DK174675B1 - Nukleinsyrereagenser og fremgangsmåde til fremstilling deraf - Google Patents

Nukleinsyrereagenser og fremgangsmåde til fremstilling deraf Download PDF

Info

Publication number
DK174675B1
DK174675B1 DK198500589A DK58985A DK174675B1 DK 174675 B1 DK174675 B1 DK 174675B1 DK 198500589 A DK198500589 A DK 198500589A DK 58985 A DK58985 A DK 58985A DK 174675 B1 DK174675 B1 DK 174675B1
Authority
DK
Denmark
Prior art keywords
nucleic acid
fragments
series
rows
dna
Prior art date
Application number
DK198500589A
Other languages
English (en)
Other versions
DK58985D0 (da
DK58985A (da
Inventor
Tuula Marjut Ranki
Hans Erik Soederlund
Airi Marjatta Palva
Original Assignee
Sangtec Molecular Diagnostics
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sangtec Molecular Diagnostics filed Critical Sangtec Molecular Diagnostics
Publication of DK58985D0 publication Critical patent/DK58985D0/da
Publication of DK58985A publication Critical patent/DK58985A/da
Application granted granted Critical
Publication of DK174675B1 publication Critical patent/DK174675B1/da

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/705—Specific hybridization probes for herpetoviridae, e.g. herpes simplex, varicella zoster
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/682—Signal amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria

