体の固定化及びそれに続く他方のプローブの検出によ
り標的の存在を検出することを含む。

〔従来の技術〕

Ｉ）ＮＡゾローブを基礎にする測定のために最近用いら
れる方法はサデンプロットハイプリダイゼーション及び
ドットブロットハイプリダイゼーシロンを包含する。こ
れらの方法はいずれも液体一固体ハイブリダイゼーショ
ンに頼り、これらは迅速でなくそして効率的で々＜、シ
かも容易に自動化することができない。サデンプロクト
法はグルから紙への移行が十分でないという他の欠点を
有する。

他のタイプの液体一固体ハイブリダイゼーションが米国
特許Ａ４，３５８，５３５　（Ｆｏｌｋｏｗ　）、Ｒａ
ｎｋｉ等（１９８３）　Ｇｅｎｅ、２１ニア７−８５、
及びヨーロッ・ぐ特許公開Ａｌ３０，５１５に記載され
ている。米国特許４４，３５８，５３５は一般に感染性
生物を検出するために１つのプローブを用いる方法を記
載している。同じ標的に対する２個の相互に重らないプ
ローブを用いるサンドイッチ系がＲａｎｋｉ等の論文中
でアデノウィルスＤＮＡの検出のために使用され、そし
てヨー四ツ／４′特許公開においては注目の制限部位を
含むＤＮＡ配列、好ましくは鎌形赤血球貧血の検出のた
めに使用される。

いずれの場合にも、プローブの一方は好ましくは固体支
持体に結合し、そして他方はシグナル発生標識に結合さ
れる。２種類のプローブを抽出されそして変性されたＤ
ＮＡサンプルに／％イブリダイゼーシ冒ノン条件下接触
せしめ、そしてノ・イブリダイスしないプローブ及び−
回のみノ＼イプリダイズしたプローブを除去する。二重
ノ〜イブリダイズした生成物の検出が標的の存否を示す
。この方法は比較的粗製のサンプルに対して行うことが
でき、そして検出に先立つ洗浄段階によって潜在的に妨
害する破片を除去することができるが、しかし、固体−
液体相ハイブリダイゼーション動態及び自動化困難の欠
点を有する。

液体一固体ハイブリダイゼーションに比べて、プローブ
と標的が均−浴液中で接触する液体ハイブリダイゼーシ
ョンは、標的配列へのプローブの一層大きな接近のため
に非常に迅速な動態及び改良された感度を有する。例え
ば、ゼンープローブ（Ｇａｎ−Ｐｒｏｂｅ　）社はＤＮ
Ａ配列を検出するために液体ハイプリダイゼータ１ンヒ
ｒロキシアノやタイト法を使用する。この系の主たる欠
点は、これが過剰のプローブからのバイブリドの配列特
異的分離ではなく単鎖ＤＮＡ配列からの二本鎖ＤＮＡ配
列の吸＝ａ別に頼っていることである。この前者の分離
は不完全である。なぜなら、標的配列に比べて大過剰の
プローブが添加されるため、注目のバイブリドと共に幾
らかのレポータープローブが不可避的に結合されるから
である。汚染レポータープローブは深刻なバックグラウ
ンド問題をもたらす。

液体ハイブリダイゼーションの他の潜在的利点は、支持
体結合プローブが同じ試薬により標識されておれば一般
化された固体支持体が複数の標的のために機能し得るこ
とである。

ヨークツノ４公開許会開Ａ７０．６８５及びＡ７０，６
８７もまた液体ハイブリダイゼーションを記載している
。前者の特許出願は、ハイプリダイスしていないプロー
ブからハイブリダイズしたプローブを物理的に分離する
ことを必要としないハイプリダイゼーションアッセイ技
法を提案している。この提案は、注目のポリヌクレオチ
ド配列上の隣接した領域にハイブリダイズする一対のプ
ローブを使用すること、及びプローブの一方を・ｆ−オ
キシダーゼのごとき化学ルミネッセンス触媒により標識
しそして他方を化学ルミネッセンス発光のだめの吸収剤
分子により標識することである。触媒標識及び吸収剤分
子は、ハイブリダイゼーションの後に吸収剤分子へのエ
ネルギーの移行によって化学ルミネッセンス発光が停止
するように、各プローブの隣接する末端近くに位置しな
ければならない。

この測定方法は、それぞれの標識がサンプル核酸にハイ
ブリダイズした後に抑制方向（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇｏｒ
ｉｅｎｔａｔｉｏｎ　）に向けられそしてノ・イブリダ
イゼーションに対するプローブの親和性に影響を与えな
い様に、２桟類の必須のプローブ試薬を調節的に合成す
ることに依存する。さらに、固体支持体が存在しないた
め、洗浄段階が存在せず、このため測定方式及び／又は
問題の破片によるシグナルの非特異的増加又は減少が生
じない。

相補的又は部分的に相補的な配列を免疫沈澱せしめるた
め、及び相補的なＤＮＡをアイソトープを用いないで検
出するために、Ｎ−アセトキシ−Ｎ−２−アセチルアミ
ノフルオレン又はその７−ヨウド誘導体を使用すること
により核酸を化学的に修飾することができることが知ら
れている。しかしながら、Ｔｃｈｅｎ等（１９８４）　
ＰＮＡＳ、Ｕ：４３６６−３４７０により記載されたこ
れらの方法は、２プローブサンドイツチイムノアツセイ
系の使用又は液体ハイツリダイゼーションアッセイにお
けるプローブの使用を記載していない。

〔発明が解決しようとする問題点〕

従って、液体ハイブリダイゼーションの迅速な動態を用
い、そしてハイブリダイズした材料を洗浄して粗サンプ
ルからの破片を除去することを可能にする簡単な方法が
当業界において必要とされている。

従りてこの発明は、迅速でしかも鋭敏であり、視覚的に
読み取ることができ又は簡単なプレートリーダーで読み
取ることができ、そして容易に自動化することができる
、２種類のプローブを使用して核酸配列を検出するため
の液体ハイツリダイゼーションサンドイノチアッセイ法
を提供する。

〔問題点を解決するための手段〕

さらに詳しくは、この発明は、１又は複数の核酸を含む
試験サンプル中にき有されることが疑われる特定の核酸
配列がその中に含有されているか否かを検出するための
液体ハイブリダイゼーション法であって、 （ｅ）　　試験サンプル中の核酸を抽出し；（ｂ）　　
抽出されたすべての二本鎖核酸を単鎖に分離し； （ｃ）該単鎖核酸をそれぞれが成るモル過剰の少なくと
も２池類のオリゴヌクレオチープローブに暴露し、該プ
ローブの少なくとも１種類は検出され得る同一の又は異
る標識に連結されたレポータープローブでちシ、そして
該プローブの少なくとも１種類は、相補的結合分子を特
異的に認識しそしてレポータープローブのために使用さ
れる標識成分とは異る結合成分に連結された支持体結合
プローブであり、ここで該プローブのすべては検出され
るべき前記核酸配列の同じ鎖の異る重らない領域に相補
的であり； （ｄ）　　段階（ｃ）からの混合物を前記配列への前記
プローブのハイブリダイゼーションに好都合なハイブリ
ダイゼーション東件にかけ； （ｅ）　　段階（ｄ）の混合物を前記結合プローブの結
合成分により特異的に認識される前記相補的結合分子を
担持する固体支持相と接触せしめ：（ｆ）　　該固体支
持相を洗浄してすべてのハイブリダイズしていない核酸
及び細胞破片を該支持体から除去し；そして （ｇ）　　Ｍ記しポータープローブの標識成分を検出す
るための１又は複数の手段に前記固体支持体を暴露する
ことにより前記配列の存在又は不存在を検出する： ことを含んで成る方法に関する。

好ましくは、核酸はＤＮＡであり、レポータープローブ
のための標識成分はビオチンであり、そして支持体結合
プローブのための結合成分はノ・ブテンであり、これに
固体支持体上の抗体が特異的に結合する。

