JPH0463679B2 - - Google Patents
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Description
本発明は、核酸断片よりなる改良された核酸試
薬に関する。本発明はまた、クローニングされた
核酸断片よりなる核酸試薬に関する。 種々のハイブリダイゼーシヨン法が、核酸の同
定および研究のために一般に用いられている。１
つの例である直接ハイブリダイゼーシヨン法
（direct hybridization methods）では、同定さ
れるべき核酸を含む試料は、溶液中に存在するか
（プラウテイガムら（Brautigam et al.）のJ.
Clin.Microbiol.、1980、12巻、226〜234頁および
英国特許公開第 2019408号公報参照）、または固
体の担体に付着され（affixed）（米国特許第
4139346号、同第 4302204号、同第 4358535号
および同第 4395486号明細書、英国特許公開第
2034323号および同第 2095833号公報、ヨーロ
ツパ特許公開第 62286号、同第 62237号および
同第 61740号公報参照）、同定されるべき核酸と
ハイブリツドを形成する１つの標識された核酸試
薬を用いることにより検出される。 他の知られているハイブリダイゼーシヨン法に
は、ダン（Dunn）およびハツセル（Hassell）
（セル（Cell）、12巻、23〜36頁、1977）によつて
示されたツーステツプサンドイツチハイブリダイ
ゼーシヨン法（two−step sandwich
hybridization method）およびヨーロツパ特許
公開第79139号公報に示されたワンステツプサン
ドイツチハイブリダイゼーシヨン法（one−step
sandwich hybridization methods）がある。サ
ンドイツチ法による核酸の同定においては、試料
溶液中に存在する核酸を検出するために２つの
別々の核酸試薬を必要とする。これらの試薬の１
つは固体の担体に付着され、他の１つは標識され
る。 固体の担体に付着された試薬および標識された
試薬の両方の核酸試薬は、それらの塩基配列が同
定されるべき核酸の塩基配列と相補的かまたはほ
とんど相補的であることを特徴とする。用いられ
る核酸試薬は、天然の核酸そのままか、またはそ
の断片である。断片は、たとえば制限酵素を用い
ることによつてえられる。核酸試薬はまた、合成
的に、または組みかえDNA技術により製造され
る。天然のプラスミド（米国特許第 4358535号
明細書参照）、バクテリオフアージからの核酸
（米国特許第 4543535号明細書参照）、リボソー
ムRNAおよびメツセンジヤーRNA（米国特許第
4302204号明細書参照）または異なるウイルスか
らの核酸（ストールハンスクら（Stalhandske
et al.）、Curr.Top.Microbiol.Virol.104巻、1983
参照）が核酸試薬として用いられている。ウイル
スのゲノム全体が、たとえばハイブリツドウイル
スのメツセンジヤーRNA中の異なるウイルスに
属する部分の同定に用いられている（ダンおよび
ハツセルのセル（Cell）、12巻、23〜36頁、1977
参照）。核酸試薬はまた、組みかえDNA技術を用
いることによつても製造されている（米国特許第
4395486号および同第 4359535号明細書、ヨー
ロツパ特許出願第 79139号明細書、英国特許公
開第 2034323号公報およびヨーロツパ特許第
62286号明細書参照）。組みかえDNA技術により
製造された核酸試薬は、複製され同定された
DNA断片がベクターのDNAから精製されるよう
な方法で用いられるか、または異なるベクターに
連結した組みかえ体DNA分子として用いられる。
組みかえDNA技術により製造された従来から用
いられている核酸試薬は、同定する機能を有する
１つの連続した核酸断片またはいくつかに分離し
たクローンからなつている。 我々は今や、同定されるべき核酸と相補的な１
つまたはいくつかの部分（segments）から調製
された核酸断片よりなる、新規でより感度の高い
核酸試薬、すなわち相互には相補的でない核酸断
片であつて、かつそれが固体担体に付着され、
同定すべき核酸のある配列部分に相補的な断片
と、検出可能なマーカーで標識され、同定すべ
き核酸の前記配列部分とは相互に排他的である配
列部分に相補的な断片とであるものを組み合わせ
たものからなる特異的な核酸を同定するためのサ
ンドイツチハイブリダイゼーシヨン用の核酸試薬
において、 上記との核酸断片からなる組み合わせ試
薬が同定すべき１または数種の核酸に対応し得
るだけの組み合わせが保持されるように用意さ
れる とともに、 上記との核酸断片のそれぞれがいずれも
２以上の核酸断片で組成されて、当該核酸試薬
と同定すべき核酸との間のハイブリツド形式に
おいてとの核酸断片が実質的に互い違いに
繰り返して位置しうるものとされ、これにより
同定すべき異なる核酸ごとに複数個のサンドイ
ツチハイブリツドが形成されるようにされた １または数種の特異的な核酸を同定するための
サンドイツチハイブリダイゼーシヨン用核酸試薬
を開発した。 叙上のような核酸断片よりなる核酸試薬は、サ
ンドイツチハイブリダイゼーシヨンテストにおい
て、従来より用いられている核酸試薬に比べて少
なくとも２倍の感度を有する。本発明による核酸
試薬またはそれらの組み合わせを用いることによ
り、従来に比べてより少量の核酸を同定すること
が可能になり、これらの試薬はとくに適切にサン
ドイツチハイブリダイゼーシヨン法に適用されう
る。 本発明による核酸試薬がサンドイツチハイブリ
ダイゼーシヨン法においてより高い感度を有する
のは、いくぶんかは、いくつものプローブ
（probe）を用いることで固体担体上の標識され
たハイブリツドの量が増加するという事実によつ
ている。ハイブリツドを形成するすべてのプロー
プに加えて、ベクター由来の核酸を標識してもよ
い（第１図および第２図参照）。第１図および第
２図において、ｖはベクター由来のDNA、Ｘは
同定されるべき核酸、ｂは標識されたプローブ、
ａは固体担体に付着された同定する機能を有する
核酸試薬およびＦはフイルターをあらわす。いく
つものプローブが用いられると、ベクター由来の
標識された核酸部分の量が増加し、形成されるハ
イブリツドに対してより多くの標識が結合され
る。したがつて、ハイブリツドはより容易に検出
しうる。 本発明による核酸断片からなる核酸試薬がサン
ドイツチハイブリダイゼーシヨン法に用いられる
ばあい、少なくとも２つ、あるいは第１図に示さ
れているように３つの同定する機能を有する核酸
断片が固体担体に付着される。このばあい、検出
されるべき核酸ストランドｘの異なる領域が、固
体担体に付着された核酸断片、たとえばa1，a2お
よびa3と反応の程度によつて１つまたはいくつか
の点でハイブリツドを形成することができる。反
応が最後の段階に達すると第１図に示されたよう
な状態になり、試料ストランドは、たとえば第１
図におけるb1およびb2のようなプローブとハイブ
リツドをなすループを形成する。この時点におい
て、ハイブリツド合流点（hybridization joining
point） (1)からベクター由来核酸部分までの距
離が小さくなり（第１図参照）、このハイブリツ
ドは第２図に示されているような１組の試薬によ
り形成されたハイブリツド（従来技術）よりも安
定であり、この従来技術のハイブリツドは、核酸
断片の列（array）の全領域と同じ大きさであ
る。１組の試薬から形成されたハイブリツドのベ
クター由来部分は、たとえば浸とうのような機械
的張力によつて容易に破壊される。そのようなば
あい、ハイブリツドにすでに結合していた標識は
消える。 本発明による改良された核酸試薬は、従来から
用いられている核酸試薬より感度がいいので染色
体配列換え（rearrangements）や遺伝病の検出
に適している。 本発明は、核酸断片よりなる核酸試薬に関す
る。 本発明の特徴は特許請求の範囲においてきわだ
つて示されているが、以下の記載および添付の図
面においてより詳しく説明する。 本発明は、核酸断片よりなる核酸試薬に関す
る。これらの核酸試薬は、少なくとも２つ、しか
し好ましくは20までのいくつかの核酸断片よりな
り、これらの核酸断片は同定されるべき核酸と充
分に相補的な１つまたはいくつかの核酸に由来す
る。それによつて、固体担体に付着され、同定
すべき核酸のある配列部分に相補的な断片と、
検出可能なマーカーで標識され、同定すべき核酸
の前記配列部分とは相互に排他的である配列部分
に相補的な断片とであるものを組み合わせたもの
からなる核酸試薬であつて、当該核酸試薬と同定
すべき核酸との間のハイブリツド形成において
との核酸断片が実質的に互い違いに繰り返して
位置しうる核酸試薬がえられるが、これらの核酸
断片は互いに相同であつてはならない。 核酸試薬は、合成して調製することもできる。
このばあい、との核酸断片は、互いに相同で
あつてはならない。しかし、これらの核酸断片
は、同定されるべき核酸におけるたがいに交互に
なつている部位と充分に相補的でなければならな
い。これらの核酸断片は、同定されるべき核酸の
塩基配列を特徴づけたのち、完全な自動機械によ
つて容易に調製することができる。 本発明による核酸試薬は、連結されていない列
の核酸断片、連結された核酸断片または連結され
ていない核酸断片と連結された列の両方の核酸断
片よりなる。 核酸断片はベクターに結合されていてもよい
し、ベクターの部分を含んでいてもよいし、また
はベクターの部分が完全に欠失していてもよい。 用いられる核酸断片は、最小15ヌクレオチドの
長さを有する。核酸断片の長さについては事実上
の上限はないが、20〜5000ヌクレオチドの長さを
有する核酸断片を用いるのが有利である。本発明
による核酸断片は、同定されるべきゲノムまたは
ゲノムの一部、たとえばゲノムのある部分に相当
する比較的大きなクローンに由来する。本発明に
よる核酸断片は、それゆえ直接隣接していないい
くつかの独立したゲノム領域から調製することが
できる。このようにして調製された核酸断片は結
合され、同じ試薬として用いられる。核酸断片
は、同定されるべき核酸と同一ではないが、同定
されるべき核酸と試薬のあいだに安定なハイブリ
ツドが形成されるために充分に相補的である
DNAから単離することもできる。適当な核酸断
片の調製は、ゲノムからの適当な核酸断片の単離
に決して限定されることはない、そのような核酸
断片を調製するために等しく有用な多くの方法が
利用できる。当業者は、合成または半合成的方法
によつて核酸断片を調製することができる。 試薬は、少なくとも２つの系列（series）の、
当該核酸試薬と同定されるべき核酸との間に形成
されるハイブリツドにおいては、異なる系列に属
する核酸断片が実質的に互い違いに位置すること
になるような核酸断片（a1，a2，a3などおよび
b1，b2，b3など）がえられるような仕方で単離さ
れる。系列a1，a2，a3などに属する核酸断片は、
近接して位置するが、互いに隣接してはいない断
片よりなる。系列b1，b2，b3などに属する核酸断
片もまた、近接して位置するが、互いに隣接して
はいない核酸断片よりなる。系列a1，a2，a3など
に属する核酸断片および系列b1，b2，b3などに属
する核酸断片は互いに相同であつてはならない。
系列a1，a2，a3などに属する核酸断片および系列
b1，b2，b3などに属する核酸断片は、第３図に示
されているように、一つおきの断片がａ系列に属
し、一つおきの断片がｂ系列に属するような仕方
で単離するのが好ましい。第３図において、a1，
a2，a3およびb1，b2，b3は、同定されるべき核酸
に充分に相補的な核酸断片である。第４図に示さ
れているように、第３の系列の核酸断片（c1，
c2，c3など）を同じ核酸から単離することももち
ろん可能である。２つの、当該核酸試薬と同定さ
れるべき核酸との間に形成されるハイブリツドに
おいては、異なる系列に属する核酸断片が実質的