Description

i DK 174675 B1
Den foreliggende opfindelse angår forbedrede nukle-insyrereagenser omfattende en række (array) af nukleinsy-refragmenter samt kombinationer af sådanne forbedrede reagenser. Opfindelsen angår tillige en fremgangsmåde til 5 fremstilling af nukleinsyrereagenser omfattende en række af kloner samt kombinationer af sådanne nukleinsyrereagenser ved anvendelse af rekombinant-DNA-teknikker.
Der har alment været anvendt forskellige hybridise-ringsmetoder til identifikation og undersogelse af nuklein-10 syrer. Nogle eksempler er den direkte hybridiseringsmetode, hvor en prøve indeholdende den til identifikation værende nukleinsyre enten er i opløsning (Brautigam et al, J. Clin. Microbiol., 1980, 12, 226-234 og britisk patentskrift nr. 2.019.408) eller fæstnet til en fast bærer (US-patentskrif-terne nr. 4.139.346, 4.302.204, 4.358.535 og 4.395.488, 15 de britiske patentskrifter nr. 2.034.323 og 2.095.833 samt de europæiske patentpublikationer nr. 62.286, 62.237 og 61.740), og påvises ved anvendelse af ét mærket nukleinsyre-reagens som hybridiserer med den til identifikation værende nukleinsyre.
20 Andre kendte hybridiseringsmetoder indbefatter den af Dunn og Hassell i Cell, 1^, 23-36, 1977 angivne totrins-sandwich-hybridiseringsmetode samt de i europæisk patentpublikation nr. 79.139 -angivne ettrins-sandwich-hybridiserings-metoder. Til identifikation af nukleinsyrerne ved sandwich- metoderne behøves der to særskilte nukleinsyrereagenser 25 for at påvise de nukleinsyrer som er til stede i en prøveopløsning. Det ene af disse reagenser er fæstnet til en fast bærer og det andet er mærket.
Nukleinsyrereagenser, både dem der er fæstnet til en fast bærer og dem som er mærket, er karakteriseret ved 30 at deres basesekvens er komplementær, eller næsten komplementær, til den nukleinsyre som skal identificeres, dvs. homolog. De anvendte nukleinsyrereagenser er enten naturlige nukleinsyrer som sådanne eller som fragmenter deraf. Pragmen-terne fremstilles fx ved anvendelse af restriktionsenzymer.
DK 174675 B1 2
Man har også fremstillet nukleinsyrereagenser syntetisk eller ved rekombinant-DNA-teknikker. Naturlige plasmider (US-patentskrift nr. 4.358.535), nukleinsyrer fra bakte-riofager (US-patentskrift nr. 4.543.535), ribosomal RNA og budgringer-RNA (US-patentskrift nr. 4.302.204) eller nukleinsyre fra forskellige vira (Stålhandske et al, 5 Curr. Top. Microbiol. Virol. 104, 1983) har været anvendt som nukleinsyrereagenserne. Hele virus-genomet har været anvendt til identifikation af fx dele der hører til de forskellige vira i budbringer-RNA fra et hybridvirus (Dunn og Hassell, Cell, .12, 23-36, 1977)). Der er også fremstillet nukleinsyrereagenser ved anvendelse af rekom-10 binant-DNA-teknikker (US-patentskrift nr. 4.395.486 og 4.359.535, europæisk patentansøgning nr. 79.139, svarende til dansk patentansøgning nr. PA 1983 02751, og britisk patentskrift nr. 2.034.323 samt europæisk patentansøgning nr. 62.286). Nukleinsyrereagenser fremstillet ved rekombinant -DNA- teknikker har været anvendt enten på en sådan / 15 måde at det replikerede definerede DNA-fragment er blevet renset ud fra vektorens DNA, eller som rekombinant-DNA-molekyler er blevet koblet til forskellige vektorer. De tidligere anvendte nukleinsyrereagenser fremstillet ved rekombinant-DNA-teknikker er opbygget af et kontinuerligt identificerende nukleinsyrefragment eller af flere sær-2_q skilte kloner.
Der er nu udviklet nye, mere følsomme nukelinsyrerea-genser omfattende mindst to serier af alternerende rækker (arrays) af nukleinsyrefragmenter fremstillet fra enten ét eller flere segmenter homologe med den nukleinsyre der skal iden-25 tificeres.
Nukleinsyrereagenser som omfatter sådanne rækker af nukleinsyrefragmenter er ved sandwich-hybridiseringsprøver mindst dobbelt så følsomme som de tidligere anvendte nukleinsyrereagenser. Ved anvendelse af nukleinsyrereagenser 3Q ifølge opfindelsen eller kombinationer deraf er det muligt at identificere mindre mængder af nukleinsyrer end hidtil, og de er særlig velegnede til anvendelse i sandwich-hybri-diseringsmetoder.
Den højere følsomhed af nukleinsyrereagenserne ifølge opfindelsen ved sandwich-hybridiseringsmetoder er til dels DK 174675 B1 3 baseret på den kendsgerning at anvendelse af flere sonder (probes} forøger mængden af mærkede hybrider på den faste bærer.
Der kan være mærkede vektorafledede nukleinsyrer sammen med enhver hybridiseringssonde (figur 1 og 2). I figur 1 og 2 betegner v vektorafledet DNA, x den nukleinsyre som 5 skal identificeres, b den mærkede sonde, a det identificerende nukleinsyrereagens fæstnet til den faste bærer og F filteret. Nar der bruges flere sonder stiger mængden af mærkede, vektorafledede nukleinsyredele og mere mærkningsmateriale bindes til de hybrider der dannes. Hybriderne kan derved lettere opdages.
^ Når rækken af nukleinsyrefragmenter ifølge opfindel sen bruges i sandwich-hybridiseringsmetoder er der fæstnet mindst to, eller som vist i figur 1 tre, identificerende nukleinsyref ragmenter til den faste bærer. I dette tilfælde kan de forskellige områder af den nukleinsyrestreng x, der skal 15 påvises, hybridisere med de nukleinsyrefragmenter der er fæstnet til den faste bærer, fx a^, a2 og a-j, i et eller flere punkter i afhængighed af reaktionsgraden. Når reaktionen når frem til sit sluttrin kan der frembringes en situation i overensstemmelse med figur 1, ved hvilken prøvestrengen danner en eller flere løkker hvortil sonden el- 20 ler sonderne, fx b^ og b2 i figur 1, hybridiserer. På dette tidspunkt går afstanden mellem de vektorafledede nukleinsyredele og hybridiserrings-foreningspunktet (1) ned (figur 1), og hybriden bliver mere stabil end den hybrid der dannes af ét reagenspar (kendt teknik) vist i figur 2, hvil-25 ken hybrid er af samme størrelse som det totale areal af rækken af nukleinsyrefragmenter. De vektorafledede dele af en hybrid dannet ud fra ét reagenspar brydes let ved fx mekanisk påvirkning såsom rystning. I et sådant tilfælde forsvinder den mærkning som allerede er bundet til hybriden.
30 Eftersom de forbedrede nukleinsyrereagenser ifølge opfindelsen er mere følsomme end tidligere anvendte nukleinsyrereagenser, egner de sig til påvisning af kromosomale omlejringer og arvelige sygdomme.
Opfindelsen angår nukleinsyrereagenser som anført i DK 174675 B1 4 krav 1 og en fremgangsmåde til fremstilling af nukleinsy-rereagenserne som anført i krav 6. Det ejendommelige ved opfindelsen fremgår af kravenes kendetegnende del.
Opfindelsen skal nu beskrives mere udførligt i det følgende og under henvisning til tegningen. På denne vi-5 ser fig. 1 en række (rækkefølge; array) af sandwichhybrider, fig. 2 en sandwich-hybrid i henhold til kendt teknik, fig. 3 beliggenheden af to alternerende serier nu-10 kleinsyrefragmenter i en nukleinsyre som er blevet ud valgt til fremstilling af en række af nukleinsyrereagen-ser i henhold til opfindelsen, fig. 4 udgår fig. 5 en række af nukleinsyrefragmenter ifølge fig. 3 hver for sig (a), forenet (b) og både adskilt og 15 forenet (c), fig. 6 en række af sandwich-hybrider, fig. 6a en række af sandwich-hybrider som er dannet ved anvendelse af separate fragmenter, fig. 6b en række af sandwich-hybrider som er dannet ved anvendelse af forenede b-fragmenter, 20 fig. 6c en række af sandwich-hybrider som er dan net ved anvendelse af både separate og sammenføjede b-fragmenter, fig. 7 en række af nukleinsyrefragmenter som identificerer forskellige nukleinsyrer, fig. 8 en række af sandwich-hybrider som dannes 25 ved anvendelse af rækken af nukleinsyrereagenser ifølge fig. 7, der identificerer forskellige nukleinsyrer, fig. 9 en række af hybrider dannet ved en direkte hybridiseringsmetode, fig. 10 rekombinant-plasmidet pKTH1220, fig. 11 en række af sandwich-hybrider som dannes 30 når der bruges en række af nukleinsyrefragmenter frem stillet ud fra rekombinant-plasmidetg pKTTH1220, fig. 12 rekombinant-plasmidet pKTH1271 og DK 174675 B1 5 fig. 13 en række af sandwich-hybrider der dannes når der bruges rækker af nukleinsyrefragmenter fremstillet ud fra rekombinant-plasmidet pKTH1271.
Opfindelsen angår nukleinsyrereagenser sammensat af en række (array) af nukleinsyrefragmenter. Disse rækker af nukle-5 insyrereagenser indeholder mindst to men fortrinsvis flere alternerende nukleinsyrefragmenter, op til 20 fragmenter, der er afledet fra en eller flere nukleinsyrer som er tilstrækkeligt homologe med nukleinsyren som skal identificeres. Derved opnås der mindst to serier alternerende rækker af nukleinsyrefragmen-10 ter, der ikke må være homologe med hinanden.
Rækken af nukleinsyrereagenser kan fremstilles syntetisk. I dette tilfælde må fragmenterne fra de to alternerende serier af rækker af nukleinsyrefragmenter ikke være homologe med hinanden. Men de må være tilstrækkeligt homologe med alter-nerende steder i de nukleinsyrer som skal identificeres. Disse fragmenter kan let fremstilles ved hjælp af fuldautomatiske maskiner efter karakterisering af nukleinsyresekvensen i den nukleinsyre der skal identificeres.
Nukleinsyrereagenserne ifølge opfindelsen er sammensat 20 af separate eller forenede eller bade separate og forenede rækker af nukleinsyrefragmenter.
Rækkerne af nukleinsyrefragmenter kan være forenede til en vektor, indeholde dele af vektorer eller være helt uden vektordele.
25 De anvendte nukleinsyrefragmenter har en mindste læng de på 15 nukleotider. Der er ikke nogen faktisk øvre grænse for længden, men det er fordelagtigt at bruge fragmenter med en længde på 20-5000 nukleotider. Nukleinsyrefragmenter-ne ifølge opfindelsen er afledet enten fra det genom som 2Q skal identificeres eller fra en del af genomet, fx fra en forholdsvis stor klon repræsenterende en vis del af genomet. Rækkerne'af nukleinsyrefragmenter ifølge opfindelsen kan således fremstilles ud fra flere uafhængige genomområder som ikke er direkte nabostillede. De således fremstillede DK 174675 B1 6 rækker af nukleinsyrefragmenter kombineres og bruges til det samme reagens. Rækkerne af nukleinsyrefragmenter kan også isoleres fra et DNA som ikke er identisk med den nukleinsyre som skal identificeres, men tilstrækkeligt homolog, således at der dannes en stabil hybrid mellem reagenset ^ og den til identifikation værende nukleinsyre. Fremstilling af passende rækker af nukleinsyrefragmenter er på ingen måde begrænset til isolering af passende nukleinsyrefragmenter fra genomet. Der er mange lige så nyttige metoder til fremstilling af sådanne fragmentrækker til rådighed. Den på området sagkyndige kan fremstille rækker af nukleinsyrefrag-10 menter ved syntetiske eller halvsyntetiske metoder.