この発明の他の観点においては、１又は複数の核酸を含
む試験サンプル中に含有されることが疑われる特定の核
酸配列がそれに含有されているか否かを決定するための
液体ノ・イブリダイゼーシ１ン測定キットであって、 （ｅ）　　検出され得る標識成分に連結されておりそし
て検出されるべき核酸配列の１つの鎖の第一の領域に対
して相補的である少なくとも１つのオリゴヌクレオチド
レポータープローブのための容器；（ｂ）　　前記第一
標識成分とは異りておシそして相補的結合分子を特異的
に認識する結合成分に連結されているオリゴヌクレオチ
ド支持体結合プローブ（ここで、該支持体結合プローブ
は前記の配列の同じ鎖にあり該配列の第一領域と重なら
ない第二頭域に対して相補的である）のための容器；及
び （ｃ）　　前記支持体結合プローブの結合成分により特
異的に認識される前記相補的結合分子を担持する固体支
持体； を−まとめにして含んで成るキットが提供される。

この発明の方法及びキットは全くの液体一固体ハイブリ
ダイゼーション法及び全くの液体ハイブリダイゼーショ
ン法が有する欠点を回避し、そして両者の利点を合せ持
つ。すなわち、ハイブリダイゼーションを、固体支持体
の洗浄を許容する液体−同体ハイブリダイゼーションと
同様に粗サンプルに対して行うことができ、しかしさら
に液体ハイブリダイゼーションに関連する迅速な動態が
得られる。２つのプローブの開用がこの検出系の精度を
保証する。さらに、この発明の方法は、アッセイ結果を
読み取るための高価な装置を必要としない。なぜなら＋
／−判定のためには視覚的に、又は定量のためには簡単
なグレートリーダーによりアッセイ結果を読み取ること
ができるからである。反応結果は永久保存のために写真
に撮ることができる。

この明細書において使用する場合、１液体ノ・イブリダ
イゼーション”なる語は、プローブ又は標的配列のいず
れかに結合したいかなる固体支持体も存在しないで液体
媒体中で行われる核酸プローブと標的配列とのハイブリ
ダイゼーションに関する。

この明細書において使用される場合“抽出“なる語は、
試験サンプル中の細胞から核酸を取り出しそして該核酸
が酵素及びプローブに利用され得る様にする工程に関す
る。抽出は例えば細胞の破砕及び細胞破片からの核酸の
分離を含む。

この明細書において使用する場合“オリゴヌクレオチド
なる語は、２個以上の、好ましくは３個より多くのデオ
キ７リデヌクレオチド又はりがヌクレオチドから成る分
子に関する。その正確なサイズは多くの因子、主として
試験サンプル中に存在すると疑われる標的核酸配列に依
存するであろう。　　　　　゛ この明細４において便用する場合１試験サンプル”なる
語は１又は複数の核酸を含有するサングルに関し、所望
の特定の核酸配列を含有するか又は含有していると疑わ
れる限り精製されていても未精製でもよい。検出される
べき核酸配列は例えばＤＮＡ又はＲＮＡ　、例えばメツ
センジャーＲＮＡであり、そしてこれらのＤＮＡ又はＲ
ＮＡは単鎖でも二本鎖でもよい。さらに、それぞれ１本
ずつの鎖から成るＤＮＡ　−ＲＮＡバイブリドを用いる
こともできる。これらの核酸のいずれかの混合物も使用
され得る。この発明において好ましくは核酸は二本鎖で
ありそしてＤＮＡである。検出されるべき特定の核酸配
列は大きな分子の単なる部分であってもよく、又は全体
核酸を構成することができる。試験サンプルは組成であ
ってもよく、この場合サンプル中に含有されると疑われ
る核酸配列は複雑な混合物の小部分であり、セして／又
はサンプルは幾つかの異るタイプの核酸の非精製混合物
から成る。例えば、配列は全ヒ）　ＤＮＡ中に含まれる
β−グロピン遺伝子の部分又は特定の生物学的サンプル
の非常に小さな部分のみを代表する特定の微生物からの
核酸配列の部分を構成することができる。

試験サンプルはまた任意の由来、例えばｐＢＲ３２２の
ごときプラスミドから、クローン化ＤＮＡもしくはＲＮ
Ａから、又は細菌酵母、ウィルス、及び植物もしくは動
物のごとき高等生物を包含する任意の由来（細胞、組織
及び体液）から得ることができる。体液の例には血漿、
脳を髄液、羊水、涙、唾液、尿、喀痰等が含まれる。細
胞並びにウィルス性及び生物学的組織抽出物も試験サン
プルであることができる。

この発明の方法の第１段階において、試験サンプルはそ
の中に含まれる核酸を抽出するために処理される。これ
は任意の適切な方法により行うことができる。例えば、
ＲＮＡ又はＤＮＡは血液又は尿のごとき体液、絨毛のご
とき組織材料、羊水細胞のごとき細胞から、種々の技法
、例えばＭａｎｉａｔｉｓ等、Ｍｏ１ｓｃｕｌａｒ　Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ　（１９８２）、２８〇−２８１により記
載されている技法により抽出することができる。

この第一段階の後、場合によっては核酸のサイズを音波
処理により短縮し、又は核酸を標的配列内の部位を認識
しない適切な制限酵素と接触せしめることにより隣接し
ない２以上の類似の領域を有するのに十分な長さの標的
配列を含む様にする。

この制限断片は粘性が低く、複数のハイブリダイゼーシ
ョン領域の中間における剪断に対して感受性でなく、そ
して変性及びハイブリダイズが迅速であろう。プローブ
のいずれかが前記制限部位を有する場合にはプローブに
暴露する前に酵素を破壊（例えば加熱又は化学物質によ
る）しなければならない。

試験サンプル中の核酸が二本鎖である場合、ハイブリダ
イゼーション段階の前に鎖を分離する必要がある。この
鎖分離又は変性は適当な方法、例えば物理的手段、化学
的手段又は酵素的手段により達成することができる。核
酸の鎖を分離するための１つの物理的方法は、それが完
全に（〉９９チ）変性するまで核酸を加熱することを含
む。典型的な加熱変性は１〜１０分間にわたる約８０℃
〜１０５℃の温度を用いるであろう。変性の停止は迅速
な冷却によりて達成される。ＤＮＡの鎖分離はまた、Ｉ
ＮＡに塩基を典を的には０．１〜Ｉ　Ｎ　ＮａＯＨで添
加し、次にｐＨ６〜８．５に中和することにより達成す
ることができる。塩基はＲＮＡを分解するのでＲＮＡに
は添加することができない。

中和段階を行った後、単鎖核酸を２つのタイプのオリゴ
ヌクレオチドプローブにハイブリダイズせしめる。１つ
のタイプは以後レポータープローブと称し、これは１又
は複数のプローブであり、そして他方のタイプは以後支
持体結合プローブと称する。

１又は複数のレポータープローブは検出され得る同一の
又は異る標識成分に連結される。この連結は核酸ハイブ
リダイゼーション相互作用と同等に強いか又はそれより
強く、そして一般に共有結合である。好゛ましくけ１種
類より多くのレポータープローブを使用し、そしてそれ
ぞれに同じ標識成分を使用してシグナルを増強する。各
プローブに使用される標識成分は検出可能なシグナルを
生成することができる成分、例えばシグナルを生じさせ
る工程により少量で検出され得る酵素である。

この様な適当な検出手段の例には分光的又は光化学的手
段、例えば吸光、螢光もしくは化学ルミネッセンス、又
は放射性、生化学的、免疫化学的もしくは化学的手段、
例えば検出分析化合物との接触の際、もしくは検出可能
な複合体を形成するためのポリペプチドもしくは４？リ
ペプチド／酵素混合物との反応の際の物理的、生化学的
、免疫化学的もしくは化学的性質の変化が挙げられる。

これに関し、“ｍＲ’なる語は、直接的に検出され得る
成分、例えばラジオアイソトープ又はフルオロホーレ（
ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅｓ　）、及び標識成分と検出可
能な生成物を生成することができる他の成分、例えばア
ビジン−もしくはストレプトアビジン−酵素接合体と反
応するビオチン、基質と反応して発色的又は螢光的手段
により検出可能な生成物を生成する酵素、又は検出可能
な成分により標識された特異的抗体と反応するハプテン
、との間の反応を介して間接的に検出される反応性成分
の両者を包含することが意図される。