に互い違いに位置することになるような核酸試薬
は互いに直接つき従つているのが好ましいが、こ
のことは本発明にとつて、絶対必要条件ではな
い。 前記核酸断片系列は、第５ａ図に示されている
ようにa1，a2，a3などおよびb1，b2，b3などのよ
うな連結されていない断片として、または第５ｂ
図に示されているように、a1−a2−a3などおよび
b1−b2−b3などのような連結されたより長いスト
ランドとして用いることができる。もちろん、第
５ｃ図に示されているように、たとえばａ系列に
おいてa1が連結されていない断片でa2−a3が互い
に連結された断片、ｂ系列においてたとえばb1−
b2が互いに連結されておりb3が連結されていない
というような、あらゆる種類の中間的な形を調製
することもできる。 第６図は、サンドイツチハイブリツドの種々の
列を示す。第６ａ図は、核酸断片が連結されてい
ないばあいのハイブリツドの列を示す。第６ｂ図
は、標識された核酸断片が互いに連結されたばあ
いのハイブリツドの列を示す。第６ｃ図は、サン
ドイツチハイブリツドの列が、互いに連結された
標識核酸断片の列および連結されていない標識核
酸断片から形成されたばあいを示す。第６図にお
いて、ｘは同定されるべき核酸、b1，b2およびb3
は標識されたプローブ、a1，a2およびa3は固体担
体に付着された核酸断片の列を示す。 ｂ系列に属する核酸断片は、たとえば、標識さ
れた核酸断片すなわちプローブＢがえられるよう
な仕方で標識することができる。ａ系列に属する
核酸試薬は、固体担体に結合した核酸試薬Ａがえ
られるような仕方で固体担体に付着することがで
きる。もちろん、その代わりに標識された核酸試
薬Ａおよびそれに対応する固体担体に結合した核
酸試薬Ｂを調製することもできる。 標識された、およびそれぞれ固体担体に付着さ
れた叙上の核酸試薬のペア、ＡとＢまたはＢとＡ
は、同定されるべきいくつもの異なる核酸のため
に調製することができる。それらの核酸試薬のペ
アは適当に組み合わされて、異なる核酸試薬ペ
ア、すなわちA1とB1，A2とB2，A3とB3などま
たはB1とA1，B2とA2，B3とA3などのような組
み合わせにすることができる。異なるいくつかの
核酸を同定する核酸断片を含む試薬もまた、プロ
ーブAx−Ay−Azがえられるようにして結合する
ことができる。たとえばこれは第７図に示されて
いるように、（a1−a2−a3）x−（a1−a2−a3）y−（a1
−a2−a3）zの核酸断片の列からなる。第７図にお
いて、a1x，a2xおよびa3xは核酸ｘを同定する核酸
断片Axの列、a1y，a2yおよびa3yは核酸ｙを同定
する核酸断片Ayの列、a1z，a2zおよびa3zは核酸ｚ
を同定する核酸断片Azの列、ｖはベクター由来
の核酸部分をあらわす。もちろん、連結された核
酸断片の列もまた連結されていない断片、または
連結された断片と連結されていない断片の適当な
混合物と同様に用いることができる。 第８図に示されたサンドイツチハイブリツドの
列は、第７図に示された核酸試薬を用いることに
よつてえられる。いくつもの異なる核酸を同時に
同定しようとするならば、もちろん第８図に示さ
れているように別々のフイルターを用いる必要が
ある。第８ａ図は核酸ｘを同定する固体担体のば
あい、第８ｂ図は核酸ｙを同定する固体担体のば
あい、第８ｃ図は核酸ｚを同定する固体担体のば
あいをそれぞれ示す。第８ａ図、第８ｂ図および
第８ｃ図において、b1xおよびb2xは固体担体に付
着されて核酸ｘを同定する核酸断片の列、b1yお
よびb2yは固体担体に付着されて核酸ｙを同定す
る核酸断片の列、b1zおよびb2zは固体担体に付着
されて核酸ｚを同定する核酸断片の列、ｘ，ｙお
よびｚは同定されるべき核酸をあらわす。Fx、
FyおよびFzはそれぞれのばあいの固体担体また
はフイルターであり、Ax−Ay−Azは別々の固体
担体が用いられたばあいに３つの核酸すべてを同
時に同定するプローブである。 叙上の核酸断片系列および試薬は、公知の組み
かえDNA技術によつて調製することができる。
制限酵素を用いることによつて、同定されるべき
核酸または同定されるべき核酸に相当する部分か
ら、長さの異なるいくつかの核酸断片がえられ
る。同定されるべきゲノムの制限酵素切断地図が
わかつているばあいには、制限酵素を用いること
によつてえられた断片のうち適当な隣接断片をゲ
ノムから選択することができ、その断片は単離さ
れ、組みかえDNA技術を用いることによつて増
幅される。 知られていないゲノムが含まれるばあいには、
試薬の調製において中間的な段階操作を行なうこ
とができる。すなわち、比較的大きな制限酵素切
断断片をクローニングし、この断片をマツピング
し、このようにしてえられた情報にもとづいて核
酸断片の系列a1，a2，a3などおよびb1，b2，b3な
どが製造される。 もちろん、上述した方法を組み合わせて用いる
ことも、出発物質としていくつかの大きな別々に
クローニングされた制限酵素切断断片を、用いる
ことも、いくつかの別々の断片を調製しそれを結
合して適当な組み合わせを形成することもでき
る。 本発明による核酸断片系列a1，a2，a3などおよ
びb1，b2，b3などは、組みかえDNA技術を用い
て、ａ系列に属する断片を１つのベクター、たと
えばプラスミドpBR322中にクローニングし、ｂ
系列に属する断片を前記ベクターと共通なシーケ
ンスをもたない他の適当なベクター中にクローニ
ングするようなやり方で調製するのが有利であ
る。バクテリオフアージM13は後者の有利なベク
ターの例である。ａ系列に属する核酸断片は互い
に連結することができ、連結された断片は１つの
ベクター中にクローニングすることができる。た
とえば、a1−a2は互いに連結されて、１つの連続
した挿入部として同じpBR322ベクター中にクロ
ーニングすることができる。同じようなやり方で
試薬系列b1−b2を調製することができる。クロー
ニングにおいて、外来DNAの非常に大きな挿入
部を連結することができるようなベクターを用い
るのが好ましい。この目的のためには、たとえば
ランダムフアージおよびコスミドベクターが適し
ている。 このように本発明によるサンドイツチハイブリ
ダイゼーシヨン法においては、核酸断片よりなる
２つの試薬ペア、すなわち同定されるべく標識物
質で標識した試薬つまりプローブと、固体担体に
付着されたいわゆるフイルター試薬の２つが必要
である。 プローブを標識するために、放射性同位元素が
最も一般に用いられる。たとえば英国特許公開第
2034323号公報、米国特許第 4358535号明細書
および同第 4302204号明細書においては32P，
125I，131Iおよび3Hのような同位元素が用いられ
ている。ヨーロツパ特許公開第 79139号公報に
おいては、125Iが用いられている。核酸のプロー
ブはまた別のやり方でも修飾され、たとえば螢光
標識によつて標識される（フランス特許公開第
2518755号公報参照）。酵素的な標識または酵素的
に測定可能な標識もまた用いられる（英国特許公
開第 2019408号公報、ヨーロツパ特許公開第
63879号公報およびフランス特許公開第 2519005
号公報参照）。ヨーロツパ特許公開第 70685号公
報および同第 70687号公報には、発光（light−
emitting）標識および発光標識法が記載され、フ
ランス特許公開第 2518755号公報には免疫学的
に測定可能な標識が記載されている。米国特許第
4374120号明細書に記載されているランタニド
キレート、とくにユーロピウムを標識物質として
用いることができる。リアリーら（Leary et al）
の「PNAS、80巻、4045〜4049頁、1983」に記載
されているビオチン−アビジン（biotin−
avidin）標識物質もまた標識に適している。本発
明による核酸試薬の標識に用いることのできるい
くつかの標識を上述したが、本発明による核酸断
片の標識に適した、新しいよりすぐれた標識物質
が開発されるであろうことは明らかである。 フイルター試薬に適した担体には、種々のニト
ロセルロースフイルターが含まれる（米国特許第
4358535号明細書および英国特許公開第
2095833号公報参照）。東ドイツ特許公告第
148955号公報には、核酸を担体（たとえば紙）に
化学的に結合させる方法が記載されている。米国
特許第 4359535号および同第4302204号明細書に
は、固体担体として用いることのできる化学的に
修飾された紙が記載されている。他のこれに代わ
る担体としては、ナイロン膜および修飾されたニ
トロセルロースフイルターがある。しかし、本発
明による固体担体として用いるにより適した新し
い材料が開発されるであろうことは明白である。
もちろん、種々のクロマトグラフイーマトリツク
ス、トリアジンもしくはエポキシ活性化セルロー
ス（triazine−or epoxy−activated cellulose）
のような種々のクロマトグラフイーマトリクス、
ラテツクスなどのような他の固体担体もまた用い
ることもできる。原則として、つぎにのべること
を除いて固体担体の選択が制限されることはな
い。一本鎖の形の核酸を、それが相補的な核酸と
ハイブリツドを形成できるように固体担体上に付
着することが可能でなければならない。固体担体
はまた、ハイブリダイゼーシヨン溶液から容易に
取り除くことができなければならない。あるい
は、ハイブリダイゼーシヨン溶液は固体担体から
容易に取り除くことができなければならない。プ
ローブはまた、洗い落とすことができなくなるの
で担体物質自体に粘着してはならない。 上述した標識された核酸試薬と固体担体に付着
された核酸試薬のペアＡとＢもしくはＢとＡの組
み合わせ、およびいくつかの異なる核酸の同定の
ためにつくられたそのような核酸のペアから、組
合わせAxとBx，AyとByおよびAzとBzを組みたて
ることができる。 これらの組み合わせは、サンドイツチハイブリ
ダイゼーシヨン法によつて核酸ｘ，ｙおよびｚを
同時に同定するために用いることができる。 試料は、核酸がハイブリダイゼーシヨン溶液中
に放出されて、それらが１本鎖にされるようなや
り方で処理される。ハイブリダイゼーシヨンはハ
イブリダイゼーシヨン溶液中で行なわれ、これに
対して固体担体に付着された核酸断片および標識
された核酸断片の両方が加えられる。ハイブリダ
イゼーシヨンがおこると、フイルターが固体担体
として用いられたばあいにはフイルターがハイブ
リダイゼーシヨン溶液から引き上げられる。クロ
マトグラフイーマトリツクスやラテツクスなどが
用いられたばあいには、ハイブリダイゼーシヨン
溶液が取り除かれる。固体担体は適当な洗浄溶液
ですすがれる。形成されたサンドイツチハイブリ
ツドの列（第８ａ図，第８ｂ図および第８ｃ図参
照）は公知の方法で検出される。放射性の標識
は、たとえばオートラジオグラフイー、シンチレ
ーシヨンカウンターまたはガンマカウンターによ
つて測定される。たとえば酵素的な標識は、たと
えば呈色反応ののち、測光法または沈降にもとづ
いて同定される。ランタニドキレートは、いわゆ
る“時間分解螢光”（time resolved
fluorescence）法によつて検出することができ
る。免疫学的な標識は、目的に適した免疫学的な
方法によつて検出される。 ハイブリダイゼーシヨン溶液として、種々の異
なる混合物を用いることができる。ヨーロツパ特
許公開第 79139号公報および米国特許第
4302204号明細書に示されているハイブリダイゼ
ーシヨン溶液を例としてあげることができる。も
ちろん、他のハイブリダイゼーシヨン溶液を用い
ることもできる。ハイブリダイゼーシヨンは０〜
80℃の温度で起こるが、たとえば65℃の温度で行
なうのが有利である。非常に短い時間のあいだに
充分なハイブリダイゼーシヨンを起こすことがで
きるが、たとえば12〜20時間のあいだでハイブリ
ダイゼーシヨンを行なうのが有利である。 ツーステツプサンドイツチハイブリダイゼーシ
ヨン法は、原則として同様の方法で行なわれる
が、このばあいは固体担体に付着された核酸試薬