Reagenserne isoleres på en sådan måde at der opnås mindst to rækker alternerende nukleinsyrefragmenter ai, a2, a3 og så fremdeles, og bi, b2, b3 og så fremdeles. De nukleinsyref ragmenter som hører til serien ai, a2, a3 . . . ' er sammensat af fragmenter der befinder sig nærved, men ikke nabostillet til hinanden. De nukleinsyrefragmenter som hører til serien bi, b2, b3 . . . er ligeledes sammen sat af nukleinsyref ragmenter, som befinder sig nær ved hinanden, men ikke i nabostilling til hinanden. De nukle- 2 0 insyrefragmenter som hører til serien a3, a2, a 3 . . .og de som hører til serien bi, b2, b3 . . .må ikke være homo loge med hinanden. Det foretrækkes at de nukleinsyrer som hører til serien alt a2, a3 . . . og de som hører til serien bi, b2, b3 . . . isoleres på en sådan måde at hver andet fragment hører til a-serien og hver andet til b-serien, som det ses i fig. 2. X fig. 3 er ai, a2, a3 og bi, b2, b3 rækker af nukleinsyrefragmenter som er tilstrækkeligt homologe med den nukleinsyre som skal identificeres. Det foretrækkes at de alternerende to nukleinsyrereagenser -3 Π følger hinanden direkte, men dette er ikke absolut nødvendigt for opfindelsen.
De ovenfor beskrevne nukleinsyre-fragmentserier kan bruges enten som separate fragmenter a-^, a2, ... og b^, DK 174675 B1 7 b2, t>3 ··· (fig. 5a) eller sammen forenede til længere strenge a1-a2~a3 ... og b^-b^b-j * Det er naturlig vis muligt at fremstille alle slags mellemformer som fx en a-serie hvor a^ er et separat fragment og a2-a3 er indbyrdes forbundne/ og i b-serien fx bjL-b2 er forenet med 5 hinanden og b3 er separat, og så fremdeles, som vist i fig.
5c.
Fig. 6 viser forskellige rækker sandwich-hybrider.
Fig. 6a viser en række sandwich-hybrider hvor rækken af nukleinsyrefragmenter er separate. Fig. 6b viser en række hybrider hvor den mærkede række af nukleinsyrefragmenter ' er forenet med hinanden. Fig. 6c viser et tilfælde hvor en række sandwich-hybrider er dannet af både forenede og separate mærkede rækker af nukleinsyrefragmenter. I fig.
6 betyder x den nukleinsyre som skal identificeres; b^, b2 og b3 repræsenterer den mærkede sonde og a^, a2 og a^ 15 rækker af nukleinsyrefragmenter som er bundet til en fast bærer. Nukleinsyrefragmenter som hører til b-serien kan fx være mærket på en sådan måde at der opnås et mærket nu-kleinsyrereagens, dvs. sonden B. Nukleinsyrereagenser som tilhører a-serien kan bindes til en fast bærer på en sådan måde at der vindes et nukleinsyrereagens A bundet til en fast bærer. Det er naturligvis også muligt at fremstille et mærket nukleinsyrereagens A, og et tilsvarende nukleinsyrereagens B bundet til en fast bærer.
Sådanne nukleinsyrepar A og B, eller B og A, henholdsvis mærket og bundet til en fast bærer,kan fremstilles for 25 flere forskellige nukleinsyrer som skal identificeres. De kan kombineres til passende nukleinsyrereagens-kombinationer, der er sammensat af forskellige nukleinsyre-reagens-par A^ og B^, A2 og B2, og B^ og så fremdeles, eller B^ og h^, B2 og B3 og og så fremdeles. Reagenser 2q indeholdende rækker af nukleinsyrefragmenter som identificerer forskellige nukleinsyrer kan også kombineres så der vindes en sonde Ax-Ay-Az, der fx omfatter en række af nukleinsyrefragmenter (ai-a2_a3^x"ial“a2-a3^y_^ai_a2-a3^z som vist i fig. 7, hvor alx, a2y og a3x er rækker af nukleinsyrefrag- DK 174675 B1 8 Αχ der identificerer nukleinsyren X! aly' a2y °9 a3y er rækker af nukleinsyrefragmenter Ay der identificerer nukleinsyre y; a, , a., og a^ er rækker af nukleinsyrefragmen-ter Az der identificerer nukleinsyren z, og v er en vektor-afledet nukleinsyredel. Forenede rækker af nukleinsyrefrag-5 menter kan naturligvis også bruges som separate fragmenter, som passende blandinger.
Rækkerne af sandwich-hybrider ifølge fig. 8 opnås ved anvendelse af reagenser som vist i fig. 7. Hvis der ønskes samtidig identifikation af flere forskellige nukleinsyrer er det naturligvis nødvendigt at bruge separate fil- 10 tere som vist i fig. 8. Fig. 8a viser en fast bærer som identificerer nukleinsyren x, fig. 8b en fast bærer som identificerer nukleinsyren y og fig. 8c en fast bærer som
identificerer nukleinsyren z. I fig. 8a, 8b og 8c er b^x, b2X
og b^x rækker af nukleinsyrefragmenter som er bundet til 15 en fast bærer og identificerer nukleinsyren x; b^, k>2y °9 ^3y er rækker af nukleinsyrefragmenter som er bundet til en fast bærer og identificerer nukleinsyren y; og b. , b_ og b-, lz^z33z er rækker af nukleinsyrefragmenter som er bundet til en fast bærer og identificerer nukleinsyren z; og x, y og z er de nukleinsyrer som skal identificeres. F^, og Fz er de respektive faste bærere eller filtere, A -A -A er r x y z en sonde som identificerer alle de tre nukleinsyrer samtidig hvis der bruges separate faste bærere.
De ovenfor beskrevne nukleinsyrefragmentserier, reagenser og reagenskombinationer kan fremstilles ved i og for sig kendte rekombinant-DNA-teknikker. Der frembringes et antal nukleinsyrefragmenter med indbyrdes forskellig længde ved anvendelse af restriktionsenzymer, fra den nukleinsyre som skal identificeres eller fra en del som repræsenterer den. Hvis man kender restriktionskortet over det genom 30 som skal identificeres, er det muligt fra genomet at udvælge de passende nabostillede fragmenter, frembragt ved anvendelse af restriktionsenzymer, og fragmenterne isoleres og opformeres ved anvendelse af rekombinant-DNA-teknikker.
Når der er involveret et ukendt genom kan der bruges DK 174675 B1 9 et mellemtrin ved fremstilling af reagenserne, på en sådan måde at et forholdsvis stort restriktionsfragment klones, dette fragment kortlægges og der produceres rækker af nukle-insyrefragmenter, serie a^, a2, a^ ... og b^, b^ ...
på basis af de således vundne oplysninger.
5 Det er naturligvis muligt at bruge kombinationer af de ovennævnte metoder og at bruge flere store separate klonede restriktionsfragmenter som udgangsmateriale, og at fremstillede flere separate serier som kombineres til dannelse af hensigtsmæssige kombinationer.
Det er fordelagtigt at fremstille nukleinsyrefragment-10 serierne a^, &2, og b^, b2, b^ ... ifølge opfindelsen ved at bruge rekombinant-DNA-teknikker på en sådan måde at serie a klones ind i én vektor, fx i plasmidet pBR322, mens serie b klones ind i en anden passende vektor som ikke har sekvenser tilfælles med den foregående vektor. Bakte- * 15 riofagen M13 er et eksempel på en sådan anden fordelagtig vektor. De fragmenter som hører til serie a kan forbindes med hinanden, og den forbundne serie kan klones ind i én vektor. Fx kan a^-a2, forenet med hinanden, klones som en kontinuerlig indføjning ind i samme pBR322 vektor. På tilsva-rende måde er det muligt at fremstille en reagensserie Ved kloningen foretrækkes det at bruge vektorer til hvilke der kan forbindes meget store indføjninger af fremmed DNA.
Fx er lambdafag- og cosmid-vektorer egnede til dette formål.
Således behøves der to reagenspar omfattende rækker 25 af nukleinsyrefragmenter ved sandwich-hybridiseringsmetoden ifølge opfindelsen, et reagens mærket med den til identifikation værende mærkningssubstans, dvs. en sonde, og et såkaldt filterreagens fæstnet til en fast bærer.
Hyppigst bruges der radioaktive isotoper til mærkning 30 af sonderne. Fx anvendes der ifølge britisk patentskrift nr. 2.034.323 og US-patenterne nr. 4.358.535 og 4.302.204 følgende isotoper: ^P, ^^1, 1^1 j Qg 3^ if©ige europæisk 125 patentpublikation nr. 79.139 bruges isotopen I. Nuklem-syresonder er også blevet modificeret på forskellige måder DK 174675 B1 10 og mærket med fx fluorescerende markører (fransk patentskrift nr. 2.518.755). Endvidere bruges der enzymatisk eller enzymatisk målelige mærkninger (britisk patentskrift nr.
2.019.408, europæisk patentpublikation nr. 63.879 og fransk patentskrift nr. 2.519.005). De europæiske patentpublika-2 tioner nr. 70.685 og 70.687 beskriver en lysudsendende markør og mærkningsmetode, og fransk patentskrift nr. 2.518.755 beskriver en immunologisk målelig markør. De lanthanid-che-later der er beskrevet i US-patentskrift nr. 4.374.120, navnlig europium, kan bruges som mærkningsstoffer. Også det biotin-avidin-mærkningsstof som er beskrevet af Leary et al (PNAS 8(D, 4045-4049, 1983) er egnet som mærkningsstof. Foran er der nævnt nogle få eksempler på markører der kan bruges til mærkning af nukleinsyrereagenser ifølge opfindelsen, men det vil forstås at der vil blive udviklet nye, forbedrede mærkningsstoffer som også vil være egnet til 15 mærkning af rækker af nukleinsyrefragmenter ifølge opfindel sen .
Bærere der egner sig til filterreagenser indbefatter forskellige nitrocellulosefiltere (US-patentskrift nr.
4.358.535, GB-patentskrift nr. 2.095.833). DDR-patentskrift nr. 148.955 beskriver en fremgangsmåde til at binde nukleinsyrer kemisk til bæreren (papir). US-patentskrifterne nr. 4.359.535 og 4.302.204 beskriver forskelligt kemisk modificeret papir der kan bruges som faste bærere. Andre alternativer er nylonmembraner og modificerede nitrocellulosefiltere. Men det er klart at der vil blive udviklet nye materia-25 ler som vil være endnu mere egnede til anvendelse som faste bærere ifølge opfindelsen. Det er naturligvis også muligt at bruge andre faste bærere såsom forskellige kromatografimatrixer såsom triazin- eller epoxyaktiveret cellulose, latex etc. I princippet er der ikke andre begrænsninger 3Q for valg af den faste bærer end de nedenfor beskrevne. Det skal være muligt at fæstne nukleinsyre i en enkeltstrenget form til den faste bærer så at disse enkeltstrengede nukleinsyrer kan hybridisere med den komplementære nukleinsyre.
Den faste bærer må også være let at fjerne fra hybridise- DK 174675 B1 11 ringsopløsningen, eller hybridiseringsopløsningen må være let at fjerne fra den faste bærer. Tillige må sonden ikke klæbe til bærermaterialet selv så den ikke kan vaskes af.
Foran er beskrevet kombinationer af rækker af nukleinsyrer, som giver reagenspar A og B, eller B og A, henholdsvis _ mærket og fæstnet til en fast bærer, og fra sådanne nukleinsy- 5 rereagenspar, udformet til identifikation af forskellige nukleinsyrer, er det muligt at samle kombination Ax og Bx, Ay og By, A- og Bz. Disse kombinationer kan bruges til samtidig identifikation af nukleinsyrerne x, y og z ved sandwich-hybridiseringsmetoder.
10 Prøven behandles på en sådan måde at nukleinsyrerne frigives til hybridiseringsopløsningen, og de gøres enkeltstrengede. Hybridiseringen udføres i en hybridiseringsopløs-ning til hvilken både nukleinsyrereagenserne fæstnet til en fast bærer og de mærkede nukleinsyrer tilsættes. Når 15 hybridiseringen har fundet sted løftes filtrene fra hybridiseringsopløsningen såfremt der har været brugt filtre som faste bærere. Hvis der har været brugt kromatografi-matrixer, latex eller lignende fjernes hybridiseringsopløsningen.