この発明の好ましいハイブリダイゼーシヲンレポーター
プローブは、放射能分析に着きまとう不利益を回避する
ために非放射性標識されておυ、そして／又はハイブリ
ダイゼーション条件に対して耐性である。この発明の好
ましい検出手段は分光法もしくは光化学法、又は酵素、
例えば発色性基質もしくは螢光性基質を有するアルカリ
性ホスファターゼもしくはホースラディツシュパーオキ
シダーゼ又はルミネッセンスを生じさせることができる
ルシフェラーゼを包含する、検出可能な変化を生じさせ
ることができる成分に連結されたポリペプチド、レクチ
ン又は抗体と標識成分との間の検出可能な複合体の形成
である。この様な複合体の例として次のものが挙げられ
る。標識成分がビオチンであれば、ポリペプチドである
アビジンとホースラディツシュパーオキシダーゼ又はア
ルカリ性ホスファターゼのごとき酵素との複合体、又は
アビジンと化学ルミネッセンスもしくはバイオルミネッ
センス標識との接合体が検出手段として使用されよう。

アビジンが標識成分であれば、ビオチンが化学ルミネッ
センス試薬、バイオルミネッセンス試薬又は酵素との接
合体として使用され得る。ハシテン（これは適当なキャ
リヤーに連結された場合にのみ免疫原性である）、例え
ばフルオレノセイン、ノニトロフェノール又１ｄＮ−ア
セトキシ−Ｎ−２−アセチルアミノフルオレン、が標識
成分として使用される場合、検出手段として適切な検出
可能な抗体を使用することができる。

例えば、ジニトロフェノールが標識成分として使用され
る場合、適当な抗体には例えばモノクローナル又はポリ
クローナル抗ゾニトロフェノール抗体が包含されるであ
ろう。抗体はそれに付加された標識により、例えば酵素
、化学ルミネッセンス試薬、バイオルミネッセンス試薬
、フルオロフォーレ、又は検出可能な標識により標識さ
れた５ｔａｐｈ　Ａ蛋白質により直接的に検出され得る
。他の方法として、抗体は第一抗体に対して特異的な標
識された第二抗体の添加によって間接的に検出され得る
。標識試薬として炭水化物が使用される場合、検出手段
として標識されたレクチンを使用することができる。

レポータープローブのためのこの発明の最も好ましい標
識成分はハプテン又はビオチンであり、ビオチンのため
の最も好ましい検出手段はアビジン−又はストレプトア
ビジン−酵素接合体である。

支持体結合プローブは、固体支持体孔に結合することが
できそしてレポータープローブとの接合において使用さ
れる標識成分とは異る成分（以後、結合成分と称する）
に連結された単一のプローブである。固体支持体孔への
プローブの結合は核酸ハイプリダイゼーシ百ン相互作用
よりも強力である。この目的のためにに用される結合成
分は、それがレポータープローブのために実際に使用さ
れるそれと同一でない限り、レポータープローブに関し
て上記した、相補的結合分子を認識する成分、例えばポ
リペプチド、レクチン又は抗体から選択することができ
る。支持体結合プローブのための結合成分はレポーター
成分とは異っていなければならない。なぜなら、レポー
ター成分は結合成分との間接的連係によってのみ固体支
持体に結合しなければならないからである。

結合成分と標識成分との間の差異が大きくなるに従りて
感度及び特異性が良好になり、診断試験における偽陰性
及び偽陽性結果が回避される。この差異は２つのタイプ
の成分間の交差反応性の程度によりて測定することがで
きる。交差反応性はオーキテルロニーのｒル免疫拡散試
験、競争ラジオイムノアッセイ、又は平衡透析により測
定することができる。

結合成分と相補的結合分子との間の相互作用が強くなる
に従って検出限界が低くなるＪうである。

結合強度は解離定数パラメーター、又はＫｄにより定量
的に表現することができる。Ｋｄが小さくなるに従って
結合が強くなる。例えば最も強い既知の結合反応の１つ
であるアビジンとビオチンとの間のそれは１０　　　Ｍ
に近いＫｄを有する。他方、多くの抗体−抗原反応は１
０〜１０　　ＭのオーダーのＫｄ値を有し、検出限界は
許容されない程高い。好ましくは、支持体結合プローブ
を支持体に保持する結合反応のＫｄは１０”’Ｍよシ小
さい。

最も好ましくは、Ｋｄは１０　　　Ｍ未満である。この
ように高い親和性を惹起することが知られているハプテ
ン又は抗原の例にはフルオレツセイン、ガストリン、デ
ィゴキシン（ｄｉｇｏｘｉｎ　）、ＨｂＳ。

インシュリン、及びジニトロフェノールが含まれる。

プローブの結合成分のための相補的結合分子は固体支持
体上に被覆され又は付着され、これはノ・イブリダイゼ
ーションの後混合物に暴露される。

例えば、支持体結合プローブの結合成分がビオチンであ
る場合、アビジン又はストレプトアビジンが付着されて
いる固体支持体がノ・イブリダイズした混合物とその後
に接触される。結合成分がフルオレッセイン又はジニト
ロフェノールのごときハプテンである場合、支持体は該
ノ・ブテンに対して特異的な担体を担持する。好ましく
は、支持体結合プローブ上の結合成分はハプテンであり
、そして最も好ましくはフルオレッセインである。これ
は、非常に低いＫｄ値の抗体を生じさせるその能力のた
めである。

プローブそれ自体はオリゴヌクレオチドプローブであり
、その特定の組成は検出されるべき特定の核酸配列に依
存する。ＲＮＡ配列及びＤＮＡ配列の両者の検出のため
にオリゴデオキシリ？ヌクレオチドｆロープ及びオリゴ
リゲヌクレオチドデ０−ブを使用することができる。好
ましくは、プローブはオリゴデオキシリ？ヌクレオチド
である。さらに、プローブは、それらがそれぞれ同一の
鎖にハイブリダイズすることができそして検出されるべ
き核酸配列の重り合わない異る領域に対して相補的であ
る。このことはこの発明において必須であり、そうでな
ければプローブは相互に競争してアッセイの感度を低下
せしめるであろう。

プローブはまた、検出されるべき塩基対変化をまたぐ標
的核酸配列の領域を含み、そして検出されるべき配列変
化に特異的な対立遺伝子特異的プローブでありてもよい
。例えば、サンプルが鎌形赤血球貧血に係る変異を含有
するか否かを検出することが望まれる場合、診断的制限
部位の５′側である１つのプローブが調製され、そして
同じ領土の同じ制限部位の３′側である他のプローブが
調製されるであろう。これらのプローブはＣａｎｎｅｔ
　等、ＰＮＡＳ　（ＵＳＡ　）、８０：２７８（１９８
３）により一層詳細に記載されている。

プローブのための正確な長さは幾つかの因子に依存する
であろう。これらが短か過ぎれば、プローブは標的配列
以外の核酸配列とハイブリダイズするであろう。配列が
短かくなるに従って、その相補体は一層頻繁に生物の核
酸中に見出されるであろう。さらに、短い配列の塩基対
合はエネーギー的に弱い傾向があシ、支持体への支持体
結合プローブの弱い結合反応と同様な態様で検出限界を
制限するであろう。他方、非常に長いプローブは遅いハ
イブリダイゼーション速度を示し、そして内部的に塩基
対合した二次構造を形成することができる自己相補的配
列を含有する可能性が増加するであろう。この様な自己
ハイプリダイゼーシッンはハイプリダイゼーシッンにつ
いて標的核酸配列と競争し、アッセイ感度を低下せしめ
るであろう。結合成分が過剰に付着されるようにプロー
ブは標的分子のハイプリダイゼーシラン領域よシも長く
てもよい。

プローブは制限消化により、サブクローニングにより、
又は合成法により、当業界においてよく知られている技
法を用いて調製することができる。

すなわち、例えば、検出されるべき配列と実質的に同一
の配列を有する核酸をクローン化し、そして次に、何個
のプローブが調製されるべきか、及び配列中九何個の便
利な制限部位が存在するかに依存して１又は複数の酵素
により消化する。これらの酵素は配列を適切な制限部位
において切断し、プローブとして有用な適切な塩基対長
さの断片を残すであろう。次に、これらの生成する断片
を、任意の適当な手段、例えば電気泳動により制限消化
物から分離する。これらは例えばサブクローニングによ
り相互に分離することができる。すなわち、制限断片を
、生じた断片に対して相補的な制限部位において適切な
ベクター中に無作為にクローン化する。ベクター及び断
片を連結し、そして新たな分子を用いて適切な宿主を形
質転換する。