が最初にハイブリダイゼーシヨン溶液に加えられ
る。ハイブリダイゼーシヨンが起こると固体担体
は洗浄されて、標識された核酸試薬が存在する中
で第２のハイブリダイゼーシヨンが行なわれる。
叙上の標識された核酸試薬またはその組み合わせ
Ax，Ay，AzなどおよびBx，By，Bzなどは、もち
ろん直接ハイブリダイゼーシヨン法においても用
いることができる。このばあいは、溶液中の核酸
試料を同定されるべきおのおのの核酸ｘ，ｙおよ
びｚに対して、分割しなければならない。あるい
は、試料が固体担体に付着されているばあいは、
おのおのの試料に対して担体に付着された別々の
試料を調製しなければならない。形成されたハイ
ブリツドの列（第９図参照）は公知の方法によつ
て検出される。第９図において、Ｆは固体担体す
なわちフイルター、ｘは同定されるべき核酸、ｖ
はベクター由来部分を表わす。用いられる標識さ
れたプローブはa1，a2およびa3（第９ａ図参照）、
b1およびb2（第９ｂ図参照）、a1，b1，a2，b2およ
びa3（第９ｃ図参照）である。 すでに述べたように、本発明において種々の組
み合わせ試薬をつくることができる。これらの組
み合わせ試薬を用いることにより、いくつもの異
なる核酸を同時に同定することができる。同定さ
れるべき異なる核酸に相補的な核酸断片は、いく
つもの異なる核酸を同定する１つのプロープがえ
られるような方法で、連結されていない断片を混
合物として、または互いに連結されて用いること
ができる。固体担体に付着された核酸試薬は、も
ちろん同定が首尾よくできるように別々にしてお
かなければならない。 核酸断片を用いたハイブリダイゼーシヨンは、
ヒト、動物および植物の種々の病原微生物を同定
するために用いることができる。この方法によつ
て、食料品の中に存在し食中毒を惹き起こすクロ
ストリデイウム菌（clostridia）、サルモネラ菌
（salmonellae）およびブドウ球菌
（staphylococci）のような微生物を同定すること
ができる。この方法は、腸内細菌やエンテロウイ
ルスのような水中に存在する汚染物の同定に適し
ている。 核酸断片を用いるサンドイツチハイブリダイゼ
ーシヨンテストは定量的な方法なので、これはた
とえば遺伝子の増幅の検出および測定に応用でき
る。この特徴は、たとえばガンの検出および治療
において重要である。安定なハイブリツドの列を
形成するためには、プローブ試薬に相補的なシー
ケンスとフイルター試薬に相補的なシーケンス
が、試料ストランド中で互いに適当な、好ましく
は５キロベース（kb）未満の距離で位置してい
ることが必要である。この２つの領域のあいだの
距離に関する変化が起こると、この変化はこの方
法によつてはつきりと観察される。それゆえ、こ
の方法は、変化したmRNA、遺伝子の配列換え、
免疫グロブリン発現遺伝子の配列換えおよび遺伝
病の検出にも適している。このように、核酸断片
から種々の組み合わせ試薬をつくることができ
る。たとえば、性病の原因となる因子を同定する
ために、淋病、梅毒、ヘルペスおよびクラミデイ
アを同定する核酸断片を含むプローブを有するキ
ツトを調製することができる。同定はこのばあ
い、淋病、梅毒、ヘルペスまたはクラミデイアの
ための別々のフイルターを用いることによつて可
能となる。 本発明は、とくに組みかえプラスミドpKTH
1220およびpKTH 1271よりなる核酸断片に関す
る。組みかえプラスミドpKTH 1220は、プラス
ミドベクターpBR 322中に、クラミデイアに特
異的なトラコーマクラミデイア（Chlamydia
trachomatis）L2のDNAを含有する。この組み
かえプラスミドは、宿主の大腸菌（Escherichia
coli）K12 HB101中にクローニングされる。組
みかえプラスミドpKTH 1271は、プラスミドベ
クターpBR 325中に、サイトメガロウイルスAD
169からのDNAを含有する。この組みかえプラス
ミドは、宿主の大腸菌K12 HB101中にクローニ
ングされる。組みかえプラスミドpKTH 1220お
よびpKTH 1271を含むそれぞれの宿主は、菌株
保存機関であるドイチエザムルンク フオン ミ
クロオルガニスメン（Deutsche Sammlung von
Mikroorganismen（DSM）（グリーゼバツハシユ
トラツセ（Griesebachstrasse）８，Ｄ−3400
ゲツチンゲン（Gottingen）、西ドイツ）に寄託
したある。組みかえプラスミドpKTH 1220を含
む株の寄託番号はDSM 2825であり、組みかえプ
ラスミドpKTH 1271を含む株の寄託番号はDSM
2826である。寄託微生物は、特許出願がいつたん
公開になると自由に入手できる。 つぎに本発明を実施例にもとづいてさらに詳し
く説明するが、かかる実施例にのみ限定されるも
のではない。核酸（DNAおよびRNA）の構造
は、それが真核生物細胞由来であるか原核生物細
胞由来であるかにかかわらず、類似している。こ
の理由から実施例において示された原理は、ヒト
を含む動物、植物またはウイルスの核酸にひとし
く充分応用することができる。それゆえ、本発明
による核酸断片は、ヒト、動物、植物、微生物ま
たはウイルスの核酸を検出するために用いること
ができる。核酸断片は、合成的にも調製すること
ができる。同定されるべき核酸のシーケンスは特
徴づけることができ、これに対して相補的な核酸
断片は自動核酸調製機によつて調製することがで
きる。 実施例 １ (a) トラコーマクラミデイアからの核酸試薬およ
びその調製 トラコーマクラミデイアグループの診断に適
したDNA断片を、血清型L2のトラコーマクラ
ミデイアのDNAから調製した。公知の方法で
DNAを単離および断片化し、公知の方法で、
えられたDNA断片をプラスミドpBR322中に
クローニングし宿主生物である大腸菌K12
HB101に移した。トラコーマクラミデイアL2
細菌のジーンバンク、すなわちクラミデイア由
来のDNAのBam HI制限酵素により切り離さ
れた断片をそれぞれ含む多量の組みかえプラス
ミドがクローニングの結果えられた。核酸試薬
の調製のために、クラミデイアのDNAに由来
するDNAの最大限に大きな挿入部を含んでい
る組みかえプラスミドをジーンバンクから選ん
だ。そのようなプラスミドの１つは
pKTH1220として表わされ、これは菌株保存
機関であるドイチエ ザムルンクフオン ミク
ロオルガニスメンに寄託番号DSM2825で寄託
されており、試薬として用いるのに適している
ことは直接ハイブリダイゼーシヨンテストによ
つて示された。テストは、pKTH1220が異な
る血清型のトラコーマクラミデイアに由来する
すべての核酸を同定するが、他の核酸は同定し
ないことを示した。 異なる制限酵素を用いることによつてうるこ
とが可能な適当な断片を、pKTH 1220のプラ
スミドDNAから選択し、これらの断片のいく
つかをpAT 153プラスミドに移して、いくつ
かをM13フアージに移してさらにクローニング
した（マニアチスら（Maniatis et al）の「モ
レキユラー クローニング（Molecular
Cloning）、アラボラトリー マニユアル（Ａ
Laboratory Manual）、コールド スプリン
グハーバー ラボラトリー（Cold Spring
Harbor Laboratory）、６頁、1982」参照）。
第１０図に示したのは組みかえプラスミド
pKTH1220であり、その分子長は14kbであつ
た。第１０図において、BamHI、SalIおよび
ClaIは用いられた制限酵素を表わし、a1，a2，
b1，b2およびb3はこれらの制限酵素によつてえ
られた断片の相互の位置と大きさを表わす。ｂ
系列に属する断片は標識されたプローブであ
る。第１表に断片の大きさ、さらなるクローニ
ングに用いられたベクター、組みかえプラスミ
ドの名称およびその用途を示した。
薬に関する。本発明はまた、クローニングされた
核酸断片よりなる核酸試薬に関する。 種々のハイブリダイゼーシヨン法が、核酸の同
定および研究のために一般に用いられている。１
つの例である直接ハイブリダイゼーシヨン法
（direct hybridization methods）では、同定さ
れるべき核酸を含む試料は、溶液中に存在するか
（プラウテイガムら（Brautigam et al.）のJ.
Clin.Microbiol.、1980、12巻、226〜234頁および
英国特許公開第 2019408号公報参照）、または固
体の担体に付着され（affixed）（米国特許第
4139346号、同第 4302204号、同第 4358535号
および同第 4395486号明細書、英国特許公開第
2034323号および同第 2095833号公報、ヨーロ
ツパ特許公開第 62286号、同第 62237号および
同第 61740号公報参照）、同定されるべき核酸と
ハイブリツドを形成する１つの標識された核酸試
薬を用いることにより検出される。 他の知られているハイブリダイゼーシヨン法に
は、ダン（Dunn）およびハツセル（Hassell）
（セル（Cell）、12巻、23〜36頁、1977）によつて
示されたツーステツプサンドイツチハイブリダイ
ゼーシヨン法（two−step sandwich
hybridization method）およびヨーロツパ特許
公開第79139号公報に示されたワンステツプサン
ドイツチハイブリダイゼーシヨン法（one−step
sandwich hybridization methods）がある。サ
ンドイツチ法による核酸の同定においては、試料
溶液中に存在する核酸を検出するために２つの
別々の核酸試薬を必要とする。これらの試薬の１
つは固体の担体に付着され、他の１つは標識され
る。 固体の担体に付着された試薬および標識された
試薬の両方の核酸試薬は、それらの塩基配列が同
定されるべき核酸の塩基配列と相補的かまたはほ
とんど相補的であることを特徴とする。用いられ
る核酸試薬は、天然の核酸そのままか、またはそ
の断片である。断片は、たとえば制限酵素を用い
ることによつてえられる。核酸試薬はまた、合成
的に、または組みかえDNA技術により製造され
る。天然のプラスミド（米国特許第 4358535号
明細書参照）、バクテリオフアージからの核酸
（米国特許第 4543535号明細書参照）、リボソー
ムRNAおよびメツセンジヤーRNA（米国特許第
4302204号明細書参照）または異なるウイルスか
らの核酸（ストールハンスクら（Stalhandske
et al.）、Curr.Top.Microbiol.Virol.104巻、1983
参照）が核酸試薬として用いられている。ウイル
スのゲノム全体が、たとえばハイブリツドウイル
スのメツセンジヤーRNA中の異なるウイルスに
属する部分の同定に用いられている（ダンおよび
ハツセルのセル（Cell）、12巻、23〜36頁、1977
参照）。核酸試薬はまた、組みかえDNA技術を用
いることによつても製造されている（米国特許第
4395486号および同第 4359535号明細書、ヨー
ロツパ特許出願第 79139号明細書、英国特許公
開第 2034323号公報およびヨーロツパ特許第
62286号明細書参照）。組みかえDNA技術により
製造された核酸試薬は、複製され同定された
DNA断片がベクターのDNAから精製されるよう
な方法で用いられるか、または異なるベクターに
連結した組みかえ体DNA分子として用いられる。
組みかえDNA技術により製造された従来から用
いられている核酸試薬は、同定する機能を有する
１つの連続した核酸断片またはいくつかに分離し
たクローンからなつている。 我々は今や、同定されるべき核酸と相補的な１
つまたはいくつかの部分（segments）から調製
された核酸断片よりなる、新規でより感度の高い
核酸試薬、すなわち相互には相補的でない核酸断
片であつて、かつそれが固体担体に付着され、
同定すべき核酸のある配列部分に相補的な断片
と、検出可能なマーカーで標識され、同定すべ
き核酸の前記配列部分とは相互に排他的である配
列部分に相補的な断片とであるものを組み合わせ