De faste bærere skylles med en passende vaskeopløsning.
Rækkerne af dannede sandwich-hybrider (fig. 8a, 8b og 8c) 20 . .
påvises ved i og for sig kendte metoder. Fx males den radioaktive markør ved autoradiografi, ved hjælp af en scintilla-tionstæller eller med en gamma-tæller. Fx identificeres en enzymatisk mærkning efter fx en farvereaktion, ved fotometri eller på basis af et bundfald. Lanthanid-chelater 25 kan påvises ved hjælp af en såkaldt "time resolved fluorescence" metode. En immunologisk markør påvises ved immunologiske metoder egnede til formålet.
Der kan bruges flere forskellige blandinger som hybri-diseringsopløsning; som eksempler nævnes de alternativer 3Q der er fremlagt i europæisk patentpublikation nr. 79.139 og US-patentskrift nr. 4.302.204. Det er naturligvis også muligt at bruge andre hybridiseringsblandinger. Hybridiseringen finder sted ved en temperatur på 0-80°C, men det er fordelagtigt at bruge fx en temperatur på 65°C.
DK 174675 B1 12
Tilstrækkelig hybridisering vil kunne finde sted på meget kort tid, men det er fordelagtigt at bruge hybridise-ringsperioder på fx 12-20 timer.
Totrins sandwich-hybridiseringsmetoden udføres i princippet på samme måde, men i dette tilfælde sættes nuklein-5 syrereagenset fæstnet til en fast bærer først til hybridi- seringsopløsningen. Når hybridisering har fundet sted vaskes den faste bærer og der'udføres en næste hybridisering hvor det mærkede nukleinsyrereagens er til stede.
De foran beskrevede mærkede nukleinsyrereagenser eller reagenskombinationer A , A , A osv. og B , B , B osv.
^0 x y z x y z kan naturligvis bruges i direkte hybridiseringsmetoder.
I sådanne tilfælde må nukleinsyreprøven i opløsningen deles for hver til identifikation værende nukleinsyre x, y og z eller, hvis prøven er fæstnet til en fast bærer, må der fremstilles en separat prøve fæstnet til en bærer for hver 15 prøve. Den dannede række hybrider (fig. 9) påvises ved i og for sig kendte metoder. I fig. 9 betegner F den faste bærer, dvs. filteret, x den til identifikation værende nukleinsyre og v de vektorafledede dele. De anvendte mærkede sonder er a^, a2 og a^ (fig. 9a), b-^ og b2 (fig. 9b) og 20 ai' bi» a2 ’ b2 a3 9c).
Som allerede beskrevet foran kan der opstilles forskellige kombinationer af nukleinsyrereagenser fra rækkerne af nukleinsyrefragmenter ifølge opfindelsen. Det er muligt ved at anvende disse kombinationer at identificere flere forskellige nukleinsyrer samtidig. Rækker af nukleinsyre-25 fragmenter som er homologe med de forskellige til identifikation værende nukleinsyrer kan bruges som separate fragmenter i blandingerne eller forenes med hinanden på en sådan måde at der opnås én sonde som identificerer flere forskellige nukleinsyrer. Nukleinsyrereagenser fæstnet til en fast 3Q bærer må naturligvis holdes hver for sig for at identifikationen kan blive vellykket.
Hybridisering under anvendelse af rækker af nukleinsyrefragmenter kan bruges til identifikation af forskellige human-, dyre- og plantepatogene mikroorganismer. Ved denne DK 174675 B1 13 metode er det muligt at identificere mikroorganismer som er til stede i fødevarer såsom clostridier, salmonellaer og stafylokokker som bevirker fødevareforgiftninger. Metoden egner sig til identifikation af forureningsorganismer som er til stede i vand, fx enterobakterier og enterovira. g Eftersom sandwich-hybridiseringstesten under anven delse af rækker af nukleinsyrefragmenter er en kvantitativ metode, kan den fx anvendes til påvisning og måling af genformering (gene amplification). Dette karakteristikum er fx væsentligt ved påvisning og behandling af cancer. Dannelse af en stabil række hybrider fordrer at de homologe ' sekvenser af sondereagenset og filterreagenset er lokaliseret inden for en moderat afstand, fortrinsvis under 5 kilobase (kb) fra hinanden i prøvestrengen. Hvis der optræder ændringer med hensyn til afstanden mellem disse to områder er ændringen klart iagttagelig ved denne metode. Metoden 15 er derfor også egnet til opdagelse af mRNA, kromosomale omlejringer, omlejring af immunoglobulingener for ekspression og arvelige sygdomme. Det er således muligt at konstruere forskellige reagenskombinationer ud fra rækkerne af nukleinsyref ragmenter. Fx er det til identifikation af årsagerne ^ til veneriske sygdomme muligt at tilberede præparatsæt som indbefatter en sonde som indeholder rækker af nukleinsyre-fragmenter som identificerer gonorré, syfilis, herpes og chlamydiae. Identifikationen er i dette tilfælde mulig ved at anvende særskilte filtre for gonorré, syfilis, herpes og chlamydiae.
25 Opfindelsen angår i særlig grad rækker af nukleinsyre- fragmenter omfattende rekombinant-plasmiderne pKTHl220 og pKTH1271. Rekombinant-plasmidet pKTH1220 omfatter i plas-midvektoren pBR322 DNA fra Chlamydia trachomatis L2, som er specifikt for slægten Chlamydia. Dette rekombinantplas-2Q mid klones ind i værten Escherichia coli K12 HB101. Rekom-binantplasmidet 1271 omfatter i plasmidvektoren pBR32 5 DNA fra cytomegalovirus AD169. Dette rekombinantplasmid klones ind i værten Escherichia coli K12 HB101. De værter som indeholder rekombinantplasmiderne pKTH1220 og pKTHl271 er depo- DK 174675 B1 14 neret i kultursamlingen Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Griesebachstrasse 8, D-3400 Gottingen, Forbundsrepublikken Tyskland. Nummeret på den deponering som indeholder rekombinantplasmidet pKTHl220 er DSM2825 og nummeret på den deponering der indeholder rekombinantplasmidet pKTHl271 er DMS2826. Deponeringerne vil blive frit til-5 gængelige når nærværende patentansøgning bliver offentlig tilgængelig.
Opfindelsen vil blive beskrevet mere udførligt ved de følgende eksempler. Strukturen af nukleinsyren (DNA og RNA) er ensartet uanset om det drejer sig om en nukleinsyre stam-10 ‘ mende fra en eukaryotisk eller en prokaryotisk celle. Af denne grund er de i eksemplerne præsenterede principper lige vel anvendelige på nukleinsyrer fra dyr (inklusive mennesker), planter og mikroorganismer eller vira. Reagenserne ifølge opfindelsen kan således bruges til påvisning , af nukleinsyrer fra mennesker, dyr, planter, mikroorganismer og vira. Rækkerne af nukleinsyrefragmenter kan ligeledes fremstilles syntetisk. Sekvensen af nukleinsyrer til identifikation kan karakteriseres og homologe rækker af fragmenter fremstilles ved hjælp af automatiske nukleinsyrefremst illingsmaskiner.
20
Eksempel 1 a) Rækker af nukleihsyrereagenser fra Chlamydia trachomatis og fremstilling deraf_ 25 DNA-fragmenter egnet til diagnosticering af Chlamydia trachomatis-gruppen blev fremstillet ud fra DNA fra Chlamydia trachomatis serotype L2. DNA isoleredes og fragmentere-des ved kendte metoder og de resulterende DNA-fragmenter klonedes ind i plasmidet pBR322 og overførtes til værtsorganismen Escherichia coli K12 HB101 ved kendte metoder.
Der vandtes en genbank med Chlamydia trachomatis L2-bakte~ rien som resultat af kloningen,dvs. et stort antal rekombi-nantplasmider som hver havde et separat BamHI restriktionsfragment af DNA stammende fra chlamydier. Til reagenSproduk-tion udvalgtes der fra genbanken rekombinantplasmider inde DK 174675 B1 15 holdende maksimalt store DNA-indskud stammende fra chlamy-dialt DNA. Et sådant plasmid er det der betegnes pKTH1220, der er deponeret i kultursamlingen Deutsche Sammlung von Microorganismen under nummeret DSM 2825, og dets egnethed til anvendelse som reagens påvistes ved en direkte hybridi-seringstest. Testen viste at pKTH1220 identificerede alle de nukleinsyrer som stammede fra forskellige Chlamydia trachomatis serotyper, men ingen andre nukleinsyrer.
De anvendelige fragmenter, der kan opnås ved anvendelse af forskellige restriktionsenzymer, blev udvalgt fra pKTH1220-plasmid DNA og nogle af disse fragmenter overfør-^ ' tes ved yderligere kloning til pATl53 plasmidet (Maniatis et al, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory side 6, 1982) og nogle til M13 fagen.
Fig. 10 viser rekombinantplasmidet pKTHl220 med en molekyl-længde på 14 kb. I fig. 10 repræsenterer BamHI, Sail og ,
Clal de anvendte restriktionsenzyraer, og a^, a2« b^, b2 og bj belyser størrelsen og de relative beliggenheder af de fragmenter der blev frembragt ved hjælp af disse restriktionsenzymer. Fragmenterne hører til serie b som mærkede sonder. Nedenstående tabel 1 opregner størrelserne af de fragmenter og vektorer som brugtes til videre kloning, navnene 20 på rekombinantplasmiderne samt deres anvendelse.
Tabel 1
Fragment Stør- Vektor Rekombinant- Anvendelse relse, plasmid 25 -—---- a]_ Clal-Sall 3,0 pATl53 pKTHl252 filter a2 Sall-Clal 2,9 pAT153 pKTHl250 filter
Sall-BamHI 0,7 Ml3mp8 mKTHl242 mærket sonde b2 BamHI-Sall 1,4 Ml3mp8 mKTHl239 mærket sonde 2Q b^ Clal-Clal 1,7 Ml3mp8 mKTH1248 mærket sonde bl-b2 BamHI-BamHI 2,1 Ml3mp8 mKTHl245 mærket sonde
De fragmenter der er opført i tabel 1 blev isoleret fra en agarosegel ved elektroeluering, og de blev klonet DK 174675 B1 16 ind i de respektive restriktionsenzym-identifikationsste-der på de vektorer som er anført i tabel 1 under anvendelse af kendte metoder.
Fragmentet BamHI-BamHI 2,1 kb fremstilledes på følgende måde: fragmenterne BamHI-Sall 1,4 kb og Sall-BamHI 0,7 kb i plasmidet pKTH1220 blev adskilt ved gelelektroforese 5 i en agarosegel, og derfra isoleredes de. De rensede fragmenter blev forbundet med hinanden ved hjælp af T4 ligase-enzym, og af de 2,1 kb DNA-fragmenter der dannedes ved reaktionen blev de, der havde frie ender som identificeredes af BamHI-enzymet, yderligere forbundet til BamHl-restrik-tionsstedet i den dobbeltstrengede form af M13mp8 fag-DNA.
Der blev således fremstillet en rekombinant fag-DNA (mKTHl245) som indeholder Chlamydia trachomatis-DNA omfattende to separate DNA-fragmenter som ikke er lokaliseret ved siden af hinanden i genomet. De er i genomet imidlertid' ^5 lokaliseret ved siden af DNA-reagenserne pKTHl250 og pKTHl252, der skal fæstnes til filteret (fig. 11). Fig. 11 viser en række sandwich-hybrider som er dannet når de i tabel 1 anførte rekombiant-plasmider og rekombinant-phager bruges som rækker af nukleinsyrereagenser.
20 b) Påvisning af følsomheden af en række nukleinsyrereagenser fra Chlamydia trachomatis under anvendelse af sandwich- hybr i di seringsmetoden________ Følsomheden af en række nukleinsyrereagenser i sammenligning med et enkelt kontinuerligt reagenspar blev under-25 søgt ved sandwich-hybridiseringsmetoden. Testen udførtes under anvendelse af filtre som alle indeholdt 1011 molekyler af både pKTH1250 (a2) og pKTHl252 (a^) DNA, der var gjort enkeltstrenget. Den til undersøgelse værende prøve var plasmid pKTH1220, der med henblik på testen var gjort enkelt-3Q strenget ved kogning i 5 minutter i 0,17M NaOH hvorefter det overførtes til 0°C og neutraliseredes med en ækvimolær 12 5 mængde eddikesyre. Følgende sonder mærket med J, anført i tabel 1, blev brugt i testerne: mKTHl242 (b^), mKTHl239 (b2)f mKTHl248 (b3) og mKTHl245 (b-L“b2) .