発現された選択マーカーに基いて、又はサイズに基く電
気泳動によるＩＮＡ分析に基いて適切なりローンを選択
する。

Ｍｅｓａｉｎｇ、　Ｊ、　（１９８１）Ｔｈｉｒｄ　Ｃ
１ｅｖｅｌａｎｄＳ　ｍ　ｏａｉｕｍ　ｏｎ　Ｍａｃｒ
ｏｍｏｌｅｃｕｌｅａ　：　ＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＤ
ＮＡ、　Ａ、　Ｗｏｌｔｏｎ　ｌｉＡ、エルゼビール、
アムステルダム、１４３−１５３により記載されている
ようにして、プローブのハイブリダイセーフ８フ部分ｅ
Ｍ１３中にクローン化して単鎖核酸を得ることができる
。さらに、Ｃｏｕｒａｇｅ−Ｔｅｂｂｅ等、Ｂｉｏｃｈ
ｉｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、　６９７　：１−５　（１
９８２）により記載され七いる様にして、１ギヤツプド
・サークＡ／　’　（ｇａｐｐｅｄ　ｃｉｒａｌａ　）
をプローブとして用いることができ、この場合、ハイプ
リダイゼーシ■ン領域は分子の単鎖部分のみである。

他の態様においては、プローブは一般に知られている組
換ＤＮＡ技法を用いて所望のオリゴヌクレオチド断片の
各々を別々の宿主ベクター系、例えばｐＢＲ３２２、及
びｐＢＲ３２２の変異体プラスミドであるｐｓｃ１０２
　（挿入のための好ましい追加のユニーク制限部位を有
する）にサブクローニングすることにより得られる。こ
のプラスミドｐｓｃ１０２はアメリカン・タイプ・カル
チュアー・コレクションにＡＴＣＣＡ　３７．０３２と
して寄託されておシ、ぞして米国特許煮４，２３７，２
２４及び屋４，３３９，５３８に記載されている。

第三の態様においては、Ｎａｒａｎｇ等慰止。

Ｅｎｚｙｍｏｌ、　（１９７９）６Ｂ　：９０及びＢｒ
ｏｗｎ等、Ｍａｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　（１９７９
）　６８　：　１０９に記載されているそれぞれホスホ
）　ＩＪエステル法又はホスホジエステル法、あるいは
これらの自動化された方法によりブロープを調製するこ
とができる。

１つのこの様な自動化された態様においては、ジエチル
ホスホラミダイト０が出発物質として使用され、このも
のはＢａａｕｅａｇｅ等、ＴｅｔｒｎｈｓｄｒｏｎＬａ
ｔｔｅｒｓ　（１９８１）２２：１８５９−１８６２に
より記載されている様にして合成することができる。修
飾された固体支持体上でオリゴヌクレオチドを合成する
だめの１つの方法は米国特許屋４．４５８，０６６に記
載されている。

嬉四の態様においては、５ａｌｋｉ等、５ｃｉｅｎｃｅ
　。

±、１ム３Ｏ−１５３４（１９８５）に記載されている
様にして核酸配列を増幅することによりプローブを、１
！！袈することができる。

プローブを調製した後、適当な連結手段、好ましくは共
有結合により、これらをそれぞれその標識成分及び結合
成分に連結する。米国特許屋４．５８２，７８９に記載
されている様にして、導入剤としてゾソラレンを用いて
プローブを標識に連結することができる。

さらに、Ｗａｒｄ、ヨー０７　／４’特許出願Ａ６３．
８７９に記載されているような、標識を導入するために
良く知られているニククトランスレーション法ヲ用いる
ことができる。さらにＢａｕｍａｎ等、Ｊ。

Ｈｉｓｔｏｃｈａｍ、　　Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、　　、　
　　２　９　　二　２２７−２３７（１９８１）Ｋより
記載されている様にして、フルオロクロームを用いてＲ
ＮＡを標識することができる。さらに、Ｔｃｈｅｎ等、
ＰＮＡＳ　（ＵＳＡ）　８１　：３４６６−３４７０（
１９８４）の方法に従って、Ｎ−アセトキシ−Ｎ−２−
アセチルアミノフルオレン（ＡＡＦ　）又はその７−ヨ
ウド誘導体（ＡＡＩＦ）を用いてＲＮＡ又は茂中のグア
ニン残基金化学的に修飾することができる。また、Ｐｏ
１ｒｉａｒ等、Ｎａｔｕｒｅ、２７０：１８６−１８８
（１９７７）はアセチルアミノフルオレンのＤＮＡアダ
クトを記載している。

実際のハイブリダイゼーシヨンにおいて、細胞破片等と
の混合物でもよい単鎖ヌクレオチドを、使用される特定
のハイツリダイゼーシッン条件に依存するハイプリダイ
ゼーシ目ン溶液に加える。

この様な溶液は１００チの水、又は約ｇＱ谷ｉｉ％まで
、好ましくは２０〜６０％までの不活性極性有機溶剤、
例えば稙々の塩、フィコール、血清アルブミン、ポリビ
ニルピロリドン及びｐＨ６〜９の緩衝剤を含有するホル
ムアミドから成ることができる。この発明において使用
することができる液体ハイブリダイゼーション粂件の評
細はＷ＠ｔｍｕｒ。

Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｐｈｙａ、　Ｂｉｏｅｎｇ
、　、　５　：　３３７−３６１（１９７６）、及びＧ
ｉｌｌｅｓｐｉｅｗ　Ｒｅｃｅｎｔにより提供される。

次に、プローブを、試験サンプルのモルに対して理論量
を超えるモル過剰で加えることにより核酸配列へのプロ
ーブの結合速度を高める。溶液中のプローブのモル過剰
の正確な程度は例えばプローブに結合された標識成分、
固体支持体上の結合部位の数、検出されるべき特定の配
列、及びハイブリダイゼーション条件に依存するであろ
う。例えば、感度の低下を回避するため支持体結合プロ
ーブは支持体上の結合部位の数より過剰に存在すべきで
ない。一般に、プローブはｉｏ、ｏｏｏ〜１０　モル過
剰、さらに好ましくは１００．０００〜１×１０モル過
剰で存在する。

使用されるハイブリダイゼーション条件は所望の最終目
的に依存して異るストリンジエンシーの程度を有する。

ストリンジエンシーは温度、プローブの長さ、イオン強
度、等により影響される。

溶液中の不活性有機溶剤の濃度を２０〜５０容量チの範
囲で調節することにより、極性及びハイブリダイゼーシ
ョンのストリンジエンシーが変るであろう。一般に、ハ
イブリダイゼーションは約２５〜７５℃、好ましくは３
５〜６５℃において０．２５〜２０時間、好ましくは１
．５〜５．０時間行われ、これらの条件は主として使用
される特定のプローブ及び試験サンプルの相対的及び絶
対的濃度、並びに媒体中の他の成分の濃度に依存するで
あろう。当業者は条件を適切に調節することができよう
。条件のストリンジエンシーが大きくなるに従って、プ
ローブと核酸配列との間のハイブリダイゼーションの必
要とされる相補性が犬となる。

ハイブリダイゼーション混合物を固体支持体に接触させ
るに先立ち、好ましくは固体支持体を処理してプローブ
が支持体に非特異的に結合しない様にする。固体支持体
を処理することができるブロッキング剤の例には、例え
ばウシ血清アルブミンを含有するリン酸緩衝化塩溶液、
非イオン性洗浄、ポリアニオン、及びニシン硝子ＤＮＡ
が含まれる。

ハイブリダイゼーションが完了した後、ハイブリダイゼ
ーション混合物を、支持体結合プローブの結合成分に対
して相補的でありこれによＮ？異的に認識される結合分
子を（被覆により、吸着により、又は付着により〕担持
する固体支持体と接触せしめる。この分子はハイブリダ
イゼーション混合物中に存在する他のいずれの成分とも
交差反応してはならない。適当なこの様な結合分子の例
にはｉｉ９１Ｊペプチド、レクチン、又は抗体が包含さ
れ、使用される結合成分に依存する。個体支持体の例に
はミクロタイターウェル、ポリスチレンビーズ、ポリア
クリルビーズ、アガロースビーズ、ナイロンビーズ、誘
導体化紙、例えばニトロセルロース紙、水不溶性多孔性
フィルター、例えばニトロセルロース又はナイロン膜、
並びに反応媒体及び支持体の表面に担持される材料に対
して不活性な他の材料が含まれる。結合分子は支持体に
吸着してもよく、又は共有結合してもよいが、感度の理
由のため共有結合しているのが好ましい。使用される条
件は相補的結合分子の付着のために好ましいものであろ
う。この付着のための好ましい方法はＷｏ　ｏ　ｄ等、
Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｅｍ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ、　ｌζ１ニア８９−７９７（１９８３）により
記載されている。