たものからなる特異的な核酸を同定するためのサ
ンドイツチハイブリダイゼーシヨン用の核酸試薬
において、 上記との核酸断片からなる組み合わせ試
薬が同定すべき１または数種の核酸に対応し得
るだけの組み合わせが保持されるように用意さ
れる とともに、 上記との核酸断片のそれぞれがいずれも
２以上の核酸断片で組成されて、当該核酸試薬
と同定すべき核酸との間のハイブリツド形式に
おいてとの核酸断片が実質的に互い違いに
繰り返して位置しうるものとされ、これにより
同定すべき異なる核酸ごとに複数個のサンドイ
ツチハイブリツドが形成されるようにされた １または数種の特異的な核酸を同定するための
サンドイツチハイブリダイゼーシヨン用核酸試薬
を開発した。 叙上のような核酸断片よりなる核酸試薬は、サ
ンドイツチハイブリダイゼーシヨンテストにおい
て、従来より用いられている核酸試薬に比べて少
なくとも２倍の感度を有する。本発明による核酸
試薬またはそれらの組み合わせを用いることによ
り、従来に比べてより少量の核酸を同定すること
が可能になり、これらの試薬はとくに適切にサン
ドイツチハイブリダイゼーシヨン法に適用されう
る。 本発明による核酸試薬がサンドイツチハイブリ
ダイゼーシヨン法においてより高い感度を有する
のは、いくぶんかは、いくつものプローブ
（probe）を用いることで固体担体上の標識され
たハイブリツドの量が増加するという事実によつ
ている。ハイブリツドを形成するすべてのプロー
プに加えて、ベクター由来の核酸を標識してもよ
い（第１図および第２図参照）。第１図および第
２図において、ｖはベクター由来のDNA、Ｘは
同定されるべき核酸、ｂは標識されたプローブ、
ａは固体担体に付着された同定する機能を有する
核酸試薬およびＦはフイルターをあらわす。いく
つものプローブが用いられると、ベクター由来の
標識された核酸部分の量が増加し、形成されるハ
イブリツドに対してより多くの標識が結合され
る。したがつて、ハイブリツドはより容易に検出
しうる。 本発明による核酸断片からなる核酸試薬がサン
ドイツチハイブリダイゼーシヨン法に用いられる
ばあい、少なくとも２つ、あるいは第１図に示さ
れているように３つの同定する機能を有する核酸
断片が固体担体に付着される。このばあい、検出
されるべき核酸ストランドｘの異なる領域が、固
体担体に付着された核酸断片、たとえばa1，a2お
よびa3と反応の程度によつて１つまたはいくつか
の点でハイブリツドを形成することができる。反
応が最後の段階に達すると第１図に示されたよう
な状態になり、試料ストランドは、たとえば第１
図におけるb1およびb2のようなプローブとハイブ
リツドをなすループを形成する。この時点におい
て、ハイブリツド合流点（hybridization joining
point） (1)からベクター由来核酸部分までの距
離が小さくなり（第１図参照）、このハイブリツ
ドは第２図に示されているような１組の試薬によ
り形成されたハイブリツド（従来技術）よりも安
定であり、この従来技術のハイブリツドは、核酸
断片の列（array）の全領域と同じ大きさであ
る。１組の試薬から形成されたハイブリツドのベ
クター由来部分は、たとえば浸とうのような機械
的張力によつて容易に破壊される。そのようなば
あい、ハイブリツドにすでに結合していた標識は
消える。 本発明による改良された核酸試薬は、従来から
用いられている核酸試薬より感度がいいので染色
体配列換え（rearrangements）や遺伝病の検出
に適している。 本発明は、核酸断片よりなる核酸試薬に関す
る。 本発明の特徴は特許請求の範囲においてきわだ
つて示されているが、以下の記載および添付の図
面においてより詳しく説明する。 本発明は、核酸断片よりなる核酸試薬に関す
る。これらの核酸試薬は、少なくとも２つ、しか
し好ましくは20までのいくつかの核酸断片よりな
り、これらの核酸断片は同定されるべき核酸と充
分に相補的な１つまたはいくつかの核酸に由来す
る。それによつて、固体担体に付着され、同定
すべき核酸のある配列部分に相補的な断片と、
検出可能なマーカーで標識され、同定すべき核酸
の前記配列部分とは相互に排他的である配列部分
に相補的な断片とであるものを組み合わせたもの
からなる核酸試薬であつて、当該核酸試薬と同定
すべき核酸との間のハイブリツド形成において
との核酸断片が実質的に互い違いに繰り返して
位置しうる核酸試薬がえられるが、これらの核酸
断片は互いに相同であつてはならない。 核酸試薬は、合成して調製することもできる。
このばあい、との核酸断片は、互いに相同で
あつてはならない。しかし、これらの核酸断片
は、同定されるべき核酸におけるたがいに交互に
なつている部位と充分に相補的でなければならな
い。これらの核酸断片は、同定されるべき核酸の
塩基配列を特徴づけたのち、完全な自動機械によ
つて容易に調製することができる。 本発明による核酸試薬は、連結されていない列
の核酸断片、連結された核酸断片または連結され
ていない核酸断片と連結された列の両方の核酸断
片よりなる。 核酸断片はベクターに結合されていてもよい
し、ベクターの部分を含んでいてもよいし、また
はベクターの部分が完全に欠失していてもよい。 用いられる核酸断片は、最小15ヌクレオチドの
長さを有する。核酸断片の長さについては事実上
の上限はないが、20〜5000ヌクレオチドの長さを
有する核酸断片を用いるのが有利である。本発明
による核酸断片は、同定されるべきゲノムまたは
ゲノムの一部、たとえばゲノムのある部分に相当
する比較的大きなクローンに由来する。本発明に
よる核酸断片は、それゆえ直接隣接していないい
くつかの独立したゲノム領域から調製することが
できる。このようにして調製された核酸断片は結
合され、同じ試薬として用いられる。核酸断片
は、同定されるべき核酸と同一ではないが、同定
されるべき核酸と試薬のあいだに安定なハイブリ
ツドが形成されるために充分に相補的である
DNAから単離することもできる。適当な核酸断
片の調製は、ゲノムからの適当な核酸断片の単離
に決して限定されることはない、そのような核酸
断片を調製するために等しく有用な多くの方法が
利用できる。当業者は、合成または半合成的方法
によつて核酸断片を調製することができる。 試薬は、少なくとも２つの系列（series）の、
当該核酸試薬と同定されるべき核酸との間に形成
されるハイブリツドにおいては、異なる系列に属
する核酸断片が実質的に互い違いに位置すること
になるような核酸断片（a1，a2，a3などおよび
b1，b2，b3など）がえられるような仕方で単離さ
れる。系列a1，a2，a3などに属する核酸断片は、
近接して位置するが、互いに隣接してはいない断
片よりなる。系列b1，b2，b3などに属する核酸断
片もまた、近接して位置するが、互いに隣接して
はいない核酸断片よりなる。系列a1，a2，a3など
に属する核酸断片および系列b1，b2，b3などに属
する核酸断片は互いに相同であつてはならない。
系列a1，a2，a3などに属する核酸断片および系列
b1，b2，b3などに属する核酸断片は、第３図に示
されているように、一つおきの断片がａ系列に属
し、一つおきの断片がｂ系列に属するような仕方
で単離するのが好ましい。第３図において、a1，
a2，a3およびb1，b2，b3は、同定されるべき核酸
に充分に相補的な核酸断片である。第４図に示さ
れているように、第３の系列の核酸断片（c1，
c2，c3など）を同じ核酸から単離することももち
ろん可能である。２つの、当該核酸試薬と同定さ
れるべき核酸との間に形成されるハイブリツドに
おいては、異なる系列に属する核酸断片が実質的
に互い違いに位置することになるような核酸試薬
は互いに直接つき従つているのが好ましいが、こ
のことは本発明にとつて、絶対必要条件ではな
い。 前記核酸断片系列は、第５ａ図に示されている
ようにa1，a2，a3などおよびb1，b2，b3などのよ
うな連結されていない断片として、または第５ｂ
図に示されているように、a1−a2−a3などおよび
b1−b2−b3などのような連結されたより長いスト
ランドとして用いることができる。もちろん、第
５ｃ図に示されているように、たとえばａ系列に
おいてa1が連結されていない断片でa2−a3が互い
に連結された断片、ｂ系列においてたとえばb1−
b2が互いに連結されておりb3が連結されていない
というような、あらゆる種類の中間的な形を調製
することもできる。 第６図は、サンドイツチハイブリツドの種々の
列を示す。第６ａ図は、核酸断片が連結されてい
ないばあいのハイブリツドの列を示す。第６ｂ図
は、標識された核酸断片が互いに連結されたばあ
いのハイブリツドの列を示す。第６ｃ図は、サン
ドイツチハイブリツドの列が、互いに連結された
標識核酸断片の列および連結されていない標識核
酸断片から形成されたばあいを示す。第６図にお
いて、ｘは同定されるべき核酸、b1，b2およびb3
は標識されたプローブ、a1，a2およびa3は固体担
体に付着された核酸断片の列を示す。 ｂ系列に属する核酸断片は、たとえば、標識さ
れた核酸断片すなわちプローブＢがえられるよう
な仕方で標識することができる。ａ系列に属する
核酸試薬は、固体担体に結合した核酸試薬Ａがえ
られるような仕方で固体担体に付着することがで
きる。もちろん、その代わりに標識された核酸試
薬Ａおよびそれに対応する固体担体に結合した核
酸試薬Ｂを調製することもできる。 標識された、およびそれぞれ固体担体に付着さ
れた叙上の核酸試薬のペア、ＡとＢまたはＢとＡ
は、同定されるべきいくつもの異なる核酸のため
に調製することができる。それらの核酸試薬のペ
アは適当に組み合わされて、異なる核酸試薬ペ
ア、すなわちA1とB1，A2とB2，A3とB3などま
たはB1とA1，B2とA2，B3とA3などのような組
み合わせにすることができる。異なるいくつかの
核酸を同定する核酸断片を含む試薬もまた、プロ
ーブAx−Ay−Azがえられるようにして結合する
ことができる。たとえばこれは第７図に示されて
いるように、（a1−a2−a3）x−（a1−a2−a3）y−（a1
−a2−a3）zの核酸断片の列からなる。第７図にお
いて、a1x，a2xおよびa3xは核酸ｘを同定する核酸
断片Axの列、a1y，a2yおよびa3yは核酸ｙを同定
する核酸断片Ayの列、a1z，a2zおよびa3zは核酸ｚ
を同定する核酸断片Azの列、ｖはベクター由来
の核酸部分をあらわす。もちろん、連結された核
酸断片の列もまた連結されていない断片、または
連結された断片と連結されていない断片の適当な
混合物と同様に用いることができる。 第８図に示されたサンドイツチハイブリツドの
列は、第７図に示された核酸試薬を用いることに
よつてえられる。いくつもの異なる核酸を同時に
同定しようとするならば、もちろん第８図に示さ
れているように別々のフイルターを用いる必要が
ある。第８ａ図は核酸ｘを同定する固体担体のば
あい、第８ｂ図は核酸ｙを同定する固体担体のば
あい、第８ｃ図は核酸ｚを同定する固体担体のば
あいをそれぞれ示す。第８ａ図、第８ｂ図および
第８ｃ図において、b1xおよびb2xは固体担体に付
着されて核酸ｘを同定する核酸断片の列、b1yお
よびb2yは固体担体に付着されて核酸ｙを同定す
る核酸断片の列、b1zおよびb2zは固体担体に付着
されて核酸ｚを同定する核酸断片の列、ｘ，ｙお
よびｚは同定されるべき核酸をあらわす。Fx、
FyおよびFzはそれぞれのばあいの固体担体また
はフイルターであり、Ax−Ay−Azは別々の固体
担体が用いられたばあいに３つの核酸すべてを同
時に同定するプローブである。 叙上の核酸断片系列および試薬は、公知の組み
かえDNA技術によつて調製することができる。
制限酵素を用いることによつて、同定されるべき
核酸または同定されるべき核酸に相当する部分か
ら、長さの異なるいくつかの核酸断片がえられ
る。同定されるべきゲノムの制限酵素切断地図が
わかつているばあいには、制限酵素を用いること
によつてえられた断片のうち適当な隣接断片をゲ
ノムから選択することができ、その断片は単離さ
れ、組みかえDNA技術を用いることによつて増