DK 174675 B1 17
Hybridiseringen udførtes ved +65°C i 17 timer i en hybridiseringsopløsning med følgende sammensætning: 4 x SSC, 0,02% "Ficoll" ® , 0,02% polyvinylpyrrolidon, 0,2% SDS og 200 pg/ml sildesperma-DNA. Filtrene vaskedes i 2 timer ved 50°C med en vaskeopløsning med følgende sammen-5 sætning: 0,1 x SSC, 0,2% SDS, og de taltes ved hjælp af en gamma-tæller. Resultaterne fremgår af tabel 2 og er gennemsnitsværdier for fem parallelle forsøg.
Tabel 2
Prøve Hybridiseret radioaktivitet, I® med (b) som sonde wolekyler/test b^ b2 b-j bi'b2 (b^-b2) ^bl~b2^'b3 0 37 37 33 49_39_52 KJ6 48 44 48 93 68 140 .
107 226 236 232 396 416 686 108 1475 1415 1456 2912 2637 3580
b, 380.000 cpm/test; 5 x 107 cpm/pg DNA
*" 7
b5 340.000 cpm/test; 4 x 10 cpm/ug DNA
* 7
b-, 350.000 cpm/test; 5 x 10 cpm/pg DNA
20 j 7
b-^-b2 310.000 cpm/test; 7 x 10 cpm/pg DNA
b1,b2 700.000 cpm/test; (b1~b2),b3 700.000 cpm/test;
Statistisk beregnet blev 95% konfidensgrænsen for 25 testerne udført uden en prøve (= negative kontroller) anset som den nedre grænse for positivitet. Disse værdier var 52-54 cpm når sonden var b-^, b2 eller b^, 58 cpm når sonden var b^, b2, 56 cpm når sonden var b^-b2 og 65 cpm når sonden var b^-b2, b^.
30 c) Chlamydia-diagnosticering ved anvendelse af sandwich-hybridisering med rækker af nukleinsyrefragmenter
Prøveeksemplarer udtaget fra tre mænd der led af urethritis og fra tre kvinder som led af cervicitis blev ud- DK 174675 B1 18 valgt til testen. Chlamydia trachomatis var blevet isoleret fra de mandlige urethrale prøver og de kvindelige prøver blev udtaget fra cervix. Desuden undersøgtes et tilsvarende antal af lignende patientprøver fra hvilke chlamydia ikke var blevet isoleret. De til undersøgelse værende prøver 5 blev udtaget med vatpinde som blev neddyppet i en chlamy-dia-prøveudtagningspuffer indeholdende 0,2 M sakkarose, 20 mM fosfatpuffer, 3% kalvefosterserum, 10 μg/ml gentamicin, 100 pg/ml vancomycin og 25 IU/ml nystatin (IU står for internationale enheder).
Chlamydia dyrkedes fra de pågældende prøver. De oprin- 10 delige prøveeksemplarer blev også bedømt ved sandwich-hybri-disering under anvendelse af en række nukleinsyrefragmenter. Prøveeksemplarerne koncentreredes ved anvendelse af 2-buta-nol til fjernelse af væske fra dem på en sådan måde at slut-rumfanget var ca. 80 μΐ, hvorved koncentreringen til test-15 ningen således var omkring 3-7-dobbelt. Derefter sattes der 70 mM EDTA, 0,7% SDS, 200 μg/ml proteinase K-enzym til prøven og den behandledes i 15 minutter ved 55°C og i 45 minutter ved 37°C. Derefter kogtes prøven i 5 minutter i 0,175 M NaOH. Den kogte prøve afkøledes til 0°C og neutrali-2q seredes med en ækivmolær mængde eddikesyre og testedes.
Ved testen brugtes der de filtere og hybridiseringsbetingel-ser som er beskrevet i eksempel lb. Den anvendte sonde var mKTHl245 (b^-b2), 300.000 cpm/400 μΐ hybridiseringsreaktion. Resultaterne fremgår af tabel 3.
25 30 DK 174675 B1 19
Tabel 3
Prøve Hybridiseret Resultat af radioaktivitet Chlamydia-dyrkning
Mand 1 151 + mand 2 164 + ^ mand 3 154 + mand 4 61 mand 5 76 mand 6 55 10 Kvinde 1 343 + kvinde 2 509 + kvinde 3 362 + kvinde 4 57 kvinde 5 58 kvinde 6 81
Puffer, X4 30-55
Chlamydia trachomatis 20 L2 bakterie, 106 419 +
Grænsen for positivitet i disse tester var 104 cpm.
Resultaterne i tabel 3 viser at sandwich-hybridise-ring under anvendelse af en række nukleinsyrefragmenter er egnet til diagnose af veneriske sygdomme. De prøver som var negative i dyrkningstesterne var også negative i sand-wich-hybridiseringstesten.
Eksempel 2 30 a) En række nukleinsyrereagenser fra Cytomegalovirus og fremstilling deraf__ DNA-fragmenter egnet til diagnosticering af Cytomegalovirus fremstilledes ud fra Cytomegalovirus (AD 169, ATCC VR-538)-(CMV). DNA isoleredes og fragmenteredes ved kendte DK 174675 B1 20 metoder. EcoRl fragment I på ca. 9 kb, defineret i Spector et al, J. Virol. 42 , 558-582, 1982, isoleredes fra agarose-gel ved elektroeluering efter at EcoRI-restriktionsfragmenter var blevet separeret på basis af deres størrelse. Det eluerede DNA ekstraheredes med fenol hvorefter det fældedes 2 med ætanol. Det således rensede DNA forenedes ved hjælp af T4-ligase til pBR325 plasmidvektoren som var åbnet ved anvendelse af EcoRl-enzymet, og det derved dannede rekombi-nant-DNA overførtes til Escherichia coli K12 HB101 værtsbakterier. Blandt ampicillin- og tetracyklin-resistente, men kloramfenikol-følsomme kloner udvalgtes der en som indeholdt en cytomegalovirus-specifik DNA-indsats af den korrekte størrelse. Karakteren af det klonede cytomegalovirus-DNA bedømtes ved Southern blot metoden.
Denne test sikrede at det beskrevne 9 kb EcoRI-DNA-fragment stammede fra DNA fra Cytomegalovirus og, nærmere betegnet, , 15 indgik i dets HindIII-D fragment (Oram et al, J. Gen. Virol.
59, 111-129, 1982). Det således beskrevne rekombinant-plas-mid blev betegnet pKTHl271 og det blev deponeret i kultursamlingen Deutsche Sammlung von Microorganismen under nr.
DSM 2826. Rekombinant-plasmidet dyrkedes og rensedes ved kendt teknik.
20
De videre kloninger udførtes ved kendte teknikker under anvendelse som vektorer af pBR322-plasmidet og Ml3mp7 og Ml3mp8 fager. Fig. 12 viser hybridplasmidet pKTH1271 med en molekyllængde på ca. 9 kb. Rækken af nukleinsyrefragmenter vist i fig. 12 fremstilledes ved anvendelse af re-25 striktionsenzymerne EcoRl, BamHI, Clal og Pstl. Fig. 12 viser de fragmenter der opnåedes ved anvendelse af restriktionsenzymer såvel som deres relative størrelse og beliggenhed. Tabel 4 angiver størrelserne af de pågældende fraktioner og de vektorer der brugtes til den videre kloning, nav-3q net på de således vundne rekombinant-plasmider og deres anvendelse enten som filterreagenser eller som mærkede sonder. Fig. 13 viser en række sandwich-hybrider som dannes når de i tabel 4 anførte nukleinsyrefragmenter bruges.
DK 174675 B1 21
Tabel 4
Restriktionsfragment Vektor Betegnelse Anvendelse a1 EcoRI-PstI (3,3 kb) pBR322 pKTHl273 filter a2 Clal-BamHI (3,0 kb) pBR322 pKTFl274 filter b1 PstX-PstI (0,6 kb) Ml3mp7 mKTHl277 mærket sonde 5 b2 Pstl-Clal (1,0 kb) M13mp8 mKTHl278 mærket sonde b^ BamHO-EcoRI (1,0 kb) M13mp8 mKTHl279 mærket sonde b) Påvisning af følsomheden af en række nukleinsyrereagenser fra cytomegalovirus ved sandwich-hybridiseringsmetoden 10 Følsomheden af en række nukleinsyrereagenser i sammen ligning med ét kontinuerligt reagenspar bedømtes ved sandwich-hybridiseringsmetoden. Prøveeksemplaret i testerne var CMV-DNA som kogtes i 0,17 M NaOH i 5 minutter og derefter neutraliseredes som i eksempel lb. I testen brugtes 11 o ' ^ der filtre som alle indeholdt 10 molekyler af både pKTH1273 (a.)-DNA og pKTH1274 (a-)-DNA, som var gjort enkelt- Α ^ 125 strenget, og de følgende sonder mærket med J anført i tabel 4: mKTHl277 (b^, mKTH1278 (b2) og mKTHl279 (b3).
Hver af prøverne indeholdt 10® cpm/pg DNA. Hybridiseringen udførtes som beskrevet i eksempel lb. Resultaterne fremgår 20 af tabel 5.
_Tabel 5_
Hybridiseret radioaktivitet,
Prøveeksempler med (b) som sonde_ molekyler/test b± b2 b3 bi'b2 bl'b2,b3 0 35 33 38 45_ 53 106 38 44 46 95 125 4xl06 85 135 142 205 292 1,6xl07 203 254 265 415 645 30 bl 310.000 cpm/test b2 320.000 cpm/test b3 300.000 spm/test bl,b2 300.000 cpm af hver/test bl,b2,b3 300.000 cpm af hver/test DK 174675 B1 22 I den værdifulde test var den nedre grænse for positivitet 51-55 cpm når sonden var b^, b2 eller b^, 59 cmp når sonden var b^, b2 og 63 cpm når sonden var b^, b2, b^.
Resultaterne i tabel 5 viser at sandwich-hybridise-ring hvor der anvendes et individuelt sondereagens (b,, ϊ>2 og b^) påviser i alle tilfælde 4 x 10 CMV-DNA molekyler.
På den anden side bevirker hybridisering med et reagens af b^, b2 eller b·^, b2, så få som 10^ molekyler CMV-DNA. Resultaterne viser at rækken af nukleinsyrereagenser er fire gange så følsom som de individuelle nukleinsyrereagenser .
10 c) CMV-diagnose ved anvendelse af sandwich-hybridisering med en række nukleinsyrereagenser_
Kliniske prøver bedømtes ved anvendelse af sandwich-hybridisering med en række reagenser. Disse prøver omfatte-; !5 de to urinprøver fra børn med en alder under 1 år. Disse børn var under mistanke for at lide af en congenit cytome-galosygdom. En lungebiopsi-prøve fra en patient med CMV pulmonær infektion blev også bedømt ved den foreliggende sandwich-hybridisering. Både cytomegalovirus-inficerede og -uinficerede menneskefosterceller blev også brugt som 20 , prøveeksemplarer i testen.
En opløsning som indeholdt 1% sarkosyl og 5 mM EDTA samt 200 pg kalvethymus-DNA sattes til en prøve på 10 ml urin, hvorpå DNA frigivet fra viruset udfældedes sammen med bæreren ved hjælp af 10 ml isopropanol ved stuetempera- 25 tur. DNA-bundfaldet opløstes i 200 μΐ TE-puffer og bragtes til en enkeltstrenget form ved kogning i 5 minutter, hvorpå DNA-opløsningen afkøledes til 0°C og sattes til hybridise-ringsopløsningen.
Lunge-biopsiprøven (nogle få mm^) findeltes mekanisk 2Q med en kniv, og der sattes 200 μΐ TE-puffer indeholdende 1% SDS-opløsning og 1 mg/ml proteinase K-enzym dertil. Der udførtes' fordøjelse ved +37°C i 1 time hvorpå prøven blev trukket ind i en injektionssprøjte to gange gennem en tynd injektionsnål. Den således homogeniserede prøve kogtes hvorefter den sattes til testopløsningen.
DK 174675 B1 23
De med cytomegalovirus inficerede celler og de uinfi-cerede celler blev brudt op ved hjælp af en behandling med SDS, proteinase K, homogeniseret og kogt som beskrevet ovenfor .
Reagenserne i hybridiseringsprøven var pKTH1273 (a·^) 5 og pKTHl274 (a2) på filtre og mKTH1277 (bx), mKTH1278 (k>2) og mKTHl279 (b^) som sonder, hver 200.000 cpm/reaktion.
I andre henseender udførtes hybridiseringen, vasken af filtrene og optællingen af resultaterne som beskrevet i eksempel lb.
Resultaterne af denne hybridisering fremgår af tabel 6.
10
Tabel 6
Prøveeksempler Hybridiseret Virusisola- radioaktivitet tion
Inficerede celler (10^) 3521 ikke udført'
15 Urin 1 (10 ml) 243 CMV
Urin 2 (10 ml) 3215 CMV
Urin fra en rask person (10 ml) 52 ikke udført
Lungebiopsi-prøve 535 CMV
Kontrolceller (10^) 68 ikke udført 20 Ingen prøve 65 ikke udført
Resultaterne i tabel 6 viser at det er muligt ved anvendelse af en række nukleinsyrereagenser at påvise CMV i forskellige kliniske prøver såsom urin, lungebiopsi-prø- ver og celler.
25
Testen er specificeret til cytomegalovirus; den identificerer ikke humant DNA, dvs. testen påvirkes ikke af humant DNA som måtte være til stede i prøven. Faktisk indgriber prøvetypen ikke med testens specificitet på nogen måde.
30