この発明の方法の次の段階において、固体支持体を洗浄
してすべてのハイブリダイズしていない核酸、例えばレ
ポータープローブ、及びサンプルからの残シのすべての
細胞破片、例えば蛋白質、リピド、ムコポリサッカライ
ド等を除去する。支持体がフィルターであれば、洗浄溶
液、例えば０．１〜１容量チの１又は複数のイオン性洗
剤又は塩と洗剤との組合せを一定の接触時間にわたって
それに適用し、そして除去する。支持体がビーズでアレ
ハ、ビーズを含むハイブリダイゼーション混合物を濾過
して液体を除去しそしてビーズを洗浄溶液と接触せしめ
、あるいは米国特許屋４．４７８，０９４中に記載され
ているような自動液体取扱装置により液体を除去する。

支持体がミクロタイターウェルであれば、液体を除去し
、そしてウェルの壁を溶液で洗浄する。洗浄溶液は主と
して標識成分のタイプ及び関与する核酸、並びに必要な
ストリンジエンシーの程度により異シ、シかし典温的に
は塩、例えば塩化ナトリウム及びりエン酸す）　ＩＪウ
ムと非イオン性洗剤、例えばトゥイーン２０又はトリト
ンＸ１００から成る。洗浄の穴めの接触時間は主として
溶液のタイプにより異るが、しかし一般的には５分間〜
３時間又はそれ以上である。次に、検出手段にかける前
に非特異的相互作用を妨害する必要があれば、サンプル
が付着された洗浄された支持体を室温において、希塩溶
液（例えばクエン酸ナトリウム−塩化ナトリウム）によ
りすすぐ。

この発明の方法の最終段階においては、洗浄されそして
好ましくはブロックされた固体担体を標識成分のための
１又は抜数の検出手段に暴露することにより検出される
。この成分が検出されれば、標的単鎖核酸と両プローブ
との間にハイブリダイゼーシヨンが起っており、そして
サンプル中に含有されることが凝われる核酸配列がサン
プル中に実際に存在する。ｌａＩ類より多くのタイプの
標識成分を使用すれば、それぞれに対する検出手段の添
加ＩＭ序は主として検出手段のタイプ及び使用される標
１＆成分に依存するであろう。検出手段はまた、もし適
当であれば同時に添加することもできる。適当な検出手
段はレポータープローブのための標識成分の検討と関連
して前記したものであり、そして放射性手段、分光的手
段、光化学的手段、免疫化学的手段、生化学的手段、又
は化学的手段を包宮する。免疫化学的手段には適当な条
件下でレポータープローブと複合体を形成することがで
きる抗体が含まれ、生化学的手段には適当な条件下でレ
ゾ−タープローブと複合体を形成することができるぼり
ペプチド又はレクチンが含まれ、そして光化学的手段に
は螢光を刺激するための紫外線又は可視光線が含まれる
。さらに、ヨーロッパ特許出願公開扁７０．６８６及び
扁７０．６８５に記載されているように、検出手段は化
学ルミネッセンス触媒の存在下光反応を誘導するのに適
当な化学ルミネッセンス試薬と組み合わせて、非放射エ
ネルギーの移行を許容するのに十分に相互に接近した吸
光−発光成分と化学ルミネッセンス触媒との組合せから
成ることができる。抗体、ポ＋）ｄプチド又はレクチン
は検出可能でなければならず、又は複合体が形成された
ときに検出され得る成分を含有しなければならない。こ
の様な含有され得る検出可能な成分には螢光色素、電子
密度試薬、又は不溶性反応生成物を沈澱し得る酵素もし
くは分光光度的に又は螢光的に検出される酵素が含まれ
る。通常、抗体、ポリペプチド又はレクチンを酵素と連
結する。この酵素は色原体基質と反応するであろう。酵
素のごとく、検出手段が間接検出のみ可能でおれば、固
体支持体からすべての遊離の検出手段を洗浄除去し、そ
して酵素の基質のごとき残りの成分を添加して結合した
検出系を可視化しそして結果を読み取る。例えば、ビオ
チンにより標識されたハイブリダイズしたレポータープ
ローブを検出するためのアビジン−酵素の複合体の使用
は、未反応アビジ／−酵素複合体の洗浄除去、酵素のた
めの色原体基質の添加、及び生ずる色変化の読み取りを
含む。しかしながら、適切に処理した場合に発光性とな
る蛋白質もまた標識されたプローブ全検出するために使
用することができる。

ハイブリダイゼーション混合物と検出成分、例えば抗原
標識に対する抗体の接触は好ましくは、十分な相互作用
を保証するために混合することにより行う。

試験結果の可視化は検出手段に依存して多くの方法によ
り行うことができる。高価な機械は必ずしも必要ではな
く、そして色原体検出系を使用すれば、＋／−判定は一
般に視覚的に行われ、そして定量のためには簡単なプレ
ートリーダーが使用される。反応結果は永久記録のため
に写真に撮ることができる。

この発明の方法は、米国特許Ａ４，４７８，０９４に記
載されているような液体取扱系を使用して自動化するこ
とができる。すなわち、支持体結合プローブの結合成分
を特異的に認識する相補的結合分子によりミクロタイタ
ーウェルを被覆する。ノ・イブリダイゼーションの後、
空気制御されたサンプラー？使用してハイブリダイゼー
ション混合物をウェルに移し、ここで固定を行う。次に
、ウェル全自動的に排水し、そして洗浄して／・イブリ
ダイズしていない過剰のレポータープローブを含む、固
体支持体に結合していないすべての物質を除去する。次
に、検出手段を使用して結果を読み取る。

固体支持体を洗浄して過剰の不所望の物質を除去するこ
とができるためこの発明の方法は完全な液体ハイブリダ
イゼーションに比べて低いパックグラウンドを有するが
、試験サンプル中に存在すると凝われる核酸配列をプロ
ーブにハイブリダイズせしめる前に５ａｉｋｉ等、前掲
により記載されている連鎖反応において２つのオリゴヌ
クレオチドを用いて延長生成物を生成せしめることによ
り該配列を増幅することによってこの方法を一層鋭敏に
することができる。分析のために利用できる核酸の量が
非常に少ない場合、例えば胎児細胞からのＤＮＡを使用
する鎌形赤血球貧血の出生前診断において、増幅は非常
に有用であり、そしてさらに、細胞当りの標的核酸のコ
ピー数が１未満である小サンプルについて分析を行う場
合有用である。

この発明の方法は、感染性疾患、遺伝的異状、細胞性異
状、例えば癌と関連する特定の核酸配列の検出を可能に
するために使用することができる。

この発明の目的のため、遺伝的疾患は、ホモ接合的であ
ってもヘテロ接合物であっても、あらゆる生物からのゲ
ノムＤＮＡ中の特異的欠失及び／又は変異、例えば鎌形
赤血球貧血、のう胞性線維症、α−サラセミア、β−サ
ラセミア等を包含する。

制限酵素部位の存在又は不存在に関連ずけることができ
る遺伝的疾患は、制限断片法に類似するこの方法により
検出することができる。例えば、正常β−グロビン遺伝
子はＤｄｅ　ｌ又はＭ＋ｓｔ［により陰性結果をもつ開
裂される（両プローブは非−隣接断片にハイブリダイズ
する）。ホモ接合体鎌形赤血球対立遺伝子は開裂されず
、場合反応を与える（両ゾロープは同じ無傷の標的にハ
イブリダイズする）。α−サラセミアは配列の不存在に
より検出することができ、そしてβ−サラセミアはこの
疾患を生じさせる変異に密接に関連する多型性制限部位
の存在により検出され得る。

この発明の方法を使用して制限部位を検出する場合（鎌
形赤血球貧血の場合のように）、プローブこの方法を行
うために特別に設計されなければならない。プローブの
１つは注目の制限部位の３′側にあり、そしてもう１つ
は該制限部位の５′側にあるであろう。いずれのプロー
ブも注目の制限部位に重ることはできない。