幅される。 知られていないゲノムが含まれるばあいには、
試薬の調製において中間的な段階操作を行なうこ
とができる。すなわち、比較的大きな制限酵素切
断断片をクローニングし、この断片をマツピング
し、このようにしてえられた情報にもとづいて核
酸断片の系列a1，a2，a3などおよびb1，b2，b3な
どが製造される。 もちろん、上述した方法を組み合わせて用いる
ことも、出発物質としていくつかの大きな別々に
クローニングされた制限酵素切断断片を、用いる
ことも、いくつかの別々の断片を調製しそれを結
合して適当な組み合わせを形成することもでき
る。 本発明による核酸断片系列a1，a2，a3などおよ
びb1，b2，b3などは、組みかえDNA技術を用い
て、ａ系列に属する断片を１つのベクター、たと
えばプラスミドpBR322中にクローニングし、ｂ
系列に属する断片を前記ベクターと共通なシーケ
ンスをもたない他の適当なベクター中にクローニ
ングするようなやり方で調製するのが有利であ
る。バクテリオフアージM13は後者の有利なベク
ターの例である。ａ系列に属する核酸断片は互い
に連結することができ、連結された断片は１つの
ベクター中にクローニングすることができる。た
とえば、a1−a2は互いに連結されて、１つの連続
した挿入部として同じpBR322ベクター中にクロ
ーニングすることができる。同じようなやり方で
試薬系列b1−b2を調製することができる。クロー
ニングにおいて、外来DNAの非常に大きな挿入
部を連結することができるようなベクターを用い
るのが好ましい。この目的のためには、たとえば
ランダムフアージおよびコスミドベクターが適し
ている。 このように本発明によるサンドイツチハイブリ
ダイゼーシヨン法においては、核酸断片よりなる
２つの試薬ペア、すなわち同定されるべく標識物
質で標識した試薬つまりプローブと、固体担体に
付着されたいわゆるフイルター試薬の２つが必要
である。 プローブを標識するために、放射性同位元素が
最も一般に用いられる。たとえば英国特許公開第
2034323号公報、米国特許第 4358535号明細書
および同第 4302204号明細書においては32P，
125I，131Iおよび3Hのような同位元素が用いられ
ている。ヨーロツパ特許公開第 79139号公報に
おいては、125Iが用いられている。核酸のプロー
ブはまた別のやり方でも修飾され、たとえば螢光
標識によつて標識される（フランス特許公開第
2518755号公報参照）。酵素的な標識または酵素的
に測定可能な標識もまた用いられる（英国特許公
開第 2019408号公報、ヨーロツパ特許公開第
63879号公報およびフランス特許公開第 2519005
号公報参照）。ヨーロツパ特許公開第 70685号公
報および同第 70687号公報には、発光（light−
emitting）標識および発光標識法が記載され、フ
ランス特許公開第 2518755号公報には免疫学的
に測定可能な標識が記載されている。米国特許第
4374120号明細書に記載されているランタニド
キレート、とくにユーロピウムを標識物質として
用いることができる。リアリーら（Leary et al）
の「PNAS、80巻、4045〜4049頁、1983」に記載
されているビオチン−アビジン（biotin−
avidin）標識物質もまた標識に適している。本発
明による核酸試薬の標識に用いることのできるい
くつかの標識を上述したが、本発明による核酸断
片の標識に適した、新しいよりすぐれた標識物質
が開発されるであろうことは明らかである。 フイルター試薬に適した担体には、種々のニト
ロセルロースフイルターが含まれる（米国特許第
4358535号明細書および英国特許公開第
2095833号公報参照）。東ドイツ特許公告第
148955号公報には、核酸を担体（たとえば紙）に
化学的に結合させる方法が記載されている。米国
特許第 4359535号および同第4302204号明細書に
は、固体担体として用いることのできる化学的に
修飾された紙が記載されている。他のこれに代わ
る担体としては、ナイロン膜および修飾されたニ
トロセルロースフイルターがある。しかし、本発
明による固体担体として用いるにより適した新し
い材料が開発されるであろうことは明白である。
もちろん、種々のクロマトグラフイーマトリツク
ス、トリアジンもしくはエポキシ活性化セルロー
ス（triazine−or epoxy−activated cellulose）
のような種々のクロマトグラフイーマトリクス、
ラテツクスなどのような他の固体担体もまた用い
ることもできる。原則として、つぎにのべること
を除いて固体担体の選択が制限されることはな
い。一本鎖の形の核酸を、それが相補的な核酸と
ハイブリツドを形成できるように固体担体上に付
着することが可能でなければならない。固体担体
はまた、ハイブリダイゼーシヨン溶液から容易に
取り除くことができなければならない。あるい
は、ハイブリダイゼーシヨン溶液は固体担体から
容易に取り除くことができなければならない。プ
ローブはまた、洗い落とすことができなくなるの
で担体物質自体に粘着してはならない。 上述した標識された核酸試薬と固体担体に付着
された核酸試薬のペアＡとＢもしくはＢとＡの組
み合わせ、およびいくつかの異なる核酸の同定の
ためにつくられたそのような核酸のペアから、組
合わせAxとBx，AyとByおよびAzとBzを組みたて
ることができる。 これらの組み合わせは、サンドイツチハイブリ
ダイゼーシヨン法によつて核酸ｘ，ｙおよびｚを
同時に同定するために用いることができる。 試料は、核酸がハイブリダイゼーシヨン溶液中
に放出されて、それらが１本鎖にされるようなや
り方で処理される。ハイブリダイゼーシヨンはハ
イブリダイゼーシヨン溶液中で行なわれ、これに
対して固体担体に付着された核酸断片および標識
された核酸断片の両方が加えられる。ハイブリダ
イゼーシヨンがおこると、フイルターが固体担体
として用いられたばあいにはフイルターがハイブ
リダイゼーシヨン溶液から引き上げられる。クロ
マトグラフイーマトリツクスやラテツクスなどが
用いられたばあいには、ハイブリダイゼーシヨン
溶液が取り除かれる。固体担体は適当な洗浄溶液
ですすがれる。形成されたサンドイツチハイブリ
ツドの列（第８ａ図，第８ｂ図および第８ｃ図参
照）は公知の方法で検出される。放射性の標識
は、たとえばオートラジオグラフイー、シンチレ
ーシヨンカウンターまたはガンマカウンターによ
つて測定される。たとえば酵素的な標識は、たと
えば呈色反応ののち、測光法または沈降にもとづ
いて同定される。ランタニドキレートは、いわゆ
る“時間分解螢光”（time resolved
fluorescence）法によつて検出することができ
る。免疫学的な標識は、目的に適した免疫学的な
方法によつて検出される。 ハイブリダイゼーシヨン溶液として、種々の異
なる混合物を用いることができる。ヨーロツパ特
許公開第 79139号公報および米国特許第
4302204号明細書に示されているハイブリダイゼ
ーシヨン溶液を例としてあげることができる。も
ちろん、他のハイブリダイゼーシヨン溶液を用い
ることもできる。ハイブリダイゼーシヨンは０〜
80℃の温度で起こるが、たとえば65℃の温度で行
なうのが有利である。非常に短い時間のあいだに
充分なハイブリダイゼーシヨンを起こすことがで
きるが、たとえば12〜20時間のあいだでハイブリ
ダイゼーシヨンを行なうのが有利である。 ツーステツプサンドイツチハイブリダイゼーシ
ヨン法は、原則として同様の方法で行なわれる
が、このばあいは固体担体に付着された核酸試薬
が最初にハイブリダイゼーシヨン溶液に加えられ
る。ハイブリダイゼーシヨンが起こると固体担体
は洗浄されて、標識された核酸試薬が存在する中
で第２のハイブリダイゼーシヨンが行なわれる。
叙上の標識された核酸試薬またはその組み合わせ
Ax，Ay，AzなどおよびBx，By，Bzなどは、もち
ろん直接ハイブリダイゼーシヨン法においても用
いることができる。このばあいは、溶液中の核酸
試料を同定されるべきおのおのの核酸ｘ，ｙおよ
びｚに対して、分割しなければならない。あるい
は、試料が固体担体に付着されているばあいは、
おのおのの試料に対して担体に付着された別々の
試料を調製しなければならない。形成されたハイ
ブリツドの列（第９図参照）は公知の方法によつ
て検出される。第９図において、Ｆは固体担体す
なわちフイルター、ｘは同定されるべき核酸、ｖ
はベクター由来部分を表わす。用いられる標識さ
れたプローブはa1，a2およびa3（第９ａ図参照）、
b1およびb2（第９ｂ図参照）、a1，b1，a2，b2およ
びa3（第９ｃ図参照）である。 すでに述べたように、本発明において種々の組
み合わせ試薬をつくることができる。これらの組
み合わせ試薬を用いることにより、いくつもの異
なる核酸を同時に同定することができる。同定さ
れるべき異なる核酸に相補的な核酸断片は、いく
つもの異なる核酸を同定する１つのプロープがえ
られるような方法で、連結されていない断片を混
合物として、または互いに連結されて用いること
ができる。固体担体に付着された核酸試薬は、も
ちろん同定が首尾よくできるように別々にしてお
かなければならない。 核酸断片を用いたハイブリダイゼーシヨンは、
ヒト、動物および植物の種々の病原微生物を同定
するために用いることができる。この方法によつ
て、食料品の中に存在し食中毒を惹き起こすクロ
ストリデイウム菌（clostridia）、サルモネラ菌
（salmonellae）およびブドウ球菌
（staphylococci）のような微生物を同定すること
ができる。この方法は、腸内細菌やエンテロウイ
ルスのような水中に存在する汚染物の同定に適し
ている。 核酸断片を用いるサンドイツチハイブリダイゼ
ーシヨンテストは定量的な方法なので、これはた
とえば遺伝子の増幅の検出および測定に応用でき
る。この特徴は、たとえばガンの検出および治療
において重要である。安定なハイブリツドの列を
形成するためには、プローブ試薬に相補的なシー
ケンスとフイルター試薬に相補的なシーケンス
が、試料ストランド中で互いに適当な、好ましく
は５キロベース（kb）未満の距離で位置してい
ることが必要である。この２つの領域のあいだの
距離に関する変化が起こると、この変化はこの方
法によつてはつきりと観察される。それゆえ、こ
の方法は、変化したmRNA、遺伝子の配列換え、
免疫グロブリン発現遺伝子の配列換えおよび遺伝
病の検出にも適している。このように、核酸断片
から種々の組み合わせ試薬をつくることができ
る。たとえば、性病の原因となる因子を同定する
ために、淋病、梅毒、ヘルペスおよびクラミデイ
アを同定する核酸断片を含むプローブを有するキ
ツトを調製することができる。同定はこのばあ
い、淋病、梅毒、ヘルペスまたはクラミデイアの
ための別々のフイルターを用いることによつて可
能となる。 本発明は、とくに組みかえプラスミドpKTH
1220およびpKTH 1271よりなる核酸断片に関す
る。組みかえプラスミドpKTH 1220は、プラス
ミドベクターpBR 322中に、クラミデイアに特
異的なトラコーマクラミデイア（Chlamydia
trachomatis）L2のDNAを含有する。この組み
かえプラスミドは、宿主の大腸菌（Escherichia
coli）K12 HB101中にクローニングされる。組
みかえプラスミドpKTH 1271は、プラスミドベ
クターpBR 325中に、サイトメガロウイルスAD
169からのDNAを含有する。この組みかえプラス
ミドは、宿主の大腸菌K12 HB101中にクローニ
ングされる。組みかえプラスミドpKTH 1220お
よびpKTH 1271を含むそれぞれの宿主は、菌株
保存機関であるドイチエザムルンク フオン ミ
クロオルガニスメン（Deutsche Sammlung von
Mikroorganismen（DSM）（グリーゼバツハシユ
トラツセ（Griesebachstrasse）８，Ｄ−3400
ゲツチンゲン（Gottingen）、西ドイツ）に寄託
したある。組みかえプラスミドpKTH 1220を含