Claims (6)

1. Nukleinsyrereagens, kendetegnet ved, at det omfatter to serier af rækker af alternerende nukleinsyrefragmenter som er tilstrækkeligt ho- 5 mologe med en til identifikation værende nukleinsyre, men ikke homologe med hinanden, hvor den ene af serierne omfatter mærkede nukleinsyrefragmenter og den anden er fæstnet til en fast bærer, og hvor serierne omfatter mindst to, men fortrinsvis flere, fragmen-10 ter.
2. Nukleinsyrereagens ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det omfatter enten separate eller sammensluttede rækker af alternerende nukleinsyref ragmenter .
3. Nukleinsyrereagens ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at det omfatter rækker af nukleinsyrefragmenter som enten har eller ikke har vektorafledede dele.
4. Nukleinsyrereagens ifølge krav l, 2 eller 3, 20 kendetegnet ved, at det omfatter rekombi- nantplasmidet pKTH1220 eller derivater deraf, hvilket rekombinantplasmid indeholder DNA fra Chlamydia trachomatis L2 bakterien og er klonet ind i værten Escherichia coli K12 HB101, hvilken vært indeholdende 25 rekombinantplasmidet pKTH1220 er deponeret under nummeret DSM 2825.
5. Nukleinsyrereagens ifølge krav 1, 2 eller 3, kendetegnet ved, at det omfatter rekombinantplasmidet pKTH1271 eller derivater deraf, hvilket 30 rekombinantplasmid indeholder DNA fra Cytomegalovirus AD169 og er klonet ind i værten Escherichia coli K12 HB101, hvilken vært indeholdende rekombinantplasmidet pKTH1271 er deponeret under nummeret dsm 2826, DK 174675 B1 25
6. Fremgangsmåde til fremstilling af nukleinsy-rereagenser som angivet i et hvilket som helst af kravene 1-5, kendetegnet ved, at fremstillingen af rækkerne af nukleinsyrefragmenter om-5 fatter: a) isolering af udvalgte nukleinsyrer med passende længde, der kan identificere nukleinsyren, som skal påvises, b) kloning af udvalgte nukleinsyrer i passen- 10 de vektorer, c) fragmentering af nukleinsyrerne ved anvendelse af restriktionsenzymer, d) kombination af de passende rækker af fragmenter til to serier under anvendelse af 15 passende ligaser, e) kloning af rækkerne af fragmenter i passende vektorer, fortrinsvis fragmenter tilhørende forskellige serier i forskellige vektorer, 20 f) mærkning af de enten separate eller for enede nukleinsyrefragmenter hørende til en serie, og g) fiksering til en fast bærer af de · enten separate eller forenede nukleinsyrefrag-25 menter hørende til den anden serie.
DK198500589A 1984-02-17 1985-02-08 Nukleinsyrereagenser og fremgangsmåde til fremstilling deraf DK174675B1 (da)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI840655 1984-02-17
FI840655A FI71768C (fi) 1984-02-17 1984-02-17 Foerbaettrade nykleinsyrareagenser och foerfarande foer deras framstaellning.