好ましくは、いずれのプローブも注目の第一部位と同じ
制限酵素により認識される標的の第二部位をまたがない
。いずれについても、・両プローブが第二又は第三部位
をまたぐことはできない。結果が正確でなくなるからで
ある。プローブの１つが同じ部位を表わす第二配列をま
たぐ場合、同じ部位を表わすいずれの配列もまたがない
プローブが支持体結合プローブでなければならない。そ
うでなければ、結果に対して無関係のセグメントが固体
支持体に結合し、正しい断片と競争するであろう。

制限部位を検出するためのこの方法において、注目の部
位を認識する制限酵素を、好ましくはハイブリダイゼー
ションの前に反応混合物に添加し、そして制限断片長条
型について使用されるのと本質的に同じ条件下で〔米国
特許Ｊｆｉ４，３９５，４８６（Ｗｉｌｓｏｎ等）及び
Ｇｅｅｖｅｒ等、ＰＮＡＳ、７８：５０８１−５０８５
（１９８１）：ｌでそれと接触せしめることにより、も
し存在すればその部位を開裂せしめる。次に、この制限
消化物を固体支持体布と接触せしめ、そして上記の様に
段階を続ける。

病原性（感染性）微生物に特徴的な特定のＤＮＡ配列の
臨床サンプル中での存在を検出するために適切なプロー
ブを用いることによ！１ｌａｔ々の感染性疾患を診断す
ることができる。これらには例えば、細菌、例えばサル
モネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　）、ナイゼリア争ゴノ
ルヘア（Ｎｅ１ｓｓｅｒ１ａ　ｇｏｎｏｒｒｈｅａｓ　
）、寄生性微生物、例えばクラミジア（ｃｈｌａｍｙｄ
ｉａ　）　及びリケッチア（Ｒｉｃｋ＠ｔｔｓｉａｓ　
）、ウィルス、例えば肝炎ウィルス、及び原生動物寄生
体、例えばマラリアを起こすプラスモノラム（Ｐｌａｓ
ｍｏｄｉｕｍ　）が含まれる。抗生物質耐性？、多くの
病原生物により共有紮れるシラづミド上に存在するβ−
ラクターｚ　−セ（Ｄ　コトき物質についてスクリーニ
ンクスることかできる。

生物のゲノム中の病原性異常及び感染性疾患の検出に加
えて、この発明の方法は病的状態に関連しないＤＮＡ多
型性を検出するために使用することができる。

次に、例によりこの発明をさらに具体的に説明するが、
これによりこの発明の範囲を限定するものではない。こ
れらの例において、すべてのチは固体については重量、
液体については容舊上により、そしてすべての温度は℃
で表わす。

例１゜ 鎌形赤血球貧血の原因であるヒト−β−グロビン遺伝子
の変異を下記の方法により同定する。

アッセイはクローン化β−グロビンＤＮＡから２つのプ
ローブを調製することにより行う。この目的のため、プ
ローブ原としてプラスミドｐＢＲ３２８：βＡ−１，９
（ｐＢＲ：β１と略す）を使用する。ｐｎｔｔ：βＡを
次の様にして調製した。

正常β−グロビン遺伝子の１．９　Ｋｂ　Ｂａｍ　ＨＩ
断片を、Ｆ、　ＣＣｏ１１ｉｎ等、ＰＮＡＳ、８１．４
８９４−４８９８（１９８４）により記載されているコ
スミッドｐＦｃ１１から単離し、そしてｐＢＲ３２８（
５ｏｂｅｒｏｎ等、Ｇｏｎｅ　（１９８０）９：２８７
−３０５〕のシｔｍ、Ｈ７部位に挿入した。合成４〇−
ｍａｒプローブにハイブリダイズする領域を含むこの断
片は第−及び第二エクソン、第一イントロン、並びに遺
伝子の５′フランキング配列を含む（：Ｌａｗｎ等、−
ｑリュ（１９７８）１５：１１５７−１１７４：ｌ。

このクローンｐＢＲ：β”は１９８４年５月２５日に、
ＡＴＣＣ＆　３９．６９８としてＡＴＣＣに寄許された
。

ｐＢＲ：β”からのＤＮＡを標準的方法（Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ等、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　（１９
８２）　）により単離する。酵素の製造者により記載さ
れている適切な消化条件を用いて２つの別個の消化反応
を行う。

反応の１つは１（ａｅ　■を用い、そして他方はＨｉｎ
ｆ　Ｉを用いる。

平滑末端断片の調製のための標準的方法（Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ等、前掲によυ記載されている）を用いて、Ｈｉｎ
ｆｌ消化断片をフィルインするか、又は消化後退した後
、Ｍ１３のポ１７１７ンカー領域中の担■部位に連結す
る。

旦ａｅ［［消化断片を平滑末端化し、そしてＭ１３のポ
ＩＪ　ＩＪンカー領域のＳｍａ　１部位に連結する。

Ｍ１３の調製及び単離はＪ、　Ｍｅｓａｉｎｇ（１９８
１）ル、アムステルダム、１４３−１５３頁に記載され
ている。Ｍ１３を制限酵素）↓Ｉを用いて、製造者の指
示に従ってポＩＪ　ＩＪンカー領域のユニーククローニ
ング部位を開く。

Ｈａｅｌｌ消化生成物をＭ１３のポリリンカー領域のＳ
ｍａ　１部位に平滑末端連結し、そしてＪ。

Ｍｅｓｓｉｎｇ、前掲、の方法に従ってこの連結生成物
を用いてＥ、コＩＪ　ＪＭ１０３　（ＢＲＬ）株を形質
転換する。

平滑末端化されたＨｉｎｆｌ消化生成物をＭ１３のポＩ
Ｊ　ＩＪンカー領域のＳｍａ　１部位に平滑末端連結し
、セしてＨａｅｌ［プローブについて前記したのと同様
にして、別個の反応としてＥ、コリＪＭ１０３株全形質
転換する。

カｎｆｌプローブについては、３４１　ｂｐ現ｎｆ）挿
入部を適切な方向に含みそしてｐＢＲ：β”供与体から
の位置２７７５−３１１５をまたぐクローンを、プラー
クリフト及びこれに続＜３２ｐ−標識オリゴマープロー
ブによる所望配列のブロービングにより選択する。

Ｈａｅ［ｌプローブについては、２７２ｂｐμツ■挿入
部を適切な方向に含みそしてｐＢＲ：β１供与体からの
位置３１８１−３４５６を捷たぐクローンを上記の様に
して拾い上げ、そしてプローブする。

２つのＭ１３クローンを増殖せしめ、そしてＭｅｓｓｉ
ｎｇｓ前掲、により記載されている様にして、培養上清
からｓ　ｓ　ＤＮＡを単離する。

Ｈ１ｎｆｌプローブは診断用Ｍｓｔ１部位及びＤｄｅ１
部位の５′側にあり、そして支持体結合プローブとして
機能する。

１（ａｅ［［プローブは診断用Ｍｓｔ１１部位及びＤｄ
ｅ　【部位の３′側にあり、そしてレポータープローブ
として機能する。下記参照のこと。

ここで、スケール上の印は５０塩基対ごとに付されてお
シ、そして制限地図上の印は各制限酵素部位を示す。Ｘ
印は鎌形赤血球貧血の診断用聾１ｅ　１部位及びｙす■
部位を示す。

こうして得られた各プローブを、米国特許屋４．５８２
，７８９に記載されている様なプソラレン化され良化合
物を用いてピオチ／又はフルオレツセイ／により標識す
る。反応体を３５０〜３７０ｎｍのＵＶ光紛で１０分間
照射し、そして反応した物質をエタノール沈澱によって
単離する。

正常β−グロビンについてホモ接合性のヒト−ゲノムＤ
ＮＡをリン／４’系でセルライｙ　Ｍｏ　１　ｔ４　（
ＨｕｍａｎＧｅｎｅｔｉｃ　Ｍｕｔａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　
Ｒｅｐｏｓｌｔｏｒｙ　（ＨＭＣＲ）、カムデン、Ｎ、
　Ｊ、　ＧＭ２２１９Ｃ）から抽出し、そして鎌形赤血
球貧血についてホモ接合性のとドーグツムＤＮＡをＥＢ
Ｖ−形質ｋＪ％ＢセルラインＳＣＩ　（アメリカン・タ
イプ・カルチュア・コレクション（ＡＴＣＣ）、ロック
ビル、ＭＤ、ＣＲＬ８７５６）から、Ｍａｎｉａｔｌｓ
等、前掲、２８０−２８１頁の方法に本質的に従って抽
出した。β−又はδ−グロビン遺伝子配列を含有しない
ＣＭ２Ｏ６４（ＨＭＣＲ）からのヒトーｒツムＤＮＡを
、Ｍａｎｉａｔｉｓ等、前掲、２８０−２８１頁の方法
に本質的に従って抽出する。ヒテロ接合性の鎌形赤血球
貧血対立遺伝子を有する個体から得られるとトーダノム
胱は次の方法により血液から抽出する。