む株の寄託番号はDSM 2825であり、組みかえプ
ラスミドpKTH 1271を含む株の寄託番号はDSM
2826である。寄託微生物は、特許出願がいつたん
公開になると自由に入手できる。 つぎに本発明を実施例にもとづいてさらに詳し
く説明するが、かかる実施例にのみ限定されるも
のではない。核酸（DNAおよびRNA）の構造
は、それが真核生物細胞由来であるか原核生物細
胞由来であるかにかかわらず、類似している。こ
の理由から実施例において示された原理は、ヒト
を含む動物、植物またはウイルスの核酸にひとし
く充分応用することができる。それゆえ、本発明
による核酸断片は、ヒト、動物、植物、微生物ま
たはウイルスの核酸を検出するために用いること
ができる。核酸断片は、合成的にも調製すること
ができる。同定されるべき核酸のシーケンスは特
徴づけることができ、これに対して相補的な核酸
断片は自動核酸調製機によつて調製することがで
きる。 実施例 １ (a) トラコーマクラミデイアからの核酸試薬およ
びその調製 トラコーマクラミデイアグループの診断に適
したDNA断片を、血清型L2のトラコーマクラ
ミデイアのDNAから調製した。公知の方法で
DNAを単離および断片化し、公知の方法で、
えられたDNA断片をプラスミドpBR322中に
クローニングし宿主生物である大腸菌K12
HB101に移した。トラコーマクラミデイアL2
細菌のジーンバンク、すなわちクラミデイア由
来のDNAのBam HI制限酵素により切り離さ
れた断片をそれぞれ含む多量の組みかえプラス
ミドがクローニングの結果えられた。核酸試薬
の調製のために、クラミデイアのDNAに由来
するDNAの最大限に大きな挿入部を含んでい
る組みかえプラスミドをジーンバンクから選ん
だ。そのようなプラスミドの１つは
pKTH1220として表わされ、これは菌株保存
機関であるドイチエ ザムルンクフオン ミク
ロオルガニスメンに寄託番号DSM2825で寄託
されており、試薬として用いるのに適している
ことは直接ハイブリダイゼーシヨンテストによ
つて示された。テストは、pKTH1220が異な
る血清型のトラコーマクラミデイアに由来する
すべての核酸を同定するが、他の核酸は同定し
ないことを示した。 異なる制限酵素を用いることによつてうるこ
とが可能な適当な断片を、pKTH 1220のプラ
スミドDNAから選択し、これらの断片のいく
つかをpAT 153プラスミドに移して、いくつ
かをM13フアージに移してさらにクローニング
した（マニアチスら（Maniatis et al）の「モ
レキユラー クローニング（Molecular
Cloning）、アラボラトリー マニユアル（Ａ
Laboratory Manual）、コールド スプリン
グハーバー ラボラトリー（Cold Spring
Harbor Laboratory）、６頁、1982」参照）。
第１０図に示したのは組みかえプラスミド
pKTH1220であり、その分子長は14kbであつ
た。第１０図において、BamHI、SalIおよび
ClaIは用いられた制限酵素を表わし、a1，a2，
b1，b2およびb3はこれらの制限酵素によつてえ
られた断片の相互の位置と大きさを表わす。ｂ
系列に属する断片は標識されたプローブであ
る。第１表に断片の大きさ、さらなるクローニ
ングに用いられたベクター、組みかえプラスミ
ドの名称およびその用途を示した。
【表】
第１表に示された制限酵素切断断片は、電気
泳動溶出によつてアガロースゲルから単離し、
公知の方法を用いて第１表に示されたベクター
の適当な制限酵素サイト中にクローニングし
た。 断片BamHI−BamHI（2.1kb）は、つぎのよ
うにして製造した。プラスミドpKTH1220の
断片BamHI−SalI（1.4kb）およびSalI−
BamHI（0.7kb）をゲル電気泳動によつてアガ
ロースゲル中で分離し、単離した。精製された
断片をT4リガーゼを用いて互いに連結し、こ
の反応で2.1kbのDNA断片が製造された。この
断片はBamHI酵素によつて認識されるフリー
の末端を有しており、２本鎖のM13 mp8フア
ージDNAのBamHI制限酵素サイトにさらに連
結される。こうして、トラコーマクラミデイア
のゲノム中で隣接して位置しない別々の２つの
DNA断片を含む組みかえフアージDNA
（mKTM 1245）がえられる。しかしながら、
ゲノム中でこれら２つのDNA断片は、フイル
ターに付着されるべきDNA試薬pKTH1250お
よびpKTH1252に隣接している（第１１図参
照）。第１１図は、第１表に示された組みかえ
プラスミドおよび組みかえフアージを核酸試薬
として用いたばあいに形成されるサンドイツチ
ハイブリツドの列を示す。 (b) トラコーマクラミデイアからえられた核酸試
薬のサンドイツチハイブリダイゼーシヨン法に
よる感度の証明 サンドイツチハイブリダイゼーシヨン法によ
つて、ひと続きの試薬のペアと比較したばあい
の、本発明による核酸試薬の感度を調べた。テ
ストは、１本鎖にしたpKTH 1250（a2）DNA
とpKTH 1252（a1）DNAをともに1011分子含
むフイルターを用いて行なつた。調べた試料は
pKTH1220プラスミドであり、これはテスト
に用いるために0.17M NaOH中で５分間沸騰
させて１本鎖にし、そのあと０℃に移して等モ
ル量の酢酸で中和した。第１表に示されている
mKTH 1242（b1）、mKTH 1239（b2）、
mKTH 1248（b3）およびmKTH 1245（b1−
b2）を125Iで標識されたプローブとしてテスト
に用いた。 ハイブリダイゼーシヨンを65℃において17時
間、４×SSC、0.02％フイコール（Ficoll）、
0.02％ポリビニルピロリドン、0.2％SDSおよ
びニシンの精子DNA 200μｇ／mlよりなるハ
イブリダイゼーシヨン溶液中で行なつた。フイ
ルターは50℃において２時間、0.1×SSCおよ
び0.2％SDSよりなる洗浄溶液で洗浄し、ガン
マカウンターを用いて測定した。結果を第２表
に示したが、これは５回行なつたテストの平均
である。
泳動溶出によつてアガロースゲルから単離し、
公知の方法を用いて第１表に示されたベクター
の適当な制限酵素サイト中にクローニングし
た。 断片BamHI−BamHI（2.1kb）は、つぎのよ
うにして製造した。プラスミドpKTH1220の
断片BamHI−SalI（1.4kb）およびSalI−
BamHI（0.7kb）をゲル電気泳動によつてアガ
ロースゲル中で分離し、単離した。精製された
断片をT4リガーゼを用いて互いに連結し、こ
の反応で2.1kbのDNA断片が製造された。この
断片はBamHI酵素によつて認識されるフリー
の末端を有しており、２本鎖のM13 mp8フア
ージDNAのBamHI制限酵素サイトにさらに連
結される。こうして、トラコーマクラミデイア
のゲノム中で隣接して位置しない別々の２つの
DNA断片を含む組みかえフアージDNA
（mKTM 1245）がえられる。しかしながら、
ゲノム中でこれら２つのDNA断片は、フイル
ターに付着されるべきDNA試薬pKTH1250お
よびpKTH1252に隣接している（第１１図参
照）。第１１図は、第１表に示された組みかえ
プラスミドおよび組みかえフアージを核酸試薬
として用いたばあいに形成されるサンドイツチ
ハイブリツドの列を示す。 (b) トラコーマクラミデイアからえられた核酸試
薬のサンドイツチハイブリダイゼーシヨン法に
よる感度の証明 サンドイツチハイブリダイゼーシヨン法によ
つて、ひと続きの試薬のペアと比較したばあい
の、本発明による核酸試薬の感度を調べた。テ
ストは、１本鎖にしたpKTH 1250（a2）DNA
とpKTH 1252（a1）DNAをともに1011分子含
むフイルターを用いて行なつた。調べた試料は
pKTH1220プラスミドであり、これはテスト
に用いるために0.17M NaOH中で５分間沸騰
させて１本鎖にし、そのあと０℃に移して等モ
ル量の酢酸で中和した。第１表に示されている
mKTH 1242（b1）、mKTH 1239（b2）、
mKTH 1248（b3）およびmKTH 1245（b1−
b2）を125Iで標識されたプローブとしてテスト
に用いた。 ハイブリダイゼーシヨンを65℃において17時
間、４×SSC、0.02％フイコール（Ficoll）、
0.02％ポリビニルピロリドン、0.2％SDSおよ
びニシンの精子DNA 200μｇ／mlよりなるハ
イブリダイゼーシヨン溶液中で行なつた。フイ
ルターは50℃において２時間、0.1×SSCおよ
び0.2％SDSよりなる洗浄溶液で洗浄し、ガン
マカウンターを用いて測定した。結果を第２表
に示したが、これは５回行なつたテストの平均
である。
【表】
統計的に計算して、試料なしで行なわれたテ
スト（ネガテイブコントロール）の95％信頼限
界を、陽性のための下限とみなした。これらの
値はプローブがb1，b2またはb3のばあいは52〜
54cpm、プローブがb1，b2のばあいは58cpm、
プローブがb1−b2のばあいは56cpm、プローブ
がb1−b2，b3のばあいは65cpmであつた。 (c) サンドイツチハイブリダイゼーシヨンを用い
た核酸断片によるクラミデイアの診断尿道炎患
者の３人の男性および子宮頸炎の３人の女性か
ら採取した試料をテストのために選択した。男
性の尿道からの試料および女性の子宮頸から取
られた試料からトラコーマクラミデイアを単離
した。加えて、対応する数のクラミデイアの単
離されなかつた同様の患者の試料を調べた。試
験する試料は先端に綿のついた綿棒で採取し、
これをシヨ糖0.2M、リン酸バツフアー20mM、
胎児子牛血清３％、ゲンタマイシン10μｇ／
ml、バイコマイシン100μｇ／mlおよびナイス
タチン25IU／mlを含むクラミデイア試料採取
バツフアーに浸した。 クラミデイアを試料から培養した。もとの試
料も核酸断片を用いたサンドイツチハイブリダ
イゼーシヨンによつてアツセイした。試料を２
−ブタノールを用いて液体を除き、最終容積が
約80μになるように濃縮した。テストのため
の濃度はそれゆえ約３〜７倍であつた。そのの
ちEDTA70mM、SDS 0.7％およびプロテイナ
ーゼＫ酵素 200μｇ／mlを試料に加え、55℃
において15分間、37℃において45分間処理し
た。つぎに試料を0.175M NaOH中で５分間沸
騰させた。沸騰された試料を０℃に移し、等モ
ル量の酢酸で中和しテストした。実施例１(b)に
記載したフイルターおよびハイブリダイゼーシ
ヨン条件をテストに用いた。用いたプローブは
mKTH 1245（b1−b2）で、300000cpm／400μ
ハイブリダイゼーシヨン反応であつた。結果
を第３表に示した。
スト（ネガテイブコントロール）の95％信頼限
界を、陽性のための下限とみなした。これらの
値はプローブがb1，b2またはb3のばあいは52〜
54cpm、プローブがb1，b2のばあいは58cpm、
プローブがb1−b2のばあいは56cpm、プローブ
がb1−b2，b3のばあいは65cpmであつた。 (c) サンドイツチハイブリダイゼーシヨンを用い
た核酸断片によるクラミデイアの診断尿道炎患
者の３人の男性および子宮頸炎の３人の女性か
ら採取した試料をテストのために選択した。男
性の尿道からの試料および女性の子宮頸から取
られた試料からトラコーマクラミデイアを単離
した。加えて、対応する数のクラミデイアの単
離されなかつた同様の患者の試料を調べた。試
験する試料は先端に綿のついた綿棒で採取し、
これをシヨ糖0.2M、リン酸バツフアー20mM、
胎児子牛血清３％、ゲンタマイシン10μｇ／
ml、バイコマイシン100μｇ／mlおよびナイス
タチン25IU／mlを含むクラミデイア試料採取
バツフアーに浸した。 クラミデイアを試料から培養した。もとの試
料も核酸断片を用いたサンドイツチハイブリダ
イゼーシヨンによつてアツセイした。試料を２
−ブタノールを用いて液体を除き、最終容積が
約80μになるように濃縮した。テストのため
の濃度はそれゆえ約３〜７倍であつた。そのの