Publications (3)

Publication Number Publication Date
DK58985D0 DK58985D0 (da) 1985-02-08
DK58985A DK58985A (da) 1985-08-18
DK174675B1 true DK174675B1 (da) 2003-08-25

Family

ID=8518568

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DK198500589A DK174675B1 (da) 1984-02-17 1985-02-08 Nukleinsyrereagenser og fremgangsmåde til fremstilling deraf

Country Status (22)

Country Link
US (1) US4731325A (da)
JP (1) JPS60188100A (da)
AT (1) AT394578B (da)
AU (1) AU577568B2 (da)
BE (1) BE901671A (da)
CA (1) CA1248895A (da)
CH (1) CH671778A5 (da)
DE (1) DE3505287C2 (da)
DK (1) DK174675B1 (da)
FI (1) FI71768C (da)
FR (1) FR2559783B1 (da)
GB (1) GB2156074B (da)
HU (1) HU194938B (da)
IE (1) IE57652B1 (da)
IT (1) IT1183184B (da)
LU (1) LU85768A1 (da)
NL (1) NL193663C (da)
NO (1) NO166543C (da)
RO (1) RO92633B (da)
SE (1) SE463103B (da)
SU (1) SU1523053A3 (da)
ZA (1) ZA85511B (da)

Families Citing this family (151)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1260372A (en) * 1984-04-27 1989-09-26 Elazar Rabbani Hybridization method for the detection of genetic materials
US4725536A (en) * 1985-09-19 1988-02-16 Genetics Institute, Inc. Reagent polynucleotide complex with multiple target binding regions, and kit and methods
US4876187A (en) * 1985-12-05 1989-10-24 Meiogenics, Inc. Nucleic acid compositions with scissile linkage useful for detecting nucleic acid sequences
US4868105A (en) * 1985-12-11 1989-09-19 Chiron Corporation Solution phase nucleic acid sandwich assay
US4910300A (en) * 1985-12-11 1990-03-20 Chiron Corporation Method for making nucleic acid probes
US4882269A (en) * 1985-12-13 1989-11-21 Princeton University Amplified hybridization assay
FI76119C (fi) * 1986-02-27 1988-09-09 Orion Yhtymae Oy Kvantitativ bestaemning av nukleinsyramolekyler och reagensfoerpackning som anvaends vid foerfarandet.
US4925785A (en) * 1986-03-07 1990-05-15 Biotechnica Diagnostics, Inc. Nucleic acid hybridization assays
US5281518A (en) * 1986-05-01 1994-01-25 Washington Research Foundation Detection of a unique chlamydia strain associated with acute respiratory disease
CA1341065C (en) * 1986-05-01 2000-08-01 J. Thomas Grayston Detection of a unique chlamydia strain associated with acute respiratory disease
US6270961B1 (en) * 1987-04-01 2001-08-07 Hyseq, Inc. Methods and apparatus for DNA sequencing and DNA identification
US5202231A (en) * 1987-04-01 1993-04-13 Drmanac Radoje T Method of sequencing of genomes by hybridization of oligonucleotide probes
US5359100A (en) * 1987-10-15 1994-10-25 Chiron Corporation Bifunctional blocked phosphoramidites useful in making nucleic acid mutimers
CA1339351C (en) * 1987-10-15 1997-08-26 Michael S. Urdea Nucleic acid multimers and amplified nucleic acid hybridization assays using same
US5124246A (en) * 1987-10-15 1992-06-23 Chiron Corporation Nucleic acid multimers and amplified nucleic acid hybridization assays using same
CA1323293C (en) * 1987-12-11 1993-10-19 Keith C. Backman Assay using template-dependent nucleic acid probe reorganization
GB8810400D0 (en) * 1988-05-03 1988-06-08 Southern E Analysing polynucleotide sequences
US6054270A (en) * 1988-05-03 2000-04-25 Oxford Gene Technology Limited Analying polynucleotide sequences
US5700637A (en) * 1988-05-03 1997-12-23 Isis Innovation Limited Apparatus and method for analyzing polynucleotide sequences and method of generating oligonucleotide arrays
US7811751B2 (en) * 1988-05-03 2010-10-12 Oxford Gene Technology Limited Analysing polynucleotide sequences
EP0379559B1 (en) * 1988-06-24 1996-10-23 Amgen Inc. Method and reagents for detecting nucleic acid sequences
US5185243A (en) * 1988-08-25 1993-02-09 Syntex (U.S.A.) Inc. Method for detection of specific nucleic acid sequences
JPH0638758B2 (ja) * 1989-02-03 1994-05-25 イーストマン コダック カンパニー 核酸試験片及び所定の核酸を検出するためのその使用
US6346413B1 (en) 1989-06-07 2002-02-12 Affymetrix, Inc. Polymer arrays
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US6955915B2 (en) * 1989-06-07 2005-10-18 Affymetrix, Inc. Apparatus comprising polymers
US5925525A (en) * 1989-06-07 1999-07-20 Affymetrix, Inc. Method of identifying nucleotide differences
US6040138A (en) * 1995-09-15 2000-03-21 Affymetrix, Inc. Expression monitoring by hybridization to high density oligonucleotide arrays
US6919211B1 (en) 1989-06-07 2005-07-19 Affymetrix, Inc. Polypeptide arrays
US5800992A (en) 1989-06-07 1998-09-01 Fodor; Stephen P.A. Method of detecting nucleic acids
US5424186A (en) 1989-06-07 1995-06-13 Affymax Technologies N.V. Very large scale immobilized polymer synthesis
US6309822B1 (en) 1989-06-07 2001-10-30 Affymetrix, Inc. Method for comparing copy number of nucleic acid sequences
US6406844B1 (en) 1989-06-07 2002-06-18 Affymetrix, Inc. Very large scale immobilized polymer synthesis
US6379895B1 (en) 1989-06-07 2002-04-30 Affymetrix, Inc. Photolithographic and other means for manufacturing arrays
US5744101A (en) 1989-06-07 1998-04-28 Affymax Technologies N.V. Photolabile nucleoside protecting groups
US6551784B2 (en) 1989-06-07 2003-04-22 Affymetrix Inc Method of comparing nucleic acid sequences
US5232829A (en) * 1989-09-29 1993-08-03 Hoffmann-La Roche Inc. Detection of chlamydia trachomatis by polymerase chain reaction using biotin labelled lina primers and capture probes
US6506558B1 (en) 1990-03-07 2003-01-14 Affymetrix Inc. Very large scale immobilized polymer synthesis
CA2039517C (en) * 1990-04-03 2006-11-07 David Segev Dna probe signal amplification
US5071962A (en) * 1990-05-31 1991-12-10 The United State Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Nucleotide, deduced amino acid sequence, isolation and purification of heat-shock chlamydial proteins
DE69112309T2 (de) * 1990-06-28 1996-01-25 Wakunaga Seiyaku Kk Verfahren zum Nukleinsäurenachweis.
US5645994A (en) * 1990-07-05 1997-07-08 University Of Utah Research Foundation Method and compositions for identification of species in a sample using type II topoisomerase sequences
GB9020621D0 (en) * 1990-09-21 1990-10-31 Imp Cancer Res Tech Identification of organisms
GB2262987A (en) * 1990-09-21 1993-07-07 Imp Cancer Res Tech Identification of organisms
EP0834576B1 (en) 1990-12-06 2002-01-16 Affymetrix, Inc. (a Delaware Corporation) Detection of nucleic acid sequences
US5437976A (en) * 1991-08-08 1995-08-01 Arizona Board Of Regents, The University Of Arizona Multi-domain DNA ligands bound to a solid matrix for protein and nucleic acid affinity chromatography and processing of solid-phase DNA
US5632957A (en) * 1993-11-01 1997-05-27 Nanogen Molecular biological diagnostic systems including electrodes
US6569382B1 (en) * 1991-11-07 2003-05-27 Nanogen, Inc. Methods apparatus for the electronic, homogeneous assembly and fabrication of devices
US6017696A (en) 1993-11-01 2000-01-25 Nanogen, Inc. Methods for electronic stringency control for molecular biological analysis and diagnostics
US6051380A (en) * 1993-11-01 2000-04-18 Nanogen, Inc. Methods and procedures for molecular biological analysis and diagnostics
US6652808B1 (en) * 1991-11-07 2003-11-25 Nanotronics, Inc. Methods for the electronic assembly and fabrication of devices
US5849486A (en) * 1993-11-01 1998-12-15 Nanogen, Inc. Methods for hybridization analysis utilizing electrically controlled hybridization
US5605662A (en) * 1993-11-01 1997-02-25 Nanogen, Inc. Active programmable electronic devices for molecular biological analysis and diagnostics
US6048690A (en) * 1991-11-07 2000-04-11 Nanogen, Inc. Methods for electronic fluorescent perturbation for analysis and electronic perturbation catalysis for synthesis
US5556961A (en) * 1991-11-15 1996-09-17 Foote; Robert S. Nucleosides with 5'-O-photolabile protecting groups
DE69233331T3 (de) 1991-11-22 2007-08-30 Affymetrix, Inc., Santa Clara Kombinatorische Strategien zur Polymersynthese
US6943034B1 (en) 1991-11-22 2005-09-13 Affymetrix, Inc. Combinatorial strategies for polymer synthesis
US6468740B1 (en) 1992-11-05 2002-10-22 Affymetrix, Inc. Cyclic and substituted immobilized molecular synthesis
US6864101B1 (en) 1991-11-22 2005-03-08 Affymetrix, Inc. Combinatorial strategies for polymer synthesis
WO1993013227A1 (en) * 1991-12-23 1993-07-08 Chiron Corporation Cmv probes for use in solution phase sandwich hybridization assays
JPH07502414A (ja) * 1991-12-23 1995-03-16 バイエル　コーポレイション 溶液相サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイに用いるためのクラミジアプローブ
US5583211A (en) * 1992-10-29 1996-12-10 Beckman Instruments, Inc. Surface activated organic polymers useful for location - specific attachment of nucleic acids, peptides, proteins and oligosaccharides
US7713528B1 (en) 1993-02-18 2010-05-11 Enzo Therapeutics, Inc. Method for in vivo delivery of active compounds using reagent conjugate
EP0787183A4 (en) 1993-07-23 1998-05-27 Hyseq Inc METHOD FOR DETECTION OF UNKNOWN ORGANISMS
FR2710075B1 (fr) * 1993-09-15 1995-10-27 Bio Merieux Réactif et procédé pour la détection d'une séquence nucléotidique avec amplification de signal.
US20040077074A1 (en) * 1993-11-01 2004-04-22 Nanogen, Inc. Multi-chambered analysis device
US6375899B1 (en) 1993-11-01 2002-04-23 Nanogen, Inc. Electrophoretic buss for transport of charged materials in a multi-chamber system
US6331274B1 (en) 1993-11-01 2001-12-18 Nanogen, Inc. Advanced active circuits and devices for molecular biological analysis and diagnostics
US7314708B1 (en) 1998-08-04 2008-01-01 Nanogen, Inc. Method and apparatus for electronic synthesis of molecular structures
US6315953B1 (en) 1993-11-01 2001-11-13 Nanogen, Inc. Devices for molecular biological analysis and diagnostics including waveguides
US6319472B1 (en) 1993-11-01 2001-11-20 Nanogen, Inc. System including functionally separated regions in electrophoretic system
US6309602B1 (en) 1993-11-01 2001-10-30 Nanogen, Inc. Stacked, reconfigurable system for electrophoretic transport of charged materials
US6225059B1 (en) 1993-11-01 2001-05-01 Nanogen, Inc. Advanced active electronic devices including collection electrodes for molecular biological analysis and diagnostics
US7582421B2 (en) * 1993-11-01 2009-09-01 Nanogen, Inc. Methods for determination of single nucleic acid polymorphisms using a bioelectronic microchip
US7172864B1 (en) 1993-11-01 2007-02-06 Nanogen Methods for electronically-controlled enzymatic reactions
US7101661B1 (en) 1993-11-01 2006-09-05 Nanogen, Inc. Apparatus for active programmable matrix devices
US6068818A (en) 1993-11-01 2000-05-30 Nanogen, Inc. Multicomponent devices for molecular biological analysis and diagnostics
US6254827B1 (en) 1993-11-01 2001-07-03 Nanogen, Inc. Methods for fabricating multi-component devices for molecular biological analysis and diagnostics
US6726880B1 (en) 1993-11-01 2004-04-27 Nanogen, Inc. Electronic device for performing active biological operations and method of using same
US6638482B1 (en) 1993-11-01 2003-10-28 Nanogen, Inc. Reconfigurable detection and analysis apparatus and method
US6287517B1 (en) 1993-11-01 2001-09-11 Nanogen, Inc. Laminated assembly for active bioelectronic devices
US6287850B1 (en) * 1995-06-07 2001-09-11 Affymetrix, Inc. Bioarray chip reaction apparatus and its manufacture
EP0695941B1 (en) * 1994-06-08 2002-07-31 Affymetrix, Inc. Method and apparatus for packaging a chip
US5807522A (en) * 1994-06-17 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for fabricating microarrays of biological samples
US7378236B1 (en) 1994-06-17 2008-05-27 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Method for analyzing gene expression patterns
US7323298B1 (en) * 1994-06-17 2008-01-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Microarray for determining the relative abundances of polynuceotide sequences
US6306657B1 (en) * 1994-06-28 2001-10-23 Kalyx Biosciences, Inc. Polynucleotide probe and kit for amplifying signal detection in hybridization assays
US6403367B1 (en) 1994-07-07 2002-06-11 Nanogen, Inc. Integrated portable biological detection system
US7857957B2 (en) * 1994-07-07 2010-12-28 Gamida For Life B.V. Integrated portable biological detection system
US6121048A (en) * 1994-10-18 2000-09-19 Zaffaroni; Alejandro C. Method of conducting a plurality of reactions
US8236493B2 (en) * 1994-10-21 2012-08-07 Affymetrix, Inc. Methods of enzymatic discrimination enhancement and surface-bound double-stranded DNA
US6720149B1 (en) * 1995-06-07 2004-04-13 Affymetrix, Inc. Methods for concurrently processing multiple biological chip assays
US20040086917A1 (en) * 1995-09-27 2004-05-06 Nanogen, Inc. Methods for electronic fluorescent perturbation for analysis and electronic perturbation catalysis for synthesis
EP0880598A4 (en) * 1996-01-23 2005-02-23 Affymetrix Inc RAPID EVALUATION OF NUCLEIC ACID ABUNDANCE DIFFERENCE, WITH A HIGH-DENSITY OLIGONUCLEOTIDE SYSTEM
US6706473B1 (en) 1996-12-06 2004-03-16 Nanogen, Inc. Systems and devices for photoelectrophoretic transport and hybridization of oligonucleotides
US6297006B1 (en) 1997-01-16 2001-10-02 Hyseq, Inc. Methods for sequencing repetitive sequences and for determining the order of sequence subfragments
US6309824B1 (en) 1997-01-16 2001-10-30 Hyseq, Inc. Methods for analyzing a target nucleic acid using immobilized heterogeneous mixtures of oligonucleotide probes
US20020042048A1 (en) 1997-01-16 2002-04-11 Radoje Drmanac Methods and compositions for detection or quantification of nucleic acid species
US6326489B1 (en) 1997-08-05 2001-12-04 Howard Hughes Medical Institute Surface-bound, bimolecular, double-stranded DNA arrays
DE19741715A1 (de) 1997-09-22 1999-03-25 Hoechst Ag Pentopyranosyl-Nucleosid, seine Herstellung und Verwendung
US6485944B1 (en) 1997-10-10 2002-11-26 President And Fellows Of Harvard College Replica amplification of nucleic acid arrays
US6511803B1 (en) * 1997-10-10 2003-01-28 President And Fellows Of Harvard College Replica amplification of nucleic acid arrays
AU737174B2 (en) 1997-10-10 2001-08-09 President & Fellows Of Harvard College Replica amplification of nucleic acid arrays
US6548021B1 (en) 1997-10-10 2003-04-15 President And Fellows Of Harvard College Surface-bound, double-stranded DNA protein arrays
AU746061B2 (en) * 1997-12-12 2002-04-11 Qiagen Gaithersburg, Inc. Assessment of human papilloma virus-related disease
US6355419B1 (en) 1998-04-27 2002-03-12 Hyseq, Inc. Preparation of pools of nucleic acids based on representation in a sample
US6232067B1 (en) * 1998-08-17 2001-05-15 The Perkin-Elmer Corporation Adapter directed expression analysis
US6545264B1 (en) 1998-10-30 2003-04-08 Affymetrix, Inc. Systems and methods for high performance scanning
US7510841B2 (en) 1998-12-28 2009-03-31 Illumina, Inc. Methods of making and using composite arrays for the detection of a plurality of target analytes
AU4025300A (en) * 1999-03-24 2000-10-09 Packard Bioscience Company Continuous porous matrix arrays
EP1088101A4 (en) * 1999-03-30 2004-10-20 Nanogen Inc UNIQUE NUCLEOTIDE POLYMORPHIC DISCRIMINATION BY ELECTRONIC DOT BLOT TEST ON SEMICONDUCTOR MICROCHIPS
JP2003524772A (ja) 1999-04-27 2003-08-19 シファーゲン バイオシステムズ， インコーポレイテッド 気相イオン分析計のためのプローブ
EP1054259A1 (en) * 1999-05-19 2000-11-22 Remacle, José Method for the identification of a target compound
US20030096321A1 (en) * 1999-05-19 2003-05-22 Jose Remacle Method for the identification and/or the quantification of a target compound obtained from a biological sample upon chips
US6465183B2 (en) * 1999-07-01 2002-10-15 Agilent Technologies, Inc. Multidentate arrays
JP2001017166A (ja) * 1999-07-02 2001-01-23 Fuji Photo Film Co Ltd Ｄｎａチップ、ｄｎａチップの検定キットおよびｄｎａチップの検定法
US6428957B1 (en) * 1999-11-08 2002-08-06 Agilent Technologies, Inc. Systems tools and methods of assaying biological materials using spatially-addressable arrays
US6235483B1 (en) 2000-01-31 2001-05-22 Agilent Technologies, Inc. Methods and kits for indirect labeling of nucleic acids
US7955794B2 (en) 2000-09-21 2011-06-07 Illumina, Inc. Multiplex nucleic acid reactions
US7582420B2 (en) 2001-07-12 2009-09-01 Illumina, Inc. Multiplex nucleic acid reactions
US8076063B2 (en) 2000-02-07 2011-12-13 Illumina, Inc. Multiplexed methylation detection methods
US6455007B1 (en) * 2000-06-13 2002-09-24 Symyx Technologies, Inc. Apparatus and method for testing compositions in contact with a porous medium
US7439016B1 (en) 2000-06-15 2008-10-21 Digene Corporation Detection of nucleic acids by type-specific hybrid capture method
US7601497B2 (en) 2000-06-15 2009-10-13 Qiagen Gaithersburg, Inc. Detection of nucleic acids by target-specific hybrid capture method
US6905816B2 (en) 2000-11-27 2005-06-14 Intelligent Medical Devices, Inc. Clinically intelligent diagnostic devices and methods
CA2440656A1 (en) * 2001-03-09 2002-09-19 Apollo Biotechnology, Inc. Conjugate probes and optical detection of analytes
EP2246438B1 (en) 2001-07-12 2019-11-27 Illumina, Inc. Multiplex nucleic acid reactions
US6893822B2 (en) 2001-07-19 2005-05-17 Nanogen Recognomics Gmbh Enzymatic modification of a nucleic acid-synthetic binding unit conjugate
US7601493B2 (en) * 2002-07-26 2009-10-13 Nanogen, Inc. Methods and apparatus for screening and detecting multiple genetic mutations
US20040241659A1 (en) * 2003-05-30 2004-12-02 Applera Corporation Apparatus and method for hybridization and SPR detection
US7622281B2 (en) 2004-05-20 2009-11-24 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and compositions for clonal amplification of nucleic acid
US7828954B2 (en) * 2004-09-21 2010-11-09 Gamida For Life B.V. Electrode based patterning of thin film self-assembled nanoparticles
US7314542B2 (en) * 2004-09-23 2008-01-01 Nanogen, Inc. Methods and materials for optimization of electronic transportation and hybridization reactions
US20060246576A1 (en) 2005-04-06 2006-11-02 Affymetrix, Inc. Fluidic system and method for processing biological microarrays in personal instrumentation
JP5187847B2 (ja) 2005-05-06 2013-04-24 ジェン−プローブ・インコーポレーテッド 核酸標的の捕獲方法
WO2007070553A2 (en) * 2005-12-12 2007-06-21 The Johns Hopkins University Double-tiled and multi-tiled arrays and methods thereof
EP1971690B1 (en) 2005-12-28 2018-10-17 Translational Therapeutics, Inc. Translational dysfunction based therapeutics
US20080003667A1 (en) * 2006-05-19 2008-01-03 Affymetrix, Inc. Consumable elements for use with fluid processing and detection systems
NZ576149A (en) 2006-09-29 2012-06-29 Translational Therapeutics Inc Eif4e regulon-based diagnostics
EP1912067A1 (en) * 2006-10-12 2008-04-16 Eppendorf Array Technologies S.A. Method for quantification of a target compound obtained from a biological sample upon chips
US9938641B2 (en) * 2006-12-18 2018-04-10 Fluidigm Corporation Selection of aptamers based on geometry
WO2008085777A2 (en) * 2007-01-03 2008-07-17 Xgenetics Inc. A method for early detection of cancer
JP2012506705A (ja) * 2008-10-27 2012-03-22 キアジェン ゲイサーズバーグ インコーポレイテッド 迅速に結果を得るハイブリッドキャプチャー法による分析およびシステム
CA2750338C (en) * 2009-01-28 2019-06-25 Qiagen Gaithersburg, Inc. Sequence-specific large volume sample preparation method and assay
JP5738278B2 (ja) * 2009-05-01 2015-06-24 キアジェン ゲイサーズバーグ インコーポレイテッド 試料中のｒｎａスプライシング形態を検出するための非標的増幅法
WO2011032124A1 (en) 2009-09-14 2011-03-17 Qiagen Gaithersburg, Inc. Compositions and methods for recovery of nucleic acids or proteins from tissue samples fixed in cytology media
JP6103941B2 (ja) 2010-01-29 2017-03-29 キアジェン ゲイサーズバーグ インコーポレイテッド 核酸の配列特異的精製および多重分析のための方法および組成物
JP2013517803A (ja) 2010-01-29 2013-05-20 キアジェン ゲイサーズバーグ インコーポレイテッド サンプル中のｈｐｖの存在を決定および確認する方法
JP2013528049A (ja) 2010-05-19 2013-07-08 キアゲン ガイサーズバーグ アイエヌシー． 核酸の配列特異的な精製及び多重分析のための方法及び組成物
US9376727B2 (en) 2010-05-25 2016-06-28 Qiagen Gaithersburg, Inc. Fast results hybrid capture assay and associated strategically truncated probes
WO2012116220A2 (en) 2011-02-24 2012-08-30 Qiagen Gaithersburg, Inc. Materials and methods for detection of hpv nucleic acid