ＤＮＡは、１０〜５０−の血液からＲＢＣからの分離、
高塩濃度及び洗剤中での白血球の溶解、フェノールによ
る核酸の抽出、及び沈澱により次の様にして最も容易に
調製される。

１）血液サンプルに１／４容積の０．２５　Ｍ　Ｔｒｉ
ｍ　−Ｈｃｚ（ｐＨ７，ｓ）、０．５　Ｍ　Ｎａ２ＥＤ
ＴＡ、　　１　％　Ｎｏｎ１ｔａｔｐ−４０を加える。

混合を穏和にしかし常に行う。

２）コニカルチューブ中での低速遠心分離により核の粗
分画を集める。核を５．０　ａｔの０．０５ＭＴｒｉａ
　、　０．１　Ｍ　ＥＤＴＡに懸濁する。５ゴチー−ブ
に移す。

３）　　Ｏ，ｓ　ｍｔの４ＭＮａＣ２，２％サルニア　
シＡ／を加え、そして識しく且つ常に混合する６１ｒＩ
Ｌｌのフェノール／クロロホルム〔１：１、フェノール
（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌにより飽和）及びクロロホルム〕を
加え、そして乳化せしめる。激しい振とうを５分間続け
、そして次に高速で遠心分離する。

４）有機相及び債乱されない変性蛋白質のバンドを残し
て（上）水性相を集める。溶液を他の５ｍｌチューブに
移し、そして２．５１１Ｌｌの９５チエタノールを加え
る。十分に混合し、そして高速で遠心する。

５）上清をデカントし、そして３ＷＬｌの７（ｌエタノ
ールをチューブに加える。激しく（渦流）攪拌してベレ
ットを懸濁し、次に高速で遠心する。

エタノールを遠心し、次に７０％エタノール洗浄を反復
する。遠心及びデカントの後、３ｍ／の９５チエタノー
ルを加える。混合し、次に高速で遠心する。エタノール
をデカントし、次にチューブを乾燥する。

６）　　Ｑ、１ｍ／！の側限酵素消化緩衝液中に硬レッ
トを溶解し、次に０．０１ｍ７の制限酵素を加える。

３７℃にて１時間又はそれよシ長時間インキュベートす
る。

りざヌクレアーゼ＋アミラーゼ段階を含めることもでき
、そしてＤＮＡの純度を保証するため核酸をＣｓＣ１浮
力密度平衡勾配中で遠心することもできる。ＤＮＡを勾
配画分から３容情の７０チエタノールにより沈澱せしめ
、沈澱を７０チエタノール及び９５％エタノールによυ
洗浄する。沈ｆｓを乾燥し、ＤＮＡをＴＥ　　（１０ｍ
Ｍ　Ｔｒｙｓ−ＨＣｌ、　ｐＨ７，６，１ｍＭ　Ｎａ２
ＥＤＴＡ　）又は水中に溶解する。

ＤＮＡサンプルをＤｄｓ　ｌ又はＭｓｔｌｌのいずれか
、あるいは両者の組合わせにより製造者の指示に従って
消化する。未知サンプルとしてゲノムＤＮＡを・使用す
る場合、制限酵素消化を完全に又はほとんど完全に行う
のが好ましい。特に、野性型ＤＮＡ中には存在するがし
かし鎌形赤血球貧血遺伝子には存在しない聾に■／μ四
■部位を、鎌形赤血球貧血対立遺伝子を欠（ＩＩＪＡサ
ンプル中で開裂せしめなければならない。市販のＭｓｔ
［は活性が高くないので、消化ができるだけ完全である
ことを保証するために特別な注意を払わなければならな
い。

この様な注意には、理論量に比べて１オーダーより多く
の酵素を使用することが含まれる。鎌形赤血球貧血の特
別の場合には、過剰の秩り■及びＤｄａｌの両者による
ＤＮＡの消化が含まれる。多くの酵素は消化混合物に稀
釈した後１時間以内に不活性化されるので、消化時間を
延長することには頼れない。

ケ゛ツムＤＮＡｔ−９５℃にて５分間加熱そして迅速に
冷却するか、又は０．２　Ｍ　ＮａＯＨと共に２５℃に
て１０分間インキュベートしそして０．２　Ｍ　ＨＣｌ
に暴露して−を６．５−８．５にすることにより変性せ
しめる。

冷却又は中和の後、２種類の１０−プを各変性ＤＮＡサ
ンプルにｉｏｏ、ｏｏｏ倍の過剰量で加え、そしてハイ
ブリダイゼーションを０．５　Ｍ　ＮａＣｔ’ｆｒ苫む
１０　ｍＭ　ＩＪン酸緩衝液中で５０〜６０℃にて約３
時間行う。

次に、反応混合物を、抗−フルオレッセイン抗体（α−
フルオレッセインに対するＭＡＲＩｇＧ２ａ　。

ケミコンインターナショナル社）により前処理されたミ
クロタイターウェルに適用し、リン酸緩衝化塩溶液（Ｐ
ＢＳ　）及びトウィーン０．０５チ（ｐＨ８，０）によ
υ洗浄して被覆されていない抗体を除去し、そしてブロ
ッキング剤としてのＰＢＳとニシン組子ＤＮＡの混合物
により前処理する。

反応混合物を室温にて１５分間〜３時間振とり又は攪拌
することにより、前処理されたプレートと接触せしめ、
この後プレートをＰＢＳ及びトリトンＸ−１００洗剤の
洗浄Ｂ液により洗浄する。５分間攪拌した後、このすす
ぎ溶剤を、市販のアビジン−ホースラディツシュパーオ
キシダーゼ接合体を含有する洗浄溶液と交換する。プレ
ートを２０分間接合体と接触せしめ、次に尿素を加えた
洗浄溶液によりすすぐ。プレートを酢酸ナトＩＪウム、
エタノール、３．３’５．５’−テトラメチルベンゾジ
ン（ＴＭＢ　）及びＨ２０□の混合物と共にインキュベ
ートする。

ＳＣＩセルラインについては青色が現われ、このセルラ
イン中には正常β−グロビンに特徴的なＭａｔ■及びＤ
ｄｅ　ｌ制限部位が存在しないことが示され、このこと
に正しい。対照０Ｍ２０６４セルラインについては予想
通シ赤色が表われない。β−グロビン配列が存在しない
からである。正常β−グロビンに特徴的な蜘す■及び旦
ｄｏ　（部位を有し、そしてそれ故に開裂されるＭｏ　
１　ｔ　４セルラインについては青色が現われない。ヘ
テロ接合性鎌状赤面球貧血サンプルにおいては青色が現
われ、そしてヘテロ接合性サンプルは与えられたサンプ
ル負荷につき半分のシグナルを示すはずであるから、ホ
モ接合体から区別することができる。

ＴＭＢ及びＨ２Ｏ２と共に１時間インキュベートした後
、反応混合物にＨ２ＳＯ４を添加することができる。青
色が現われておればそれは明黄色に変化し、そして存在
する配列の量は４５０λにおける反応混合物の吸光を測
定することによりて定量することができる。

上記の方法は、固体支持体としてミクロタイターウェル
を有する液体取扱装置を用いて自動化することができる
。

例２゜ Ｍａｙｅｒ等、ＰＮＡＳ　（ＵＳＡ　）、８１　：６１
１０−６１１４（１９８４）により記載されているＮ。

ゴノルヘア（Ｎ、　ｇｏｎｏｒｒｈｅａｅ　）　ＭＳｌ
１株ビルス（ｐｌｕｇ　）遺伝子からプローブを調製す
ることによりＮ、ゴノルヘア中に含まれる配列を決定す
ることができる。ピルスはＮ、ゴノルヘアの支配的な表
面抗原であり、そして宿主細胞への細菌の付着を可能に
する。