ちEDTA70mM、SDS 0.7％およびプロテイナ
ーゼＫ酵素 200μｇ／mlを試料に加え、55℃
において15分間、37℃において45分間処理し
た。つぎに試料を0.175M NaOH中で５分間沸
騰させた。沸騰された試料を０℃に移し、等モ
ル量の酢酸で中和しテストした。実施例１(b)に
記載したフイルターおよびハイブリダイゼーシ
ヨン条件をテストに用いた。用いたプローブは
mKTH 1245（b1−b2）で、300000cpm／400μ
ハイブリダイゼーシヨン反応であつた。結果
を第３表に示した。
【表】
【表】
テストにおける陽性の限度は104cpmであつ
た。 第３表の結果は、核酸断片を用いるサンドイ
ツチハイブリダイゼーシヨンが性病の診断に適
していることを示している。培養テストで陰性
であつた試料は、サンドイツチハイブリダイゼ
ーシヨンテストにおいても陰性であつた。 実施例 ２ (a) サイトメガロウイルスからの核酸試薬およ
びその調製 サイトメガロウイルスの診断に適したDNA
断片をサイトメガロウイルス（AD 169、
ATCC VR−538）−（CMV）から調製した。
DNAを公知の方法で単離し断片にした。スペ
クターら（Spector et al）の「J.Virol.42巻、
558〜582頁、1982」で定義された約9kbのEco
RI断片Ｉを、Eco RI制限酵素切断断片を大き
さにしたがつて分離したのち、電気泳動溶出に
よつてアガロースゲルから単離した。溶出した
DNAをフエノールで抽出し、つぎにエタノー
ルで沈殿させた。こうして精製したDNAを、
Eco RI酵素を用いて開かれたpBR325プラスミ
ドベクターにT4−リガーゼによつて連結し、
えられた組みかえDNAを宿主細菌の大腸菌
K12HB101に移した。アンピシリンおよびテト
ラサイクリン耐性でクロラムフエニコール感受
性のクローンの中から、適当な大きさのサイト
メガロウイルスに特異的なDNA挿入部を有す
るものを選んだ。クローニングされたサイトメ
ガロウイルスDNAの特性を、サザーンブロツ
テイング法によつて確かめた。このテストによ
つて、記載された9kbのEcoRI−DNA断片は
サイトメガロウイルスのDNAに由来し、とり
わけそのHind−Ｄ断片中に含まれることが
確実になつた（オラムら（Oram et al）の
「J.Gen.Virol.、59巻、111〜129頁、1982」参
照）。このように記載された組みかえプラスミ
ドはpKTH1271と呼ばれ、これは菌株保存機
関であるドイチエ ザムルンク フオン ミク
ロオルガニスメンに寄託番号DSM2826で寄託
してある。この組みかえプラスミドは、公知の
技術により増やし精製した。 ベクターとしてpBR322プラスミド、M13m7
およびM13m8フアージを用いて、公知の方法
によりさらにクローニングを行なつた。第１２
図は約9kbの分子長を有するハイブリツドプラ
スミドpKTH1271を表わす。第１２図に示さ
れた核酸断片の列は、制限酵素EcoRI，
BamHI，ClaIおよびPstIを用いて調製した。
第１２図に制限酵素を用いることによつてえら
れた断片を、その相対的な大きさおよび位置と
ともに示した。第４表には、当該断片の大き
さ、さらなるクローニングのために用いるベク
ター、こうしてえられた組みかえプラスミドの
名称およびそれらのフイルター試薬としてまた
は標識されたプローブとしてのいずれかの用途
を示した。第１３図には第４表に示された核酸
断片が用いられたときに形成されるサンドイツ
チハイブリツドの列を示す。
た。 第３表の結果は、核酸断片を用いるサンドイ
ツチハイブリダイゼーシヨンが性病の診断に適
していることを示している。培養テストで陰性
であつた試料は、サンドイツチハイブリダイゼ
ーシヨンテストにおいても陰性であつた。 実施例 ２ (a) サイトメガロウイルスからの核酸試薬およ
びその調製 サイトメガロウイルスの診断に適したDNA
断片をサイトメガロウイルス（AD 169、
ATCC VR−538）−（CMV）から調製した。
DNAを公知の方法で単離し断片にした。スペ
クターら（Spector et al）の「J.Virol.42巻、
558〜582頁、1982」で定義された約9kbのEco
RI断片Ｉを、Eco RI制限酵素切断断片を大き
さにしたがつて分離したのち、電気泳動溶出に
よつてアガロースゲルから単離した。溶出した
DNAをフエノールで抽出し、つぎにエタノー
ルで沈殿させた。こうして精製したDNAを、
Eco RI酵素を用いて開かれたpBR325プラスミ
ドベクターにT4−リガーゼによつて連結し、
えられた組みかえDNAを宿主細菌の大腸菌
K12HB101に移した。アンピシリンおよびテト
ラサイクリン耐性でクロラムフエニコール感受
性のクローンの中から、適当な大きさのサイト
メガロウイルスに特異的なDNA挿入部を有す
るものを選んだ。クローニングされたサイトメ
ガロウイルスDNAの特性を、サザーンブロツ
テイング法によつて確かめた。このテストによ
つて、記載された9kbのEcoRI−DNA断片は
サイトメガロウイルスのDNAに由来し、とり
わけそのHind−Ｄ断片中に含まれることが
確実になつた（オラムら（Oram et al）の
「J.Gen.Virol.、59巻、111〜129頁、1982」参
照）。このように記載された組みかえプラスミ
ドはpKTH1271と呼ばれ、これは菌株保存機
関であるドイチエ ザムルンク フオン ミク
ロオルガニスメンに寄託番号DSM2826で寄託
してある。この組みかえプラスミドは、公知の
技術により増やし精製した。 ベクターとしてpBR322プラスミド、M13m7
およびM13m8フアージを用いて、公知の方法
によりさらにクローニングを行なつた。第１２
図は約9kbの分子長を有するハイブリツドプラ
スミドpKTH1271を表わす。第１２図に示さ
れた核酸断片の列は、制限酵素EcoRI，
BamHI，ClaIおよびPstIを用いて調製した。
第１２図に制限酵素を用いることによつてえら
れた断片を、その相対的な大きさおよび位置と
ともに示した。第４表には、当該断片の大き
さ、さらなるクローニングのために用いるベク
ター、こうしてえられた組みかえプラスミドの
名称およびそれらのフイルター試薬としてまた
は標識されたプローブとしてのいずれかの用途
を示した。第１３図には第４表に示された核酸
断片が用いられたときに形成されるサンドイツ
チハイブリツドの列を示す。
【表】
(b) サイトメガロウイルスからえられた核酸断片
のサンドイツチハイブリダイゼーシヨンによる
感度の証明 サンドイツチハイブリダイゼーシヨン法によ
つて、１組の連続した試薬のペアと比較したば
あいの、本発明による核酸試薬の感度を調べ
た。テストされた試料はサイトメガロウイルス
DNAであり、これは0.17M NaOH中で５分間
沸騰させたのち実施例１(b)のようにして中和し
た。１本鎖にしたpKTH1273（a1）DNAと
pKTH1274（a2）DNAをともに1011分子を含む
フイルター、および125Iで標識されたプローブ
として第４表に示されているmKTH1277（b1）、
mKTH 1278（b2）およびmKTH 1279（b3）を
用いた。プローブはそれぞれ108cpm／μｇ
DNAを含んでいた。ハイブリダイゼーシヨン
は実施例１(b)に記載された方法によつて行なつ
た。結果を第５表に示した。
のサンドイツチハイブリダイゼーシヨンによる
感度の証明 サンドイツチハイブリダイゼーシヨン法によ
つて、１組の連続した試薬のペアと比較したば
あいの、本発明による核酸試薬の感度を調べ
た。テストされた試料はサイトメガロウイルス
DNAであり、これは0.17M NaOH中で５分間
沸騰させたのち実施例１(b)のようにして中和し
た。１本鎖にしたpKTH1273（a1）DNAと
pKTH1274（a2）DNAをともに1011分子を含む
フイルター、および125Iで標識されたプローブ
として第４表に示されているmKTH1277（b1）、
mKTH 1278（b2）およびmKTH 1279（b3）を
用いた。プローブはそれぞれ108cpm／μｇ
DNAを含んでいた。ハイブリダイゼーシヨン
は実施例１(b)に記載された方法によつて行なつ
た。結果を第５表に示した。
【表】
テストにおいて陽性のための下限値は、プロ
ーブがb1，b2またはb3のばあいは51〜55cpm、
プローブがb1，b2のばあいは59cpm、プローブ
がb1，b2，b3のばあいは63cpmであつた。 第５表の結果によると、（b1，b2またはb3）
として用いられた個々のプローブ試薬を用いた
サンドイツチハイブリダイゼーシヨンは、おの
おののばあいにおいて４×106個のサイトメガ
ロウイルスDNA分子を検出した。一方、b1，
b2またはb1，b2，b3のプローブ試薬でハイブリ
ダイゼーシヨンさせると106分子のサイトメガ
ロウイルスDNAを検出した。この結果は、そ
れらの核酸試薬は個々の核酸試薬より４倍感度
の高いことを示している。 (c) サンドイツチハイブリダイゼーシヨンを用い
た核酸試薬によるサイトメガロウイルスの診断 サンドイツチハイブリダイゼーシヨンを用い
て、核酸試薬により臨床試料をアツセイした。
これらの試料には、１歳未満の子供から採取し
た２つの尿の試料が含まれていた。これらの子
供は先天性のサイトメガロ疾患に感染している
疑いがあつた。サイトメガロウイルスが肺に感
染した患者から採取した肺の生検試料もまた、
サンドイツチハイブリダイゼーシヨンによりア
ツセイした。サイトメガロウイルス感染および
非感染のヒト胎児細胞も試料としてテストに用
いた。 サルコシル（sarcosyl）１％、EDTA 5mM
および子牛の胸腺DNA 200μｇを含む溶液を
尿の試料10mlに加え、つぎにウイルスから放
出されたDNAを担体とともに室温でイソプロ
パノール10mlを用いて沈殿させた。DNAの沈
殿をTEバツフアー200μに溶かし、５分間沸
騰させて１本鎖にした。つぎにDNA溶液を０
℃に冷却し、これをハイブリダイゼーシヨン溶
液に加えた。 肺の生検試料（数mm3）をナイフを用いて機
械的に細かく切り、これに１％SDS溶液および
プロテイナーゼＫ酵素1mg／mlを含むTEバツ
フアー200μを加えた。37℃において１時間
消化を行ない、つぎに試料を細い皮下注射針を
通して２回注射器中に吸い込んだ。こうしてホ
モジエナイズされた試料を沸騰させ、つぎにこ
れをテスト溶液中に加えた。 サイトメガロウイルスに感染された細胞およ
び非感染の細胞を、叙上のようにSDSおよびプ
ロテイナーゼＫで処理して破壊し、ホモジエナ
イズし、沸騰させた。 ハイブリダイゼーシヨンテストに用いられた
試薬はフイルターに付着したpKTH 1273（a1）
およびpKTH 1274（a2）、プローブとしての
mKTH 1277（b1）、mKTH 1278（b2）および，
mKTH 1279（b3）であり、それぞれ
200000cpm／反応であつた。他の点に関して
は、ハイブリダイゼーシヨン、フイルターの洗
浄および結果の測定は実施例１(b)に記載した方
法に従つて行なつた。 ハイブリダイゼーシヨンの結果を第６表に示
した。
ーブがb1，b2またはb3のばあいは51〜55cpm、
プローブがb1，b2のばあいは59cpm、プローブ
がb1，b2，b3のばあいは63cpmであつた。 第５表の結果によると、（b1，b2またはb3）
として用いられた個々のプローブ試薬を用いた
サンドイツチハイブリダイゼーシヨンは、おの
おののばあいにおいて４×106個のサイトメガ
ロウイルスDNA分子を検出した。一方、b1，
b2またはb1，b2，b3のプローブ試薬でハイブリ
ダイゼーシヨンさせると106分子のサイトメガ
ロウイルスDNAを検出した。この結果は、そ
れらの核酸試薬は個々の核酸試薬より４倍感度
の高いことを示している。 (c) サンドイツチハイブリダイゼーシヨンを用い
た核酸試薬によるサイトメガロウイルスの診断 サンドイツチハイブリダイゼーシヨンを用い
て、核酸試薬により臨床試料をアツセイした。
これらの試料には、１歳未満の子供から採取し