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4366246A (en) * 1977-11-08 1982-12-28 Genentech, Inc. Method for microbial polypeptide expression
US4293652A (en) * 1979-05-25 1981-10-06 Cetus Corporation Method for synthesizing DNA sequentially
FI63596C (fi) * 1981-10-16 1983-07-11 Orion Yhtymae Oy Mikrobdiagnostiskt foerfarande som grundar sig pao skiktshybridisering av nukleinsyror och vid foerfarandet anvaenda kombinationer av reagenser
GB8306426D0 (en) * 1983-03-09 1983-04-13 Malcolm A D B Detecting polynucleotide sequence
CA1260372A (en) * 1984-04-27 1989-09-26 Elazar Rabbani Hybridization method for the detection of genetic materials
US4563417A (en) * 1984-08-31 1986-01-07 Miles Laboratories, Inc. Nucleic acid hybridization assay employing antibodies to intercalation complexes

Also Published As

Publication number Publication date
SE8500733L (sv) 1985-08-18
GB8503900D0 (en) 1985-03-20
FI71768B (fi) 1986-10-31
FR2559783A1 (fr) 1985-08-23
US4731325A (en) 1988-03-15
RO92633A (ro) 1987-10-30
DK58985D0 (da) 1985-02-08
IE57652B1 (en) 1993-02-10
ATA44185A (de) 1991-10-15
GB2156074A (en) 1985-10-02
AU577568B2 (en) 1988-09-29
RO92633B (ro) 1987-10-31
HU194938B (en) 1988-03-28
NO166543B (no) 1991-04-29
IT1183184B (it) 1987-10-05
CH671778A5 (da) 1989-09-29
NL193663B (nl) 2000-02-01
IT8519432A0 (it) 1985-02-07
CA1248895A (en) 1989-01-17
BE901671A (fr) 1985-05-29
AU3842285A (en) 1985-08-22
SE8500733D0 (sv) 1985-02-15
IE850202L (en) 1985-08-17
GB2156074B (en) 1988-03-16
ZA85511B (en) 1985-11-27
FR2559783B1 (fr) 1990-03-02
NL8500424A (nl) 1985-09-16
SU1523053A3 (ru) 1989-11-15
JPH0463679B2 (da) 1992-10-12
DE3505287C2 (de) 1994-01-20
FI840655A (fi) 1985-08-18
DE3505287A1 (de) 1985-09-05
LU85768A1 (fr) 1985-07-24
FI71768C (fi) 1987-02-09
HUT37459A (en) 1985-12-28
NO166543C (no) 1991-08-07
SE463103B (sv) 1990-10-08
JPS60188100A (ja) 1985-09-25
NO850554L (no) 1985-08-19
AT394578B (de) 1992-05-11
DK58985A (da) 1985-08-18
NL193663C (nl) 2000-06-06
FI840655A0 (fi) 1984-02-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DK174675B1 (da) Nukleinsyrereagenser og fremgangsmåde til fremstilling deraf
Carder et al. Molecular variation and restriction fragment length polymorphisms (RFLPs) within and between six species of Verticillium
Samuel et al. Correlation of plasmid type and disease caused by Coxiella burnetii
Allard et al. Polymerase chain reaction for detection of adenoviruses in stool samples
Perez et al. Genetic structure of Peruvian populations of Phytophthora infestans
US4900659A (en) Nucleotide sequence composition and method for detection of Neisseria gonorrhoeae and method for screening for a nucleotide sequence that is specific for a genetically distinct group
US6207367B1 (en) Process for genetic mapping for plant identification and breeding purposes
WO1986005816A1 (en) Type-specific papillomavirus dna sequences and peptides
Kinchington et al. Use of polymerase chain amplification reaction for the detection of adenoviruses in ocular swab specimens.
Chay et al. Diversity among isolates within the PAV serotype of barley yellow dwarf virus
Hyypiä Detection of adenovirus in nasopharyngeal specimens by radioactive and nonradioactive DNA probes
Mallavia et al. Genetic diversity of Coxiella burnetii
Kleeman et al. Specificity of PCR and in situ hybridization assays designed for detection of Marteilia sydneyi and M. refringens
Ensinger et al. Marker rescue of temperature-sensitive mutations of vaccinia virus WR: correlation of genetic and physical maps
US5691138A (en) Nucleotide sequences which hybridize specifically with a Campylobacter jejuni genomic nucleic sequence
ODell et al. The classification of isolates of Gaeumannomyces graminis from wheat, rye and oats using restriction fragment length polymorphisms in families of repeated DNA sequences
Tisserat et al. Identification of Leptosphaeria korrae by cloned DNA probes.
Fauron et al. A second type of normal maize mitochondrial genome: an evolutionary link.
EP0178435A2 (en) cDNA probe for the detection of bluetongue virus
Lemaire et al. Detection of sugar beet-infecting beet mild yellowing luteovirus isolates with a specific RNA probe
CN102719519B (zh) 用于检测Ⅰ型新德里金属β-内酰胺酶基因的组合物和试剂盒
Raab-Traub et al. Hybridization of viral nucleic acids: Newer methods on solid media and in solution
Saltzgaber-Muller et al. Detection of Corynebacterium kutscheri in animal tissues by DNA-DNA hybridization
Lawson Pathogen detection and elimination
JPH04502253A (ja) 植物染色体中のｄｎａ配列を同定する方法

Legal Events

Date Code Title Description
PUP Patent expired