ＭＳＩＩ　ピルス遺伝子をＴａｑ　（で開裂せしめるこ
とＫより得られるＤＮＡセグメントからプローブを調製
することができる。使用されるセグメントは位置１０４
−３６４、及び３６５−７７８をまたぎ、そしてそれぞ
れ隣接する２　６１　ｂｐ及び４１４ｂｐのＴａｑｌ断
片である。下記参照のことここで、スケール上の印は５
０塩基対の間隔を示し、そしてＴａｑ　ｌ上の印はＴａ
ｑ　１部位の存在を示す。

前記の例において記載した様にして標準的クローニング
法によりこれらの断片をＭ１３７アージ中に平滑末端連
結し、そして前記の例に記載した様にして、１つの生じ
たベクターをフルオレッセインと反応せしめ、そして他
方のベクターをビオチンと反応せしめることができる。

次に、例１に記載した方法を用いることができる。但し
、ハイブリダイゼーションの後に］）ＨＡを開裂せしめ
るために制限酵素を使用しない。試験サンプル中にＮ、
ゴノルヘアが存在すれば青色が生じ、標的へのプローブ
のハイブリダイゼーションが起ったことが示される。

櫓約すれば、この発明は、サンプル中に含まれることが
疑われる核酸配列の迅速かつ鋭敏な測定のための方法を
提供する。この測定方法は迅速サンプル処理のための粗
製サンプルを評価するために使用することができる。さ
らに、両プローブが特異的であれば、核酸配列に対する
特異性増強が生ずるであろう。ハイブリダイゼーション
後の固体支持体への結合が妨害物質又はバックグラウン
ド発生物質の除去を保証し、高いシグナル対ノイズ比を
もたらすであろう。さらに、この発明の方法は目動化が
比較的容易であり、そしてレポータープローブを検出す
るために酵素が使用されれば、製造が容易で高価でない
機により測定が読み取られる。＆の使用はまた、−Ｊ−
高い感度をもたらす。

以下余白

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、１又は複数の核酸を含む試験サンプル中に含有され
   ることが疑われる特定の核酸配列がその中に含有されて
   いるか否かを検出するための液体ハイブリダイゼーショ
   ン法であって、 （ａ）試験サンプル中の核酸を抽出し； （ｂ）抽出されたすべての二本鎖核酸を単鎖に分離し； （ｃ）該単鎖核酸をそれぞれが或るモル過剰の少なくと
   も２種類のオリゴヌクレオチドプローブに暴露し、該プ
   ローブの少なくとも１種類は検出され得る同一の又は異
   る標識に連結されたレポータープローブであり、そして
   該プローブの少なくとも１種類は、相補的結合分子を特
   異的に認識しそしてレポータープローブのために使用さ
   れる標識成分とは異る結合成分に連結された支持体結合
   プローブであり、ここで該プローブのすべては検出され
   るべき前記核酸配列の同じ鎖の異る重らない領域に相補
   的であり； （ｄ）段階（ｃ）からの混合物を前記配列への前記プロ
   ーブのハイブリダイゼーションに好都合なハイブリダイ
   ゼーション条件にかけ； （ｅ）段階（ｄ）の混合物を前記結合プローブの結合成
   分により特異的に認識される前記相補的結合分子を担持
   する固体支持相と接触せしめ； （ｆ）該固体支持相を洗浄してすべてのハイブリダイズ
   していない核酸及び細胞破片を該支持体から除去し；そ
   して （ｇ）前記レポータープローブの標識成分を検出するた
   めの１又は複数の手段に前記固体支持体を暴露すること
   により前記配列の存在又は不存在を検出する； ことを含んで成る方法。 ２、前記試験サンプル中の前記核酸が二本鎖ＤＮＡであ
   り、そして前記プローブがオリゴデオキシリボヌクレオ
   チドである特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ３、前記プローブが試験サンプルに対して １０，０００〜１，０００，０００倍モル過剰で存在す
   る特許請求の範囲第１項又は第２項に記載の方法。 ４、前記１又は複数のプローブの１又は複数の標識成分
   が、分光的にもしくは光化学的に、又は該１又は複数の
   標識成分と検出手段を有するポリペプチド、レクチンも
   しくは抗体との間の１又は複数の検出可能な複合体の形
   成により検出可能である特許請求の範囲第１項〜第３項
   のいずれか１項に記載の方法。 ５、検出されるべき前記配列が制限部位を表わし、１つ
   のプローブが該制限部位の３′側に対応し、１つのプロ
   ーブが該制限部位の３′側に対応し、そしていずれのプ
   ローブも該制限部位に重ならず、ここで１つのプローブ
   が同じ制限部位を表わす第２の配列をまたぐ場合に、同
   じ制限部位を表わすいずれの配列もまたがないプローブ
   が支持体結合プローブであり、そして段階（ｄ）の後で
   あって段階（ｅ）の前に前記混合物を検出されるべき前
   記制限部位を認識する制限酵素と接触せしめる、特許請
   求の範囲第１項〜第４項のいずれか１項に記載の方法。 ６、前記制限部位が鎌形赤血球貧血に特徴的である特許
   請求の範囲第５項に記載の方法。 ７、段階（ｅ）における支持体結合プローブと固体支持
   体相との間の解離定数パラメーターが１０＾−＾７Ｍ未
   満である特許請求の範囲第１項〜第７項に記載の方法。 ８、支持体相への支持体結合プローブの非特異的結合を
   プロックするために段階（ｅ）に先立って固体支持体相
   を処理する特許請求の範囲第１項〜第７項のいずれか１
   項に記載の方法。 ９、ＤＮＡの試験サンプル中に含有されることが疑われ
   る特定のＤＮＡ配列がそれに含有されているか否かを検
   出するための液体ハイブリダイゼーション法であって、 （ａ）該試験サンプルから該ＤＮＡを抽出し；（ｂ）該
   ＤＮＡを単鎖に分離し； （ｃ）該単鎖を各々１０，０００〜１，０００，０００
   モル過剰量の２種類のＤＮＡプローブに暴露し、該ＤＮ
   Ａプローブの１つはビオチンにより標識されておりそし
   て検出されるべきＤＮＡ配列の１つの領域に対して相補
   的であるレポータープローブであり、そして該ＤＮＡプ
   ローブの１つはフルオレッセインに結合されておりそし
   て前記配列の第２の領域に対して相補的である支持体結
   合プローブであり、該２つの領域は検出されるべきＤＮ
   Ａ配列の同じ鎖からのものであり； （ｄ）段階（ｃ）からの混合物を前記ＤＮＡ配列への前
   記プローブのハイブリダイゼーションに好都合なハイブ
   リダイゼーション条件にかけ； （ｅ）段階（ｄ）の混合物を、フルオレッセインに特異
   的に結合する抗体を担持しておりそして支持体相への支
   持体結合プローブの非特異的結合をブロックするために
   前処理されている該固体支持体と接触せしめ； （ｆ）該同体支持体相を洗浄して該固体支持体相からす
   べてのハイブリダイズしていない核酸及び細胞破片を除
   去し； （ｇ）該洗浄された支持体にアビジン−酵素接合体又は
   ストレプトアビジン−酵素接合体を添加し；そして、 （ｈ）該酵素の基質を該酵素処理された支持体に添加し
   、そして分光的手段を用いて酵素触媒反応の生成物の生
   成を検出する； ことを含んで成る方法。 １０、１又は複数の核酸を含む試験サンプル中に含有さ
   れることが疑われる特定の核酸配列がそれに含有されて
   いるか否かを決定するための液体ハイブリダイゼーショ
   ン測定キットであって、（ａ）検出され得る標識成分に
   連結されておりそして検出されるべき核酸配列の１つの
   鎖の第一の領域に対して相補的である少なくとも１つの
   オリゴヌクレオチドレポータープローブのための容器； （ｂ）前記第一標識成分とは異っておりそして相補的結
   合分子を特異的に認識する結合成分に連結されているオ
   リゴヌクレオチド支持体結合プローブ（ここで、該支持
   体結合プローブは前記の配列の同じ鎖にあり該配列の第
   一領域と重ならない第二領域に対して相補的である）の
   ための容器；及び （ｃ）前記支持体結合プローブの結合成分により特異的
   に認識される前記相補的結合分子を担持する固体支持体
   ； を一まとめにして含んで成るキット。