た２つの尿の試料が含まれていた。これらの子
供は先天性のサイトメガロ疾患に感染している
疑いがあつた。サイトメガロウイルスが肺に感
染した患者から採取した肺の生検試料もまた、
サンドイツチハイブリダイゼーシヨンによりア
ツセイした。サイトメガロウイルス感染および
非感染のヒト胎児細胞も試料としてテストに用
いた。 サルコシル（sarcosyl）１％、EDTA 5mM
および子牛の胸腺DNA 200μｇを含む溶液を
尿の試料10mlに加え、つぎにウイルスから放
出されたDNAを担体とともに室温でイソプロ
パノール10mlを用いて沈殿させた。DNAの沈
殿をTEバツフアー200μに溶かし、５分間沸
騰させて１本鎖にした。つぎにDNA溶液を０
℃に冷却し、これをハイブリダイゼーシヨン溶
液に加えた。 肺の生検試料（数mm3）をナイフを用いて機
械的に細かく切り、これに１％SDS溶液および
プロテイナーゼＫ酵素1mg／mlを含むTEバツ
フアー200μを加えた。37℃において１時間
消化を行ない、つぎに試料を細い皮下注射針を
通して２回注射器中に吸い込んだ。こうしてホ
モジエナイズされた試料を沸騰させ、つぎにこ
れをテスト溶液中に加えた。 サイトメガロウイルスに感染された細胞およ
び非感染の細胞を、叙上のようにSDSおよびプ
ロテイナーゼＫで処理して破壊し、ホモジエナ
イズし、沸騰させた。 ハイブリダイゼーシヨンテストに用いられた
試薬はフイルターに付着したpKTH 1273（a1）
およびpKTH 1274（a2）、プローブとしての
mKTH 1277（b1）、mKTH 1278（b2）および，
mKTH 1279（b3）であり、それぞれ
200000cpm／反応であつた。他の点に関して
は、ハイブリダイゼーシヨン、フイルターの洗
浄および結果の測定は実施例１(b)に記載した方
法に従つて行なつた。 ハイブリダイゼーシヨンの結果を第６表に示
した。
【表】
第６表の結果は、核酸試薬を用いることによつ
て尿、肺の生検試料および細胞のような異なる臨
床試料においてサイトメガロウイルスを検出する
ことが可能であることを示している。 テストはサイトメガロウイルスに特異的であ
り、ヒトのDNAを同定しなかつた。すなわち、
テストは試料中に存在するヒトのDNAにより妨
げられなかつた。実際、テストの特異性は、試料
の型によつていかようにも妨げられることはれな
かつた。
て尿、肺の生検試料および細胞のような異なる臨
床試料においてサイトメガロウイルスを検出する
ことが可能であることを示している。 テストはサイトメガロウイルスに特異的であ
り、ヒトのDNAを同定しなかつた。すなわち、
テストは試料中に存在するヒトのDNAにより妨
げられなかつた。実際、テストの特異性は、試料
の型によつていかようにも妨げられることはれな
かつた。
第１図はサンドイツチハイブリツドの列を示
す。第２図は従来技術によるサンドイツチハイブ
リツドを示す。第３図は本発明による核酸試薬の
調製のために選ばれた核酸における、核酸断片の
２つの交互になつている系列の位置を示す。第４
図は同じく核酸断片の３つの系列の対応する位
置、第５ａ図は第３図による核酸断片の列が連結
されていないもの、第５ｂ図は第３図による核酸
断片が連結しているもの、第５ｃ図は第３図によ
る核酸断片が部分的に連結されたものを示す。第
６図はサンドイツチハイブリツドの列を示してお
り、第６ａ図は分離している核酸断片を用いたば
あいに形成されるサンドイツチハイブリツドの
列、第６ｂ図は連結されたｂ断片を用いたばあい
に形成されるサンドイツチハイブリツドの列、第
６ｃ図は分離しておりかつ連結されたｂ断片を用
いたばあいに形成されるサンドイツチハイブリツ
ドの列を示す。第７図は異なる核酸を同定する核
酸試薬を示す。第８図は第７図による異なる核酸
を同定する核酸試薬を用いたばあいに形成される
サンドイツチハイブリツドの列を示す。第９図は
直接ハイブリダイゼーシヨン法により形成される
ハイブリツドの列を示す。第１０図は組みかえプ
ラスミドpKTH 1220を示す。第１１図は組みか
えプラスミドpKTH 1220から調製された核酸断
片を用いたばあいに形成されるサンドイツチハイ
ブリツドの列を示す。第１２図は組みかえプラス
ミドpKTH 1271を示す。第１３図は組みかえプ
ラスミドpKTH 1271から調製された核酸断片を
用いたばあいに形成されるサンドイツチハイブリ
ツドの列を示す。
す。第２図は従来技術によるサンドイツチハイブ
リツドを示す。第３図は本発明による核酸試薬の
調製のために選ばれた核酸における、核酸断片の
２つの交互になつている系列の位置を示す。第４
図は同じく核酸断片の３つの系列の対応する位
置、第５ａ図は第３図による核酸断片の列が連結
されていないもの、第５ｂ図は第３図による核酸
断片が連結しているもの、第５ｃ図は第３図によ
る核酸断片が部分的に連結されたものを示す。第
６図はサンドイツチハイブリツドの列を示してお
り、第６ａ図は分離している核酸断片を用いたば
あいに形成されるサンドイツチハイブリツドの
列、第６ｂ図は連結されたｂ断片を用いたばあい
に形成されるサンドイツチハイブリツドの列、第
６ｃ図は分離しておりかつ連結されたｂ断片を用
いたばあいに形成されるサンドイツチハイブリツ
ドの列を示す。第７図は異なる核酸を同定する核
酸試薬を示す。第８図は第７図による異なる核酸
を同定する核酸試薬を用いたばあいに形成される
サンドイツチハイブリツドの列を示す。第９図は
直接ハイブリダイゼーシヨン法により形成される
ハイブリツドの列を示す。第１０図は組みかえプ
ラスミドpKTH 1220を示す。第１１図は組みか
えプラスミドpKTH 1220から調製された核酸断
片を用いたばあいに形成されるサンドイツチハイ
ブリツドの列を示す。第１２図は組みかえプラス
ミドpKTH 1271を示す。第１３図は組みかえプ
ラスミドpKTH 1271から調製された核酸断片を
用いたばあいに形成されるサンドイツチハイブリ
ツドの列を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 相互には相補的でない核酸断片であつて、か
つそれが固体担体に付着され、固定すべき核酸
のある配列部分に相補的な断片と、検出可能な
マーカーで標識され、同定すべき核酸の前記配列
部分とは相互に排他的である配列部分に相補的な
断片とであるものを組み合わせたものからなる特
異的な核酸を同定するためのサンドイツチハイブ
リダイゼーシヨン用の核酸試薬において、 上記との核酸断片からなる組み合わせ試
薬が同定すべき１または数種の核酸に対応し得
るだけの組み合わせが保持されるように用意さ
れる とともに、 上記との核酸断片のそれぞれがいずれも
２以上の核酸断片で組成されて、当該核酸試薬
と同定すべき核酸との間のハイブリツド形式に
おいてとの核酸断片が実質的に互い違いに
繰り返して位置しうるものとされ、これにより
同定すべき異なる核酸ごとに複数個のサンドイ
ツチハイブリツドが形成されるようにされた １または数種の特異的な核酸を同定するため
のサンドイツチハイブリダイゼーシヨン用核酸
試薬。 ２ 固体担体に付着される核酸断片および／また
は検出可能なマーカーで標識される核酸断片が、
同定すべき１または数種の核酸に対応する核酸断
片のうちのいくつかまたはすべてを互いに連結し
た核酸断片列として構成される特許請求の範囲第
１項記載の核酸試薬。 ３ ベクター由来の部分を有する少なくとも１つ
の核酸断片を含んでなる特許請求の範囲第１項ま
たは第２項記載の核酸試薬。 ４ 核酸断片が、トラコーマクラミデイアL2細
菌のDNAを含み、かつ宿主の大腸菌K12 HB101
中にクローニングされうる組みかえプラスミド
pKTH1220より調製されるものであり、該組み
かえプラスミドを含む宿主大腸菌K12 HB101の
寄託番号がDSM 2825である特許請求の範囲第３
項記載の核酸試薬。 ５ 核酸断片が、サイトメガロウイルスAD169
のDNAを含み、かつ宿主の大腸菌K12 HB101中
にクローニングされうる組みかえプラスミド
pKTH1220より調製されるものであり、該組み
かえプラスミドを含む宿主大腸菌K12HB101の寄
託番号がDSM2826である特許請求の範囲第３項
記載の核酸試薬。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI840655A FI71768C (fi) | 1984-02-17 | 1984-02-17 | Foerbaettrade nykleinsyrareagenser och foerfarande foer deras framstaellning. |
| FI840655 | 1984-02-17 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60188100A JPS60188100A (ja) | 1985-09-25 |
| JPH0463679B2 true JPH0463679B2 (ja) | 1992-10-12 |
Family
ID=8518568
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60029207A Granted JPS60188100A (ja) | 1984-02-17 | 1985-02-15 | 核酸試薬 |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4731325A (ja) |
| JP (1) | JPS60188100A (ja) |
| AT (1) | AT394578B (ja) |
| AU (1) | AU577568B2 (ja) |
| BE (1) | BE901671A (ja) |
| CA (1) | CA1248895A (ja) |
| CH (1) | CH671778A5 (ja) |
| DE (1) | DE3505287C2 (ja) |
| DK (1) | DK174675B1 (ja) |
| FI (1) | FI71768C (ja) |
| FR (1) | FR2559783B1 (ja) |
| GB (1) | GB2156074B (ja) |
| HU (1) | HU194938B (ja) |
| IE (1) | IE57652B1 (ja) |
| IT (1) | IT1183184B (ja) |
| LU (1) | LU85768A1 (ja) |
| NL (1) | NL193663C (ja) |
| NO (1) | NO166543C (ja) |
| RO (1) | RO92633B (ja) |
| SE (1) | SE463103B (ja) |
| SU (1) | SU1523053A3 (ja) |
| ZA (1) | ZA85511B (ja) |
Families Citing this family (151)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| US4910300A (en) * | 1985-12-11 | 1990-03-20 | Chiron Corporation | Method for making nucleic acid probes |
| US4882269A (en) * | 1985-12-13 | 1989-11-21 | Princeton University | Amplified hybridization assay |
| FI76119C (fi) * | 1986-02-27 | 1988-09-09 | Orion Yhtymae Oy | Kvantitativ bestaemning av nukleinsyramolekyler och reagensfoerpackning som anvaends vid foerfarandet. |
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